virologia...virologia 2020 cebio 6 resposta immunitària adaptativa a virus..... 121 resposta...
TRANSCRIPT
VIROLOGIA Apunts 3r Biotecnologia
2020 UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Consell d’Estudiants de Biociències
Virologia 2020
CEBIO 1
Índex Capítol 1 – La naturalesa i la multiplicació dels virus............................................................. 7
Introducció. ........................................................................................................................ 7
Els virus són arreu. ........................................................................................................ 7
Imatges de Partícules Víriques. ................................................................................... 10
Ni petits ni Senzills. ...................................................................................................... 10
El món dels Virus: Parasitisme estricte, multiplicació i transmissió. ................................. 10
Definició. ...................................................................................................................... 10
Virus i Organismes ....................................................................................................... 11
Transmissió. ................................................................................................................ 12
Malalties Víriques. ........................................................................................................... 12
El Concepte Iceberg. ................................................................................................... 14
Diversitat Vírica. .............................................................................................................. 14
La partícula vírica. ........................................................................................................... 15
Mida de la Partícula vírica. ........................................................................................... 15
Composició química de la partícula vírica. ................................................................... 15
Morfologia de la partícula vírica ................................................................................... 16
Funcions de la càpsida: estabilitat i reconeixement. ........................................................ 16
La composició química, l’estructura i l’organització del genoma víric. .............................. 16
La classificació de Baltimore ........................................................................................ 16
La replicació del genoma víric. ..................................................................................... 17
Gens estructurals i no estructurals. .............................................................................. 17
El cicle víric. .................................................................................................................... 17
Multiplicació vírica. .......................................................................................................... 18
Expressió seqüencial dels gens vírics ............................................................................. 18
Virus, elements genètics mòbils i éssers vius .................................................................. 19
Capítol 2 – Història Vírica ................................................................................................... 20
D’agent filtrable a paràsit genètic. .................................................................................... 20
L’erradicació de la verola i el risc de la re-emergència. ................................................... 24
Història de la Verola. .................................................................................................... 24
La variolació ................................................................................................................. 24
La primera Vacuna contra la verola.............................................................................. 24
Aspectes clínics de la virologia i de la biotecnologia. ....................................................... 25
Capítol 3 - Multiplicació vírica .............................................................................................. 27
Introducció ....................................................................................................................... 27
Infecció Fàgica ............................................................................................................. 27
El cicle infecciós........................................................................................................... 28
Virologia 2020
CEBIO 2
Reconeixement Cel·lular ................................................................................................. 29
Identificació de receptors vírics en cèl·lules. ................................................................ 30
Internalització. ................................................................................................................. 31
Translocació de virus nus. ........................................................................................... 31
Virus amb membrana. .................................................................................................. 31
Pèrdua de la càpsida. .................................................................................................. 32
Cell shutdown. ............................................................................................................. 32
Estimulació de funcions cel·lulars. ............................................................................... 33
Síntesi de RNA, DNA i proteïnes víriques: expressió gènica temporal. ........................ 34
Efectes citopàtics. ........................................................................................................... 35
Alliberament de partícules víriques per gemmació o lisi. ................................................. 36
Apoptosi. ......................................................................................................................... 36
Transformació cel·lular. ................................................................................................... 36
Medicaments antivirals. ................................................................................................... 37
RNA d’interferència ......................................................................................................... 38
Capítol 4 – Morfologia Vírica. .............................................................................................. 39
Morfologia de virus animals. ............................................................................................ 39
Morfologia de virus vegetals. ........................................................................................... 40
Morfologia de Bacteriòfags. ............................................................................................. 40
Simetria vírica. ................................................................................................................. 40
La família Poxviridae. ................................................................................................... 40
La família Baculoviridae. .............................................................................................. 41
Microscòpia Electrònica de partícules víriques. ............................................................... 41
Capsòmers. ..................................................................................................................... 41
Capsòmers Icosaèdrics. ............................................................................................... 41
Simetria helicoidal. ....................................................................................................... 43
Embolcall dels virus. ........................................................................................................ 44
Exemples de Virus........................................................................................................... 45
Neutralització dels virus. .................................................................................................. 45
Neutralització per anticossos. ...................................................................................... 46
Mecanismes vírics per evitar la neutralització. ............................................................. 46
El virió. ............................................................................................................................ 46
Capítol 5 – Genètica i genomes vírics. ................................................................................ 47
La classificació de Baltimore i variabilitat genètica........................................................... 47
Presumpcions de la classificació de Baltimore. ............................................................ 48
Els set tipus de genomes vírics. ................................................................................... 48
Mida del Genoma víric. ................................................................................................ 49
Virologia 2020
CEBIO 3
Seqüenciació dels genomes Vírics. ................................................................................. 50
Estructura gènica del VIH. ........................................................................................... 50
Genomes complexos. .................................................................................................. 50
Genomes simples. ....................................................................................................... 50
Informació codificada en els genomes vírics. ............................................................... 51
Informació NO codificada en els genomes vírics. ......................................................... 51
Genomes de DNA de doble cadena. ............................................................................... 51
Expressió gènica dels Herpesviridae. .......................................................................... 51
Genomes de DNA de cadena senzilla. ............................................................................ 52
Genomes de RNA. .......................................................................................................... 52
Genomes de RNA de doble cadena ............................................................................. 52
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat positiva. ...................................... 52
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat negativa.. .................................... 53
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat positiva i intermediari de DNA. .... 55
Genomes de DNA de doble cadena Espaiats. ............................................................. 56
Expressió gènica en els genomes de RNA. ..................................................................... 57
Clons infecciosos. ........................................................................................................... 57
Virus amb genomes defectuosos. .................................................................................... 57
Capítol 6 – Origen i Evolució dels Virus. ............................................................................. 58
Propietats dels virus que provoquen que l’evolució vírica sigui extremadament ràpida. .. 58
Desenvolupaments de Resistències. ........................................................................... 58
Fonts de variabilitat genètica en virus. ............................................................................. 59
Freqüència de mutació en Genomes de DNA i de RNA. .............................................. 59
Canvis en el medi víric. ................................................................................................ 60
La coevolució. .............................................................................................................. 61
Origen dels virus. ............................................................................................................ 62
Les tres hipòtesis. ........................................................................................................ 62
Capítol 7 – Virus emergents i malalties víriques emergents ................................................ 63
Emergència de Virus. ...................................................................................................... 63
La infecció per virus emergents. ...................................................................................... 65
Vectors en la transmissió vírica. ...................................................................................... 66
Possibles Epidèmies. ...................................................................................................... 66
SARS. .......................................................................................................................... 66
MERS. ......................................................................................................................... 66
La re-emergència contínua de la grip. .......................................................................... 67
Capítol 8 – Metodologia d’estudi dels virus. ........................................................................ 69
Història de l’estudi dels virus. .......................................................................................... 69
Virologia 2020
CEBIO 4
Cultius Cel·lulars: Relació Superfície – Volum. ................................................................ 69
Purificació dels Virions. ................................................................................................... 70
Titració en embrions de pollets. ................................................................................... 71
Titració de virus de plantes. ......................................................................................... 71
Tritació de virus oncogènics. ........................................................................................ 71
Comptabilitat en animals. ............................................................................................. 71
Recompte total. ............................................................................................................... 71
Tècniques de detecció vírica. .......................................................................................... 72
Western blot per immunoblotting. ................................................................................. 72
ELISA. ......................................................................................................................... 73
Immunostaining............................................................................................................ 73
EBER ISH / MG. .......................................................................................................... 73
Hemaglutinació. ........................................................................................................... 73
Mesura de l’activitat enzimàtica vírica.............................................................................. 74
Reacció en Cadena de la Polimerasa. ......................................................................... 74
Seqüenciació High-Throughput. ................................................................................... 74
Proteïnes Fluorescents. ............................................................................................... 74
Nivells de Bioseguretat. ................................................................................................... 75
Capítol 9 – Taxonomia ........................................................................................................ 76
ICTV. ............................................................................................................................... 76
Classificació vírica. .......................................................................................................... 77
Classificació en funció de Baltimore. ............................................................................... 77
Virus de doble cadena de DNA. ................................................................................... 77
Virus de cadena senzilla de DNA. ................................................................................ 78
Virus de doble cadena de RNA. ................................................................................... 78
Virus de RNA de cadena senzilla positiva. ................................................................... 78
Virus de RNA de cadena senzilla negativa. .................................................................. 78
Virus de RNA amb activitat transcriptasa inversa. ........................................................ 79
Virus de DNA amb activitat transcriptasa inversa. ........................................................ 79
Canvis de nomenclatura. ................................................................................................. 79
La Taula que cal saber-se. .............................................................................................. 79
Capítol 10 - Prions i viroides. .............................................................................................. 82
Proteïnes Infeccioses: el Prió. ......................................................................................... 82
Desenvolupament del concepte Prió. ........................................................................... 82
L’amiloide. .................................................................................................................... 84
Síntesi i processament de PrPc. ................................................................................... 84
Formació de PrPsc i propagació de prions. ................................................................... 84
Virologia 2020
CEBIO 5
Encefalopatia Espongiforme Bovina. ............................................................................ 85
Encefalopaties Espongiformes Transmissibles Humanes. ........................................... 85
Barreres entre espècies. .............................................................................................. 86
Diversitat fenotípica dels prions: Soques...................................................................... 87
Prions de llevats. .......................................................................................................... 87
Viroides. .......................................................................................................................... 87
Estructura i dominis constants. .................................................................................... 87
Possibles mecanismes de patogenicitat. ...................................................................... 88
Satèl·lits. ......................................................................................................................... 88
Hepatitis delta virus. ........................................................................................................ 89
Capítol 11 – Bacteriòfags. ................................................................................................... 90
Ús dels bacteriòfags en genètica molecular i Biotecnologia. ............................................ 90
Què és un Bacteriòfag? ............................................................................................... 90
Ús dels bacteriòfags com a sensors per a la detecció de bacteris................................ 90
Ús de bacteriòfags com a eines antimicrobianes. ........................................................ 91
Ús de Bacteriòfags com a vehicles de subministrament de medicaments o gens. ....... 91
Ús de bacteriòfags com a biomaterials per la construcció òssia. .................................. 91
Ús de bacteriòfags com a eines d’expressió peptídiques (Phage Display). .................. 92
Usos i aplicacions del Phage display. .............................................................................. 96
Selecció d’Anticossos. ................................................................................................. 96
Identificació de nous lligands. ...................................................................................... 97
Evolució molecular dirigida. ............................................................................................. 97
Ús del Phage Display en la selecció d’insecticides. ......................................................... 98
Capítol 12 – Patogènia Viral ................................................................................................ 99
Fets bàsics. ..................................................................................................................... 99
Vivim i prosperem en un núvol de virus, literalment. .................................................... 99
Qüestions fonamentals de la patogènia viral. ................................................................ 100
Vies de transmissió. ................................................................................................... 100
Tropisme Víric. ........................................................................................................... 105
Factors que modifiquen la patogenicitat. ....................................................................... 109
Mecanismes de dany cel·lular. ...................................................................................... 110
Virologia de plantes. ...................................................................................................... 111
Capítol 13 – Resposta Immune Antivírica. ........................................................................ 112
La vacuna de la pòlio. .................................................................................................... 112
Vacunes de DNA. .......................................................................................................... 117
Resposta immunitària a virus. ....................................................................................... 118
Resposta immunitària innata a virus. ......................................................................... 119
Virologia 2020
CEBIO 6
Resposta immunitària adaptativa a virus. ................................................................... 121
Resposta immunitària de bacteris enfront virus. ......................................................... 122
Capítol 14 – Aplicacions dels Virus. .................................................................................. 123
Teràpia Gènica. ............................................................................................................. 123
Inhibicions de gens. ................................................................................................... 124
Tipus de teràpies gèniques. ....................................................................................... 125
Teràpia gènica mitjançant virus. .................................................................................... 125
Famílies víriques per a teràpia gènica. ....................................................................... 127
Assajos clínics de teràpies gèniques. ............................................................................ 127
Vehicles de teràpies gèniques. ...................................................................................... 128
Vehicles no vírics. ...................................................................................................... 128
Vehicles vírics. ........................................................................................................... 129
Vehicles proteics. ....................................................................................................... 129
Propietats dels vehicles de teràpia gènica. .................................................................... 130
Mecanismes d’internalització de la partícula. ............................................................. 131
Virologia 2020
CEBIO 7
Capítol 1 – La naturalesa i la multiplicació dels virus.
Introducció.
Els virus són arreu.
Existeixen milions, bilions, de microorganismes a la biosfera d’aquest planeta.
Microorganismes grans, microorganismes petits, paràsits, independents, terrestres,
aquàtics... I n’hi ha, també, que conviuen amb nosaltres. Els humans carreguem, allà on
anem, una gran quantitat de bacteris que sempre ens acompanyen. I aquests
microorganismes, encara que estiguin dins nostre, no estan protegits d’un ésser encara més
present arreu que ells: els virus.
Els virus són un dels grans èxits evolutius d’aquest mon. Són capaços d’estar sobre i
dins de quasi tots els materials, ja sigui terra, aigua o aire. I el que és més important: no hi ha
cap ésser viu que es salvi de ser infectat. Conseqüentment, no és pas cap bogeria afirmar
que els virus, per si sols, ja tenen un magnífic èxit evolutiu al tenir més variabilitat i adaptabilitat
que cap altre tipus d’organisme de la terra. Els virus es troben arreu.
El conjunt de tots els virus que existeixen rep el nom de Virosfera. Aquesta està composta,
si fa no fa, per entre 1030 i 1032 virus. Així, amb dos nombres qualssevol no ens podem arribar
a fer una idea del que significa aquest valor. Per això el posarem en context.
Ara ja no semblen tan merdes, els cabrons. Bé, això perquè els hem comparat amb nosaltres:
l’espècie més egòlatra del món. Però no per això hem d’oblidar que també són uns cabrons
amb altres espècies.
Alguns virus, com els Baculoviridiae, es fan servir molt en biotecnologia. Aquest tipus de virus
infecta a les larves d’arna (les papallones lletges i peludes). Les larves d’aquests insectes són
erugues que s’alimenten de les fulles de les plantes sobre les que es troben. Com que passen
la majoria de la seva vida a sobre d’aquestes, si moren prematurament per causa d’un virus,
les seves restes es quedaran sobre les mateixes. Aquesta informació ha estat aprofitada
evolutivament pels Baculoviridiae, que ho fan servir per infectar a la resta de larves.
La infecció d’una larva per un Baculoviridiae comença amb una larva ja infectada. En aquests
casos, el virus s’escampa per totes les cèl·lules del cos de l’eruga fins que no en queda
ni una sense infectar. Aleshores, un cop s’ha arribat a la infecció total, el virus inicia un cicle
lític a totes i cadascuna de les cèl·lules. Aquest cicle lític no deixa gaire bé a la larva, que perd
de cop i volta totes les seves cèl·lules. Abans de morir, però, el virus obliga a les cèl·lules a
produir una estructura anomenada PoliHedrina. Aquest compost provoca que les restes de
les cèl·lules que estaven allà es mantinguin pròximes les unes amb les altres i que mantingui
el virus estable durant un llarg temps al que estarà sotmès a les inclemències del clima.
Un humà pesa, de mitjana, 70Kg i n'hi ha uns 7 mil milions (7*109).
Un virus, en canvi, pesa una mitjana de 1 femtogram (10-15g).
Fent una simple multiplicació per la forquilla baixa de la virosfera, el conjunt dels virus pesa EL DOBLE (1012Kg) que el
conjunt d’éssers humans (4.9*1011Kg).
Virologia 2020
CEBIO 8
Les masses subjectades per la PoliHedrina es mantenen a sobre de les fulles de les
plantes, resistint vent, pluja i sol. Quan arriba una altra larva, però, no es para a pensar que
potser és mala idea menjar-se aquella fulla i se la fot com una golosa que és. L’amalgama
plena de virus circula per tot el sistema digestiu (boca i resta d’òrgans que en formin part en
insectes) fins arribar a l’intestí de la larva, on hi ha un fantàstic pH de 10. Aquest pH, que es
dona la costat de les cèl·lules diana del Baculovirus, provoca que es desfaci la PoliHedrina i
comenci l’espectacle d’estar infectat amb un virus que matarà a la larva tota de cop i la
desfarà.
Però no totes les infeccions són en animalons o humans, amb dues potes que els permeten
fugir de tot menys d’aquests bèsties assassins. Existeixen molts tipus de virus i tot tipus
d’organisme es pot veure afectat per ells. Mirem sinó les plantes, que es poden veure
afectades si tenen un trencament en parets cel·lulars.
Les infeccions per virus, mortals o inofensives, requereixen de la transmissió, el pas pel qual
el virus passa d’estar d’un lloc a un altre. En el cas dels Baculoviridiae, la transmissió és per
l’alimentació, per exemple. Existeixen diverses i variades maneres de transmetre un
virus. Una d’elles és des del medi, sense estar associats a una cèl·lula hoste. Això és perquè
els virus, fora de les cèl·lules hoste, tenen una finestra temporal durant la qual encara són
infecciosos. N’hi ha que tenen una finestra de temps d’hores, altres, en canvi, la tenen d’anys.
La capacitat de sobreviure fora d’una cèl·lula hoste, independentment del temps que això
pugui durar, permet al virus mantenir el cicle infecciós. En altres paraules, la finestra de
temps durant la qual el virus pot sobreviure sense un hoste és el que evita la seva erradicació.
L’únic cas d’una malaltia humana transmesa per un virus i que ha pogut ser erradicada és el
de la verola. El virus que causa aquesta malaltia és un virus de DNA que només era capaç
d’infectar l’espècie humana. Gràcies a l’existència d’una vacuna des del segle XVIII i a que la
variabilitat del virus era molt minsa al llarg del temps, es va obrir la possibilitat de trencar-ne
el cicle infecciós i erradicar-la. Després vindrà algun anti-vacunes imbècil a dir que
provoquen autisme, quins collons.
Com es pot comprovar tot llegint entre les línies del paràgraf anterior, per poder erradicar la
verola va haver de coincidir que:
1) El virus només infectés a l’espècie humana.
2) Existís una vacuna des de fa una pila d’anys.
3) El virus no variés molt entre brots infecciosos.
Si tenim en consideració que gairebé no hi ha virus que compleixin aquestes tres
característiques i que hi ha una molt gran variabilitat en la virosfera, és bastant normal que
no s’hagi pogut erradicar cap altre malaltia vírica.
Clar que no cal que intentem erradicar tots i cadascun dels virus d’aquest planeta. N’hi ha que
provoquen malalties, sí, però no tots són així. La majoria dels virus es transmeten d’un individu
a un altre, infecten l’hoste, s’hi multipliquen, hi augmenten en concentració i salten a un altre
individu amb qui tornen a començar el cicle. N’existeixen, però, que trenquen la dinàmica, que
són uns rebels. Són uns virus que, un cop infecten l’hoste, entren a les cèl·lules diana i el
mantenen infectat fins que l’individu es mor per alguna altre causa. En aquests casos,
la simptomatologia és molt lleu o ni tan sols hi és present. Aquests virus són molt exitosos en
quant a evolució, ja que són capaços de conviure amb l’hoste i transmetre’s quasi
indetectablement.
Virologia 2020
CEBIO 9
En humans, un exemple bastant conegut dels virus tranquils, aquests que infecten i es queden
dins l’organisme sense fotre ni brot, és l’Human Herpesvirus. Herpes pels amics. D’aquesta
família vírica hi ha 9 tipus de virus, tots una colla de dormilegues al cos humà.
A llarg termini en termes evolutius, milions d’anys, la coexistència de virus i humans pot
acabar produint que alguns genomes vírics es quedin “atrapats” en el genoma de
l’hoste i n’acabin formant part.
En l’ésser humà, i gràcies a les tècniques de seqüenciació juntament amb el projecte genoma,
s’ha descobert l’existència de fragments de DNA molt similars als genomes d’alguns
virus. Estaríem parlant que un 8.3% del genoma humà consisteix en gens compartits amb
virus. Un percentatge excepcional per si sol i encara més si afegim el context que només un
1.5% del genoma humà codifica per proteïnes.
Amb aquesta informació es pot extreure que hi ha hagut una coevolució entre els
organismes infectats i els infectants. Resta sent un dubte quin hi era abans, l’humà o el
virus, però no és pas cap incògnita que la presència d’aquests fragments de DNA són una
part essencial per la supervivència de la nostra espècie.
oConegut per tothom, tal i com demostren les estadístiques segons les quals el 50% dels individus humans presenten anticossos contra aquest tipus de virus.
oMalgrat la meitat de la gent occidental el té, no n’hi ha masses que n’hagin patit els efectes...
Tipus 1: Herpes Labial.
oDe manera similar al tipus 1, entre el 20 i el 50% de la població occidental n’està infectada o presenta anticossos. Així i tot, pocs símptomes clínics.
Tipus 2: Herpes Genital.
oEl cas més complex de comptabilitzar.
oAl existir-ne una vacuna, l’abast de la infecció no es pot calcular mitjançant un recompte d’anticossos.
oEs calcula que el 95% de les persones han estat en contacte amb el virus directament.
oEl seu cognom és fruit de la infecció secundària que provoca quan el sistema immunitari està dèbil, que pot ser bastant incapacitant.
Tipus 3: Varicel·la zoster
oSimilar al tipus 3, es calcula que entre el 80 i el 95% de la gent dels països occidentals tenen o han entrat en contacte amb aquest virus.
Tipus 4: Mononucleosi Infecciosa o Epstein Barr
oMalgrat el nom, entre un 40 i un 70% de la població dels països desenvolupats ha entrat en contacte amb ell.
Tipus 5: Mononucleosi no infecciosa
oPràcticament tots els nens tenen aquest virus dins seu.
Tipus 6, 6a i 7: Herpes (infantil?)
oÉs un virus classista que quasi no es troba present en països desenvolupats però que té una interessant presència en països en vies de desenvolupament.
Tipus 8
Virologia 2020
CEBIO 10
Imatges de Partícules Víriques.
Els virus infecten organismes. Aquestes infeccions consisteixen, en gran part, en introduir
un material genètic en la cèl·lula hoste. El material genètic, però, no és altament estable. En
el cas del DNA, l’entorn pot atacar-lo i fer-lo malbé. En el cas del RNA, l’entorn pot ser atacat
per ell mentre es fa malbé ell sol.
Per tant, els virus requereixen d’algun mecanisme d’aïllament o protecció del seu
material genètic en front de les inclemències de l’entorn. Per fer-ho, al llarg de l’evolució
s’han anat desenvolupant una sèrie d’estratègies i mecanismes que realitzaven aquesta
funció. La majoria han desenvolupat el que s’anomena una càpsida.
Una càpsida és una estructura complexa constituïda per moltes subunitats idèntiques
d’una proteïna vírica (sovint anomenades capsòmer). La funció de la càpsida, com ja hem
dit, és dotar al virus d’un embolcall proteic en el qual el genoma es pot mantenir en un ambient
estable. Malgrat els virus poden optar per una immensa varietat de formes per les seves
càpsides, algunes fins i tot molt complexes, la gran majoria d’ells opten per dos tipus
d’estructures regulars.
Una de les estructures és l’Hèlix, on els capsòmers s’associen amb els àcids nucleics
(helicoidals, detall important) per formar una nucleoproteïna. Aquesta unió i estructura pot
ser molt flexible o molt rígida depenent de les pròpies proteïnes de la càpsida. L’altre
estructura regular altament utilitzada és l’icosaedre, on els capsòmers formen una estructura
regular sòlida envoltant el material genètic.
Malgrat la freqüència d’aquestes formes regulars, molts virus tenen formes més complexes o
irregulars entre les que s’inclouen les formes de ronyó, llimona o diamant entre d’altres. Per
aprofundir, hi ha virus que poden variar la seva forma segons la naturalesa de la cèl·lula
en la qual maduren. Alguns tipus de virus, sobretot els Poxviridae, es distingeixen de la resta
perquè tenen diferents formes que caracteritzen membres específics d’aquest grup. La
distribució de la càpsida al voltant del material genètic és una característica única per
cada tipus de virus i la seva forma i simetria són els seus elements més característics.
Ni petits ni Senzills.
De la mateixa manera que no tots els virus tenen la mateixa càpsida ni genoma, no tots els
virus tenen la mateixa mida. Només per posar un exemple, existeixen els mimivirus, uns
dels virus més grans que existeixen i els quals tenen un genoma i un proteoma bastant
complex. Hi ha més d’un d’aquests virus que, de fet, són més grans que alguns bacteris.
Però no ens fem idees estranyes: al camp de la virologia també es compleix la màxima que
la mida no importa. Pensem, sinó, en virus petits com el VIH. Aquest petit de tan sols 15
proteïnes és el causant de la més recent de les pandèmies devastadores. Gairebé 78 milions
de persones s’han vist infectades amb el VIH i unes 35 milions de persones ja han mort per
culpa seva. En conclusió, podem comprovar que ni tots els virus són petits ni tots els virus
són senzills.
El món dels Virus: Parasitisme estricte, multiplicació i transmissió.
Definició.
La comunitat científica està relativament d’acord en definir els virus com una entitat que no
es pot replicar de manera independent a una altre cèl·lula viva, a la que anomenem
cèl·lula hoste. Aquestes entitats biològiques (no organismes!) es veuen abocades, doncs, a
ser uns paràsits intracel·lulars que fan servir la maquinària cel·lular de l’hoste per
multiplicar-se.
Virologia 2020
CEBIO 11
Els virus tenen dos estadis en base a si es troben intracel·lulars a una cèl·lula hoste o si estan
fora d’aquesta per infectar-ne una altra. Aquesta forma extracel·lular rep el nom de virió
o partícula vírica i facilita la transmissió entre cèl·lules hostes.
Un cop s’han transmès, els virus necessiten multiplicar-se per mantenir la seva
presència evolutiva. Per multiplicar-se, els virus han d’entrar en una cèl·lula en la qual es
puguin replicar, un procés anomenat infecció. La multiplicació també necessita de la
producció de proteïnes víriques codificades en el material genètic del virus. Per tant, tots els
virus han de produir mRNA que les ribosomes de la cèl·lula hoste pugui traduir a
proteïnes. Per això es considera que els virus són paràsits de la maquinària de síntesi de la
cèl·lula hoste.
Ara, repassem la informació que tenim dels virus:
Els problema d’aquests 5 punts és que hi ha altres organismes vius que ho compleixen.
Per exemple, les espècies bacterianes Rickettsiae i Chlamydiae, ambdues un tipus de bacteri
gramnegatiu. Per poder aconseguir una definició més acurada dels bacteris es van afegir els
següents tres punts:
Virus i Organismes
Aquests tres punts ajuden a diferenciar, ja del tot, els bacteris dels virus. Els bacteris, éssers
vius metabòlicament actius amb una reproducció per fissió binària i que poden causar
malalties, ja no poden ser confosos amb uns paràsits metabòlicament inactius que es
multipliquen per l’assemblatge de components i que sempre causen malalties infeccioses
anomenats virus. Gràcies a aquests tres punts ja sabem que no serveix de res tractar un
constipat amb un antibiòtic.
Són entitats biològiques que no es poden replicar independentment de la cèl·lula hoste.
Són paràsits intracel·lulars obligats que fan servir la maquinària de la cèl·lula hoste per multiplicar-se.
Tenen una forma extracel·lular que facilita la transmissió.
Per multiplicar-se, han d’entrar en una cèl·lula on es puguin replicar mitjançant un procés anomenat infecció.
Tots els virus han de fer mRNA que es pugui traduir pels ribosomes de la cèl·lula hoste.
Els Virus són resistents a antibiòtics
Les partícules víriques són generades a partir de l'assemblatge de components preformats
Les partícules víriques, per si soles, no creixen o realitzen la divisió
Virologia 2020
CEBIO 12
A diferència dels organismes d’aquest planeta (recordem que un virus no és un organisme
sinó que és una entitat biològica), els virus ni creixen ni es reprodueixen, sinó que es
multipliquen a partir dels organismes infectats.
Transmissió.
Hem dit que aquesta infecció és un procés del virus per multiplicar-se mitjançant el qual
entra en una cèl·lula on es pugui replicar. Per arribar a aquesta altre cèl·lula on realitzar el
procés cal que es doni el fenomen de la transmissió, el qual és essencial per determinar si
el virus en qüestió podrà seguir infectant altres organismes. Això és perquè els virus es
mantenen mentre la cadena d’infecció es mantingui expandint de cèl·lula a cèl·lula en un
hoste o des d’un hoste a un altre. Existeixen dos patrons generals de transmissió. En les
transmissions que només involucren una espècie, aquesta és el seu reservori. En el cas
d’infeccions alternades entre espècies, aquelles on el virus completi el cicle d’infecció són els
reservoris. Les malalties víriques compartides entre humans i animals s’anomenen
zoonosis.
Un exemple de virus que es transmet involucrant només una espècie és el virus de l’Hepatitis
A (HAV), mentre que un exemple del que ho fa entre espècies és el Dengue virus, on els
primats són el reservori i el mosquit Aedes, el vector de transmissió.
La cadena de transmissió o d’infecció és el que permet que el virus segueixi existint. Si es
trenca aquesta cadena, s’elimina el virus. Això, però, només s’ha aconseguit amb un sol
virus que ja hem comentat prèviament: el de la Verola. I es que per poder eliminar virus amb
una cadena de transmissió on intervenen més d’una espècie (cas diferent al de la Verola, on
només hi havia els humans) cal aplicar prevenció, vacunes i productes anti-virals, els quals
no tenen molta diversitat i solen ser molt tòxics.
Malalties Víriques. La malaltia o patogènesi és una característica molt típica de les infeccions virals. El concepte
de patogènesi viral fa referència als esdeveniments que succeeixen durant una infecció
viral d’un hoste. Aquests esdeveniments, majoritàriament simptomàtics, són el resultat d’una
interacció Virus–Sistema Immunitari.
És possible estudiar aquestes interaccions sense haver de buscar malalts d’una malaltia o
haver-la de provocar en pacients sans (que seria una mica pitjor que l’altre opció): els models
animals. Calen, però, models animals molt bons per entendre com els virus causen malalties
en humans i per identificar els principis i mecanismes de les infeccions víriques.
A més a més cal tenir en compte que, per molt que tinguem un molt bon model animal, hi ha
una sèrie de factors que no el fan del tot vàlid, sinó que impliquen un estudi més ampli i
extensiu. Un d’aquests factors és que els virus d’una mateixa família poden provocar
diferents tipus de malalties depenent del teixit, la resposta immune de l’hoste i de la
susceptibilitat genètica del mateix. L’altre factor, encara més malparit, és que un mateix virus
pot provocar diferents estadis de la malaltia en hostes de la mateixa espècie. Això
significa que un hoste humà del coronavirus, per exemple, pot mostrar els mateixos
símptomes que un constipat mentre que un altre infectat per la mateixa espècie de virus pot
acabar morint.
Malgrat el dramatisme, cal tenir en compte que la majoria de les infeccions víriques causen
malalties suaus com un malestar, una lleu febre, mucositat... Pocs virus tenen una mortalitat
tan alta com el ja erradicat virus de la verola (que oscil·lava entre un 30 i un 40%), d’altres
s’ha descobert fa poc que estan relacionats amb el càncer i alguns escassos virus
provoquen malalties agudes, tot i que aquestes només es passen un cop a la vida.
Virologia 2020
CEBIO 13
D’entre aquestes malalties agudes és interessant destacar-ne el que ara mateix té en marxa
una iniciativa per erradicar-lo: el poliovirus, causant de la poliomielitis. Aquesta malaltia és
també un bon exemple sobre com les infeccions víriques provoquen diferents estadis
d’una mateixa malaltia en individus d’una mateixa espècie.
El virus de la pòlio o poliomielitis és un virus sense embolcall, esfèric i d’uns 30nm de
diàmetre. La seva càpsida consisteix en un arranjament icosaèdric de 60 protòmers,
cadascun dels quals consisteix en 4 polipèptids (VP1, VP2, VP3 i VP4). D’aquests 4
polipèptids, VP4 es localitza a la cara interna de la càpsida. Els protòmers s’agrupen de 3 en
3 per formar les 20 cares triangulars. Les cares triangulars s’ordenen per formar una càpsida
de 12 pentàmers de protòmers. En l’interior d’aquesta càpsida s’hi troba un RNA de
cadena senzilla amb una proteïna adherida al seu extrem. Les imatges que aquí
s’exposen estan extretes de ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics.
La poliomielitis és una malaltia la incubació de la qual pot trigar entre 7 i 14 dies de
normal, tot i que els símptomes de tenir-la són bastant variables, començant per una infecció
que passa desapercebuda gràcies a la eficàcia del sistema immune, una petita malaltia amb
febre, mal de coll i malestar, una fase meningítica i una malaltia paralítica; en casos extrems
pot acabar en la mort. Cada greuge es dona tan sols en una quantitat de gent equivalent a
una petita fracció de la simptomatologia anterior, pel que la quantitat de gent morta a causa
de la poliomielitis no és gaire gran a final d’any.
Significa això que les virus en realitat són inofensius excepte per molt poca gent que és una
desgraciada? NO. És obvi que maten a gent i que, per tant, han tingut i tenen un gran
impacte en la població humana. Per posar-ne un exemple, observem el virus de la SIDA,
el VIH. Aquest virus provoca una malaltia que debilita el sistema immunitari humà. Gràcies
als diversos tractaments, n’hem pogut reduir la letalitat, però l’any 2018 encara en van morir
770,000 persones a tot el mon.
Això va ser en l’última epidèmia del VIH, però cada any hi ha noves pandèmies. La més
recorrent és la grip estacional, a la que no li donem tanta importància malgrat succeir cada
anualment com a conseqüència d’una incapacitat de l’ésser humà per reconèixer petites
variacions en un virus que ja hem “patit”.
El virus del VIH, precisament, és un virus molt interessant des del punt de vista del seu
comportament perquè realitza en humans el què molts virus realitzen als bacteris, el cicle
lisogènic d’infecció vírica. En aquest tipus de cicle d’infecció, el genoma del virus infectant
pot introduir-se en el de l’hoste fins que, per algun motiu concret, inicia el cicle d’infecció
oposat: el cicle lític. Aquest segon cicle consisteix en infectar la cèl·lula i generar noves
partícules víriques des que s’ha infectat.
Unitat icosaèdrica asimètrica Cara triangular Càpsida Externa
Virologia 2020
CEBIO 14
No és tan fàcil de generar cicle d’infecció en plantes, però. Les cèl·lules de les plantes
protegeixen la seva membrana citoplasmàtica amb una paret que les envolta i evita que entrin
materials no desitjats. Entre aquests es troben els virus, que aprofiten esquerdes en les
plantes (una esquerda o trencament en una planta sol significar parets cel·lulars trencades)
per infectar-les. Com que no totes les cèl·lules de la planta estan malmeses, la infecció,
observada a contrallum, es veu com un munt de petites clapes sobre una fulla o un
material vegetal.
Amb moltes plantes també es dona un cas víric especial: els efectes positius de la infecció.
Aquests efectes poden ser purament visuals com en el cas de les tulipes infectades per Tulip
breaking virus, on el virus interfereix en la síntesi de pigments de les flors, o poden ser
beneficioses per l’hoste com li passa a Dichanthelium lanugiosum quan es troba a 55ºC, on
necessita del virus C. Protuberata infectat per CthTV per sobreviure.
El Concepte Iceberg.
Sorprenentment, i al contrari del que hem estat dient fins ara, la gran majoria dels virus que
ens infecten tenen poc o cap efecte sobre la nostra salut o benestar. Així i tot,
l’epidemiologia serològica indica que, per certes infeccions, la seva presència en les
poblacions és molt superior que la quantitat de malalties clíniques aparents. Això és el que
John Paul va definir com El Concepte Iceberg, i va afirmar que els anticossos del sèrum
representen les petjades d’una infecció. En el símil amb l’Iceberg, la part per sobre de
l’aigua representa la malaltia clínica i la part per sota representa la prevalença de l’anticòs en
la població.
Aquests anticossos hem dit que són petjades d’infeccions, com també ho són alguns dels
gens que es troben en el nostre genoma des de fa milions d’anys. Això ha succeït perquè hi
ha hagut gens vírics segrestats per dur a terme funcions importants en la fisiologia del
mamífer hoste. Un d’aquests gens, el qual codifica per una proteïna anomenada sincitina, és
el gen de l’embolcall d’un retrovirus defectiu d’humans que s’ha descobert recentment: HERV-
W. El principal lloc d’expressió de la sincitina són els sincitoblasts de la placenta, cèl·lules
multinucleades que s’originen de trofoblasts fetals. Hi ha dades que indiquen que la sincitina
pot tenir un rol important en la morfogènesi humana en la placenta.
Diversitat Vírica. Per poder comprendre les interaccions dels virus amb els seus hostes, com el que pot acabar
derivant en l’exemple que hem vist de la sincitina, cal entendre la diversitat vírica que
existeix. I és que la diversitat biològica dels virus és més gran que entre tots els bacteris,
plantes i regnes animals junts. Això resulta de la capacitat dels virus d’infectar tots els grups
d’organismes vius coneguts. A nivell molecular, les interaccions proteïna-proteïna, Proteïna-
àcid nucleic i proteïna-lípid determinen l’estructura de les partícules víriques, la síntesi i
expressió dels genomes vírics i els efectes dels virus en les cèl·lules hoste.
Els virus que infecten bacteris poden ser de RNA de cadena senzilla, de RNA de cadena
doble, de DNA de cadena senzilla i de DNA de doble cadena. El que no poden ser és virus
amb embolcall. Això és perquè infecten bacteris, els quals no tenen una membrana
plasmàtica. La majoria dels genomes bacterians són d’entre 1 i 5 Mbp de DNA, amb el més
petit sent de 500kb. El genoma víric més gran correspon als Mimivirus i als Pandoravirus,
consistents en 1.2Mbp i 2.5Mbp de doble cadena de DNA, respectivament. Aquests genomes
són més grans que els d’alguns bacteris. El genoma víric més petit, el del Circovirus, codifica
només per dos gens i consisteix en 2 kb. Això ens ensenya en quin rang es mouen les mides
dels genomes.
Virologia 2020
CEBIO 15
Respecte la diversitat de virus que infecten animals, cal mencionar que la combinatòria de
tipus de virus s’estén, ja que n’hi ha que estan despullats, que tenen membrana, de RNA, de
DNA, de cadena senzilla, de cadena doble... Cal destacar la predominància dels virus de
RNA, que és el grup amb més variabilitat en recobriment. Un tipus de virus d’animals són els
Adenovirus, que tenen unes puntes que són punts d’interacció. Un altre tipus són els
Papovirus i els Papilomavirus. Altres són els Poxvirus, molt grans i que ho fan tot al
citoplasma. Els Hepandavirus (representat per l’hepatitis D) tenen un cicle que ha de passar
per RNA i després a DNA.
De virus de RNA amb membrana hi ha els Coronavirus (amb polaritat positiva), els
Paramixovirus (del xarampió i les paperes), els Retrovirus (amb cadena de RNA senzilla però
que després, dins la cèl·lula, canvien a DNA de doble cadena)... Dels virus d’animals de RNA
sense embolcall en destaquen els Picornavirus i els Reovirus (virus que causen gastroenteritis
en edat infantil i provoquen uns 500,000 morts).
La diversitat vírica que s’observa entre genomes, membranes, proteïnes i la resta de
components vírics és immensa.
La partícula vírica.
Mida de la Partícula vírica.
La majoria dels virus varien en mida de 20 a 100nm, el que significa que són uns dos
ordres de magnitud més petits que el bacteri més petit. Generalment, i arran d’aquesta
característica, no es poden visualitzar amb un microscopi òptic i per això la microscòpia
electrònica és la tècnica més utilitzada per aquesta tasca. Les reconstruccions 3D es
realitzen per microscòpia crio-electrònica i per difracció de raigs X.
Els bacteriòfags, els virus que infecten bacteris, també es solen visualitzar per tinció negativa
mitjançant un TEM. En aquests aparell es mira la proporció del feix d’electrons que arriba a
la placa de fòsfor a través de la mostra. La curta longitud d’ona dels electrons permet que,
en imatges 2D obtingudes per aquesta tècnica, la resolució sigui sub-nanomètrica. Si enlloc
de voler obtenir imatges en 2D es volen prendre en 3D, s’ha de fer servir un microscopi de
tipus SEM on s’analitzen els electrons secundaris.
Composició química de la partícula vírica.
Els virus es separen en 2 tipus. En el cas dels virus despullats, estan formats només per
la nucleocàpsida: el conjunt de la càpsida i de l’àcid nucleic. Les càpsides són un conjunt de
proteïnes definides com capsòmers, els quals són la unitat morfològica més petita que es pot
veure en un microscopi electrònic. En el cas dels virus embolcallats hi ha un embolcall de
lípids i proteïnes que envolta la càpsida. Aquesta sol ser una membrana externa recollida
d’alguna de cèl·lules que han infectat prèviament. Aquesta, a més a més, sol estar recoberta
amb proteïnes víriques.
Les partícules víriques embolcallades es formen tot empenyent a través d’alguna membrana
de la cèl·lula hoste, procés durant el qual la partícula queda embolicada amb una bicapa
lipídica derivada de la membrana cel·lular. Per alguns virus, l’assemblatge de l’estructura
de la partícula i l’empenta a través de membrana succeeix alhora, mentre que en altres
hi ha una nucleocàpsida pre-formada que empeny a través de la membrana.
En molts casos, l’estructura que envolta el genoma li atorga estabilitat, mentre que en
altres es necessita que aquest embolcall estigui present només en certs moments del cicle
víric. Dins d’aquesta càpsida succeeix, per exemple, el primer pas de la infecció, la
transformació del RNA a DNA. Aquesta càpsida, ara ja no tan tancada, continuaria protegint
el DNA i se’n aniria cap al nucli, on es fusionaria amb la membrana del mateix. En el cas dels
Virologia 2020
CEBIO 16
Retrovirus, doncs, la càpsida és molt important ja que és on es dona el primer pas de la
retrotranscripció. Una de les funcions primordials de les càpsides dels virus despullats
és fer reconeixement. En els virus amb membrana, aquesta funció la tindrà alguna proteïna
que el virus tingui en ella.
Morfologia de la partícula vírica
La morfologia de la partícula vírica depèn de diferents factors: la simetria vírica, la
presència d’un embolcall i el tipus de proteïnes víriques involucrades en la gemmació.
Existeixen 5 tipus bàsics de simetria: Simetria icosaèdrica, icosaedre embolcallat,
helicoidal, helicoide embolcallat i simetria complexa.
Tan sols els virus despullats amb una simetria icosaèdrica produeixen noves partícules
víriques que són còpies exactes del virió original. La majoria dels virus despullats amb una
simetria helicoidal produeixen partícules víriques de mida variable. Els virus
embolcallats produeixen unes partícules víriques pleomòrfiques d’una morfologia similar.
Funcions de la càpsida: estabilitat i reconeixement. La càpsida és una estructura complexa feta a partir de moltes subunitats idèntiques de
proteïnes víriques, normalment anomenat capsòmer. La funció de la càpsida és atorgar una
cloïssa proteica en la que el genoma químicament làbil es pot mantenir en un ambient estable.
La composició química, l’estructura i l’organització del genoma víric. L’àcid nucleic d’un virus pot ser de DNA o de RNA. Aquest material genètic pot ser de
cadena senzilla o de cadena doble i pot ser lineal o circular, però és sempre el mateix per un
tipus concret de virus. El tipus de material genètic és un factor important en la
classificació en grups d’un virus donat. En conseqüència, tot i que totes les cèl·lules vives
fan servir tan sols DNA de doble cadena com a material genètic, alguns virus poden fer servir
altres tipus d’àcids nucleics.
Els virus que contenen DNA com a material genètic i fan servir el nucli de la cèl·lula
infectada com a punt de replicació del genoma comparteixen gran quantitat de patrons
d’expressió de gens i de replicació gènica amb aquesta cèl·lula hoste.
Els virus que fan servir RNA com a material genètic han desenvolupat algun mecanisme
per replicar aquest material, ja que la cèl·lula hoste no conté cap mecanisme per realitzar la
replicació del RNA a partir de RNA. Per tant, la replicació de virus de RNA requereix
l’expressió d’enzims específics que de normal no es troben presents en la cèl·lula
hoste.
El DNA pot arribar a ser segmentat. Això significa que el DNA pot estar format per petits
fragments. Aquest tipus de genomes es localitzen, sobretot, en els virus de RNA. El Reovirus,
per exemple, té 10 fragments. En el cas del Influenza, el virus de la grip, el DNA té 8 segments.
Com que són més petits, tenen major estabilitat que un sol genoma llarg. La contrapartida
d’aquesta fragmentació és que els fragments han d’ésser seleccionats cada vegada per tal
que totes les partícules víriques sortints siguin infectants.
La classificació de Baltimore
El 1971, David Baltimore va suggerir un esquema per a la classificació vírica en funció
del mecanisme segons el qual un virus produeix RNA missatger durant la infecció. La
lògica d’aquesta consideració es troba en què, per tal de replicar-se, tots els virus han
d’expressar mRNA per traduir en proteïnes. El que determina com realitzen aquest procés és
el tipus de genoma que fa servir els virus. En aquest sistema de classificació, els virus amb
genomes de RNA en el mateix sentit que el mRNA s’anomenen positive-sense RNA viruses,
Virologia 2020
CEBIO 17
mentre que aquells el genoma dels quals és complementari al de mRNA reben el nom de
negative-sense RNA viruses. Els virus amb genomes de doble cadena òbviament tenen els
dos sentits de l’àcid nucleic. Segons aquesta classificació, els virus de DNA s’agrupen segons
si tenen una o les dues cadenes i els retrovirus poden ser de RNA de cadena senzilla o de
DNA de cadena doble segons els passos entremitjos en la replicació.
El grup que Baltimore no havia arribat a estudiar és un grup de virus de DNA que tenen un
intermediari de RNA. Per tant, aquests necessiten tenir una activitat que transformi DNA a
RNA. Aquesta transcripció la fa la RNA polimerasa. Un cop està format el RNA, necessita
generar nou DNA. Aquesta síntesi requereix d’una transcriptasa inversa.
La replicació del genoma víric.
Tots els virus comparteixen el mateix cicle de replicació en quant a les bases, però el
temps involucrat depèn en un gran nombre de factors, incloent la mida i la complexitat
genètica del virus així com la naturalesa de la cèl·lula. El procés de replicació involucra 3
passos.
En el primer pas, els virus han de ser capaços de fer servir característiques pròpies de la
cèl·lula hoste en la que replicaran per tal d’introduir el seu genoma dins de la mateixa i
assegurar que serà transportat allà on el cicle replicatiu pugui continuar. Això requereix
induir la cèl·lula a fagocitar la partícula vírica sencera d’alguna manera específica o, en el cas
de molts virus bacterials, injectar el genoma víric dins de la cèl·lula hoste.
Un cop el genoma està introduït a la cèl·lula i pot seguir el cicle, els gens vírics han de ser
descodificats des d’àcid nucleic fins a proteïna vírica. Això requereix de la formació de
mRNA. Diferents tipus de genomes requeriran, com és obvi, diferents mecanismes. Una de
les funcions de l’expressió gènica vírica és permetre a la cèl·lula dur a terme la replicació del
genoma víric.
Finalment, un cop els genomes vírics s’han replicats, les proteïnes de la càpsida han
d’estar presents per formar l’estructura vírica. Sovint es necessita una altre fase de
l’expressió gènica vírica en la qual es generin proteïnes d’scaffolding. Seguida de la formació
de la càpsida, el virus s’hauria d’alliberar.
Gens estructurals i no estructurals.
L’organització espacial dels gens està polaritzada. En el cas dels virus amb RNA de
cadena senzilla, les regions codificants per les proteïnes estructurals es troben agrupades a
l’extrem 5’ del ORF. Les proteïnes no estructurals estan en el 3’. En el cas dels virus de DNA
de doble cadena circular, les regions que codifiquen per proteïnes no estructurals es troben
en la regió més inicial i les proteïnes estructurals estan a la regió més tardana.
El cicle víric. Per convenció en l’estudi del cicle víric, es pren com a punt inicial del mateix la interacció
del virus amb el receptor de la cèl·lula hoste. Aquesta interacció del virió amb la membrana
cel·lular provoca que el virus es quedi unit de forma estable a la cèl·lula. Això deriva en la
fusió de membranes i a la cèl·lula tan sols hi entra la nucleocàpsida. Dins d’aquesta es
produeix el canvi de RNA a DNA de doble cadena (en el cas dels virus com el VIH).
Quan el DNA ja està en doble cadena, una integrasa porta la càpsida a l’exterior del nucli
cel·lular. Aleshores s’integrarà. El genoma víric sortint de la càpsida té unes regions
promotores molt efectives que li permeten generar diferents RNAs a partir d’splicings.
Els diferents RNAs surten del nucli i són traduïts. Les proteïnes resultants són reguladores
de l’expressió gènica de la cèl·lula hoste. Això provoca que els RNAs es desplacin cap a la
Virologia 2020
CEBIO 18
membrana citoplasmàtica. Les proteïnes de membrana víriques s’uneixen a la membrana de
la cèl·lula i les de la càpsida es situen a prop. Aquestes últimes s’acumulen en diversos punts
de la membrana. Mentre es va situant tot a lloc, el genoma s’apropa al punt on estan totes les
proteïnes víriques.
El pas final del cicle víric és la separació de la cèl·lula hoste, moment que es realitza
l’assemblatge final amb totes les proteïnes al voltant de cadascuna de les partícules víriques.
Aleshores comença la fase extracel·lular, aquela en que es troba la partícula vírica com a
virió. En aquest situació, el virus s’adhereix a la cèl·lula i li afegeix DNA, iniciant la fase
intracel·lular.
Durant la fase intracel·lular es poden tenir dos tipus de vies. En la via lisogènica el
genoma del virus s’inclou en el genoma de l’hoste i s’hi manté fins i tot després de replicar-
se. En aquest cas, un canvi en les condicions pot dur a un cicle lític. En aquest cas es
sintetitzen les partícules víriques que generaran la càpsida, n’hi ha un assemblatge i la cèl·lula
es trenca alliberant un munt de partícules víriques.
Multiplicació vírica. Els virus són paràsits estrictes de l’ATP i de la maquinària de síntesi proteica. A més,
la multiplicació vírica, en tant que consisteix en entrar a la cèl·lula, replicar-se i formar les
partícules i després sortir totes de cop, genera una corba de creixement amb 3 fases:
període latent, període d’increment i “explosió”. Aquestes 3 fases sempre estan temporalment
desplaçades amb el que succeeix amb el virus quan està dins de la cèl·lula.
En la multiplicació dels virus, es comença per fer una acumulació de material, és a dir,
comencen a aparèixer còpies del material que serà necessari per fer virions. En aquest
moment els virus han aconseguit fer un shutdown de la cèl·lula tot inhibint un munt de gens i
proteïnes de la mateixa per tal que dediqui els seus recursos tan sols al virus. La sortida
d’aquest pot ser per lisi o per exocitosi. L’exocitosi només la poden fer els virus amb
membrana, però porta una sèrie de complicacions.
Els virus només es mouen si es mou el medi. Per això, la sortida dels virus de les cèl·lules
quan no hi ha lisi cel·lular és complexa. Com que en el temps que triga a sortir el virus és
possible que hi hagi una segona infecció per un virus de la mateixa espècie i per evitar que
sortint de la cèl·lula es repeteixi la infecció, un dels gens de la partícula vírica evita
l’expressió del seu propi receptor de membrana en la cèl·lula hoste.
Existeixen 2 tipus d’infecció que es poden donar arran de l’entrada d’un virus en l’organisme.
La infecció productiva és aquella que, mitjançant una infecció latent, una infecció persistent
o una infecció lítica acaba generant noves partícules víriques que poden seguir infectant altres
cèl·lules. La infecció no productiva és aquella que acaba derivant en una fusió cel·lular o
una transformació a cèl·lula cancerosa i que per això no genera noves partícules víriques.
Expressió seqüencial dels gens vírics Hi ha dos blocs de gens vírics: gens estructurals i gens no estructurals. Aquest dos blocs
s’han d’expressar de manera seqüencial i començant pels no-estructurals. Entre l’expressió
dels no estructurals i els estructurals hi ha la replicació del genoma. Els primers són aquells
que donaran lloc a la càpsida, mentre que els segons no es trobaran expressats a les
partícules víriques. Hi ha virus que generen poliproteïnes per fer les proteïnes
estructurals que després rebran una proteòlisi limitada per generar les proteïnes finals.
Virologia 2020
CEBIO 19
Virus, elements genètics mòbils i éssers vius Es considera que els retrotransposons són agents sub-vírics que es consideren virus en
quant a classificació i nomenclatura. Els estudis filogenètics suggereixen que els
retrotransposons poden ser considerats com a progenitors retrovirals.
Virologia 2020
CEBIO 20
Capítol 2 – Història Vírica Els virus es van definir per primera vegada com a entitats simples, mancades dels
mecanismes necessaris per a la funció metabòlica, que consistien en un sol tipus
d'àcid nucleic encobert en un revestiment proteic. Atès que algunes partícules de virus
poden formar agregats i unir-se entre si per formar un cristall, els virus es van considerar com
a entitats moleculars i no pas com a cel·lulars. Moltes definicions de la vida, basant-se en la
teoria cel·lular, van excloure els virus com a organismes vius.
Però el recent descobriment d'un nou grup d'espècies de virus està desafiant la
classificació d’aquests organismes com a entitats no vives i ha reiniciat debats sobre
la definició de la vida. Aquests virus, designats com a mimivirus, van ser aïllats el 1992 d'una
mostra d'aigua recollida en un sistema d'aire condicionat durant les investigacions d'un brot
de pneumònia a Anglaterra. Al principi es va sospitar d’una etiologia1 bacteriana a causa de
la seva semblança amb cocs grampositius. La microscòpia electrònica del 2003 va revelar
que aquells microorganismes aïllats eren partícules de virus icosaèdrics les dimensions de
les quals rivalitzaven amb les de molts microbis.
Això és perquè els mimivirus són tres vegades més grans que qualsevol virus conegut
en aquell moment i porten genomes d'ADN que consisteixen en 1,2 milions de parells de
bases que codifiquen 1260 gens, 7 dels quals són comuns a tota la vida cel·lular:
eucariotes, bacteris i arqueus.
El genoma d'un parent, els megavirus, es va aïllar més tard d'una mostra marina i es va
demostrar que era un 6,5% més gran que el dels mimivirus. Aquest augment en mida es va
relacionar, inusualment, amb enzims de reparació d'ADN. L'anàlisi posterior d'aquest parent
va suggerir que la complexitat d'aquests virus d'ADN gegants encara no s'ha descobert,
i potser aquests llinatges de virus tan antics com els d'altres microbis a la Terra podrien
contribuir a la reconstrucció de la història evolutiva. Alguns investigadors creuen que els virus
gegants són l'origen del nucli eucariota; d'altres especulen que van ajudar en
l'emergència d'ADN de precursors d'ARN. Tot això són hipòtesis i es necessita molta feina
per entendre l'origen i l'evolució de la vida a la Terra.
D’agent filtrable a paràsit genètic. Bona part de l'atenció inicial dels viròlegs es va centrar en els virus com a agents causants
de malalties. Certament, es van registrar intents de tractament de les infeccions per virus
molt abans que no s'entengués el concepte com a entitat diferent. Cas concret, el
desenvolupament de vacunes i vacunació.
El desenvolupament de la vacuna va començar amb els intents de prevenir infeccions
de la malaltia de la verola el segle XV. El 1796, el metge Edward Jenner va provar la seva
hipòtesi que les secrecions de les ferides que es produïen en les donzelles encarregades de
munyir les vaques contenien material que podia protegir contra la verola, una malaltia
contagiosa aguda causada pel Variola virus. La seva hipòtesi es basava en l'observació que
les donzelles de llet rarament contreien l'erupció que apareix a la cara i el cos d'una
persona infectada. En lloc d'això, sovint desenvolupaven pústules a les mans, que després
es va demostrar que eren causades pel virus estretament relacionat: la Cowpox. Un mètode
d'infecció intencionada s’havia utilitzat abans a la Xina i al Pròxim Orient els segles XV i XVI,
ja que es van adonar que els individus que van sobreviure a la malaltia eren immunes a
infeccions posteriors. La pràctica, anomenada variolació, consistia en l'aplicació de
1 Etiologia: Branca de la medicina que estudia les causes de les malalties.
Virologia 2020
CEBIO 21
secrecions de les pústules a rascades superficials al braç o a la cama d'una persona
desinfectada, de vegades amb conseqüències greus i no de la infecció lleu que s'esperava.
Gairebé un segle després, el químic i microbiòleg francès Louis Pasteur, en homenatge al
descobriment de Jenner, va encunyar el terme vacunació per referir-se a l'ús d'un patogen
debilitat per defensar-se de malalties infeccioses. Amb el jove metge Emil Roux, Pasteur
va desenvolupar una vacuna contra la ràbia i tècniques per atenuar els materials que utilitzava
per a les seves vacunes vives.
El virus de la ràbia (Rabies lyssavirus) causa una infecció aguda del sistema nerviós central.
En els humans, la infecció es caracteritza per un període neurològic, coma i mort. Quan els
signes de la ràbia es fan evidents, la malaltia gairebé sempre és fatal. La vacuna de Pasteur
es va elaborar a partir de teixits secs de medul·la recollits de conills que havien mort
per la infecció. El material, inicialment provat en gossos, es va administrar a un jove que
havia estat mossegat per un gos rabiós mort posteriorment. Va rebre múltiples dosis de la
vacuna i va sobreviure no només a les ferides de l'atac, sinó també a la vacuna
experimental. Pasteur, ja un científic respectat, va ser elevat al nivell d'un ídol, però mai va
intentar identificar l'agent parasitari responsable de la malaltia. Altres després de Pasteur,
com Mayer, Ivanovsky, Beijerinck, Loeffler, Frosch i Reed, van demostrar que els agents
infecciosos més petits que els bacteris estaven associats amb moltes de les malalties
persistents en aquell moment. Això va obrir la porta a una disciplina separada, la de la
virologia, que després va contribuir a una millor comprensió dels processos més complexos
de la vida.
A Pasteur també se li atribueix l'acceptació a la teoria germinal de la malaltia que afirma
que algunes malalties són causades per agents parasitaris. Abans del segle XIX, la
malaltia es considerava com una intervenció i un càstig divins o el resultat d'olors nocives.
Amb el treball de Pasteur i el desenvolupament de tècniques microscòpiques del metge i
microbiòleg alemany Robert Koch, els microorganismes es van fer visibles i identificables,
donant credibilitat a la teoria germinal de la malaltia. El 1840 Jacob Henle, el mentor de Koch,
va proposar que les malalties infeccioses eren causades per organismes vius capaços
de reproduir-se fora de la persona infectada. Koch va aïllar el bacteri responsable de la
tuberculosi i a partir d'aquest es van desenvolupar quatre criteris per a la identificació de
l'agent causant d'una malaltia:
Les primeres proves que van demostrar l'existència de virus provenien d'experiments posats
en pràctica per complir els postulats de Koch i determinar la causa d'una malaltia que plagava
el tabac. El 1879, Adolf Mayer, el director de l'Estació Experimental Agrícola de Wageningen,
Holanda, va iniciar els treballs sobre la malaltia del mosaic del tabac. Va descriure que "el
mal causat per aquesta malaltia és sovint molt gran i ha provocat que el cultiu de tabac es
perdi completament" als Països Baixos i algunes parts d'Alemanya.
L'organisme hauria d'estar constantment present en els animals que pateixin la malaltia i no hauria d'estar present en individus sans.
L'organisme s'ha de poder cultivar en un cultiu pur lluny del cos de l'animal.
Un cultiu pur, en inocular-se en animals susceptibles, hauria d'iniciar els símptomes característics de la malaltia.
L'organisme hauria de ser aïllat de nou d'aquests animals experimentals i ser cultivat un altre cop al laboratori, havent de ser el mateix que el de l'organisme original.
Virologia 2020
CEBIO 22
Per intentar seguir els postulats de Koch, Mayer va utilitzar saba extreta de plantes de
tabac malalt com a inòcul per infectar plantes de tabac saludables. Va tenir èxit a la
reproducció de la malaltia original i, posteriorment, va realitzar un estudi microbiològic per
identificar l'agent causant tot examinant microscòpicament les mostres de plantes malaltes.
En aquest procediment, les mostres es passaven per paper de filtre i posteriorment eren
cultivades sobre un medi ideat per al creixement de bacteris. Cap d'aquestes proves va
tenir èxit en identificar o aïllar l'agent etiològic. No obstant això, Mayer va concloure que
l'agent era un bacteri que probablement havia perdut activitat després de la filtració. Dmitri
Ivanovsky, un botànic rus, i Martinus Beijerinck, un microbiòleg del sòl, van realitzar més
investigacions sobre la relació entre aquest agent etiològic i la malaltia del tabac.
El 1890, Dmitri Ivanovsky va rebre l'encàrrec d'estudiar la malaltia del mosaic que destruïa
les plantes de tabac a Crimea. Igual que va fer Mayer, Ivanovsky va demostrar que la saba
del tabac malalt continuava infectant les plantes de tabac saludables després de la
filtració. Observacions similars es van obtenir quan es va utilitzar un filtrat derivat de filtres
de porcellana per inocular plantes de tabac saludables. Aquests filtres es van inventar als
segles XIX i principis del XX per retenir els bacteris i depurar l'aigua i altres líquids. Ivanovsky
també va afirmar que era impossible cultivar l’organisme en cultius purs. Va arribar a la
conclusió, doncs, que l'agent patogen era un bacteri minúscul i incultivable. Beijerinck, per la
seva banda, va proposar una idea revolucionària basada en tres observacions: l'agent es
podia precipitar per alcohol, es podia difondre a través d'un medi d'agar sòlid i no es podia
reproduir fora d'un hoste. A continuació, Beijerinck va plantejar que l'agent filtrable era un
tipus únic de patogen i va encunyar el terme contagium vivum fluidum per transmetre el seu
concepte d'un nou tipus d'agent infecciós que existeix en un estat fluid i no cel·lular.
Posteriorment es van reconèixer agents filtrables similars massa petits per ser observats
per microscòpia de llum visible, però capaços de causar malalties en animals. Els deixebles
de Koch, Friedrich Loeffler i Paul Frosch, van aïllar el primer agent associat a una
malaltia extremadament contagiosa d'uns animals el 1898. Posteriorment es va designar
que l’agent filtrable de la febre aftosa no es podia cultivar en un medi utilitzat per al cultiu de
patògens bacterians malgrat haver comprovat, per dilució, que era un agent infecciós. El
1901, Walter Reed i el seu equip van aïllar el primer agent filtrable d’humans, el virus
de la febre groga2.
Al mateix temps, es va proposar un enllaç entre agents filtrables o lliures de cèl·lules i el
càncer. Dos científics danesos, Vilhelm Ellerman i Oluf Bang, van utilitzar amb èxit un filtrat
sense cèl·lules de pollastres amb eritroblastosi aviària per transmetre la malaltia a gallines
sanes. De la mateixa manera, tres anys després als Estats Units, Peyton Rous va demostrar
que un agent filtrable extret d'un sarcoma en pollastres era infecciós.
Aquestes troballes, però, no es van reconèixer fins que es va revifar l'interès per la participació
d'agents filtrables en patogènesi tumoral uns vint anys després amb el descobriment d'agents
responsables dels tumors múrids3.
Finalment, el 1964, el primer agent filtrable relacionat amb el càncer humà va ser
descobert pels científics del Regne Unit Anthony Epstein i Yvonne Barr: el virus Epstein-
Barr, conegut com a herpesvirus i derivat del teixit de limfoma africà de Burkitt. Anys més tard,
2 La febre groga és una febre hemorràgica de transmissió viral transmesa per mosquits amb una elevada taxa de mortalitat. És endèmic de les regions tropicals d'Amèrica del Sud i l'Àfrica subsahariana. 3 Múrid: Família de mamífers rosegadors, amb el musell punxegut i el llavi superior partit, que comprèn les rates i els ratolins.
Virologia 2020
CEBIO 23
es va apreciar que la infecció en general no és suficient per al càncer, i els esdeveniments
addicionals i factors dels hostes, com ara immunosupressió, mutacions somàtiques,
predisposició genètica i exposició a cancerígens també tenen un paper en el
desenvolupament de càncers.
Paral·lelament, dues investigacions independents van comportar el descobriment d'agents
filtrables que infecten bacteris, confirmant que tots els organismes poden albergar
aquests agents. Mentre tractava de cultivar el bacteri Staphylococcus aureus, Frederick
Twort, un bacteriòleg mèdic anglès, va assenyalar el desenvolupament de petites zones
clares que, en investigacions posteriors, es va trobar que representen zones de bacteris
lisats. Twort no va continuar, però dos anys després se’n va fer una explicació per part de
Félix d'Herelle, un microbiòleg franc-canadenc de l'Institut Pasteur de París.
Els estudis de 1911 d'Herelle sobre la causa de la disenteria4 en poblacions de llagostes a
Mèxic van conduir a la detecció d'un bacteri com a agent causal. Com Twort, d'Herelle va
observar petites i clares regions de bacteris lisats durant els seus intents de cultiu del bacteri.
Durant investigacions posteriors amb disenteria humana el 1917, d'Herelle va observar que
el cultiu bacterià quedava completament destruït si el feia a partir de barrejar un filtrat
de les zones clares amb un cultiu de bacteris de disenteria i va atribuir el fenomen a un
agent desconegut. I va nomenar l'agent desconegut del filtrat com un bacteriòfag o "menjador
de bacteris". A principis del segle XX, el concepte de virus estava fermament establert, tot i
que en termes negatius: es van associar amb moltes malalties, no es podien veure, no es
podien conrear en absència de cèl·lules i no es van retenir per filtres a prova de bacteris.
El concepte de Beijerinck sobre el contagium vivum fluidum va ser pràcticament oblidat fins
al 1935, quan Wendell Stanley va investigar sobre la cristal·lització del virus del mosaic
del tabac (TMV). La cristal·lització del TMV va suggerir a Stanley que aquest era una proteïna
pura amb una estructura regular. Stanley va demostrar més tard que el virus, aparentment
sense vida en una forma cristal·litzada, es multiplicava quan es dissolia i es re-introduïa
a les plantes de tabac. Aquesta va ser una troballa impactant que va desdibuixar les línies
entre els organismes vius estudiats pels biòlegs i les molècules no vives estudiades pels
químics. Encara més sorprenent va ser el descobriment de dos científics britànics, el patòleg
vegetal Frederick Bawden i el bioquímic i viròleg Norman Pirie. Bawden i Pirie, el 1936, van
demostrar que el TMV no era una proteïna pura, sinó que contenia al voltant d'un 6% d'àcids
ribonucleics (ARN), el que indicava que un virus és més complex que un simple producte
químic, encara que no sigui un organisme complet. John Bernal i Isidor Fankuchen van
"visualitzar" el virus per primera vegada mitjançant la cristal·lografia de raigs X el 1941. I la
primera partícula de virus (virió) mai visualitzada (i fotografiada) mitjançant una microscòpia
electrònica va ser realitzada més tard per Helmuth Ruska el 1940.
La cristal·lització del TMV de Stanley va suposar el començament d'una comprensió de
l'organització molecular dels virus. Els virus, per la seva naturalesa, són entitats bioquímiques
constituïdes per dos elements principals i un "pla corporal" comú format per una gran quantitat
de subunitats proteiques i altres components reunits per formar estructures reproduïbles
simètriques i que protegeixen el genoma (ADN o ARN). Els virus es poden classificar com
allargats o esfèrics, amb les proteïnes de la càpsida de virus allargats disposades amb
simetria helicoidal al voltant de l'àcid nucleic i les càpsides de la majoria dels virus esfèrics
disposades amb simetria icosaèdrica. Els principis de l'enginyeria natural utilitzada durant
la formació d'un virus són omnipresents en biologia. Junts, els primers estudis amb
4 Disenteria: Malaltia que es manifesta per gran dolor i constricció a l’esfínter i l’expulsió de nombroses deposicions, poc abundants, amb sang i moc, acompanyades de febre, malestar general i desgana.
Virologia 2020
CEBIO 24
bacteriòfags, mètodes de cultiu cel·lular, avenços tecnològics en la seqüenciació d'ADN i el
desenvolupament de la reacció en cadena de la polimerasa; van contribuir a la realització d'un
ventall de mides del genoma viral que abasta tres ordres de magnitud. A principis dels
anys setanta, la classificació de Baltimore va reconèixer set tipus de genomes d'àcid nucleic
i set estratègies de replicació dins de les cèl·lules infectades. A partir d'això es va apreciar
que els virus depenen totalment de les cèl·lules per multiplicar i explotar totes les possibles
conversions d'ADN i ARN. Els virus són paràsits genètics.
L’erradicació de la verola i el risc de la re-emergència. L’espècie humana porta molt de temps en contacte amb els virus. Un d’ells n’és el de la
verola, present en els egipcis i declarada, des del 1980, erradicada. La fase d’incubació
d’aquest virus dura aproximadament uns 12 dies. Durant la part inicial d’aquesta fase, el virus
és transportat a la saliva, la qual pot ser una font de petites quantitats de partícules víriques.
Després del període d’incubació, el pacient entra en la fase simptomàtica de la malaltia.
Durant la part inicial de la fase simptomàtica, grans quantitats de virus es troben presents a
la saliva, i la persona infectada pot transmetre el virus en gotes de saliva en contactes
cara a cara amb altres persones. La fase simptomàtica dura entre 3 i 5 setmanes. Grans
quantitats de virus infecciosos es poden trobar en les pústules trencades i d’aquestes cauen
virus.
El virus de la verola rep el nom científic de Variola virus, de la família dels Orthopoxvirus del
grup dels Poxviridae. Té un genoma de DNA de doble cadena que es replica al citoplasma,
té una taxa de letalitat d’entre el 30 i el 40%, no té cap tractament específic i la seva manera
de prevenció és la vacuna.
Història de la Verola.
Originada abans del 400 abans de Crist, la verola ha afectat a poblacions humanes. El
virus, membre de la família Poxviridae, sembla haver-se originat a l’Àsia i haver-se desplaçat
fins a l’Àfrica, l’Orient mitjà i el món occidental entre el 800 i el 1000 després de Crist. El virus
es va portar al “Nou món” per exploradors i colonitzadors espanyols i d’altres nacions
europees, el que va resultar en la mort de centenars de milers de persones indígenes de
Nord i Sud-Amèrica. En alguns casos, com al carib, totes les poblacions nadiues van
desaparèixer. Variola major, la forma més seriosa de la verola, tenia una mortalitat d’entre el
30 i el 40%. En contrast, la Variola menor, una forma menys severa de la verola, tan sols va
matar entre un 1 i un 5% dels infectats.
La variolació
La variolació era un procediment tradicional a la xina on s’infectava deliberadament amb el
virus per inhalació de crostes mortes de lesions de verola. Aquest procediment, que no
era una vacuna, es feia amb tan poques partícules víriques que s’afegien en els pols que
imposaven a la gent que el sistema immunitari era capaç de combatre’l i això reduïa la
mortalitat a un 2% pràcticament a expenses d’estendre la malaltia. El 1718, Lady Mary
Wortley Montagu, esposa de l’ambaixador britànic a la xina, va importar el procediment tot i
que, enlloc d’inhalar-ho, l’injectava sota la pell.
La primera Vacuna contra la verola
Edward Jenner, un metge del segle XVI, va observar que les lleteres tenien infeccions de
cowpox a les seves mans, però que no tenien cap de les desfiguracions que provocava la
verola. El 14 de maig de 1796 va decidir realitzar un experiment en el qual va prendre pus de
les pústules de cowpox d’una de les lleteres i la va injectar sota la pell d’un noi orfe. Aquest
noi va desenvolupar febre i una lesió similar a la que provoca la cowpox, però se’n va curar.
Virologia 2020
CEBIO 25
Jenner, al cap de dues setmanes, va infectar el nen amb la verola i el noi va sobreviure.
Va ser la primera vacuna.
Actualment, la vacuna prové d’aquest virus menys mortal que s’ha atenuat. Com que és
diferent de l’original, el seu nom és vaccinia virus. Per atenuar-lo, es fa passar per diversos
cultius cel·lulars a diferents temps en cadascun, desestabilitzant-lo. El cultiu cel·lular original
es va fer passant la malaltia entre diversos nens que es van carregar al mateix vaixell. El nom
de vacuna no s’aplicava sobre aquests experiments de Jenner, va ser Pasteur qui ho va
denominar així.
La verola és un dels agents bioterroristes de categoria A. Això es deu a diversos factors
d’entre els que trobem que la població humana no ha esta vacunada d’aquesta malaltia en
els últims 40 anys. existeixen al menys dos stocks declarats en tot el món i, des dels atacs
terroristes de l’11S, els Estats Units han llençat un programa per obtenir suficient vacuna de
la verola per vacunar a tothom dins dels EEUU en cas d’una emergència de verola.
Aspectes clínics de la virologia i de la biotecnologia. El bioterrorisme és considerat l’ús d’armes biològiques per causar la malaltia o mort de
humans, animals o plantes. El bioterrorisme rep la classificació d’esdeveniment poc
probable però d’altes conseqüències. L’afectació d’un atac bioterrorista pot ser tant a individus
exposats com a individus no exposats. El primer cas seria el que provocarien agents no
replicatius com les toxines mentre que el segon és el que produirien els agents replicatius
com els bacteris o els virus.
La verola no és l’únic agent infecciós que està determinat com a element bioterrorista de tipus
A, n’existeixen altres. Entre aquests hi trobem l’Àntrax, el Botulisme, la Plaga, la Tularèmia, i
algunes febres hemorràgiques víriques. Els criteris que estableixen si un agent és de la
categoria A o no són els següents:
Els dos atacs més plausibles són el de les espores d’àntrax i el virus de la verola. Així
i tot, cada país té desplegat un programa contra el bioterrorisme de tipus A com el de la
Verola. En aquest cas concret, està tot organitzat per grups de població. També per barris.
Dins de cada zona hi hauria una sèrie de responsables encarregats de gestionar la
societat un cop exposada al virus. Aquest pla que tenen els Estats Units també en té un de
corresponent a Catalunya, on n’hi ha un altre contra l’àntrax. A tot arreu una part del pla
consisteix en entrenar al personal sanitari per reaccionar davant un atac d’aquestes
característiques.
Però no tots els problemes que poden sorgir són fruit d’un atac bioterrorista. Els plans de
resposta també poden ser útils per protegir la població en els casos de fuites i accidents.
Accidents que ja han passat amb la Verola i amb l’àntrax, on s’han arribat a detectar vials no
Es pot disseminar o transmetre de persona a persona de manera fàcil.
Resulta en una alta taxa de mortalitat i té potencial per tenir un fort impacte en la salut pública.
Pot provocar pànic i desestabilització social.
Requereix una preparació especial per part dels serveis de salut.
Virologia 2020
CEBIO 26
declarats o infeccions accidentals. Paral·lelament, als laboratoris oficials declarats, existeixen
unitats militars que disposen dels dos virus que, per accident, també es podrien “escapar”.
Des de fa poc temps es considera que hi ha una nova malaltia emergent i que és una
epidèmia: la monkeypox. Aquesta malaltia és un tipus de virus de la verola de primats
que està causant brots concrets de transmissió a humans. Aquests casos de monkeypox
es donen sobretot a zones d’Àfrica, principalment a la república democràtica del Congo.
Aquesta malaltia es considera emergent perquè les comunitats que contacten amb aquests
animals no estan protegides contra el virus. Com que cada cop es tendeix a agrupar-nos, la
relació persona-persona és més freqüent que abans i augmenta el risc de transmissió.
Paral·lelament, es pot entendre que, d’alguna manera, es pressiona a la natura i això provoca
que els ecosistemes on els virus estan com a reservori estiguin més en contacte amb l’espècie
humana.
Virologia 2020
CEBIO 27
Capítol 3 - Multiplicació vírica
Introducció Una de les característiques principals dels virus és la seva dependència de les cèl·lules
vives per a la seva replicació i propagació. Per si sols, els virus no disposen de la
maquinària completa necessària per a moltes funcions essencials que mantenen la vida. La
infecció d'una cèl·lula hoste i la propagació viral depenen de la transcripció de l'ARNm viral i,
al seu torn, de la traducció de proteïnes víriques i de la replicació del genoma.
Infecció Fàgica
El patró bàsic de replicació del virus comença amb el virus interactuant específicament
amb la superfície de la cèl·lula hoste i injectant el genoma viral al citoplasma. Això
implica un reconeixement específic entre proteïnes de la superfície del virus i proteïnes
específiques de la superfície cel·lular anomenades receptors. Introduït el genoma, comença
la infecció. El procés de replicació vírica dins d’una sola cèl·lula fins el moment d’alliberació
de les partícules víriques formades es coneix com a període latent. Aquest es separa en
dues fases: període d’eclipsi i període d’acumulació intracel·lular. L’anàlisi d’una infecció per
part d’un bacteriòfag permet analitzar de manera molt precisa l’existència d’aquestes fases.
El període d’eclipsi és aquell que es dona des de l’adhesió del virus a la superfície del
bacteri i dura entre 10 i 12 minuts. El període d’eclipsi té 2 subetapes. En la primera, que
succeeix uns 2 minuts després de la infecció, hi ha algunes càpsides que encara estan
interaccionant amb la cèl·lula mentre que altres ja han introduït el seu material genètic dins el
bacteri. En aquests 2 minuts el contingut cel·lular ha canviat de distribució, el que es
pot comprovar mitjançant un estudi de l’electrodensitat de l’interior del bacteri.
Inicialment, la zona central del bacteri era poc electrodensa mentre que la part més externa
ho era molt. Passats 2 minuts, les electrodensitats s’inverteixen i la zona central en té més
que la perifèrica. El contingut cel·lular retorna al seu estat original als 8 minuts des de
la infecció. Al cap de 12 minuts des de l’inici de la infecció és quan es comencen a veure
partícules “estranyes” dins del cos del bacteri. Finalment, al cap de 30 minuts de la infecció,
les partícules s’acumulen densament en l’interior del bacteri durant el que s’anomena
període d’acumulació intracel·lular. Al final d’aquest, s’alliberen les partícules víriques al
medi. Sol portar un temps per detectar partícules víriques a la cèl·lula després de la
multiplicació.
El temps que passa des de la primera
fase (període d’eclipsi) fins finalitzar la
segona (període d’acumulació
intracel·lular) és el període de latència.
La comprovació de l’existència del
període de latència és demostrable
mitjançant l’anomenat single-burst
experiment. En aquesta prova
s’analitzen les unitats formadores
de calbes per mil·lilitre al llarg del
temps. El que es pot observar és el
següent cicle:
En aquest experiment es recull només la fracció sobrenedant del cultiu centrifugat, el que ens
indica la quantitat de partícules víriques alliberades. Es pot observar en el diagrama resultant
que durant el període de latència no hi ha un augment de partícules víriques al medi.
En canvi, quan hi ha l’explosió (burst) és quan augmenten exponencialment les partícules
Latència Burst Burst
Burst
Size
Virologia 2020
CEBIO 28
víriques que hi ha al medi de cultiu. Un cop s’ha donat aquest burst es torna a estabilitzar la
quantitat de partícules víriques del medi en un nou període de latència.
També es pot fer un diagrama de la corba de multiplicació del virus en concret. Per fer-
ho, cal posar en contacte el virus i l’hoste durant uns dos minuts, permetent la infecció.
Després d’inutilitzar els virions lliures del medi, es recuperen només les cèl·lules i es
resuspenen en una gran quantitat de volum per evitar una possible reinfecció dels virus
descendents. Es deixa que es recuperin a 37ºC. Just aleshores es pren una mostra i se’n
determina la concentració de cèl·lules productives. La resta de mostres es van prenent al
llarg del temps i es separen en dos tipus. En el primer trenquem les cèl·lules i mesurem la
quantitat de virus que tenim dins en cada moment. En el segons centrifuguem per obtenir
només els virus que es troben en el sobrenedant. D’aquesta manera obtenim la quantitat de
partícules víriques intracel·lulars i les extracel·lulars.
Aquesta corba de multiplicació, quan es fa sobre virus animals de DNA o de RNA, es veu una
principal diferència: els virus que repliquen en el nucli tenen uns períodes d’eclipsi més
llargs. En son una excepció les famílies Orthomyxoviridae i Herpesviridae. Això és perquè a
la majoria dels virus que fan infecció al nucli els costa molt multiplicar-se. Els retrovirus
necessiten molt de temps per dur a terme la replicació, ja que han d’anar al nucli una vegada
s’ha retrotranscrit el RNA a DNA.
El cicle infecciós
En el cas de les cèl·lules eucariotes animals, el cicle infecciós consta de 8 passos.
Començant per un virió lliure al medi i amb capacitat d’infecció, el primer pas és unir-se a la
cèl·lula hoste. Podria ser que aquesta unió fos substituïda per una adsorció, cas que es
dona en virus amb membrana. Un cop unit a la cèl·lula, el virus s’hi internalitza. Aquesta
internalització pot ser per una entrada o per una penetració. Dins de la cèl·lula hoste infectada,
el virus es despulla perdent la càpsida que protegeix el DNA. Això és perquè ja ha arribat al
punt d’infecció de la cèl·lula, és a dir, l’orgànul o espai on ha d’alliberar el seu material genètic.
Perduda la càpsida, el virus mostra el seu genoma i comença a expressar els seus gens
primaris. Aquests provoquen una replicació del genoma, el qual comença a expressar els
seus gens tardans. Gràcies als mateixos, la cèl·lula començarà a fabricar les càpsides i els
elements de les partícules víriques, les quals es començaran a formar i a sortir de la
cèl·lula infectada.
Anàlisi del medi
Disrupció cel·lular
Presa de mostres
Anàlisi de cèl·lules
Resuspensió en molt de medi
Inutilitzar virions del medi
Infecció de l’hoste durant 2’
Virologia 2020
CEBIO 29
Reconeixement Cel·lular Els virus, un cop han sortit de la cèl·lula de la que s’han aprofitat, es mouen lliures pel medi
buscant una nova cèl·lula que infectar. Per trobar-la, han de reconèixer quines estan
disponibles i quines són del mateix estil que les que ells poden infectar. Això ho
aconsegueixen fer perquè els virus fan servir receptors cel·lulars.
Qualsevol molècula que es trobi en la superfície cel·lular pot ser reconeguda pels virus,
pel que totes elles seran considerades (des del punt de vista de la infecció), uns receptors
cel·lulars. També són capaços de reconèixer modificacions d’aquestes molècules. Un cas on
passa això és amb els virus de la grip, que poden reconèixer àcid siàlic i transportadors. Els
virus, a més, pot ser que s’uneixin a diferents receptors cel·lulars de la mateixa manera que
una sola proteïna cel·lular pot ser considerada com a receptor per múltiples virus. En
el cas dels virus amb membrana, la unió es dona mitjançant les seves glicoproteïnes TM. En
el cas dels virus sense membrana, la unió és per la superfície o projeccions de la càpsida. La
unió al receptor és una interacció que no té cap altre finalitat més enllà d’unir-se. Així i
tot, la unió sol inhibir el receptor. El fet que una cèl·lula tingui un receptor concret no vol dir
que la cèl·lula pugui aguantar el cicle de replicació del virus.
El VIH s’uneix a CD4, tot i que necessita d’un coreceptor com CXCR4 com CCR-5. Com que
els receptors són molt específics, la cèl·lula on es troben també ho és. Només els trobem en
limfòcits i macròfags. Altres virus reconeixen receptors que es troben a totes les
cèl·lules, però la seva infecció s’acaba concentrant en unes concretes per la facilitat
d’accés i transmissió. El Rinovirus, per exemple, malgrat podria infectar totes les cèl·lules
del cos humà, només s’expressa en el tracte respiratori perquè és la seva via d’entrada. Per
tant, en l’estudi de la interacció virus-hoste és important saber tant el receptor com la
via d’entrada i les cèl·lules susceptibles de ser infectades. En el cas de la grip, on el
receptor és l’àcid siàlic, es podrien infectar quasi totes les cèl·lules. Així i tot, només realitza
el seu cicle a les cèl·lules del tracte respiratori superior perquè entra per inhalació i perquè
aquestes cèl·lules tenen una proteasa específica imprescindible per a l’entrada del virus. La
majoria dels virus han evolucionat mecanismes per evitar unir-se a la mateixa cèl·lula
de la que han sortit. El virus Influenza, per exemple, codifica per una neuraminidasa mentre
que el VIH desregula el seu receptor CD4.
Unió a la cèl·lula hoste
Internalització del virus
Despullat del virus
Alliberament del genoma
Replicació del genoma
Producció elements del
virió
Sortida de la cèl·lula
infectada
Virologia 2020
CEBIO 30
Les primeres interaccions entre els receptors cel·lulars i els virus involucren forces
electroestàtiques, mentre que la unió d’alta afinitat es basa en forces hidrofòbiques i ponts
d’hidrogen. Les proteïnes d’interacció víriques interactuen amb el receptor o receptors de la
cèl·lula iniciant l’entrada de la partícula vírica. Aquesta interacció molecular pot induir un canvi
conformacional en les proteïnes víriques necessari pel següent pas en el cicle infecciós. El
virió no és capaç de produir ATP, però col·lecta energia conformacional que només es fa
servir quan es donen les interaccions correctes.
En el cas dels retrovirus, i de manera general, la fusió és mitjançant la glicoproteïna de la
seva membrana. Aquesta glicoproteïna està composta per dues subunitats. Una és la Unitat
de Superfície (SU) i l’altre és un domini TransMembrana (TM). SU conté el punt d’unió del
receptor, i TM conté el pèptid de fusió i el segment víric de membrane-spanning. El pèptid de
fusió es troba amagat prop de la superfície de la membrana. Quan SU s’uneix al receptor
cel·lular, es transmeten canvis conformacionals a TM, que exposa el pèptid de fusió.
En el cas del procés de fusió de les membranes quan hi ha infecció per VIH, la unió de SU a
CD4 provoca un canvi conformacional en la proteïna de la superfície del virus que es transmet
a la TM gp41. Aquest canvi conformacional exposa el pèptid d’unió, que s’uneix a la
membrana de la cèl·lula hoste. La interacció apropa les dos membranes fins a una distància
que permet la fusió física entre elles. S’ha comprovat que, a part d’aquesta interacció amb la
gp120, és necessari que hi hagi un altre coreceptor per tal que es pugui fer el canvi
conformacional en la proteïna TM.
Tots els virus excepte els de les plantes tenen proteïnes d’unió víriques a la seva
superfície per tal d’interactuar amb el receptor cel·lular. A més, virus de diferents famílies
poden fer servir el mateix receptor, com passa amb les famílies influenzavirus i rotavirus.
També pot ser que alguns virus s’uneixin a més d’un receptor, com en el cas del VIH o de
l’ebolavirus. Això, en la majoria dels casos, permet saber el rang d’hostes disponibles segons
els receptors cel·lulars, però aquests no són els únics determinants.
Identificació de receptors vírics en cèl·lules.
Existeixen dues maneres de detectar si una cèl·lula presenta receptors vírics. La primera és
la transferència gènica, la qual consisteix en una transformació mitjançant DNA i tecnologies
de clonatge molecular. En el procediment s’introdueixen fragments coneguts de DNA de
cèl·lules susceptibles a la infecció a cèl·lules no susceptibles. Els clons positius s’identifiquen
per l’ús d’anticossos específics pel receptor codificat pels gens transferits o per la unió de
virus fluorescents. Aquest sistema de selecció també s’anomena cell sorting.
L’altre mètode per detectar si una cèl·lula presenta receptors vírics és la inhibició. Existeixen
tres versions d’aquest mètode. En la primera es fan servir enzims per eliminar els receptors
cel·lulars. En aquest mètode, es seqüència el virus i s’hi busca proteïnes de superfície de
les que se’n sàpiga possibles interaccions o afinitats. Un cop identificades, s’elimina la
molècula potencialment receptora d’un cultiu cel·lular i es mira si els virus la infecten. Un
exemple de l’aplicació d’aquest mètode seria si s’identifiqués un virus amb la proteïna
hemaglutinina, que mostra afinitat per l’àcid siàlic. Incubant les cèl·lules del cultiu amb
neuramidasa, que elimina l’àcid siàlic, es pot provar de fer una infecció amb el virus. Si el
virus estudiat fos l’Influenza, aquest no s’hi uniria al fer servir l’àcid siàlic com a receptor.
L’altre versió és la detecció de receptors mitjançant mètodes proteòmics. En aquesta, es
pot marcar amb fluorescència un xip in s’identifiquin proteïnes en diferents punts i la interacció
entre el virus i aquestes.
Virologia 2020
CEBIO 31
Finalment, la tercera versió és la que fa servir anticossos monoclonals. En aquest mètode,
les línies cel·lulars del hibridoma que bloquegen la unió del virus secreten anticossos que es
fan servir per purificar el receptor per immunoprecipitació o per cromatografia d’afinitat.
Altrament, es poden subministrar col·leccions àmplies d’anticossos a diferents pous d’ELISA
amb cèl·lules i mirar en quins no es dona la infecció.
Internalització.
Translocació de virus nus.
Els virus sense envolta s’internalitzen per endocitosi, un mecanisme que les cèl·lules
fan servir per la incorporació de macromolècules que es troben en el medi
extracel·lular. Cal fer la endocitosi perquè no es pot donar una fusió de membranes. En
animals és un procés específic i es realitza a través d’un receptor que provoca la formació de
vesícules i l’alliberament d’endosomes dins el citoplasma. L’endocitosi pot ser de diferents
tipus, com l’endocitosi mediada per clatrina, la mediada per caveola, la lípid-raft o la
macropinocitosi.
Un dels organismes que realitza la primera de les quatre, l’endocitosi mediada per clatrina,
és el Rhinovirus. En aquest cas, la vesícula endocítica es forma com a conseqüència d’una
estreta associació entre el complex receptor del Rhinovirus i la membrana plasmàtica. També
es produeix gràcies a l’acumulació de clatrina a la cèl·lula, que inicia la formació de
l’endosoma. Aquesta vesícula, un cop s’ha acabat de formar, s’acidifica i pateix canvis
conformacionals. Això provoca una degradació parcial del virió que forma porus i permet
l’alliberació del genoma de la càpsida, el que indueix una potencial expressió dels antígens
processats.
Un altre virus nuu que també entra a la cèl·lula és el Poliovirus, el causant de la pòlio. Per
entrar, el virió natiu (160S) s’uneix al seu receptor cel·lular Pvr i, a temperatures superiors a
33ºC, realitza una transició conformacional que resulta en la formació de partícules
alterades. Les partícules alterades han perdut la proteïna vírica interna VP4, i l’extrem N-
terminal hidrofòbic de la VP1 és desplaçat a la superfície del virió malgrat ser normalment
interna. La partícula alterada potser és un intermediari del desembolcallament del RNA
víric. No es coneix si el RNA víric abandona la càpsida a la membrana plasmàtica o des dels
endosomes. Un cop el poliovirus ha interaccionat amb la membrana, s’hi forma un porus.
Aquest procés s’inicia amb la interacció del virus amb Pvr, el que porta a la formació de
partícules alterades amb l’extrem N-terminal hidrofòbic de VP1 exposades. Aquests extrems
pot ser que formin un porus a la membrana de la cèl·lula a través del qual s’allibera el RNA
de la càpsida al citosol.
Per tant, el que passa és que el Poliovirus o Picornavirus és reconegut per PVR. Després
d’aquest reconeixement hi ha un canvi conformacional on es perd VP4 i on s’exposa el domini
hidrofòbic de VP1. Seguidament es forma un porus i s’allibera el RNA, el qual es troba unit
covalentment a VPG pel seu extrem 5’. VPG és una proteïna de 22 aminoàcids que guia el
RNA a través del porus format per VP1.
És interessant saber que la majoria dels virus nuus indueixen a la lisi endosomal, com fa
l’Adenovirus.
Virus amb membrana.
Els virus amb membrana tenen una dificultat afegida per ser internalitzats, ja que hi ha una
capa extra que els obliga a fer una fusió de membranes en el moment de la interacció amb
el receptor cel·lular. Aquesta interacció afavoreix canvis conformacionals per a realitzar la
fusió. Les glicoproteïnes associades a la membrana poden interactuar amb receptors
Virologia 2020
CEBIO 32
cel·lulars per iniciar una fusió entre la membrana vírica i la membrana plasmàtica o poden
induir l’endocitosi.
En el cas dels Retrovirus hi ha una interacció amb el receptor de membrana, el que porta a
una posterior fusió entre aquesta i la de la cèl·lula hoste. Aquesta fusió permet l’alliberament
de la nucleocàpsida directament al citoplasma. El RNA, un cop s’ha retrotranscrit a DNA, entra
dins del nucli de la cèl·lula.
En el cas del VIH, un cop hi ha la unió de gp120 a CD4 i al coreceptor, gp41 exposa el pèptid
de fusió i es dona la fusió de l’embolcall del virus i la membrana de la cèl·lula. En aquest virus
l’entrada i la pèrdua de càpsida són processos simultanis.
Hi ha casos on no es pot fer una fusió i cal formar endosomes, ja que els virus necessiten
d’un canvi en l’ambient per poder alliberar el seu material genètic. És el que els passa als
Influenzavirus. Aquests virus requereixen d’una disminució del pH i de l’acció de les proteases
per desfer la càpsida. Per aconseguir-ho, aprofiten que l’hemaglutinina (HA) s’uneix a l’àcid
siàlic i això provoca que la vesícula endocítica on es troben es fusioni amb els lisosomes. El
baix pH d’aquests indueix a un canvi conformacional en l’hemaglutinina que després induirà
a la fusió de membranes. Els Ebolavirus, en canvi, requereixen de la participació de la furina
per infectar.
Pèrdua de la càpsida.
La càpsida és una estructura molt estable la funció de la qual és atorgar una cloïssa
proteica en la que el genoma químicament làbil es pugui mantenir en un ambient
estable. Aquesta nucleocàpsida ha de permetre l’entrada dels metabòlits necessaris per fer
els productes gènics dels virus. Els mètodes que desestabilitzen la càpsida s’anomenen
uncoating. La desestructuració pot ser total o parcial. El que entra a la cèl·lula és un complex
nucleoproteic, sovint amb components residuals de la càpsida encara associats als àcids
nucleics.
Molts virus embolcallats perden la càpsida a la membrana plasmàtica, com els Retrovirus.
Aquesta descapsidació no és total, doncs es manté una estructura que permet la concentració
de la transcriptasa inversa i la integrasa entre altres molècules. Aquest conjunt d’enzims
permeten la retrotranscripció.
Alguns dels virus embolcallats perden la nucleocàpsida als endosomes, com l’influenzavirus.
Aquest virus té un procés més complex que requereix que hi hagi una acidificació fora i dins
l’endosoma i aquesta desestabilitza la relació entre la proteïna de matriu N1 i les proteïnes
que hi ha a la nucleocàpsida. Té lloc gràcies a una bomba de protons que acidifica el medi.
En els virus sense envolta es dona una lisi de l’endosoma dependent del pH. En alguns casos,
com el de l’Adenovirus, la nucleocàpsida s’uneix a la membrana nuclear un cop hi ha
hagut la lisi dels endosomes. Aleshores s’allibera l’àcid nucleic gràcies al canvi de pH.
Cell shutdown.
El terme Cell Shutdown fa referència a la inhibició de la síntesi de macromolècules
cel·lulars per part de mecanismes vírics específics. Això demostra que els virus són capaços
no només de produir el seu material genètic i proteïnes sinó que també són capaços
d’intervenir el metabolisme cel·lular. En un cell shutdown, els virus produeixen proteïnes
que inhibeixen pathways específics de la cèl·lula, interferint en la síntesi de DNA, RNA
i proteïnes. L’objectiu d’aquesta interferència és aconseguir que els mecanismes de la
cèl·lula treballin sobre el material víric.
Virologia 2020
CEBIO 33
El cell shutdown és un fenomen comprovable experimentalment. L’experiment es realitza
mitjançant nucleòtids de DNA radioactius subministrats a cultius cel·lulars. Un d’aquests
cultius, al cap d’un temps, és infectat víricament. L’experiment mostra com, al llarg del temps,
la quantitat de radioactivitat que mostra el cultiu infectat es para en sec mentre que el del
cultiu control i els virus augmenten en radioactivitat.
Quan hi ha una infecció per Herpesvirus, per exemple, s’inhibeix la síntesi de DNA. En els
Picornavirus, la traducció es troba mediada per IRES enlloc de CAP i requereix de tan sols
una petita quantitat del complement del factor de traducció. Això implica que no es necessita
tota la maquinària cel·lular per tal de traduir el RNA. Així i tot, el virus inhibeix algunes de
les proteïnes que la cèl·lula necessita per realitzar les seves traduccions, deixant més
recursos per a les seves proteïnes.
En el cas d’infecció per Hantavirus és necessària la complexitat de producció de proteïnes
per part de les cèl·lules. Per assegurar que surt bé, la nucleoproteïna N substitueix tot o
una part del complex cel·lular CAP-binding, la qual és molt molt més eficient que el sistema
cel·lular en la captació de ribosomes.
El virus Influenza, causant de la grip, talla les regions CAP del mRNA cel·lular i les
incorpora al seu mRNA.
Estimulació de funcions cel·lulars.
En alguns virus, com els anteriorment classificats com a Papoviridae: Papillomaviridae i
Polyomaviridae; la infecció provoca que alguns processos cel·lulars augmentin en
freqüència de realització. Estem parlant de virus petits, sense embolcall, icosaèdrics i amb
un genoma de doble cadena de DNA covalentment tancada. Dins dels Poliovirus existeixen
4 subclasses que realitzen aquest augment de producció: SV40, BK, MCPyV i JC.
El genoma de SV40 es troba dividit en una regió primerenca de gens reguladors i en una
regió tardana de gens estructurals. La regió primerenca codifica pels antígens T grans i
petits. Els antígens T grans indueixen a la cèl·lula a sortir de l’estadi G1 tot inhibint p53 i
pRb, ja que la replicació del DNA víric depèn de les polimerases cel·lulars. Aquesta inhibició
comporta un cicle cel·lular descontrolat. Per infecció de MCPyV i JC, en el mateix sentit, els
estudis indiquen que podrien estar relacionats amb l’oncogènesi.
Els Papillomaviridae també són virus petits, sense embolcall, icosaèdrics i amb un genoma
de doble cadena de DNA covalentment tancada separat en una regió primerenca de gens
reguladors i en una regió tardana de gens estructurals. Els Papillomaviridae es consideren
agents causants de càncer de cervicals, anus, penis i orofaringe. Això és pels productes
gènics primerencs E5, E6 i E7, que bloquegen les proteïnes supressores de tumors p53
i Rb. El resultat d’aquest bloqueig pot ser una transformació benigna o una integració
genòmica que acumuli mutacions dels circuits de control de la cèl·lula, provocant un
carcinoma. El virus infecta les cèl·lules de la part de sota de l’epiteli, col·locant el seu
àcid nucleic com si fos un episoma5. A mesura que les cèl·lules van proliferant i passant
d’estrat, hi ha un moment que comencen a produir partícules víriques. Al final, quan es
descama l’epiteli, es desprenen les cèl·lules.
Aquestes mateixes cèl·lules que es desprenen es lisaran de manera natural tot alliberant
les partícules víriques que tenen dins. La lisi, per tant, no ha estat provocada pels
Papillomaviridae. Com que s’han inhibit proteïnes supressores de tumors, les cèl·lules
5 Material genètic que conté DNA i es pot presentar integrat en el cromosoma o de forma autònoma en el citoplasma.
Virologia 2020
CEBIO 34
pateixen una transformació. Paral·lelament, les transformacions no són l’únic tipus de mutació
que es pot donar.
Existeix una vacuna contra el Papil·loma. Inicialment consistia en obtenir la proteïna L de
forma recombinant. Per aconseguir-ho, calia expressar el gen corresponent en un sistema
d’expressió en cèl·lules d’insecte o llevats. Avui en dia, arran d’haver vist que existeixen més
virus que poden provocar tumors per transformació, s’han hagut d’incorporar més
elements a la vacuna. És per això que ha quedat descartada l’expressió de la proteïna en
insectes i ara tan sols es realitza en llevats. Actualment, quan no es pot subministrar la vacuna
o aquesta no ha estat efectiva es subministra Gardasil 9 just abans de la maduresa sexual en
dones. En alguns països s’ha estès també als homes, ja que s’ha vist que el càncer que es
pot produir també pot ser de cèrvix, d’anus, penis...
Els Adenoviridae són virus petits, sense embolcall, icosaèdrics i amb un genoma de DNA de
doble cadena lineal en el que l’expressió gènica es troba regulada temporalment. Tenen
fibres que s’encarreguen de la interacció amb el receptor cel·lular. La regió
immediatament primerenca codifica per la proteïna E1A, i la regió primerenca codifica per la
E1B. E1A i E1B es troben implicades en la interacció amb el cicle cel·lular al inhibir proteïnes
supressores de tumors. Es pot dir, per tant, que E1A i E1B transformen cèl·lules. Les famílies
víriques no relacionades amb aquesta han evolucionat mecanismes similars per induir a
cèl·lules en repòs a entrar en el cicle.
Síntesi de RNA, DNA i proteïnes víriques: expressió gènica temporal.
Tots els virus han d'expressar els seus gens com a RNAm funcional abans de la
replicació per tal de dirigir la maquinària de traducció cel·lular a sintetitzar proteïnes víriques.
Les vies que van del genoma a les proteïnes varien entre diferents virus.
La replicació dels Retrovirus.
Quan els Retrovirus com el VIH han de realitzar la seva replicació, cal que segueixin uns
quants passos. Per començar, cal que hi hagi una unió entre el virus i la membrana de la
cèl·lula hoste. En el cas del VIH, la membrana del virus conté la proteïna GP160, la qual es
divideix en GP41 i en GP120. GP41 és la proteïna transmembrana amb el pèptid de fusió i
GP120 és la proteïna de superfície que interacciona amb el coreceptor CD4. El gen que
codifica per a la proteïna GP160 és el gen env.
La proteïna de la matriu p17 es troba codificada pel gen gag. Aquesta proteïna és molt
important per un virus amb membrana com el retrovirus, ja que la càpsida és nucleofílica però
l’ambient que hi ha a l’interior de la membrana no. P17 modula el contrast entre els entorns
hidrofòbic i hidrofílic i els manté estables. Ho aconsegueix gràcies als dos dominis que la
formen, ja que un s’uneix a la membrana i l’altre a la càpsida.
L’estructura de la càpsida del VIH és especial al no ser icosaèdrica. És una càpsida en forma
de con que ve donada per la proteïna p24, codificada al gen gag.
El genoma del VIH consisteix en dues còpies de RNA. Cada còpia està acoblada a un complex
d’enzims per poder fer la síntesi de RNA a DNA i incorporar aquest últim al genoma de la
cèl·lula. El complex enzimàtic necessita de RNAsaH, transcriptasa inversa i integrasa. La
RNAsa serveix per eliminar el RNA inicial. El complex enzimàtic es troba codificat al gen Pol.
Un cop ha entrat, el virus pateix una pèrdua parcial de la càpsida que el permet realitzar
una transcripció inversa. Aquest DNA aleshores s’integra i s’expressa en el nucli, generant
mRNA que es traduirà a proteïnes que seran les responsables de la regulació post-
transcripcional. Aquesta traducció és molt eficaç ja que el genoma del VIH disposa d’uns
Virologia 2020
CEBIO 35
promotors molt eficaços per captar la RNA polimerasa de la cèl·lula i així sintetitzar el mRNA
que es traduirà. Aquest RNAm ha de fer splicing abans de generar les proteïnes. Finalment,
hi haurà un assemblatge de les partícules víriques que permetrà que hi hagi una gemmació
i una posterior maduració del virus. Aquesta fora de la cèl·lula.
La primera macromolècula que es sintetitza en el cicle infecciós d’un Retrovirus és el
DNA. La transcripció genera un virió completament de RNA que després és transportat al
citoplasma per la traducció o encapsidació. Altrament, també pot ser tallat al nucli.
La replicació del virus Influenza A.
El virió d’Influenza A conté 8 segments genòmics de RNA amb polaritat negativa, la proteïna
estructural NP i algunes poques còpies de la RNA polimerasa dependent de RNA. L’entrada
de la partícula vírica al citoplasma cel·lular es dona per la interacció dels receptors
vírics amb l’àcid siàlic de l’exterior cel·lular. L’entrada a la cèl·lula hoste es realitza per
endosomes que es fusionaran a lisosomes, el que generarà una ruptura de la càpsida que
permetrà que el genoma d’ARN surti d’aquesta i es transloqui el complex RNP al nucli. Allà
es passa de RNA de cadena negativa a mRNA de cadena positiva, el qual migrarà al
citoplasma per iniciar la traducció. Els primers gens expressats produeixen proteïnes no
estructurals que regulen el cicle víric. Aquests gens no estructurals permeten la replicació del
RNA i l’expressió final dels gens estructurals. Els virions acabats de sintetitzar gemmen
de la cèl·lula infectada i la neuraminidasa destrueix els àcids siàlics per tal d’alliberar
correctament els virions de la progènie.
La replicació del poxvirus.
El virió del Poxvirus conté DNA de cadena doble i tots els enzims que es necessiten
per la transcripció, poliadenilació i capping d’una classe específica de mRNAs vírics.
La primera macromolècula que es sintetitza és RNA.
El nucli sintetitza els mRNAs vírics primerencs. Alguns, els que són factors de creixement o
hormones que contraresten els mecanismes de defensa del sistema immunitari de l’hoste, es
secreten. Hi ha una segona reacció de pèrdua d’embolcall que porta l’expressió de gens de
fase intermèdia. Els gens tardans codifiquen per proteïnes estructurals que s’han d’incorporar
en la partícula vírica. Els virions amb una membrana surten per lisi, els virions amb doble
membrana surten per gemmació.
Efectes citopàtics. L'efecte citopàtic fa referència a canvis estructurals en cèl·lules hostes causades per
una invasió viral. El virus infectant provoca la lisi de la cèl·lula hoste o que la cèl·lula mori
sense lisi a causa d'una incapacitat de reproducció. Tots dos casos es produeixen a causa
d'efectes citopàtics. Si un virus provoca aquests canvis morfològics a la cèl·lula hoste, es diu
que és citopàtic. Exemples habituals d'efecte citopàtic són l'arrodoniment de la cèl·lula
infectada, la fusió amb cèl·lules adjacents per formar cèl·lules sincitals i l'aparició de cossos
d'inclusió nuclears o citoplasmàtics.
Els efectes citopàtics es poden veure perquè hi ha acumulació d’inclusions en el
citoplasma. Serveixen per determinar que una cèl·lula ha estat infectada per un virus. Es
poden detectar per microscòpia i els efectes varien segons el tipus cel·lular.
Els efectes citopàtics i altres canvis en la morfologia cel·lular són només alguns dels
molts efectes dels virus citocides. Quan un virus citocida infecta una cèl·lula permissiva,
els virus maten la cèl·lula hoste mitjançant canvis en la morfologia cel·lular, en la fisiologia
cel·lular i els esdeveniments biosintètics que se succeeixen. Aquests canvis són necessaris
per a una replicació de virus eficient, però succeeixen a costa de la cèl·lula hoste.
Virologia 2020
CEBIO 36
De vegades, els virus poden provocar inclusions al nucli o al citoplasma. Altrament, com en
el cas dels adenovirus, es pot donar una lisi. En cas que es disposi d’un cultiu cel·lular en
placa, la infecció per virus permetrà veure calbes en el mateix que seran resultants de la lisi.
En cas que els virus siguin amb envolta, es pot donar una fusió de membranes cel·lulars
que resulti en cèl·lules multinucleades. També es podria observar la seva transformació.
Així i tot, també hi ha efectes que no són gaire evidents. En alguns virus, com el de la grip,
la formació de partícules víriques és simultània amb la gemmació d’aquestes, el que
manté el cultiu estable. A les cèl·lules que els passi això no serà detectable amb els
mateixos mecanismes que s’han mencionat. Caldrà algun altre tipus de detecció, com assajos
d’hemaglutinació. En aquests es comprova si el virus és capaç d’interaccionar amb els
eritròcits, el que deixaria el pou de mostra tèrbol enlloc de precipitat. Altrament, també es
poden realitzar assajos d’interferència amb altres virus. Al final, doncs, cal un anàlisi a nivell
molecular.
Alliberament de partícules víriques per gemmació o lisi. Els virus nuus surten de les cèl·lules per lisi, matant-les. En canvi, la majoria dels virus amb
embolcall es reuneixen a la membrana plasmàtica i després gemmen des d'ella. Es pot
donar que la membrana presa pel virus no sigui la de la bicapa lipídica sinó que sigui una
d’algun orgànul intern. Quan això passa, els virus fan servir els sistemes membranosos
intracel·lulars per alliberar-se. És el cas dels Herpesvirus. Un dels mecanismes emprats en
la sortida de la cèl·lula és l'exocitosi. Aquest el fan servir els virus Influenza i els Retrovirus.
Pocs virus embolicats surten per lisi o gemmació. Un dels tipus són els Poxvirus.
Apoptosi. L'apoptosi durant la infecció pel virus és una important resposta innata a la infecció
pel virus. La regulació de l'apoptosi és un tema complex que no es pot descriure
completament aquí però, resumidament, es podria dir que les infeccions per virus
pertorben la bioquímica cel·lular i sovint provoquen una resposta apoptòtica.
L’apoptosi generada per pertorbació de la bioquímica cel·lular pot ser fruit de l’activació de
l’efector de l’interferó PKR, de la interacció amb p53, la producció de proteïnes reguladores
transcripcionals o la sobreexpressió de proteïnes del virus en etapes tardanes del cicle de
replicació. Molts virus han evolucionat mecanismes per reprimir l'apoptosi.
Diversos virus codifiquen per homòlegs de Bcl-2, un regulador negatiu de l'apoptosi.
Altres codifiquen per inhibidors de les caspases, una família de cisteïnes proteases que són
importants inductores de l'apoptosi. Per altra banda, també han evolucionat diversos
mecanismes per bloquejar els efectes de Fas / TNF, inclosa la senyalització a través de la
membrana plasmàtica. Alguns virus que interaccionen amb p53 han evolucionat proteïnes per
contrarestar el possible desencadenament d'apoptosi. Actualment s'estan descrivint molts
altres mecanismes en una àmplia varietat de virus.
Transformació cel·lular. La transformació és l'alteració genètica d'una cèl·lula que condueix a la seva
immortalització. És un dels passos necessaris per a l'establiment d'un tumor, un procés
multietapa conegut com a oncogènesi. Per tant, una cèl·lula transformada és diferent de la
cèl·lula tumoral. No totes les cèl·lules transformades progressen cap a cèl·lules
tumorals. Així i tot, arran ser immortals, els cicles de replicació contínua augmenten les
possibilitats d'acumular algunes altres mutacions que després establiran un estat
tumorogènic. Ni la transformació ni l’oncogènesi són necessàries per a la replicació de
cap virus.
Virologia 2020
CEBIO 37
Les infeccions virals són un factor que contribueix en un 20% dels càncers humans. Els virus
més implicats en càncers humans són: VHC, HLTV-1, VIH-1, VHB, VPH, MCPyV, HHV-4
(EBV), HHV-8 (KSHV).
En el cas del VIH, la transformació és probable que provingui de la integració del DNA
al genoma de la cèl·lula hoste. Aquest és un procés aleatori en quant al destí, pel que es
pot donar la coincidència que es situï un fragment de DNA molt actiu en la transcripció just al
costat d’un gen encarregat de la regulació del cicle cel·lular. Això acabaria derivant en una
transformació cel·lular per culpa de la desregulació que provocaria la sobreexpressió del gen
en qüestió.
El virus de l’hepatitis C (VHC) mai passa a DNA, pel que la transformació no pot tenir la
mateixa causa que en el cas del VIH. Certament s’han trobat proteïnes encarregades d’induir
el cicle cel·lular al seu genoma, però aquestes mai s’han trobat dins de cèl·lules cancerígenes.
Es creu, doncs, que el càncer relacionat amb infecció per VHC no és fruit del virus dins
la cèl·lula, sinó de dins d’altres cèl·lules. Com que els virus maten cèl·lules del teixit, la
resta de les que hi són presents proliferen a un ritme més elevat per suplir els espais buits
que han deixat les mortes. Aquesta proliferació augmentada incrementa la probabilitat de patir
mutacions i que aquestes es fixin al genoma, el que es pot acabar traduint en un tumor.
Hi ha tres mecanismes diferents descrits per Retrovirus relacionats amb la transformació
cel·lular, tots ells relacionats amb la fase M del cicle cel·lular.
El virus del sarcoma Rous té un sol v-oncogen (v-src) en el seu genoma. Cada cèl·lula
infectada, per tant, obtindrà l'oncogen inserit al genoma però no en altes concentracions. La
majoria d'aquests virus són defectuosos i necessiten un virus d'ajuda per produir més virus.
Aquest procés s'anomena transducció. La introducció d’un nou oncogen a la cèl·lula
incrementa les possibilitats de desenvolupar un tumor.
La Cis-activació s'aplica a totes les infeccions causades per Retrovirus a causa de la inserció
del provirus. En la trans-activació els factors de transcripció viral solubles activen l'expressió
de gens cel·lulars.
És molt poc freqüent l'aparició de tumors associats a virus d'ADN com els Adenovirus,
els Poliomavirus i els Papilomavirus. Els tumors fruit de la infecció amb aquests només
contenen un fragment del virus i no els poden reproduir. El càncer pot ser que provingui dels
antígens T (oncoproteïnes) que produeixen els virus d'ADN. Els antígens interaccionen amb
els supressors tumorals tot inhibint-ne les seves funcions.
Les oncoproteïnes inicien les cèl·lules quiescents6 directament a la fase S. La presència
d'oncoproteïnes allibera E2f i activa els gens necessaris per a la síntesi d'ADN. La unió d’E2f
a les proteïnes Rb i p53 eviten l’apoptosi. A la cèl·lula hi ha diferents oncogens. Poden ser
factors de reconeixement, receptors, proteïnes G, quinases i factors de transcripció. Diferents
espècies de Retrovirus han agafat gens oncogènics de les cèl·lules. Així i tot, no s’han
identificat tots els tipus d’oncogens en el conjunt de Retrovirus descoberts.
Medicaments antivirals. Les vacunes prevenen les infeccions i els fàrmacs les tracten (teràpia). La prevenció o
profilaxi sempre és millor que el tractament o teràpia. Sobretot quan aquest últim sigui difícil
d’assolir. Així i tot, no totes les vacunes funcionen i, per a alguns virus, no n’hi ha cap de
disponible malgrat els anys d'intens treball (n’és un exemple el VIH-1).
6 Les cèl·lules quiescents són aquelles que no s’estan dividint perquè es troben en fase 0.
Virologia 2020
CEBIO 38
En ser paràsits intracel·lulars, els virus estan tan lligats als processos cel·lulars per a la
multiplicació que la majoria dels fàrmacs antivirals no poden discriminar entre ells. El
desplegament de les activitats virals específiques ha estat la clau de l'èxit en la identificació
de dianes terapèutiques.
Gairebé tots els fàrmacs antivirals actuals actuen només contra la reproducció de virus
i són ineficaços contra les infeccions latents. A més, el problema de la resistència a les
drogues adquirides és freqüent en les entitats biològiques que es multipliquen ràpidament.
Sobretot en aquelles amb genomes d'ARN. L'estratègia per combatre-les és utilitzar dos o
més fàrmacs simultàniament.
Un dels primers fàrmacs antivirals que va sorgir contra el VIH fou l’AZT. Aquest fàrmac
desenvolupat el 1987 interferia de manera única amb la transcriptasa inversa del virus. Això
anava molt bé en una etapa inicial de medicació, quan la concentració de partícules víriques
disminuïa ràpidament. El problema es donava amb la mutació del virus, que provoca un repunt
de la càrrega viral en molt poc temps. També s’ha intentat impedir la interacció del virus amb
el CD4. Per fer-ho, s’ha buscat subministrar CD4 de forma soluble al pacient. Quan es va
provar en humans, els nivells de CD4 necessaris per assolir un nivell de tractament eficaç van
resultar ser tòxics.
Els fàrmacs antivirals aprovats tenen com a objectiu molts passos de multiplicació
viral. Ara per ara, es busca impedir l'adhesió o entrada mitjançant la unió a la proteïna d'unió
del virus, la fusió viral per competència amb el pèptid, la síntesi d'ADN mitjançant la
introducció d’anàlegs de nucleòsids, la inhibició de la RT, la inhibició de l'ADN polimerasa,
la síntesi de l'ARN mitjançant la introducció d'anàlegs d'ARN purins, els canals iònics
mitjançant la inhibició de la sortida del virus dels endosomes bloquejant l'entrada de H +,
proteases mitjançant la reducció de la divisió i sortida de la poliproteïna evitant la ruptura de
molècules cel·lulars que s'enganxen a nous virions sortint de la cèl·lula... A més de tot això,
l'interferó-α ajuda al sistema immune a matar la cèl·lula infectada.
Al tractament contra el VIH es fa servir un tractament antiretroviral altament actiu
(HAART) que consisteix en combinacions de tres o més fàrmacs antivirals. Els
esquemes HAART prescrits habitualment inclouen 2 inhibidors de la transcriptasa inversa de
nucleòsids (NRTIs) i 1 inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleòsida i 1 inhibidor de la
proteasa o un inhibidor de la integrasa. Aquestes combinacions controlen la infecció pel
VIH. No obstant això, la detecció de la resistència al VIH és una amenaça per al tractament i
s'estan fent més esforços en investigacions bàsiques per identificar nous objectius per
bloquejar el cicle viral.
RNA d’interferència La interferència de RNA (RNAi) és un procés biològic pel qual s’impedeix l'expressió
dels gens mitjançant l'ús de molècules petites de RNA, com el RNA d’interferència petit
(siRNA). És un mecanisme biològic natural que es produeix en cèl·lules animals i vegetals.
Petites molècules de RNA d’entre 21 i 23 pb s'uneixen a complexos proteics orientats al RNA
complementari i porten el RNAm a la degradació.
Els siRNAs es poden subministrar experimentalment des de fora de la cèl·lula, però
també es poden produir dins de la cèl·lula, utilitzant siRNAs processats a partir d'ARN
precursors expressats al nucli cel·lular. Aquest mecanisme es pot adaptar a gairebé qualsevol
seqüència per eliminar l'expressió de gens virals. Un treball experimental demostra que
aquest mecanisme té potencialitat com a nou enfocament per protegir les cèl·lules
contra la infecció. Es poden triar seqüències conservades per reduir l'aparició de resistència
al virus.
Virologia 2020
CEBIO 39
Capítol 4 – Morfologia Vírica. En l’escala de la longitud d’ona de la llum visible, els virus són petits. És per això que cal fer
servir un microscopi electrònic per tal de poder-ne visualitzar en detall la majoria
d’espècies virals. Però no tots els virus compleixen aquesta norma. La gran diversitat vírica
existent ha fet que hi hagi virus visibles a través dels microscopis òptics.
Les partícules víriques es composen de
genomes d’àcids nucleics envoltats per
una càpsida feta de proteïnes codificades
als genomes. Els genomes dels virus, el seu
material genètic, codifiquen per les proteïnes
estructurals de la càpsida i per altres
proteïnes víriques essencials per altres
funcions, com l’inici de la replicació. El virió o
partícula vírica és l’estructura completa del
virus i està composta pel genoma, la càpsida
i l’embolcall si aquest hi és present. L’exterior
d’aquest virió conté proteïnes que
interaccionen amb proteïnes específiques de
la superfície de la cèl·lula on pot replicar.
Els àcids nucleics dels virus poden ser
DNA o RNA de cadena senzilla o de cadena doble i lineal o circular. Malgrat la varietat, un
mateix tipus de virus sempre tindrà el mateix tipus de material genètic. Precisament per
aquest motiu, el tipus de material genètic és un factor clau en la classificació dels virus.
La càpsida és una estructura complexa feta per vàries subunitats idèntiques d’una
mateixa proteïna vírica anomenada capsòmer. La càpsida serveix per atorgar una “closca”
proteica on el genoma víric químicament làbil pot ser mantingut en un ambient estable.
L’associació de les càpsides amb els genomes és un procés complex que acaba resultant en
una estructura energèticament estable.
Morfologia de virus animals. Malgrat els virus poden adoptar un rang de formes, algunes de les
quals són bastant complexes, un gran nombre de virus assumeix
una de dues estructures arran de les seves dimensions i de les
constriccions dels paràmetres estructurals del capsòmer. L’estructura
helicoidal és aquella on els capsòmers s’associen amb l’àcid
nucleic helicoidal tot formant una nucleoproteïna. Aquestes
nucleoproteïnes poden ser rígides o flexibles en base a les propietats
de les proteïnes de la càpsida. L’altre morfologia altament regular
que solen prendre els virus animals és la icosaèdrica, altrament
dita isomètrica. En aquesta, els capsòmers formen una estructura
sòlida i regular envoltant el genoma víric. A més de la seva classificació
morfològica en base a la càpsida, els virus es poden classificar
segons si són virus despullats (virus sense embolcall) o virus amb
embolcall. Els Poxviridae, els virus causants de la verola, tenen una
morfologia que s’anomena “morfologia complexa”, ja que no s’adscriu
a cap de les dues mencionades anteriorment.
Virió
Embolcall
Càpsida
Genoma
Morfologia Vírica
Icosaèdrica despullada
Icosaèdrica embolcallada
Helicoidal despullada
Helicoidal embolcallada
Morfologia complexa
Virologia 2020
CEBIO 40
Els virus animals tenen tendència a ser arrodonits. Aquesta tendència es veu dictada per
la metodologia d’infecció, doncs una forma esfèrica fa més favorable l’endocitosi.
Morfologia de virus vegetals. Tal i com passa amb els virus animals, els virus de plantes tenen una morfologia al servei
de la funció. L’entrada d’un virus a una planta no pot ser a través de la seva paret, doncs és
massa gruixuda i els porus massa estrets com perquè hi passi una partícula tan gran com un
virus. En conseqüència, els virus que infecten plantes només hi poden entrar per ferides. A
més, per poder passar d’una cèl·lula a l’altre utilitzen els plasmodesmes, petits canals que
van entre cèl·lula i cèl·lula.
És per això que els virus de plantes solen ser filamentosos, sobretot helicoidals. Els virus
de plantes helicoidals tant poden ser rígids com flexibles i poden tenir diferents mides. Com
que necessiten reduir la seva mida, els virus de plantes solen no tenir envolta.
Els virus de plantes amb morfologia icosaèdrica tenen el genoma segmentat en
partícules víriques diferents. Malgrat implica la infecció simultània de més d’una partícula
vírica amb diferents parts del genoma per poder fer el cicle infectiu, tenir el genoma segmentat
permet que les partícules víriques que infecten plantes siguin molt petites per tal de travessar
els plasmodesmes. El genoma dividit o fragmentat no és el mateix que el genoma segmentat.
Morfologia de Bacteriòfags. Els bacteriòfags són un grup molt ampli de virus que infecten bacteris. Arran de la
complexitat de travessar la gruixuda paret que aquests tenen, els bacteriòfags han
desenvolupat la capacitat d’injectar el seu material genètic. Com en els casos anteriors, la
morfologia dels bacteriòfags es separa en helicoidal, icosaèdrica, amb envolta o despullats.
El que molts bacteriòfags tenen i que els diferencia morfològicament de la resta dels virus és
una cua helicoidal per introduir el genoma en l’hoste. En molts casos, la cua és completament
o parcial retràctil per poder-lo injectar. Es considera que els virus que tenen una càpsida
unida a una cua helicoidal tenen una morfologia mixta.
Simetria vírica. La majoria dels virus assumeix una de dues estructures morfològiques arran de les
seves dimensions i de les constriccions dels paràmetres estructurals del capsòmer.
Aquestes poden ser icosaèdrica o helicoidal. Per altra banda, els virus poden estar nuus i
tenir tan sols una nucleocàpsida o poden tenir una envolta amb glicoproteïnes víriques. En
cas que el virus sigui helicoidal i amb envolta, la forma sol acabar sent també arrodonida, el
que dificulta identificar-los com a helicoidals.
La família Poxviridae.
Els virus Poxviridae són uns virus de doble cadena de DNA amb una morfologia
complexa. Observats a través del Microscopi Electrònic de Transmissió (TEM), aquesta
família vírica presenta un aspecte vellós arran de les espícules que tenen. Són uns virus molt
especials en quant a les seves característiques. Els Poxviridae són virus grans en forma i
genoma, el qual consisteix en DNA que no entrarà al nucli de la cèl·lula infectada. Aquesta
família de virus és el típic exemple en favor de la teoria regressiva de l’evolució i origen dels
virus, segons la qual els virus són cèl·lules que han anat perdent capacitats i funcions
fins tornar-se paràsits.
Virologia 2020
CEBIO 41
La família Baculoviridae.
Els Baculovirus són uns virus especials
que tenen dues morfologies segons el
moment cicle víric en què es trobin. Una
és quan es troben dins de l’insecte, on és de
virió embolcallat. L’altre forma és la que
tenen quan l’insecte mor i es queden aïllats
al medi ambient. En aquests casos, com que
necessiten mantenir la seva capacitat
infectiva, es formen unes estructures
proteiques semi-cristal·lines de polihedrina
que inclouran uns quants virions fins trobar
un altre hoste per infectar.
La polihedrina és una proteïna codificada pel virus i que, gràcies a un promotor molt
potent que es fa servir molt en expressió recombinant, es produeix en grans quantitats.
Aquests virus només maten l’hoste un cop han infectat totes les cèl·lules de l’individu. La
polihedrina permet resistir les inclemències del medi ambient.
Microscòpia Electrònica de partícules víriques. La microscòpia electrònica de transmissió ha permès conèixer la morfologia de les
partícules víriques. Amb el TEM s’han aconseguit resolucions d’entre 5 i 7nm, el que ha
permès veure el procés de sortida del virus de la cèl·lula hoste. Gràcies a aquestes imatges
s’ha comprovat que els virus es van formant a mesura que surten, és a dir, que quan surten
els virus de la cèl·lula encara no s’ha format del tot la nucleocàpsida. Per tant, gràcies a la
microscòpia electrònica de transmissió s’ha pogut comprovar que la maduració i la
exclusió virals són processos simultanis.
Capsòmers. Un capsòmer és una de les subunitats proteiques idèntiques que, juntes, formen una
càpsida. Els plecs únics de les proteïnes de la càpsida viral presenten una geometria
distintiva i permeten un muntatge eficient dels de virions. En general, l’autoassemblatge guia
la generació de nous virions formats per proteïnes codificades en el genoma del virus que
són sintetitzades de novo per i dins de l'hoste.
El virió pot estar format per un nombre definit del mateix capsòmer o per unes quantes
proteïnes diferents unides entre si per ponts d'hidrogen i interaccions hidrofòbiques.
El virió també pot estar cobert per un embolcall de lípids, derivat del propi hoste. En altres
casos, el virió porta una membrana interna situada entre el genoma i la capa viral. Els virions
presenten una sorprenent diversitat de mides i oscil·len entre 18 i 19nm (Nanoviridae) fins a
uns 900nm (Mimiviridae) o, fins i tot, més (és a dir, els gèneres no reconeguts Pandoravirus i
Pithovirus; aquests últims amb un diàmetre de més de 1000nm).
Capsòmers Icosaèdrics.
La majoria dels virus adopten la forma d'una esfera. En aquesta, la càpsida està formada
per rèpliques de la mateixa proteïna (o proteïnes) que interactuen espontàniament a través
del dominis de les seves vores, donant lloc a una estructura icosaèdrica. La càpsida
icosaèdrica més simple té un diàmetre de 20 a 25nm i està composta per 12 capsòmers
pentamèrics que formen un total de 20 cares. Normalment, els virus són més complexos,
doncs cada cara pot estar subdividida en unes cares més petites.
Virologia 2020
CEBIO 42
Segons el nombre de vegades en que s’han dividit les cares originals de l’icosaedre tindrem
un virus diferent. Les subdivisions de les cares s’anomenen nombres de triangulació o
nombres T. Com més gran és el nombre T més esfèric és l’icosaedre, que després rep el
nom d’icosadeltaedre. Les imatges que aquí s’exposen estan extretes de ViralZone, SIB
Swiss Institute of Bioinformatics.
En les càpsides icosaèdriques amb un nombre de triangulació 1, la càpsida està composta
per 60 unitats asimètriques compostes per una sola proteïna. T = 1 i hi ha 12 capsòmers
pentamèrics i cap hexamèric.
En les càpsides icosaèdriques amb un nombre de triangulació 3, la càpsida està composta
per 60 unitats asimètriques fetes per 3 proteïnes. T = 3 i hi ha 12 capsòmers pentamèrics i 20
capsòmers hexamèrics.
En les càpsides icosaèdriques amb un nombre de triangulació 4, la càpsida està composta
per 60 unitats asimètriques fetes per 4 proteïnes. T = 4 i hi ha 12 capsòmers pentamèrics i 30
capsòmers hexamèrics.
Virologia 2020
CEBIO 43
En els virus més grans es requereixen més de 60 capsòmers per encapsular
completament el genoma. La càpsida icosaèdrica del virus de la rubèola, per exemple, està
composta per 12 capsòmers pentamèrics i 30 d’hexàmerics per un total de 240 capsòmers.
El diàmetre d'aquests virions està en el rang del 65-70nm. Alguns virus es reconeixen
fàcilment per les disposicions úniques dels seus capsòmers als vèrtexs de l'icosaedre.
Arran de la tècnica de microscòpia de la difracció de raigs X, es va poder identificar que els
capsòmers estan formats per petites esferes. Són les seves unitats morfològiques i
s’anomenen protòmers. Els capsòmers es formen per la juxtaposició de peces petites i
semblants entre si que realitzen un autoassemblatge. Aquesta juxtaposició és reversible
perquè, al final, la interacció entre elles no és covalent. Així i tot, la construcció final és molt
estable.
La producció recombinant de protòmers i capsòmers provoca la formació de Virus-Like
Particles, VPLs. Les VPL són càpsides sintètiques i buides que es poden fer servir en la
síntesi de vacunes.
En referència a la geometria, cal saber que cada cara té 3 proteïnes i que, quan augmenta el
nombre de triangulació, aquestes noves cares també han de tenir 3 unitats asimètriques en
cadascuna. També és necessari recordar que els vèrtexs de les càpsides fan un capsòmer
de 5 vèrtexs.
Simetria helicoidal.
L'altra manera senzilla de construir un virió és fent ús de la simetria helicoidal, en què
les subunitats proteiques i l'àcid nucleic estan disposats en una hèlix. Això forma un
filament amb flexibilitat dependent de la força de les interaccions proteïna-proteïna. És a dir,
alguns filaments són rígids a causa dels enllaços forts entre els monòmers de les proteïnes
en girs successius de l'hèlix (per exemple, el virus del tabac del mosaic, Virgaviridae), mentre
que d'altres són flexibles (Potyviridae) a causa d'enllaços més febles. Alguns filaments són
tan flexibles que poden assumir formes molt diferents. A Filoviridae, per exemple, els virions
envoltats poden ser cilindres simples (la forma menys freqüent) o formar branques o bucles.
Els bucles també poden variar de forma i incloure la forma semblant al fil (el model més
general) i les formes croquetes de U-, 9-, d'ull o de Shepperd, entre d'altres. En el cas de la
família Ophioviridae, els virions no molt desenvolupats, de gran flexibilitat, poden formar
cercles oberts.
Altres virions amb simetria helicoidal tenen un diàmetre més ampli, de manera que
semblen una mica més gruixuts que els típics virions filamentosos. Es tracta de
filaments bacil·liformes (semiesfèrics a tots dos extrems) o de forma de bala (amb un extrem
arrodonit i un aplanat). Es troben més freqüentment en virus vegetals i animals
(Caulimoviridae, per exemple, amb hostes als dos regnes), però alguns virions arqueans
(Clavaviridae) també són bacil·liformes.
La càpsida en virus amb morfologia helicoidal va fent una espiral que puja, semblant a
una escala de cargol on cada proteïna és un esglaó. Sabent aquesta informació es pot
calcular la longitud d’una càpsida vírica mitjançant la següent fórmula:
𝑃 = 𝑝 ∗ 𝜇
On P és l’alçada d’una volta, p és l’alçada que puja una proteïna i on µ és la quantitat de
proteïnes necessàries per fer una volta sencera.
L’assemblatge de les proteïnes en virus helicoidals es realitza per fases. En cadascuna
es van formant discs que s’assemblen entre si per formar l’estructura final. També és curiós
Virologia 2020
CEBIO 44
que l’àcid nucleic que va dins de la càpsida està condensat formant una hèlix, ja que les
proteïnes que formen la mateixa tenen aminoàcids carregats positivament apuntant cap a
dins.
Embolcall dels virus. Una mica menys de la quarta part de tots els virus tenen un embolcall que envolta la
seva càpsida proteica. Aquest consisteix, normalment, en una bicapa lipídica derivada de
l'hoste més les glicoproteïnes d'origen viral que els ajuda a evadir el sistema immunològic de
l’hoste. La seva estructura varia en quant a mida, composició, morfologia i complexitat. Així i
tot, es sap que el reconeixement, l'adhesió i l'entrada a les cèl·lules mitjançant la fusió amb
les membranes de la cèl·lula hoste són les principals funcions que tenen l'embolcall i les
proteïnes associades.
La nucleocàpsida no està flotant dins l’embolcall, doncs
els dos elements estan formant una estructura compacta.
Hi ha una sèrie de proteïnes que estan ancorades a la càpsida
i a l’embolcall alhora: les proteïnes de la matriu. Això és
perquè el virus, quan està dins de la cèl·lula hoste, genera
glicoproteïnes de membrana i proteïnes de la matriu.
Aquestes últimes s’uniran a la cara interna de l’embolcall i a
l’externa de la càpsida.
Les glicoproteïnes derivades del virus que s'incorporen a la bicapa lipídica i altres
proteïnes no glucosilades d'origen viral formen part de l'embolcall. Les glicoproteïnes
víriques de l’embolcall es col·loquen travessant la membrana de la cèl·lula hoste i tenen un
domini extern, un intern i un transmembranal. Aquesta membrana sol ser la plasmàtica, però
també pot ser nuclear. El domini intern de les glicoproteïnes té un paper important en
l’agrupació de les mateixes, ja que tendeixen a oligomeritzar tot formant una sèrie d’espícules.
Se n’ha demostrat l’existència a través d’observacions al microscopi. El domini extern, en
canvi, és l’encarregat del reconeixement necessari per a la infecció.
El nombre de glicoproteïnes del virus varia entre els grups virals; en membres de la
família Herpesviridae, per exemple, s'han identificat més de 10 glicoproteïnes. En casos més
senzills (per exemple, els membres de Togaviridae i Orthomyxoviridae), hi ha una o dues
proteïnes multimèriques.
A més, des d'un punt de vista evolutiu, les proteïnes d'embolcall de virus, amb variacions,
estan ben representades en els genomes vertebrats i aparentment eren una força
potent en la placentació en diferents espècies. Els gens de la sincitina representen un
exemple dramàtic d'evolució convergent mitjançant la incorporació d'un gen de l'embolcall
d'un retrovirus per a una funció biològica clau en la morfogènesi placentària.
Hi ha estudis que demostren que les glicoproteïnes també poden ser les encarregades
de mitjançar en la fusió de membranes. Així i tot, en alguns casos, el virus no les necessita
ja que els virions poden entrar a la cèl·lula hoste per endocitosi. Majoritàriament, les
glicoproteïnes externes són les responsables de la formació d’antígens.
Existeixen casos especials on les glicoproteïnes, enlloc d’unir-se a les proteïnes de la
matriu com hem vist abans, s’uneixen directament a l’embolcall. De la mateixa manera,
pot succeir que hi hagi vàries capes de proteïnes entre la càpsida i les glicoproteïnes.
Virologia 2020
CEBIO 45
Exemples de Virus. Alguns virus són fàcilment identificables
per la disposició única dels seus
capsòmers als vèrtexs de l'icosaedre. Per
exemple, els virions dels membres de la
família Herpesviridae són icosaèdrics amb 12
vèrtex, un dels quals tindrà un porus que
s’acobla al nuclear, evitant així el
desassemblatge ja que, a través d’ell, el
material genètic del virus podrà entrar dins el
nucli.
Entre la resta d’espècies víriques amb una
morfologia de càpsida proteica multicapa es
troben espècies pertanyents a la família
Reoviridae, que es transmeten per via oral-
fecal i per això es poden passar diversos dies
al medi ambient. En conseqüència, i per
poder resistir a les inclemències del temps,
les càpsides consisteixen d'1 a 3 capes de
proteïna que envolten el nucli del genoma
format per entre 9 i 12 segments d'ARN.
Molts virus també tenen estructures similars a fibres que s'estenen
des de les seves superfícies. Els Adenoviridae tenen 12 fibres llargues
que provenen dels seus vèrtexs i que actuen com a lloc de reconeixement
dels receptors.
Els Mimiviridae s’han descobert fa
relativament poc i posseeixen un
bosc de fibres. Són gegants, d’uns
700nm de diàmetre enlloc dels 50 que
solen fer els virus, i infecten amebes.
Es suposa que són cèl·lules que han
anat desevolucionant. Tenen un
nombre de triangulació de 1179
(cadascun dels 12 pentàmers es
divideix 1179 vegades) que els fa molt
arrodonits. Així i tot, encara es poden diferenciar els vèrtexs i continua tenint 12
pentàmers. Té una regió anomenada Sargate que permet alliberar el contingut genètic a
l’exterior. Costa de classificar-lo com a virus ja que realitza la síntesi d’unes proteïnes pròpies.
Malgrat tot, al no tenir ribosomes, la síntesi no la realitzen ells mateixos.
Neutralització dels virus. Quan un virus infecta un hoste nou, es pot arribar a pensar que les apostes van en favor del
virus. Així i tot, la resposta immunitària, una de les més primitives i antigues formes del
sistema immunitari, juga un paper crític en alentir la resposta del virus en les etapes
inicials de la infecció. Aquesta resposta innata guanya temps per tal que l’hoste desenvolupi
una resposta adaptativa més específica que permeti controlar la infecció. Aquest control es
durà a terme per neutralització del virus.
Virologia 2020
CEBIO 46
Neutralització per anticossos.
Els anticossos formen part de la resposta immune adaptativa. Quan es té una cèl·lula B
que presenta anticossos per un epítop viral específic i aquest interactua amb ella, la cèl·lula
B passa a cèl·lula plasmàtica, la qual allibera anticossos a l’exterior.
Els anticossos neutralitzen els virus. Hi ha tipus concrets d’anticossos, anomenats
anticossos neutralitzants, que es poden unir a les proteïnes de la superfície del virus i
bloquejar un o altre aspectes dels esdeveniments inicials del reconeixement de la cèl·lula o
la internalització dins d’aquesta. Els virus poden bloquejar la unió amb el receptor, la
endocitosi o poden bloquejar l’alliberament del genoma a la cèl·lula. Existeix un altre mètode
que els frena: l’aglutinament. Aquest mètode consisteix en unir vàries partícules víriques,
reduint la seva possibilitat d’infecció a altres cèl·lules.
Mecanismes vírics per evitar la neutralització.
La resposta immunitària és efectiva i juga un paper constant en la selecció dels virus
que no provoquen una infecció eficient. Malgrat aquesta eficiència, és evident que hi ha
molts virus que sobreviuen passat un procés d’infecció i que poden suportar la resposta
immune de l’hoste. Un factor essencial en la supervivència vírica és que els virus organitzen
múltiples contra mesures a la resposta immunitària.
Tots els virus animals es troben en diferents formes serotípiques antigènicament
diferents. La quantitat de formes varia amb el tipus de virus. Un serotip pot ser estable i pot
ser que estigui confinat a una localització geogràfica específica, de la mateixa manera que
pot ser que una infecció prèvia amb un altre serotip porti a una protecció parcial o nul·la de la
reinfecció amb un altre serotip.
Com que la replicació de RNA depenent de RNA no té mecanismes de correcció d’errors, els
virus de RNA solen ser més susceptibles a la formació de serotips que no pas els virus
de DNA. Aquest procés es sol anomenar deriva antigènica i molt probablement sigui el
responsable dels més de 115 serotips diferents que presenten els Rhinovirus. A més, els
antígens d’aquests 115 serotips connecten pel lloc de reconeixement I-CAM amb un receptor
que està poc accessible.
Un altre virus que pot esquivar el nostre sistema immunitari és el de la febre aftosa, en
anglès conegut com Foot and mouth virus. Aquest virus reconeix integrines, en 3 aminoàcids:
RGD. Per aconseguir infectar, només manté aquests 3 aminoàcids i muta constantment els
aminoàcids del voltant. Això evita que els anticossos reconeguin el virus, ja que necessiten
10 aminoàcids constants.
El virió. La microscòpia crio-electrònica té una resolució d’entre 3.3 i 20 Armstrongs. Això
significa que la seva resolució és superior a la que dona el TEM, però que és pitjor que la que
es pot obtenir per difracció de rajos X.
Normalment no es pot veure el material genètic en la difracció de rajos X, ja que no solen
tenir la mateixa distribució i orientació espacial. S’ha pogut veure, però, la condensació del
mateix ja que és quan queda fixat a la càpsida.
Apart de les proteïnes integrants del virió, hi ha altres proteïnes que també poden ser-hi
presents, com polimerases, integrases, proteases, poly(A) polimerases, topoisomerases,
canals iònics... Aquests últims poden arribar a tenir una funció molt important dins el cicle
víric, com la introducció de protons per alliberar les ribonucleoproteïnes. També es poden
arribar a trobar activadors, degradants de mRNA, mRNAs, histones, tRNAs, lípids...
Virologia 2020
CEBIO 47
Capítol 5 – Genètica i genomes vírics.
La classificació de Baltimore i variabilitat genètica. El 1976, un científic anomenat David Baltimore va decidir aprofitar tots els seus
coneixements sobre els virus per realitzar-ne una classificació en funció del tipus de
material genètic que hi ha en el virió. Així i tot, no tots els virus amb el mateix tipus de
material genètic es comporten igual, sinó que Baltimore va classificar els diferents tipus de
virus també en funció de l’estratègia que seguissin per generar el mRNA a partir d’aquest.
Baltimore va classificar tot el món viral en 6 tipus de genomes. Més tard, però, en va aparèixer
un sèptim. David Baltimore encara està viu i té 83 anys. La imatge està extreta de ViralZone,
SIB Swiss Institute of Bioinformatics
El primer tipus de virus en la classificació de Baltimore són els virus de doble cadena
de DNA. D’aquests, la cadena negativa és la que servirà de motlle per generar l’RNA
missatger. El segon grup és el de cadena senzilla positiva de DNA. El primer que han de
fer aquests virus és generar la seva cadena complementària negativa, a partir de la qual es
generarà la cadena de RNA missatger positiva. El tercer grup és el de RNA de doble
cadena. En aquest cas, la cadena negativa servirà de motlle per generar la positiva. El quart
grup és els de RNA de cadena senzilla positiva. En una gran part dels virus d’aquest grup
la pròpia cadena de RNA es traduirà directament, però algunes famílies (com el coronavirus)
necessiten fer un intermediari de RNA negatiu per generar una cadena de RNA positiu. El
cinquè grup és el dels virus amb genomes de RNA de cadena negativa, la qual servirà
de motlle per generar el RNA de cadena positiva. El sisè grup és el dels genomes amb
RNA de cadena positiva però amb activitat transcriptasa inversa. Els virus d’aquest grup
es compliquen bastant la vida, doncs han de generar un intermediari de DNA de cadena
negativa que, al seu torn, serà un motlle per un DNA de doble cadena a partir del qual es
generarà un RNA missatger positiu.
Els virus del 7è grup, el que no estava en la classificació original, són de DNA de doble
cadena, una de les quals té espais i tenen activitat transcriptasa inversa. Per tant, la
seva manera de generar mRNA és formar una cadena de DNA completa a partir de la cadena
amb espais i d’allà generar el mRNA de cadena positiva.
Virologia 2020
CEBIO 48
Presumpcions de la classificació de Baltimore.
Per entendre l’esquema de Baltimore cal tenir en compte que, per conveni, el sentit del
mRNA que serà traduït és sempre cadena positiva. El seu equivalent en DNA serà també
cadena positiva. En conseqüència, els complementaris d’aquestes cadenes els considerarem
cadenes negatives. Per tant, les cadenes negatives sempre seran les que es faran servir de
motlle. Per altra banda, es considera que el mRNA ja està preparat per ser traduït. Això
si, no perquè un RNA sigui positiu significa que es tradueixi directament. N’hi ha que
generaran o seran intermediaris.
Els set tipus de genomes vírics.
Segons la classificació de Baltimore, en funció de la varietat genòmica hi ha 7 tipus de
genomes vírics:
I. Doble cadena de DNA
II. Cadena senzilla de DNA
III. Doble cadena de RNA
IV. Cadena senzilla de RNA amb polaritat positiva
V. Cadena senzilla de RNA amb polaritat negativa
VI. Cadena senzilla de RNA amb polaritat positiva i amb un intermediari de DNA
VII. Doble cadena de DNA amb espais
D’aquests genomes, els virus dels grups VI i VII aconsegueixen generar la cadena de mRNA
al final d’una sèrie de passos en els quals participa la transcriptasa inversa.
La classificació de Baltimore demostra que existeix una gran varietat de genomes
vírics. El que no mostra, però, és la gran varietat que també hi ha en quant a l’estructura
d’aquests genomes. Resulta que els genomes vírics poden ser lineals, circulars, fragmentats
o segmentats i poden estar sols o units a proteïnes, a un altre DNA o a un altre RNA.
Així doncs, és evident que hi ha una gran variabilitat en els genomes vírics. No se’n sap
exactament el motiu, però es creu que és fruit d’una evolució vírica. Tenint en compte que
també es creu que l’origen de la vida és el RNA, s’ha d’acceptar que els virus de DNA són
variants evolutives de virus de RNA que han sortit beneficiades del seu tipus de
genoma. No és estrany, doncs els genomes de DNA atorguen avantatges tals com un
sistema de correcció de mutacions. Malgrat tot, hi continua havent virus de RNA. Això implica
que a algunes variants evolutives els ha estat convenient tenir un material genètic basat en
el RNA, més tendent a mutacions. Unes mutacions, però, que poden ser deletèries o
favorables a l’adaptació a les condicions de l’entorn.
Cal memoritzar la classificació de Baltimore. Això significa haver de recordar la quantitat
de genomes diferents i els seus mecanismes de formació del mRNA, així com les principals
famílies que formen part de cadascun.
Virologia 2020
CEBIO 49
Grup de Baltimore Tipus de Genoma Família Vírica Representant
I dsDNA Adenoviridae i Herpesviridae
II ssDNA Parvoviridae i Circoviridae
III dsRNA Rotaviridae
IV ssRNA (+) Coronaviridae i Picornaviridae
V ssRNA (-) Influenza i Ebolavirus
VI Rt ssRNA (+) Retroviridae
VII Rt dsDNA Hepadnaviridae
Mida del Genoma víric.
També existeix una gran variabilitat entre espècies víriques en quant a la mida del
genoma. I és que resulta que, entre dues espècies víriques, la mida del genoma es pot veure
multiplicada per un factor de 100: dos ordres de magnitud en bases nucleotídiques. No és
una variabilitat gaire fàcil de comprendre’n l’existència, doncs un virus tan sols requereix de
3 gens per tal de poder-se replicar.
Així i tot, les observacions indiquen que els virus amb un genoma de DNA solen tenir més
bases que els de RNA. L’explicació d’aquest fenomen potser és el més fàcil, doncs la
resposta es resumeix en què és perquè s’ho poden permetre. La gràcia de disposar d’un
sistema de correcció de mutacions que els virus de RNA no tenen permet ampliar la
quantitat de bases en les que es poden distribuir els gens. L’eficiència del sistema de
correcció és tal que les mutacions en DNA es compten en una per milió de bases replicades,
mentre que en els de RNA la taxa és d’una per cada deu mil. A partir d’aquestes dades
s’extreu que si el genoma d’un virus de RNA fos massa gran, s’acumularien tantes mutacions
que la descendència tindria poques possibilitats de ser viable, el que els empeny a tenir un
genoma més petit.
Mutacions en virus de DNA
1 / 1,000,000
Mutacions en virus de RNA
1 / 10,000
Virologia 2020
CEBIO 50
Hi ha virus amb un genoma molt petit, de fins a 1.2kb, però són virus satèl·lits. Són virus
que necessiten que hi hagi altres virus coinfectant. N’hi ha d’aquests tipus en animals, com
els virus adenoassociats o el de l’hepatitis Bδ, que necessita d’una coinfecció amb el virus de
la hepatitis B.
Seqüenciació dels genomes Vírics. Els genomes petits aconsegueixen ser-ho perquè molts virus fan servir “trucs” que els
permeten aprofitar al màxim el seu genoma. Per exemple, hi ha virus que poden arribar a
generar 2000 aminoàcids en 1000 parells de bases. Un dels “trucs” és aprofitar els 3 marcs
de lectura. Això permet produir vàries proteïnes a partir d’una sola cadena de genoma. Un
dels virus que realitza això és el del VIH.
Estructura gènica del VIH.
Els Retroviridae causants de la Síndrome de la Immunodeficiència Adquirida (SIDA) generen
les poliproteïnes de la càpsida en un marc de lectura, les glicoproteïnes de l’embolcall en un
altre i la transcriptasa inversa i la resta de proteïnes essencials del cicle víric en un tercer.
Així es pot observar com un virus tan sofisticat com el VIH pot tenir un genoma tan petit
com 10,000 parells de bases. Això és perquè realment aprofita els tres marcs de lectura fins
i tot amb regions on es poden produir tres proteïnes però en marcs de lectura diferents.
Genomes complexos.
Tal i com hem fet referència abans, les mides dels genomes tenen una gran variabilitat,
tal i com es pot observar comparant el VIH amb el bacteriòfag T4. Malgrat infectar bacteris,
el que suposadament li hauria de simplificar la tasca i hauria de portar al bacteriòfag a tenir
un genoma més petit, el T4 té els seus gens agrupats entre estructurals i no estructurals.
Aquesta agrupació no és pas metafòrica, sinó que ve marcada per la posició d’aquests gens
en el genoma i és un fenomen que succeeix molt en bacteriòfags. En el cas del Fag T4, hi ha
molts més gens que en el VIH i es troben distribuïts en molta més quantitat de genoma.
Genomes simples.
Al costat oposat de la bàscula del fag T4 trobem el virus humà de la hepatitis B. Aquest
Hepadnaviridae codifica per 7 gens en 2,500 nucleòtids. Per aconseguir-ho, aquestes
proteïnes s’han hagut de trobar solapades en el seu genoma, també fent servir diferents
marcs de lectura.
Al mateix costat de la balança que els Hepadnaviridae, causants de la Hepatitis B humana,
trobem els Adenoviridae. Aquesta espècie vírica forma part del grup I de la classificació de
Baltimore, doncs el seu genoma és una doble
cadena de DNA. Els Adenoviridae fan servir
una tàctica compartida amb molts altres virus
del seu mateix grup: codificar gens en
ambdues cadenes de DNA. Això permet que
1,000 nucleòtids puguin acabar sent 2,000
aminoàcids: obtinguts de les dues cadenes i
els seus 3 marcs de lectura per cadascuna.
En la majoria dels virus de DNA, els gens produeixen mRNA en diferents moments del
temps. Així es pot parlar de gens molt primerencs, gens primerencs i gens tardans. En
general, els gens primerencs i els molt primerencs solen codificar per proteïnes no
estructurals i són els primers en traduir-se, mentre que els gens tardans solen ser estructurals
per acabar de generar el virió i es tradueixen al final.
Virologia 2020
CEBIO 51
Informació codificada en els genomes vírics.
La informació que es pot trobar en els genomes dels virus són els productes gènics i
senyals reguladores. Aquestes senyals reguladores controlen els estadis de:
Informació NO codificada en els genomes vírics.
En canvi, hi ha una sèrie d’informacions que no s’ha trobat en cap dels genomes dels
virus coneguts per l’espècie humana. La informació que els virus no solen tenir consisteix
en:
• Els gens codificants per tota la maquinària de síntesi proteica.
• Els centròmers o telòmers que es poden trobar en els seus hostes.
• Els gens que codifiquen per producció d’energia o la biosíntesi de membranes.
Cal especificar aquí l’excepció dels Mimiviridae. Aquests són una espècie de virus molt
concreta que és molt gran i que codifica per més gens que cap altre tipus de virus.
Genomes de DNA de doble cadena. Les famílies víriques amb un genoma de DNA de doble cadena
que infecten mamífers són els Adenoviridae, els
Hepadnaviridae, els Herpesviridae, els Polyomaviridae , els
Polyomaviridae i els Poxviridae. La imatge està extreta de
ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Els virus amb genomes de DNA de doble cadena fan servir
la cadena negativa de DNA com a motlle per produir el
mRNA. Per tal de produir més genoma durant el cicle víric, es la
replicació és semi-conservativa. Dit d’una altra manera,
cadascuna de les cadenes de DNA serveix de motlle per
generar-ne la complementària.
Hi ha virus el genoma de DNA de doble cadena dels quals
és molt senzill i petit, com els genomes dels Polyomaviridae, o
els del Polyomaviridae. Aquests genomes aconsegueixen ser
tan petits perquè fan servir la DNA polimerasa de la cèl·lula
hoste per replicar-se.
Però també hi ha genomes grans i complexes, com els dels
Adenoviridae, Herpesviridae o Poxviridae, que codifiquen per la
seva pròpia DNA polimerasa.
En general, els virus de DNA entren al nucli per fer la
replicació. Així i tot, alguns virus grans com els Poxviridae ni tan
s’hi acosten. Els virus d’aquesta família es queden al citoplasma
perquè no necessiten les polimerases de la cèl·lula hoste.
Expressió gènica dels Herpesviridae.
El virus herpes entra a la cèl·lula hoste i injecta el genoma dins del nucli a través dels
porus nuclears. El primer que es comença a expressar són els gens immediatament
primerencs, anomenats gens α.
Replicació del genoma víric
Assemblatge i empaquetament
del genoma
Regulació i temporització del
cicle replicatiu
Modulació de les defenses de
l’hoste
Transmissió a altres cèl·lules i
hostes
Virologia 2020
CEBIO 52
La transcripció i traducció dels gens α produeix factors de transcripció que tornaran a entrar
al nucli. Aquests factors inhibeixen la seva pròpia expressió però estimulen la dels gens
primerencs i estructurals, els quals reben el nom de gens β i γ, respectivament. Per això, quan
hi ha una segona onada de transcripció ja quasi no s’expressa cap gen α i es troben grans
quantitats dels β i γ.
Els gens β codifiquen per factors de transcripció que inhibeixen l’expressió dels gens α i β
però que augmenten la dels gens γ. Aquesta és una de les moltes maneres que tenen els
virus per assegurar la transcripció ordenada dels gens immediats primerencs, els primerencs
i els gens estructurals o tardans.
Genomes de DNA de cadena senzilla. Els virus amb el genoma de DNA de cadena senzilla simplement han de formar una
doble cadena de DNA, la cadena negativa de la qual servirà de motlle per la formació del
RNA missatger que es traduirà en proteïnes. Aquesta doble cadena de DNA també serà
l’intermediari replicatiu que donarà lloc a les noves cadenes de DNA. La imatge està extreta
de ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Com a exemples d’aquests virus està el TT, de la família Circoviridae.
És un virus petit i circular que no es troba associat a cap malaltia
humana malgrat estar present en molts individus.
També tenen un genoma de DNA de cadena senzilla els membres
de la família Parvoviridae, la qual també solen ser genomes molt
petits. El principal representant d’aquesta família és el Parvovirus
B19, que causa una malaltia exantemàtica7 en nens que no sol ser
molt greu.
Genomes de RNA. Els genomes de RNA tenen un problema en la replicació, doncs les cèl·lules hoste no
disposen de RNA polimerases dependents de RNA. Per tant, els virus de RNA es veuen
obligats a codificar aquests enzims en el seu genoma. Serà gràcies a aquestes polimerases
que generaran els mRNA i les còpies del seu genoma.
Genomes de RNA de doble cadena
La principal estratègia dels genomes de doble cadena de RNA consisteix en fer servir
la cadena negativa per generar cadenes positives, les qual serviran com a RNA missatger
que serà traduït a proteïnes i com a intermediari replicatiu per produir noves còpies del
genoma. La cadena negativa de RNA es replicarà a positiva per tal que sigui traduïda a
proteïnes. La cadena positiva servirà com a intermediari replicatiu per formar més còpies del
genoma. Aquest procés es realitza dins la càpsida quan es troba en l’endosoma, on es
digereix la càpsida externa.
El genoma de la família Reoviridae, un virus de RNA de doble cadena, és com la gran majoria
de virus del mateix grup de Baltimore: segmentat.
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat positiva.
Les principals famílies de virus que tenen un genoma de RNA de cadena senzilla són els
Picornaviridae, els Caliciviridae, i els Astroviridae, els Coronaviridae, els Arteriviridae, els
Flaviviridae i els Togaviridae.
7 Erupció vermellosa de la pell, difusa o en clapes i relativament estesa.
Virologia 2020
CEBIO 53
Dins dels Picornaviridae trobem els Poliovirus o els Rhinovirus. Tant els Astroviridae com els
Caliciviridae són virus responsables de gastroenteritis. Els Flaviviridae són els virus causants
de l’Hepatitis C i de la Febre Groga.
No existeix una diferència clara entre els genomes vírics de RNA de cadena senzilla
positiva i els mRNA que fan servir per expressar les proteïnes codificades al genoma.
Això és perquè tots els genomes de RNA de cadena senzilla positiva tenen la seva proteïna
Cap, la seva cua poli-A... Tots excepte els de la família Picornaviridae, en la que es troben
els Poliovirus i els Rhinovirus. En aquesta família vírica, l’extrem del RNA missatger no conté
una proteïna Cap. Enlloc d’això, hi té una proteïna vírica VPg seguida d’una seqüència IRES.
En conseqüència, la traducció en els genomes dels Picornaviridae comença més endins.
Els virus amb un genoma de RNA de cadena senzilla i de polaritat positiva no tenen
una estratègia per produir RNA missatger, doncs el seu genoma ja es comporta com a tal.
Igual que els Picornaviridae eren l’excepció en l’inici de la traducció, els Coronaviridae són
l’excepció en la producció de RNA missatger. Els virus de la família Coronaviridae produeixen
un intermediari de RNA de cadena negativa que es pot fer servir com a motlle per generar un
mRNA o com a intermediaris replicatius del genoma.
El primer procés que realitza un virus amb un genoma de RNA de cadena senzilla i
polaritat positiva dins la cèl·lula és el de la traducció completa del genoma. El resultat
d’aquest procés és una poliproteïna gegant que s’anirà partint en diferents fragments. La
fragmentació és una cascada de proteòlisis on primer es produeixen els fragments P1, P2 i
P3. Posteriorment, cadascun d’aquests serà proteolitzat en diferents fragments fins que es
formin totes les proteïnes separades. Aquest procés ocorre en cascada i de manera
ordenada. La proteòlisi que va passant en cascada pot passar en cis si les seqüències
s’autoproteolitzen, o en trans si les seqüències són proteolitzades per alguna proteïna que
s’acaba de produir.
Les noves còpies del genoma es faran a partir de les cadenes de RNA genòmic i no a
partir dels mRNA que ha produït la cèl·lula hoste. Això és així perquè els genomes vírics són
perfectament distingibles gràcies a unes estructures específiques, com fulles de trèvol o Cres
(cis-acting RNA element). D’aquesta manera, el virus és capaç de distingir els seus RNA
propis dels de l’hoste alhora de realitzar còpies del genoma.
En el cas específic dels Coronaviridae, el genoma no es tradueix sencer en entrar a la
cèl·lula hoste. Del RNA víric tan sols es tradueix la seqüència codificant per a la RNA
polimerasa. Aquesta RNA polimerasa permetrà que es produeixin cadenes negatives del RNA
genòmic. Les cadenes de RNA negatives poden servir com a intermediari replicatiu o com a
motlle per produir RNA missatgers. Així és com els Coronaviridae aconsegueixen separar la
replicació del genoma de la producció de proteïnes víriques.
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat negativa..
Les principals famílies de virus de RNA de cadena senzilla de polaritat negativa que infecten
humans són els Paramyxoviridae, els Rhabdoviridae, els Bornaviridae, els Filoviridae, els
Orthomyxoviridae i els Arenaviridae.
Existeixen dos tipus de genomes de RNA de cadena senzilla negativa. O bé el genoma
forma una única molècula o bé el genoma està segmentat. Són virus amb genomes d’una
sola molècula els de les famílies Paramyxoviridae i Rhabdoviridae, per exemple. Són virus
amb genomes segmentats els de la família Orthomyxoviridae.
Virologia 2020
CEBIO 54
L’estratègia dels virus de RNA de cadena senzilla negativa per generar proteïnes
consisteix en fer una còpia en sentit positiu del RNA genòmic. El mateix procediment es
fa servir per generar intermediaris replicatius a partir dels quals es faran còpies del genoma.
La formació de RNA missatger o de còpies del genoma ve determinada per la proteïna
N. En entrar a la cèl·lula, es generarà una còpia de RNA missatger i s’aniran traduint les
diferents proteïnes. Una d’aquestes serà la proteïna N, la qual serveix com a antiterminador.
La proteïna N provoca que, enlloc de formar-se còpies de RNA missatger, es doni una còpia
llarga i complementària del genoma. Aquesta proteïna s’uneix a la maquinària de replicació i
provoca que la replicació, enlloc de parar-se al codó stop dels mRNA, continuï i es formi la
cadena completa. Aquesta còpia completa és l’intermediari replicatiu.
El virus de la ràbia és un virus amb un genoma de RNA de cadena senzilla negativa. El
virus, quan s’introdueix en l’hoste, fa servir el genoma com a motlle per generar mRNA que
seran traduïts. Per l’altre costat, el genoma també servirà de motlle per a cadenes positives
de RNA intermediàries replicatives del genoma.
Mentre que els virus de DNA, per regla general, van al nucli a fer servir la maquinària cel·lular
que hi és present, els virus RNA es mantenen al citoplasma perquè no la poden fer servir.
Així i tot, hi ha dues excepcions: els virus DNA que es queden al citoplasma com els
Poxviridae i virus de RNA que van al nucli com el virus Influenza.
Cicle víric del virus Influenza.
El virus Influenza, de la família
Orthomyxoviridae, no només és RNA de cadena
negativa. També està segmentat. En el seu cicle
víric, el genoma del virus entra al nucli
malgrat no pugui fer servir les polimerases
de la cèl·lula hoste. Al nucli es realitza la còpia
positiva de cada segment de RNA i les còpies
surten al citoplasma per traduir-se. A més, cada
segment servirà de motlle per produir
intermediaris replicatius de cadena positiva que,
al seu torn, serviran de motlle per produir noves còpies del genoma.
Cada segment del genoma del virus Influenza dona lloc a un RNA missatger que serà
traduït a una proteïna. Tots excepte en el cas del primer segment, que dona lloc a dues
proteïnes per frameshift, i en el cas dels segments 7 i 8, que generaran 2 mRNA per splicing
alternatiu cadascun, pel que es generaran 4 proteïnes.
Intercanvi de genomes segmentats.
Els genomes segmentats presenten un avantatge evolutiu sorgit d’un error en el seu
funcionament. En les infeccions virals es pot donar que dos virions introdueixin el seu genoma
dins del mateix hoste. Quan això passa amb dos virus d genomes segmentats, l’encapsidació
pot ser que no es doni del tot correctament i que acabi generant partícules víriques amb
segments gènics de diferents soques. Com que el resultat és una sola soca amb
característiques de les altres dues, es considera que la nova soca és fruit de l’antigenic shift.
Aquest procediment succeeix molt amb el virus de la grip, pel que cada any apareixen nous
serotips davant els quals no estem preparats.
Expressió gènica dels genomes amb RNA de cadenes ambisense.
Hi ha dos exemples de famílies de RNA ambisense: l’Arenaviridae i la Bunyaviridae. La
família Arenaviridae inclou els virus responsables de la coriomeninigitis limfocítica, la febre
Virologia 2020
CEBIO 55
de l’ase, les febres hemorràgiques... La família Bunyaviridae inclou virus responsables de la
febre de la vall del rift, el síndrome pulmonar...
Ambdues famílies tenen genomes segmentats. Uns segments són de cadena negativa i es
comporten com el genoma dels virus amb tan sols un RNA de cadena negativa. Altres
segments, però, són ambisense. La família Arenaviridae, per exemple, té un segment
anomenat L, de cadena negativa, i un altre anomenat S, que és l’ambisense.
Quan el virus infecta la cèl·lula, la part negativa del fragment S servirà de motlle per
produir un RNA missatger que donarà lloc a la proteïna N. Aquesta proteïna N no és
estructural, és un enzim que ajudarà a aquesta part del genoma a produir la seva cadena
complementària, l’intermediari replicatiu. En aquest intermediari el que era negatiu en el
segment original ara és positiu i el que era positiu ara és negatiu. Tot gràcies a la proteïna N.
L’intermediari replicatiu servirà de motlle per generar noves còpies del genoma. Per
altra banda, en tenir una zona negativa que abans era positiva, també servirà de motlle per
produir un mRNA que, al seu torn, es traduirà en una proteïna. Aquesta és una glicoproteïna
estructural.
Hi ha una estructura del genoma que permet distingir físicament la part negativa de la
positiva del fragment S. Aquesta estructura és la responsable d’aturar la formació del RNA
missatger en arribar a la part positiva. No passa això un cop s’ha sintetitzat la proteïna N,
doncs actua d’antiterminador. Per tant, quan es disposa de la proteïna N es llegeix tot el
segment i es fa una còpia complementària del mateix, el que serà l’intermediari replicatiu. El
mateix passa per la formació de totes les còpies del genoma.
Genomes de RNA de cadena senzilla amb polaritat positiva i intermediari de DNA.
El grup dels virus de RNA de cadena senzilla però que tenen activitat transcriptasa inversa
està clarament representada per la família Retroviridae. Dins d’aquesta família destaquen dos
patògens. El virus causant de la SIDA, el VIH, i el virus T-limfotròpic humà, el VTLH.
L’estratègia dels Retroviridae per formar noves proteïnes i intermediaris del genoma és molt
complexa. Malgrat el seu genoma és un RNA de cadena senzilla positiva, els Retroviridae
produeixen una cadena de DNA complementària en sentit negatiu. Aquesta cadena
servirà de motlle per generar una de DNA en sentit positiu. La doble cadena de DNA
s’anomena provirus. Cal que les dues cadenes del provirus es separin en el moment de la
transcripció, doncs la cadena negativa serveix de motlle per generar RNA missatger que es
tradueix a proteïnes i per generar noves còpies del genoma.
Un cop ha entrat dins l’hoste, la primera activitat que tenen els VIH és la transcripció
inversa del seu genoma. Amb aquesta activitat que realitza la retrotranscriptasa, els VIH
aconsegueixen formar una cadena de DNA amb sentit negatiu. Al generar-ne la cadena
complementària, el virus ja no necessita actuar. La cèl·lula hoste s’encarrega de circularitzar
el DNA i introduir-lo al nucli. Un cop dins del nucli, el provirus s’integra al genoma de la cèl·lula
hoste i es comporta com un gen més. És tanta la similitud amb un gen qualsevol que el
provirus té un promotor únic.
A partir del provirus integrat es generen els RNA per procés de transcripció. Les
cadenes de RNA generades es separen en RNA missatgers i en cadenes de RNA positives
que s’encapsidaran. Els mRNA es traduiran al citoplasma per produir poliproteïnes, les quals
seran processades en proteïnes víriques individuals. Pot ser que els RNA realitzin splicing
alternatiu per generar glicoproteïnes, les quals es situaran a la membrana de la cèl·lula hoste
i formaran part de l’envolta del virus.
Virologia 2020
CEBIO 56
El fet que els Retroviridae s’insereixin al genoma i ho portin fent milions d’anys al llarg de
l’evolució ha provocat que un 8% del nostre genoma estigui compost per gens compartit
amb ells. Existeix un gen, el de la sincitina dels Retroviridae, que ha influenciat en la nostra
evolució. La nostra placenta prové, precisament, d’aquest gen. Això ens permet suposar que
alguns gens vírics ja formen part del nostre desenvolupament evolutiu.
Aquests genomes que s’han mantingut incorporats han patit tantes mutacions al llarg
del temps que ja no tenen activitat vírica. Però de vegades queda alguna traça d’activitat
transcriptasa inversa. Aquestes traces provoquen que hi hagi RNA missatger propi que s’hagi
inserit en el nostre genoma un altre cop. Això deriva en l’existència de pseudogens, el que
pot causar malalties en alguns casos.
El fet que el genoma dels Retroviridae sigui diploide (que tingui dues còpies del mateix) li
confereix un avantatge. S’ha vist que els Retroviridae són bastant resistents a les
radiacions ionitzants com les dels rajos UV, que haurien de provocar tantes mutacions
que impedirien al virus replicar-se. El que també s’ha comprovat és que els Retroviridae
realitzen una espècie de recombinació on, a partir d’un genoma en paral·lel i del qual s’està
realitzant la cadena complementària, es pot donar un salt de cadena per part de la polimerasa.
Aquest procés acaba realitzant una cadena complementària que, en el fons, és un híbrid de
totes dues cadenes. Gràcies a això, malgrat haver-hi moltes mutacions a cada cadena, la
seqüència de DNA que es formi no contindrà les mutacions de les altres dues.
Genomes de DNA de doble cadena Espaiats.
Els virus amb doble cadena de DNA amb espais es troben principalment representats per la
família Hepadnaviridae, amb el virus de l’hepatitis B com a màxim exponent. El virus de
l’hepatitis B n’és un amb un genoma molt petit compost per una doble cadena circular oberta
a la cadena positiva de la qual li falta un fragment per completar-se. Es creu que no està
completa perquè faltaven nucleòtids trifosfat per fer la doble cadena amb la transcriptasa
inversa.
A més de tenir una proteïna unida en un extrem de la cadena negativa, el genoma del virus
de l’hepatitis B té un fragment de RNA unit a l’extrem de la cadena positiva. Es pensa que
aquest fragment de RNA és el propi primer que fa servir la transcriptasa inversa per generar
el DNA de doble cadena.
Aquests virus primer formen la doble cadena de DNA. A partir de la cadena negativa
d’aquesta es generen els RNA missatgers que es traduiran a proteïnes i un altre RNA cadena
positiva que serà com un intermediari replicatiu d’aquests virus que s’anomena pre-genoma i
a partir del qual la transcriptasa inversa generarà una còpia complementària negativa de DNA
i després una doble cadena de DNA però altre cop amb espais buits.
Expressió gènica en el Virus de l’Hepatitis B.
Els Hepadnaviridae, quan entren a la cèl·lula hoste, envien el genoma al nucli i la polimerasa
del virus n’acaba d’arreglar els espais que falten a la doble cadena del DNA. El resultat
és una doble cadena de DNA circular covalentment tancat i superenrotllat a partir del qual,
mitjançant la RNA polimerasa de la cèl·lula hoste, es produiran RNA missatgers que sortiran
al citoplasma i produiran proteïnes. Alhora, també es produirà un pre-genoma que sortirà al
citoplasma, s’encapsidarà i rebrà l’actuació de la transcriptasa inversa per convertir-se en una
doble cadena de DNA amb espais.
Virologia 2020
CEBIO 57
Succeeix el contrari que amb els Retroviridae. Aquests, quan entren a la cèl·lula hoste, el
primer que fan és l’activitat transcriptasa inversa. En el cas dels Hepadnaviridae, en canvi,
l’activitat transcriptasa inversa és l’últim que es fa abans de sortir de l’hoste.
Expressió gènica en els genomes de RNA. Com hem pogut comprovar al llarg del tema, hi ha virus de RNA amb transcriptasa als virions
i n’hi ha que no. D’igual manera, existeixen virus de RNA que tenen capacitat infectiva i n’hi
ha que no. Tan sols aquells virus que tenen un genoma de RNA de cadena positiva
sense activitat transcriptasa inversa són capaços d’infectar per si sols. La resta
requereixen d’una transcriptasa inversa perquè la cèl·lula hoste no disposa d’una DNA
polimerasa dependent de RNA. Arran d’això, aquests virus no tenen un genoma infectiu.
Per altra banda, la primera acció que realitzen els virus de RNA de cadena positiva no
és pas una transcripció sinó una traducció. Això els beneficia en no haver de portar la
proteïna en el virió. Per suposat, tots han de portar la RNA polimerasa depenent de RNA com
a gen. Els virus de RNA de cadena positiva, però, són els únics que no la necessiten portar-
la físicament al virió.
Clons infecciosos. En el cas dels virus RNA de cadena positiva, es poden obtenir noves partícules víriques
transfectant el genoma a cèl·lules en cultiu. També podríem, però, infectar amb el virus.
Una altre manera seria convertir el RNA en cDNA i amb aquest transformar les cèl·lules,
obtenint noves partícules víriques. Encara més, es podria fabricar una cadena de RNA a partir
d’aquest cDNA, transfectar i així i tot continuaríem obtenint noves partícules víriques.
Els vectors d’expressió de cDNA sorgits del RNA víric reben el nom de clons
infecciosos. Realment és molt interessant poder-los generar, ja que amplien molt el
coneixement sobre el funcionament dels virus. Per exemple, es pot intentar esbrinar la
importància d’una proteïna amb funció desconeguda obtenint el cDNA i provocant una
mutació en el gen d’interès. Observant com actua el virus aleshores ens permet conèixer-lo
millor. Aquest mètode d’investigació de funcionalitats de gens rep el nom de genètica
inversa.
En canvi, amb la resta dels virus no es pot realitzar genètica inversa ja que el seu
genoma no és infecciós. Per estudiar-los per genètica inversa es sol cotransfectar un cDNA
amb el genoma del virus i un altre amb el gen que codificarà per la RNA polimerasa depenent
de RNA. Amb aquesta doble cotransfecció sí que obtindrem noves partícules víriques.
En el cas dels virus de RNA cadena positiva però amb activitat retrotranscriptasa inversa, la
seva forma provirus té capacitat infecciosa. Per tant, en el cas dels Retroviridae, es pot fer
servir aquest intermediari de DNA.
Virus amb genomes defectuosos. Un fet curiós que s’observa en infeccions amb MOIS molt altes és que, de vegades, es troben
virions complets però amb un genoma defectuós. Això és causa de la coinfecció de la
mateixa cèl·lula hoste per part de partícules víriques amb el genoma en perfecte estat i
d’altres amb el genoma defectuós. Això pot produir que, malgrat es formin virions nous amb
els genomes defectuosos, la resta de proteïnes que fan falta per generar virions complets
siguin aportades per part dels genomes dels virus complets. D’aquesta manera, es pot
classificar el virus complet com virus helper, en tant que ajuda al virus defectuós a formar
partícules víriques normals.
Virologia 2020
CEBIO 58
Capítol 6 – Origen i Evolució dels Virus. L’evolució dels virus és un fenomen molt complex que es pot entendre a partir d’un
model Neodarwinista. En un model Neodarwinista, s’assumeixen dues premisses. La
primera és que existeix una variabilitat genotípica i fenotípica en el conjunt dels virus.
La segona, que existeixen una sèrie de pressions selectives que generen colls
d’ampolla que contribueixen a la selecció dels mutants amb la màxima forma
replicativa.
Propietats dels virus que provoquen que l’evolució vírica sigui extremadament ràpida. Els virus tenen una sèrie de propietats que els diferencien de la resta d’entitats
biològiques i que els permeten tenir una evolució ràpida.
La primera és que els virus tenen una alta freqüència de mutació, sobretot en virus de
RNA i en Retrovirus. Com que les molècules de RNA tenen una taxa de mutació més gran
quan es repliquen, els virus tenen una gran variabilitat genètica. Paral·lelament, arran de
la baixa quantitat de genoma del que disposen molts virus, les mutacions a nivell d’aminoàcid
tenen un efecte fenotípic molt alt, el que també els confereix variabilitat.
Una segona propietat és que els virus tenen una taxa de replicació molt alta. Això no tan
sols comporta que tinguin una gran descendència, sinó que també implica que les poblacions
víriques tenen una mida molt gran.
Finalment, els virus es troben sotmesos a pressions selectives molt fortes, el que permet
que l’evolució vírica es pugui veure, estudiar i analitzar en períodes de temps molt curts
respecte amb altres animals o plantes.
Resumint, les propietats dels virus que provoquen que l’evolució vírica sigui extremadament
ràpida es poden definir com:
Desenvolupaments de Resistències.
Un exemple molt senzill però molt representatiu de qualsevol esdeveniment evolutiu
dels virus és el desenvolupament de resistència als medicaments. El cas més clar, els
medicaments anti-VIH. En la gràfica que aquí es mostra s’hi representa el nombre de
genomes vírics en un organisme infectat pel VIH, altrament dit càrrega vírica, respecte el
temps. En negre es mostren variants vírics sensibles a un fàrmac antiretroviral.
L’inici d’un tractament basat en un únic fàrmac antiretroviral, indicat al gràfic amb una
fletxa horitzontal, permet observar un descens en la càrrega vírica de la persona. Això
es deu a què el fàrmac està fent el seu efecte sobre la major part de la població vírica d’aquest
individu. Ara bé, dins d’aquesta població es troben alguns mutants resistents a l’acció del
fàrmac, marcats de color blau.
Els virus tenen una alta freqüència de mutació
Els virus tenen una gran variabilitat genètica
Les mutacions a nivell d’aminoàcid tenen un efecte fenotípic molt alt
Els virus tenen una taxa de replicació molt alta
Les poblacions víriques tenen una mida molt gran
Els virus es troben sotmesos a pressions selectives molt fortes
Virologia 2020
CEBIO 59
La presència dels mutants fa que el fàrmac
actuï com una pressió selectiva a favor
d’aquests. En conseqüència, posteriorment al
descens de la càrrega vírica, se n’observa un
increment que pot tornar a arribar fins als nivells
inicials. Aquesta nova càrrega vírica, però, ha
canviat la seva població respecte la original, ja
que ara està formada tan sols per virus resistents
a l’antiretroviral.
Per tant, aquest fàrmac antivíric o qualsevol pressió selectiva que pot actuar sobre un
virus crea colls d'ampolla que, en combinació amb la variabilitat fenotípica, donen lloc a la
selecció de les variants més eficients en la nova condició ambiental. Actuar com un coll
d’ampolla significa que l’element antivíric no elimina totes les partícules víriques, sinó que n’hi
ha que poden sobreviure a aquesta pressió selectiva. En aquest context, eficient és un
sinònim d’adaptabilitat, l’habilitat per generar progènia infectiva per unitat de temps.
Fonts de variabilitat genètica en virus. Hi ha molta variabilitat genètica en virus. Això és especialment cert en virus de RNA i
Retroviridae. Aquesta variabilitat genètica prové de la mutació, quantificable per un valor de
freqüència de mutació que es pot obtenir experimentalment, la recombinació i la
reorganització genòmica.
Freqüència de mutació en Genomes de DNA i de RNA.
Els genomes de RNA, incloent-hi els Retroviridae i Retroviridae-like, tenen una freqüència de
mutació molt més alta que la que tenen els virus de DNA. Estem parlant d’una freqüència de
mutació que s’estima que és de l’ordre de 10-4 mutacions per nucleòtid cada cop que es replica
el genoma. Això contrasta amb una freqüència de mutació oscil·lant per les 10-9 mutacions
per nucleòtid per ronda de replicació en virus de DNA i genomes cel·lulars.
Els virus tenen una gran mida de població. Per exemple, s’estima que el nombre de
genomes vírics presents en un individu infectat pel virus de l’hepatitis B o pel VIH pot ser 100
vegades superior a la quantitat d’individus de l’espècia humana vius actualment. Recordem
que és possible que hi hagi 7*109 persones humanes sobre la terra. A més, els virus tenen
una dinàmica poblacional molt alta. Cada dia es poden arribar a eliminar i reemplaçar el
50% de les partícules víriques del virus de l’hepatitis B i el 90% de les partícules víriques del
VIH d’un organisme.
Una única mutació a nivell d’aminoàcid a les proteïnes del virus pot tenir un efecte
fenotípic molt alt, alterant les característiques biològiques del virus i, per tant, alterant la
seva adaptabilitat.
10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
DNA cel·lular Genomes RNA
Hipomutabilitat Hipermutabilitat
Virologia 2020
CEBIO 60
Canvis en el medi víric.
Les pressions selectives venen donades per diferents factors. Com hem vist
anteriorment, algunes pressions selectives poden venir donades per la resposta immunitària
de l’hoste o fruit d’un tractament amb medicaments anti-virals. Així i tot, existeixen altres tipus
de pressions selectives. Una d’elles és el canvi d’ambient.
Els canvis d’ambient tant poden ser a nivell d’organisme hoste o a nivell de teixit. Quan
es dona un canvi d’ambient, la major part de les partícules víriques que es trobin en aquest
nou entorn no es podran multiplicar. Malgrat tot, és possible que hi hagi algun variant genètic
amb un fort impacte fenotípic que permeti la multiplicació d’algunes partícules víriques. En
aquest cas, els virus amb la mutació podran colonitzar aquest nou entorn tot creant una nova
espècie vírica o creant una nova patologia associada a la mateixa espècie.
Els virus tenen una gran variabilitat genètica, pel que es fa difícil establir espècies víriques
en funció d’una única seqüència de nucleòtids. Els virus amb més variabilitat genètica són
els de RNA i els de la família Retroviridae. És per això que les espècies víriques agrupen una
gran quantitat de genomes que tenen una gran relació entre ells malgrat no ser iguals.
Les poblacions de virus RNA o de Retroviridae solen ser molt heterogènies. Enlloc de
definir espècies, doncs, es defineixen quasiespècies, conjunts heterogenis de variants
gèniques d’un mateix virus d’una població. Cada quasiespècie té una seqüència consens
feta a partir de les coincidències del màxim de seqüències dins la població. També
existeix una seqüència màster diferent de la de consens. Una seqüència màster és aquella
seqüència òptima per la replicació del virus en l’entorn que es troba la població.
Suposem una població vírica A on el virus no comet cap error durant el procés de multiplicació
i tots els virions tenen la mateixa seqüència. Aquest és un virus amb una capacitat infectiva
perfecte en el seu estat, pel que no para de replicar. Suposem, també, una població vírica B
on tenim una quasiespècie amb la mateixa seqüència consens que la espècie A. És una
població vírica plena de mutants, però. Alguns amb molt mala adaptació i altres amb molt
bona.
Si disposéssim les dues poblacions víriques en el mateix entorn i aquest fos l’ideal per
l’espècie A, ens trobaríem que aquesta no pararia d’expandir-se mentre que la quasiespècie
B no avançaria gaire. Si, en canvi, el que fem és provocar un canvi en les condicions de
l’entorn, observarem com una de les dues poblacions es mor. És la A.
Certament, el fet que no hi haguessin mutacions permetia a l’espècie imaginària A mantenir-
se en el seu estat natural, sempre sota les mateixes condicions. El problema està en quant hi
ha un canvi en les mateixes, doncs la manca de mutabilitat la converteix en ineficient en la
replicació, fet diferent a un dels mutants de la quasiespècie B, que ha aconseguit replicar-se
sense parar i generar una nova subespècie.
La variabilitat d’una subespècie vírica depèn de la seva capacitat de mutació i de l’espai
de seqüència. Un espai de seqüència és la quantitat total de seqüències possibles que
podrien existir que tinguessin la mateixa longitud que el genoma del virus. Una altra manera
d’entendre-ho és la quantitat de permutacions que defineixen tots els possibles mutants. Per
exemplificar-ho, suposarem el següent:
Virologia 2020
CEBIO 61
La construcció d’espais de seqüències es fan per estudiar in silico les evolucions dels
virus. Es sol fer a partir de seqüències virtuals que representen totes les possibles
combinacions del virus.
Els espais de seqüència senzills es poden representar en un pla. En aquest, cada
coordenada és un genoma concret amb una seqüència única. Quan es fa això, una
quasiespècie s’observa amb un genoma en molt alta proporció rodejat d’altres genomes en
proporcions més baixes. El primer seria la seqüència màster d’aquella quasiespècie, mentre
que la quantitat de pics que el rodegin es veurà definida per la taxa de mutació i de fixació de
la mutació de la quasiespècie. Com més gran sigui la taxa de mutació, més seqüències hi
haurà al voltant.
Les pressions selectives que actuen sobre els virus ho fan en l’interior de l’organisme
hoste infectat i durant el procés de transmissió. En aquest segon cas, actuen mitjançant
els paràmetres ambientals que tendeixen a la destrucció de la infectivitat vírica. En
conseqüència, podem considerar que les partícules víriques infeccioses són supervivents de
les pressions selectives que es donen dins l’hoste i de les pressions que es donen fora del
mateix.
La coevolució.
L’any 1859, el conill europeu es va introduir a Austràlia per poder caçar-lo. Sense cap
depredador natural, es va reproduir en proporcions de plaga en molt poc temps. Durant la
dècada del 1950, en un intent d’eliminar tots els conills del país, es va alliberar el virus
Myxoma leporipox. Els hostes naturals d’aquest virus són el Sylvilagus, el Conill de Bachman
i els conills de bosc tropical de Centre-Amèrica i Sud-Amèrica. El virus es transmet per mitjà
dels mosquits i permet detectar els conills infectats perquè desenvolupen berrugues a les
orelles. Com que els conills europeus que s’havien alliberat a Austràlia eren una espècie
diferent als hostes naturals d’aquest virus, la infecció tenia una taxa de letalitat d’entre el 90 i
el 99%.
La tendència general de les infeccions víriques en noves poblacions d’hostes és que
les soques dels virus que circulen es vagin fent menys virulentes. De la mateixa manera,
també existeix una tendència natural que provoca que les poblacions hostes es vagin fent
més resistents al mateix.
En el primer any de l’alliberació del virus, l’eficiència de la tècnica va ser altíssima, doncs la
taxa de mortalitat en els conills va ser del 99.8%. El segon any, aquesta va caure al 25%. En
els anys subsegüents, la ràtio de morts dels conills era inferior a la de reproducció.
L’esperança de l’erradicació completa desaparèixer de l’imaginari col·lectiu, doncs els conills
havien evolucionat tornant-se més resistents o tolerants al virus.
Un virus de RNA X té un genoma de 5,000 bases.
Cada posició de nucleòtid pot estar ocupat per 4 nucleòtids diferents.
L'espai de seqüència és de 45,000 seqüències possibles.
Virologia 2020
CEBIO 62
Origen dels virus. Hi ha vàries hipòtesis sobre l’origen dels virus com a entitats biològiques en la
biosfera. Així i tot, totes parteixen de la base que els nous virus només poden sorgir de virus
que ja existien. No es poden generar virus de novo.
Si tenim en compte, aleshores, que tots els tipus de virus coneguts és molt probable que
haguessin aparegut abans que els humans existissin, cal entendre que tots els virus que
infecten humans han evolucionat de virus animals.
Les tres hipòtesis.
Una hipòtesi per l’origen dels virus, la hipòtesi progressiva o d’escapada, estableix que els
virus s’originen d’elements genètics que van aconseguir l’habilitat de moure’s entre cèl·lules.
L’altre, la hipòtesi regressiva o de reducció, estableix que els virus eren organismes vius i
lliures que en algun moment es van tornar paràsits. Finalment, la hipòtesi dels virus primer
suposa que els virus són els precursors de la vida o que són fruit d’una evolució paral·lela a
la dels éssers vius.
Virologia 2020
CEBIO 63
Capítol 7 – Virus emergents i malalties víriques emergents
Emergència de Virus. L’emergència dels virus o de malalties víriques es refereix a un increment en la
incidència d’aquests virus o malalties víriques. L’emergència vírica és un terme que
engloba tant l’aparició de nou virus que no havien infectat humans abans com l’augment de
les infeccions per part d’un virus que ja era conegut però que solia ocórrer en poblacions
aïllades o reduïdes. La re-emergència és un concepte que defineix el procés pel qual les
malalties que van arribar a ser un problema de salut a nivell global o en un país concret i
després van reduir-se dràsticament però que estan tornant a representar un problema per la
salut d’una important proporció de la població.
La major part dels virus emergents o re-emergents són virus de RNA, tot i que n’hi
algun que és de DNA. En referència als virus emergents i re-emergents, els avenços que la
societat ha tingut poden representar una eina per la seva expansió o una eina pel seu control.
Els desenvolupaments que faciliten l’expansió dels virus són els viatges comercials per aire,
el comerç global, la urbanització, el creixement poblacional descontrolat i el canvi climàtic.
Per contra, els avenços que faciliten el control dels virus emergents i re-emergents és la
seqüenciació genòmica, les xarxes de comunicació globals, els diagnòstics ràpids i les noves
aproximacions a les vacunes i els dissenys de teràpies.
Als mapes següents podem observar les àrees afectades per virus de Dengue, del
Chikungunya i del Zika a tot el món en els anys 2005, 2010 i 2015. Això il·lustra l'evolució de
la distribució geogràfica d'aquests virus durant l'última dècada. L'ombra o els cercles de llum
indiquen els països amb transmissió endèmica; l'ombra i els cercles foscos indiquen els
països amb brots registrats durant els cinc anys anteriors; els punts indiquen casos importats
en països sense transmissió autòctona; les estrelles indiquen els països amb transmissió
autòctona.
En els següents 7 mapes s’indica les infeccions als Estats Units pel virus de l’est del Nil.
Aquest virus normalment infecta aus, és un membre de la família Flaviviridae i ocasionalment
causa malalties nurològiques en éssers humans.
En el següent esquema es pot observar l’impacte sobre vides humanes causat pels brots més
importants de malalties víriques emergents. En destaquen el VIH i el brot de la grip espanyola
de l’hivern de 1918. En el mateix esquema es poden observar els pics dels dos coronavirus
que precedeixen l’últim que hem passat, sent el SARS i el MERS.
0
10,000,000
20,000,000
30,000,000
40,000,000
50,000,000
60,000,000
Gri
p e
spa
nyo
la
We
st
Nile
Viru
s
Gri
p a
sià
tica
Gri
p H
on
g K
on
g
Eb
ola
VIH
Hen
dra
Gri
p a
via
r
Nip
ah
SA
RS
Gri
p
ME
RS
Gri
p a
via
r
1918 1937 157 1968 1976 1981 1994 1997 1999 2002 2009 2012 2013
Virologia 2020
CEBIO 64
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
WestNileVirus
Gripasiàtica
GripHongKong
Ebola Hendra Gripaviar
Nipah SARS Grip MERS Gripaviar
1937 157 1968 1976 1994 1997 1999 2002 2009 2012 2013
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
West NileVirus
Ebola Hendra Grip aviar Nipah SARS Grip MERS Grip aviar
1937 1976 1994 1997 1999 2002 2009 2012 2013
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Ebola Hendra Grip aviar Nipah SARS MERS Grip aviar
1976 1994 1997 1999 2002 2012 2013
Virologia 2020
CEBIO 65
L’impacte econòmic de les malalties emergents és variat, però l’última infecció per
coronavirus sembla que serà de les que més conseqüències econòmiques portarà de totes
les malalties emergents que ha passat la humanitat des del 1994.
La infecció per virus emergents. Dos exemples molt representatius de virus emergents són el VIH i l’Ebola. El VIH és un
virus que va saltar d’hoste no se sap exactament quan i ara és un paràsit estable de la espècie
humana. Els brots del virus de l’Ebola es donen sempre per un salt de hoste, segurament
simis o ratpenats. Els salts d’hoste també reben el nom d’episodis zoonòtics. Malgrat les
infeccions per creuament d’espècies poden acabar establint un nou virus en la població, les
infeccions que es donen per zoonosi no es solen sostenir gaire en el temps.
L’espècie humana és un dead-end host per moltes malalties víriques, sobretot les
transmeses per vectors. Un exemple n’és el virus de l’est del Nil, on els cavalls i els humans
som dead-end hosts. Això significa que tant els cavalls com els humans ens podem infectar
arran de la picadura d’un dels mosquits que transmet el virus, però no formem part del cicle
biològic d’aquest.
El concepte de dead-end host de vegades és ambigu. En el cas de l’Ebola, per exemple, es
pot considerar que els humans no formen part del cicle víric, pel que som un dead-end host.
Així i tot, està demostrat que els humans es poden transmetre entre si la malaltia. Per
solucionar l’ambigüitat, s’ha generat el següent esquema de transmissió zoonòtica de
malalties víriques, separat en 4 etapes:
En la primera etapa, l’espècie humana entra en contacte amb molts virus de moltes altres
espècies però no s’infecta. En la segona fase, l’humà es veu infectat però no hi ha transmissió
entre humans. En la tercera fase, on hi hauria el virus de l’Ebola, hi ha un cert grau de
transmissió entre humans però cada episodi ha de provenir d’un salt zoonòtic. Finalment, a
la quarta fase és on es troba el VIH i l’espècie humana és el reservori. En l’etapa 4 no hi ha
brots d’episodis zoonòtics, sinó que el virus es troba present en l’espècie humana.
Hi ha diversos factors ecològics o situacions que afavoreixen el salt víric d’hostes no
humans a hostes humans al llarg de les quatre fases de transmissió que hem tractat. Alguns
d’aquests factors, com les situacions que augmenten la interacció entre animals exòtics,
incrementen la transició de la fase 1 a la fase 2. Altres situacions, com les aglomeracions o
l’urbanisme, afavoreixen els salts de les fases 3 i 4.
Són elements que afavoreixen els salts vírics els viatges en avió, les preses d’aigua, les
irrigacions, el canvi dels patrons de migració de les espècies salvatges, els parcs salvatges,
l’aire condicionat, la transfusió de sang, els xenotransplantaments, el transport de bestiar a
llargues distàncies, la desforestació, els canvis morals de la societat respecte el sexe, la
urbanització descontrolada, els centres de dia...
Si recordem del tema anterior, partint de la premissa que tots els virus nous només poden
sorgir de virus que existeixen i sabent que tots els tipus de virus coneguts molt probablement
han evolucionat molt abans que els éssers humans apareguéssim a la terra, podem afirmar
que tots els virus que infecten humans han evolucionat de virus que infecten animals.
Els salts d’hoste que arriben a fase 2 són molt abundants. Els virus que causen un
establiment en l’espècie humana són molt pocs i estranys. D’aquests últims tenim els virus
VIH i SARS-CoV-2. Així i tot, aquests virus no els podem prevenir perquè no sabem quins
podran produir una zoonosi.
Virologia 2020
CEBIO 66
Vectors en la transmissió vírica. Moltes de les malalties emergents que es queden en fase 2 estan transmeses per
vectors artròpodes des del reservori a l’espècie humana. El terme arbovirus es refereix a
un grup de virus que es transmeten per artròpodes (que actuen com a vectors). La paraula
arbovirus és un acrònim de ARthropod-BOrne virus. Les característiques clíniques més
comunes de la infecció són febre, mal de cap i malestar. En alguns casos també es produeix
encefalitis i febre hemorràgica.
Els arbovirus requereixen d’un artròpode que xucli la sang per completar el cicle vital.
Són virus que sovint provoquen zoonosi i n’hi ha, al menys, 500 tipus. El terme arbovirus
engloba 8 famílies víriques de les que en destaquen la Togaviridae, la Flaviviridae i
Bunyaviridae.
Possibles Epidèmies. L’Organització Mundial de la Salut ha creat una llista de les 8 malalties que són més
probables de provocar una epidèmia. Entre aquestes es troben el SARS i el MERS, molt
semblants al SARS-CoV-2 que hem patit fa poc. En aquesta mateixa llista també hi ha la febre
hemorràgica del Congo, l’Ebola, el Marbug, la febre Lassa, el Nipah i la febre de la vall del
rift.
SARS.
El SARS és una malaltia que el novembre del 2002 va provocar un brot de pneumònies
severes i atípiques a la província de Guandong, a la Xina. Aquest brot va causar 305 casos
i 5 morts. Amb un temps d’incubació d’entre 2 i 10 dies, els símptomes de la malaltia
començaven amb una febre suau que anava seguida de calfreds, mal de cap, malestar i
miàlgia. La següent fase de la malaltia es corresponia amb una tos seca i una falta d’aire.
Entre el 10 i el 20% del casos de pacients de la malaltia van requerir ventilació mecànica.
El Severe Acute Respiratory Syndrome es va expandir arran d’un doctor xinès que el 21 de
febrer de 2003 va viatjar a Hong Kong després d’haver tractat pacients amb la malaltia. Va
morir el 22 de febrer a l’hospital. La infecció es va estendre a 10 persones de l’hotel, els quals
van viatjar a Singapur, Vietnam, Canadà i els Estats Units abans de tenir símptomes evidents.
La infecció va acabar arribant a 8,000 persones de 29 països diferents i va acabar tenint una
letalitat aproximada del 10%. La pandèmia va finalitzar el juliol de 2003, entre 4 i 5 mesos
després del viatge a l’hotel.
Es va poder aïllar el virus del SARS d’individus de civeta de palmera emmascarada o
civeta de palmera de l’Himàlaia en un mercat d’animals vius de Guangdong el maig del
2003. Es van veure evidències que algunes infeccions del SARS que es van donar a la xina
van ser transmesos a partir d’aquests animals, i per això se’n va imposar una quarantena.
Així i tot, les dades no indiquen que la civeta sigui el reservori animal del virus, doncs els virus
de civeta tenen una identitat del 99.6% i no es va aconseguir aïllar gaires vegades el virus del
SARS de civetes salvatges o de granges.
MERS.
El MERS és una malaltia que prové de l’Aràbia Saudita i que provoca brots aïllats però que
en va tenir un d’important el 2015 a corea del sud. El coronavirus del Middle East
respiratory syndrome és un virus que té els ratpenats com a hostes primaris i com a
reservori natural. Els ratpenats, que poden transmetre la malaltia a humans per mitjà del
contacte directe o les secrecions, transmeten la malaltia als camells per la saliva o les
deposicions. Els camells són, a part d’un hoste intermediari, un altre reservori animal del
MERS-CoV. Aquests animals, molt emprats en el transport a l’Aràbia saudita, poden permetre
Virologia 2020
CEBIO 67
el salt del virus per mitjà del contacte directe, el qual pot ser per la llet, l’orina o la carn. En
humans, aquesta malaltia similar a la CoVID19 passa de persona a persona per contacte
directe o per mitjà de grans gotes respiratòries que poden arribar al nou hoste per
estossegades, esternuts o fomites.
El 2015, Corea del Sud va experimentar un brot de Middle East respiratory syndrome o MERS.
Es va iniciar per un individu mascle de 68 anys que hi va arribar des de Qatar el 4 de maig.
Va desenvolupar símptomes el dia 11 i el dia 20 es va confirmar que tenia MERS. Més tard,
diferents hospitals de Corea del Sud van haver de tractar varis malalts per la mateixa malaltia.
Entre maig i juliol, 186 persones van contraure el virus MERS; 38 van morir. El següent
diagrama mostra la rapidesa amb què s'estén el patogen dins i entre els hospitals a través
d'un grapat de "supercontagiadors", individus que poden infectar un nombre altíssim
d’individus sans.
Funcionaris sud-coreans van fer un seguiment del brot de MERS fins arribar a un
empresari que va visitar l'Orient Mitjà a l'abril i principis de maig. Poc després de tornar,
l'home va ser ingressat a l'hospital de Santa Maria de Pyeongtaek, on va infectar prop de 30
persones, la majoria visitants i pacients.
Un home que va compartir una habitació de l'hospital amb el primer pacient del brot de
MERS sud-coreà va infectar a la majoria de persones. El 27 de maig, va anar al centre
mèdic Samsung de Seül, on va haver d'esperar a la sala d'emergències perquè el llit estigués
disponible. Durant els següents dos dies i mig, més de 80 persones que havien passat per la
sala d'urgències van contreure el virus.
Les visites d'un pacient a dos hospitals van provocar 27 infeccions. En general, el virus
va arribar a desenes de centres de salut, en part perquè sud-coreans tendeixen a visitar
diversos centres per trobar la millor cura. Una dona gran va estendre el virus a altres 11
persones en una quarta ronda d'infecció. Les múltiples rondes d'infecció són una
preocupació perquè la transmissió sostinguda pot conduir a una pandèmia.
La re-emergència contínua de la grip.
La grip presenta una re-emergència contínua del virus a partir de fenòmens de mutació
i reorganització genètiques. El virus de la grip és bastant complex perquè infecta diferents
hostes. Per començar, el virus més comú és el de la grip aviar, present en ocells. Patint certes
mutacions, aquest virus pot acabar saltant a humans. En altres casos ens trobem el virus de
la grip humà, que també va fent mutacions que provoquen els brots estacionals de la malaltia.
Ara bé, el cas més interessant es dona quan el virus de la grip aviar i el virus humà co-
infecten un hoste mamífer com podria ser un porc. El resultat d’aquesta infecció doble és
un nou virus. Un virus capaç de resistir gran part de les dures condicions que es passen en
els ocells i que, alhora, té les característiques idònies per infectar humans.
Els funcionaris i organitzacions de salut pública de tot el món es mantenen en alerta
arran de la preocupació creixent sobre la perspectiva d'una pandèmia de grip, cosa que
molts experts creuen inevitable. A més, els problemes recents amb la disponibilitat i
l'especificitat de la vacuna per a epidèmies de grip anuals en alguns països i l'augment de
soques pandèmiques de grip aviària en regions geogràfiques diferents han alarmat els experts
sobre la capacitat mundial de prevenir o contenir una pandèmia humana.
La majoria dels experts en malalties infeccioses creuen que el món està a la vora d'una
pandèmia de la grip. I malgrat el llegat de la "grip espanyola" del 1918, que s'estima que va
matar almenys 20 milions de persones, i les morts, la disrupció social i les pèrdues
Virologia 2020
CEBIO 68
econòmiques derivades de les pandèmies del 1957 i el 1968; el públic en general sembla
relativament despreocupat sobre la següent "grip assassina".
S'ha centrat considerablement més atenció en la protecció dels atacs terroristes que
de l'amenaça molt més probable i generalitzada de la grip pandèmica, un esdeveniment
que, de forma conservadora, s'espera que causi entre 2 i 8 milions de morts.
Mentrestant, el perill augmenta a mesura que la capacitat del món per produir vacunes
es contrau i l'H5N1 assoleix els nivells endèmics en les aus de corral a moltes parts d'Àsia.
Una recent consulta d'experts convocada per l'Organització Mundial de la Salut (OMS) va
concloure que:
“La imprevisibilitat dels virus de la grip i la velocitat amb la qual es pot
millorar la transmissibilitat significa que el temps per a la planificació
preparatòria és ara.”
La pandèmia del 1918 es va anomenar grip espanyola perquè va rebre més atenció a la
premsa espanyola que a la resta d'Europa, ja que Espanya no va estar implicada en la guerra
i per tant no es va censurar informació sobre la malaltia. Així i tot, s’estima que va matar 50
milions de persones globalment.
Virologia 2020
CEBIO 69
Capítol 8 – Metodologia d’estudi dels virus.
Història de l’estudi dels virus. Malgrat al principi del segle XX ja es coneixien, l’única manera d’estudiar els virus era
infectant animals, doncs no es podien propagar en cultius cel·lulars. L’any 1949, Enders,
Weller i Robbins van aconseguir propagar el Poliovirus en cultius cel·lulars de teixits
embrionaris humans. Aquesta tecnologia revolucionària va ser premiada amb un premi Nobel
el 1954 i va obrir la porta a l’estudi dels virus al laboratori.
Una de les línies cel·lulars contínues més utilitzades per a virologia és la línia cel·lular
HeLa, derivada el 1951 a partir d'Henrietta Lacks. Sense saber-ho, ella és la responsable
d’una revolució en les tècniques de cultiu cel·lular.
A principis de 1951, una mare de cinc fills de trenta-un anys va ser diagnosticada amb un
tumor maligne del coll uterí. Era Henrietta Lacks. Durant el seu examen a l'Hospital John
Hopkins de Baltimore, se li va extreure una mostra del tumor i es va enviar al doctor George
Gey, cap d'investigació en cultiu de teixits. Feia anys que el doctor Gey intentava produir una
línia de cèl·lules humanes immortals. Quan la senyora Lacks va morir l'octubre de 1951, el
doctor Gey va anunciar a la televisió nacional que havia produït, a partir del tumor de
Lacks, una línia de cèl·lules que es propagaven com cap altra cèl·lula abans. Les va
anomenar "cèl·lules HeLa" en honor seu, i les va mostrar al públic.
Des d'aleshores, les cèl·lules HeLa s'han utilitzat en molts laboratoris de tot el món per
fer innombrables descobriments de recerca. Per exemple, poc després que el doctor Gey
anunciés la línia cel·lular HeLa, la línia cel·lular es va fer servir per propagar el Poliovirus. La
propagació del Poliovirus en un cultiu cel·lular va tenir un paper important en el
desenvolupament de les vacunes contra aquest.
Però la família de la senyora Lacks no es va assabentar de les importants cèl·lules que
se'n derivaven fins vint-i-quatre anys després de la seva mort. La història d'aquest
esdeveniment, descrita a la revista Johns Hopkins, és un comentari sobre la manca de
consentiment informat habitual en la investigació mèdica d'aleshores.
Cultius Cel·lulars: Relació Superfície – Volum. En virologia, la metodologia de cultiu s’ha d’adaptar al perfil de l’hoste. Per poder obtenir
bacteriòfags, cal cultivar bacteris. Per poder infectar plantes, cal cultivar-les... Com que no es
disposa de gaires cèl·lules vegetals que puguin créixer en cultiu, els virus vegetals estan
menys estudiats que la resta. Per altra banda, els virus animals s’adapten bé a les línies
cel·lulars en general.
El creixement de cèl·lules animals o bacterianes es pot fer en plaques, ampolles, rollers,
fermentadors... El primer que cal fer en un estudi de virus és fer créixer la cèl·lula hoste
fins a una confluència aproximada del 80%. Seguidament, cal infectar amb virus per tal
que entrin a les cèl·lules i s’hi multipliquin. En molts casos, els virus lisaran les cèl·lules. Això
significa que es pot fer una centrifugació del cultiu infectat i recollir-ne només el sobrenedant,
que estarà ple de virus.
Virologia 2020
CEBIO 70
De vegades, però, l’efecte de la infecció pot ser diferent de la lisi cel·lular. Es pot donar el
que s’anomenen efectes citopàtics. Entre aquests s’hi troben alteracions morfològiques de
les cèl·lules infectades com:
Els sincicis són fusions cel·lulars que generen una cèl·lula gegant amb molt nuclis. Els cossos
d’inclusió vírics són agregats que es poden formar tant al nucli com al citoplasma.
Purificació dels Virions. Les partícules víriques obtingudes per multiplicació a la cèl·lula hoste es poden
purificar en diferents graus de rendiment i puresa. Si es vol purificar amb una “baixa
qualitat”, tan sols cal fer una centrifugació. La centrifugació fa precipitar les restes cel·lulars i
permet disposar de les partícules víriques en el sobrenedant. Aquesta “baixa qualitat” de
purificació ja permet fer investigació vírica al laboratori, en tant que és prou bona.
Ara bé, si al intenció és obtenir partícules
víriques altament purificades, cal fer una
ultracentrifugació de gradient. El gradient
en qüestió pot ser clorur de cesi o de
sucrosa. En la ultracentrifugació de gradient,
les partícules es desplacen pel contingent de
centrifugació fins situar-se a l’alçada de
densitat igual a la partícula. Aquesta equival
a una concentració de glucosa.
Cada virus té una densitat específica. Per això és possible separar diferents espècies
víriques en una sola ultracentrifugació de gradient. Per extreure les partícules, cal perforar
la columna o tub a l’alçada de la banda i extreure’n el contingut. Per obtenir les partícules
pures, tan sols cal extreure les restes de la substància del gradient.
Un cop es té el lisat víric, estaria bé quantificar la massa i la infectivitat dels virus que
tenim. La infectivitat es mesura, en bacteriòfags, realitzant unes dilucions seriades tot
preparant, paral·lelament, un creixement continu de bacteris barrejat amb agar. L’agar és per
evitar que sigui un cultiu líquid i els virus es puguin dispersar per tota la placa. Un cop
subministrat el virus a la placa, cal afegir un medi semi-sòlid per restringir la difusió de les
partícules víriques. En tant que els virus tan sols poden infectar les cèl·lules del seu voltant,
es pot observar la destrucció cel·lular en calbes.
Quan un bacteriòfag infecta i lisa un bacteri, fa un “forat”. Com que els bacteris i els virus no
es poden moure per una placa sòlida per agar, els virus només poden infectar els bacteris del
voltant. Al final, es disposa d’una placa amb calbes. En aquesta placa, una calba és una
partícula vírica infectiva. Es fan servir vàries dilucions per assegurar que hi ha entre 15 i
300 calbes per placa en alguna de les que s’ha subministrat virus. Cada virus té el seu tipus
Reducció del nucli
Vacuoles al citoplasma
Proliferacions de la membrana
nuclear
Formació de sincicis
Trencament dels
cromosomes
Arrodoniments de les cèl·lules
hoste
Cossos d’inclusió vírics
Virologia 2020
CEBIO 71
de calba. Les calbes més turbulentes són de virus lisogènics, mentre que les més
transparents són de virus lítics.
En el cas de cèl·lules animals, es fan cultius confluents amb agar que els dificulti el moviment
i s’infecten. Posteriorment a la infecció es realitza una tinció en vermell o blau.
Una sola partícula vírica produeix una sola calba. Si la concentració del virus es duplica,
el nombre de calbes també.
Titració en embrions de pollets.
Hi ha virus que no creixen ni infecten bé en cultius cel·lulars. En aquests casos, es fan servir
embrions de pollastre. Els Poxviridae, per exemple, no creixen bé en cultius però si que ho
fan a la membrana corioalantroidea dels embrions de pollastre. En aquesta membrana també
es formen les calbes que avaluem en un laboratori.
Diferents tipus de virus creixen en diferents parts de l’embrió de pollastre. Les vacunes
contra la grip fan servir embrions de pollastre per amplificar els virus que s’hi faran servir, per
exemple.
Titració de virus de plantes.
En el cas dels virus de plantes, també es podrien comptar el nombre de partícules
infectives. Una opció és comptar les taques que es formen, on cada taca és equivalent a una
calba, o a través de les perforacions, on també cadascuna es correspon amb una partícula
infectiva.
Tritació de virus oncogènics.
Hi ha cops que, enlloc de llisar i produir calbes, els virus transformen les cèl·lules i
provoquen cèl·lules tumorals i d’un creixement descontrolat. En aquests casos es
formen nuclis de proliferació, que és el que es compta.
En cultius, les cèl·lules inhibeixen el seu creixement per contacte i arriben a una confluència
del 100%. Si es transformen, les cèl·lules creixen les unes sobre les altres i comencen
a formar els nuclis de proliferació.
Comptabilitat en animals.
A principis del segle passat, es feien servir animals per estudiar virus i ara es fan servir cultius.
De vegades, però, no hi ha altre opció que fer servir animals per conèixer la capacitat
de produir malalties i en quines concentracions ho poden fer. Així i tot, en aquests casos
faran falta moltes partícules víriques infectives per produir la malaltia.
Recompte total. Un cop es té el lisat víric a partir d’una ultracentrifugació en gradient, estaria bé
quantificar la massa i la infectivitat de les partícules víriques de les que disposem. Un
mètode inusual de realització és el recompte visual de partícules víriques. Aquest procediment
tan sols es duu a terme en virus molt nous i en casos excepcionals on s’han de conèixer
vàries coses de les partícules víriques.
El recompte visual de partícules víriques es fa a partir d’una solució de concentració
desconeguda de partícules víriques al que s’afegeix una quantitat coneguda d’esferes
de làtex. Seguidament, en prenem unes gotes i les afegim a la graella per veure a través del
microscopi electrònic. A cada camp s’hi poden observar les esferes de làtex (grans) i les
partícules víriques (petites). Repetint el procediment en varis camps es calcula la ràtio
partícules víriques / esferes de làtex. Com que coneixem la quantitat d’esferes subministrades
Virologia 2020
CEBIO 72
inicialment, es pot calcular de manera precisa la quantitat de partícules víriques
disponibles.
El recompte visual és bastant inusual. Per fer un recompte de partícules víriques se sol
fer una extracció de proteïna o àcids nucleics i fer-los passar per un gel d’agarosa.
Seguidament es realitza un Western blot o un Southern blot i una recta patró que permeti fer
un anàlisi quantitatiu. El recompte per microscòpia electrònica de transmissió es realitza quan
es comença a treballar amb un virus i és extremadament necessari saber la quantitat de
partícules víriques disponibles.
Sabent el nombre de partícules víriques i de partícules víriques infectives d’una mostra
d’un virus, es pot calcular la ràtio d’infectivitat per partícula vírica. Si els virus fossin una
maquinària perfecte, aquesta ràtio seria de 1. Així i tot, com sempre passa a la biologia, no
ho són. Solen ser ràtios molt baixes, de 1/1,000 en Poliovirus o de 10-4 en el virus del
papil·loma.
La baixa ràtio d’infectivitat per partícula vírica contradiu la idea preestablerta que els virus són
unes perfectes màquines de matar. No és habitual tenir una ràtio alta fruit de problemes
amb les partícules víriques. Aquestes poden estar danyades, poden tenir defectes, algunes
tenen mutacions que els impedeixen multiplicar-se... Però els problemes també poden estar
dins del cicle víric, que és molt complex i necessita que tots els passos funcionin. Així doncs,
la infecció vírica és molt ineficaç.
La infecció és ineficaç apart de les barreres que el nostre cos els hi posa. Entre aquestes
hi trobem la mucosa, els enzims... És això el que provoca que, malgrat diàriament ens ataquin
desenes de virus, rarament passem la malaltia.
Tècniques de detecció vírica. Les diferents tècniques que es fan servir per detectar partícules víriques poden ser
quantitatives o qualitatives. Les diferents tècniques que es coneixen es poden classificar
segons la següent taula:
Tècnica Classificació
Detecció d’enzims vírics Qualitativa
Proves serològiques per anticossos o antígens Qualitativa
Microscòpia electrònica Quantitativa
Hemaglutinació Semi-quantitativa
Extracció àcids nucleics Semi-quantitativa
Rectes patró Semi-quantitativa
ELISA Semi-quantitativa
Immunostaining Semi-quantitativa
Western blot per immunoblotting.
El Western blot és la tecnologia per detectar proteïnes virals mitjançant anticossos. En
aquesta tècnica es realitza seguint els següents passos:
Extracció de les proteïnes víriques.
Fer córrer les proteïnes en un gel on es separen per electroforesi.
Transferir la separació a un filtre per western blot.
Incubar el filtre en anticossos contra el virus.
Virologia 2020
CEBIO 73
El Western blot permet distingir les proteïnes víriques. Aquest marcatge es pot convertir
en quantitatiu a partir d’una recta patró de quantitat i amplada de banda. Un programa que
realitza aquesta comparació entre la recta patró i la del Western blot és ImageJ, per exemple.
ELISA.
La tècnica d’ELISA és molt similar al Western blot, doncs també fem servir anticossos. Les
proves ELISA es realitzen o bé per detectar partícules víriques o per detectar
anticossos que s’hagin produït enfront aquestes. Hi ha dues maneres de realitzar un
ELISA.
Un dels mètodes per fer un ELISA consisteix en immobilitzar anticossos específics
contra el virus en una placa o pouet. Un cop immobilitzat, es fa passar una mostra per
detectar-hi partícules víriques, les quals es quedaran unides als anticossos de immobilitzats.
Seguidament, es fa passar una solució d’anticossos contra un altre epítop de la partícula
vírica marcats fluorescentment. Si hi ha fluorescència, hi ha partícula vírica.
El segon mètode per fer un ELISA requereix de la immobilització de partícules víriques
del virus del que se’n vol detectar la presència d’anticossos. Un cop es tenen
immobilitzades les partícules víriques, cal fer passar la mostra del pacient per saber si ha
produït anticossos contra el virus. Per comprovar-ho, es fa passar una solució d’anticossos
anti-anticossos però marcats amb fluorescència.
La tècnica d’ELISA és considerada com a semi-quantitativa.
Immunostaining.
La tècnica d’immunostaining també serveix per detectar antígens virals tot fent servir
anticossos. En la tècnica de la immunohistoquímica es detecten antígens en seccions
de teixit per fluorescència lligada a anticossos. L’immunostaining consisteix en tenyir les
cèl·lules de la mostra amb anticossos contra certs antígens. Hi ha dues maneres de fer la
immunohistoquímica. La forma directe consisteix en posar anticossos fluorescents
directament contra l’antigen. El mètode indirecte, la fluorescència ve donada per un anticòs
secundari contra el primer anticòs.
En general, els dos mètodes d’immunostaining són qualitatius. Així i tot, hi ha programes
molt bons que permeten fer estimacions numèriques i convertir la tècnica en semi-
quantitativa.
EBER ISH / MG.
La tècnica EBER ISH / MG no es fa servir habitualment en diagnòstic víric però si en
investigació. Aquesta tècnica fa servir la hibridació in situ. El EBER ISH / MG consisteix en
trobar àcids nucleics en una secció de teixit. Per fer-ho, s’aplica una seqüència d’àcids
nucleics complementària al genoma del virus i que tendeix a hibridar-s’hi. És una tècnica que
es fa servir amb el genoma del virus d’Epstein Barr.
L’àcid nucleic complementari estarà unit o bé a un fluoròfor o bé a un enzim que
transforma un substrat i el fa canviar de color per culpa la transformació. Aquesta forma
de detecció es consideraria qualitativa malgrat haver-hi programes per fer aproximacions
numèriques.
Hemaglutinació.
L’hemaglutinació és un mètode que es fa servir per estimar la quantitat de virus que
s’uneixen a hematòcits. La versió clàssica del test requereix posar quantitats fixes de
glòbuls vermells a cada pouet d’una placa. Posteriorment, es van afegint concentracions
Virologia 2020
CEBIO 74
diferents de virus a cadascun dels pouets. A mesura que avancen les files hi ha una major
dilució vírica i a mesura que avancen les columnes es tenen diferents mostres.
Columna A Columna B Columna C Columna D Control
Fila 1 Virus α
Dilució 1:1 Virus β
Dilució 1:1 Virus γ
Dilució 1:1 Virus δ
Dilució 1:1 Virus ε
Dilució 1:1
Fila 2 Virus α
Dilució 1:10 Virus β
Dilució 1:10 Virus γ
Dilució 1:10 Virus δ
Dilució 1:10 Virus ε
Dilució 1:10
Fila 3 Virus α
Dilució 1:100 Virus β
Dilució 1:100 Virus γ
Dilució 1:100 Virus δ
Dilució 1:100 Virus ε
Dilució 1:100
Fila 4 Virus α
Dilució 1:1000 Virus β
Dilució 1:1000 Virus γ
Dilució 1:1000 Virus δ
Dilució 1:1000 Virus ε
Dilució 1:1000
Si, al cap d’una estona d’aplicar els virus, el pouet es veu difús, hi ha hagut
hemaglutinació. També es considera que n’hi ha hagut si al pouet es veu un punt vermell
molt clar. Això passa perquè els pouets acaben en un con. En conseqüència, els glòbuls
cauen al centre i semblen un punt. Quan hi ha massa quantitat de virus, pot passar que
l’enzim víric trenqui la tendència a aglutinar de les cèl·lules. Aquesta tècnica és qualitativa i
no pas quantitativa.
Una cèl·lula és susceptible de ser
infectada quan presenta receptors
perquè entri el virus. Una cèl·lula
és permissiva quan conté tota la
maquinària per tal que el virus es
pugui replicar. Per tal que una
cèl·lula sigui infectada i permeti
la multiplicació dels virus ha de
ser susceptible i permissiva.
Els glòbuls vermells no tenen la maquinària suficient per tal que el virus es puguin
multiplicar, però són susceptibles a la seva infecció. És per això que es produeix
l’hemaglutinació.
Mesura de l’activitat enzimàtica vírica. La detecció de l’activitat enzimàtica d’un virus és un mecanisme de detecció indirecta
de la presència d’un virus en una mostra. Es pot fer, per exemple, per l’activitat de la
transcriptasa inversa. El procediment consisteix en donar el substrat de l’enzim i avaluar, per
gel d’agarosa, els canvis o la producció del producte.
Reacció en Cadena de la Polimerasa.
En quant a tècniques de detecció de virus, la tècnica reina és l’ús de la PCR o rtPCR. La
tècnica de la PCR és essencial tant per diagnosi com per investigació i indústria.
Seqüenciació High-Throughput.
Una altra tècnica que està sent fonamental en el descobriment de nous virus és una
seqüenciació massiva on es fan servir primers degenerats que permeten descobrir
nous virus i patògens en l’ambient. A més, també permeten fer metagenòmica.
Proteïnes Fluorescents.
Una eina molt útil per estudiar virus és l’ús de proteïnes fluorescents. La GFP és la
primera que es va descobrir, però avui ja es gaudeix de moltes altres i amb els seus respectius
colors. La GFP és una proteïna de les meduses.
oPresenta receptors que permeten l’entrada del virus
Cèl·lula susceptible
oConté la maquinària que permet la replicació del virus
Cèl·lula permissiva
Virologia 2020
CEBIO 75
A través de l’ús de les proteïnes fluorescents podem produir virus fluorescents. Si, per
exemple, generem 3 soques de virus (una verda, una blava i una lila) el resultat de la infecció
amb els 3 genera molts colors. Això demostra que hi ha cèl·lules infectades per més d’un
virus alhora.
Per aconseguir la conversió d’un virus en fluorescent cal sintetitzar artificialment el
genoma i introduir la proteïna fluorescent en una proteïna vírica. D’aquesta manera s’ha
aconseguit veure que el virus herpes, per exemple, es desplaça a través de les neurones i
els seus exons. També s’ha pogut veure que el virus del VIH és minúscul i que es mou dins
la cèl·lula a través dels microtúbuls.
Nivells de Bioseguretat. Els nivells de bioperillositat dels laboratoris que treballen amb material biològic
s’estructuren en una escala de 1 a 4. També s’aplica als que treballen amb virus.
Els nivells 1 i 2 són laboratoris bàsics. En ells es treballa amb virus que no produeixin
malalties en humans o que aquesta sigui suau i que no es transmetin fàcilment.
Els laboratoris 3 i 4 són laboratoris de contenció. En ells es treballa amb virus perillosos
o que es transmeten fàcilment. Els laboratoris 3 i 4 reben el nom de laboratoris de contenció
perquè la idea és que cap partícula vírica amb la que es treballi en ells pugui sortir-ne.
Hi ha molt pocs laboratoris amb un nivell de bioseguretat 4 a tot el món. No n’hi ha a
Espanya, ja que les normatives són cada cop més restrictives. Aquests laboratoris tenen tot
un edifici al seu servei.
En una planta es realitzen els experiments i on hi ha l’apartat d’higiene. També hi ha una
planta incineradora per eliminar tots els residus experimentals. La planta inferior és pel
tractament de tots els residus líquids. D’aquesta manera, els residus que surtin de l’edifici
estaran lliures de virus. La planta superior és la que es dedica al tractament de l’aire. Els virus
són retinguts per filtres HEPA i l’aire surt de l’edifici, constantment. Això permet generar una
pressió interna negativa que s’incrementa a mesura que s’arriba a la zona de treball.
L’aire sempre va cap a dins del laboratori per evitar així que s’escapin els virus per
l’entrada. A més, no es pot obrir la següent porta fins que no s’han tancat les anterior. Per si
fos poc, entra més aire a la zona de baixa seguretat que a la d’alta seguretat. D’aquesta
manera s’incita a un augment de la pressió negativa cap a la zona d’alt risc.
En un laboratori de bioseguretat 4 es fan servir dos tipus de vestits protectors. Un és
per quan es surt a l’exterior i l’altre per quan es treballa a l’interior. El de l’exterior té un filtre
d’entrada d’aire i evita el contacte amb l’exterior, mentre que el d’interior té una entrada d’aire
que prové de la planta superior. A més, hi ha un protocol de neteja molt estricte a l’interior
dels laboratoris. Això consumeix molt de temps per qualsevol procés d’investigació.
Virologia 2020
CEBIO 76
Capítol 9 – Taxonomia El tema 9 vessa sobre la taxonomia vírica. És curt i no és entretingut. Bàsicament, el que cal
saber-se és la taula al final del tema. Gaudeix. La classificació de Baltimore serà el punt de
partida per l’estudi de la taxonomia malgrat no es té en compte en aquest camp. El gràfic
inferior està extret de ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics.
ICTV. El International Committee on Taxonomy
of Virus és la comissió internacional de la
taxonomia dels virus (per qui no sap
anglès). És el comitè encarregat de
caracteritzar i classificar els virus que
es van trobant. Segons la seva
classificació, hi ha ordres de virus.
Els ordres es divideixen en famílies. Les
famílies es divideixen en subfamílies. Les
subfamílies es divideixen en classes. Les
classes es divideixen en espècies. Les
espècies es divideixen en subespècies.
Les subespècies es divideixen en soques.
És rellevant destacar que no totes les
famílies tenen subfamílies de la mateixa
manera que no totes les espècies tenen
subespècies, per exemple.
Hi ha uns quants ordres, bastants milers
de famílies, milions de subfamílies... Els
tipus de virus diferents és immensa. A
cada classificació de la ICTV hi ha
diferents membres de la classificació
de Baltimore.
Ordre
Família
Subfamília
Classe
Espècie
Subespècie
Soca
Virologia 2020
CEBIO 77
Classificació vírica. Les característiques víriques més importants que es tenen en compte a l’hora d’establir les
categories són:
De fet, tornant a la classificació dels virus animals, cada família vírica té les mateixes
propietats en quant a aquestes 4 característiques. Per tant, tots els membres de la mateixa
família de virus tindran el mateix tipus d’embolcall, la mateixa organització genètica, la
mateixa simetria de càpsida...
Però si tan sols es tinguessin en compte aquestes propietats que hem dit sortirien molt poques
famílies. Malgrat tot, hem vist que n’hi una barbaritat. Per tant, cal afinar més en la classificació
i no només es poden tenir en compte aquestes característiques del virió i del genoma. Dins
dels processos de classificació també es tenen en compte aspectes com:
• La mida i nombre de les proteïnes
• La presència d’enzims vírics amb activitat específica
• Les característiques del cicle víric
• El procés de transcripció
• Els processos de traducció i processament de proteïnes
• El lloc d’acumulació de proteïnes
• Les malalties provocades
• L’estabilitat davant diferents estímuls físics com pH o temperatura
• Les característiques biològiques
D’entre les característiques biològiques que es fan servir per classificar espècies víriques, en
destaquen les espècies que infecten, el tipus d’immunitat que produeixen, com és la
patogènia, quines malalties provoquen, quin tropisme tenen, quina és la seva distribució
geogràfica...
Classificació en funció de Baltimore.
Virus de doble cadena de DNA.
Dels grups de virus de DNA de doble cadena
en destaquen les família dels Adenoviridae,
els Baculoviridae, la família Herpesviridae, els
bacteriòfags com l’ecoliòfag T4, els Poxviridae
o el virus del papil·loma.
El virus del papil·loma abans formava part de
la família Papopaviridae i ara a la
Papillomaviridae. Aquest és un clar exemple
que les classificacions van canviant a
mesura que es van trobant nous virus que
posen en entredit la classificació. Tot és
dinàmic.
Famílies Víriques amb DNA de doble cadena
Adenoviridae
Baculoviridae
Herpesviridae
Poxviridae
Papillomaviridae
Myoviridae (fag T4)
La naturalesa i seqüència dels àcids nucleics
en el virió
La simetria de la càpsida
La presència o manca de membrana
lipídica
Les dimensions del virió i de la
càpsida
Virologia 2020
CEBIO 78
Virus de cadena senzilla de DNA.
El virus més rellevants de cadena senzilla de
DNA de la classificació de Baltimore són les
famílies dels Circoviridae i dels Parvoviridae.
Als Parvoviridae hi pertanyen els virus
adeno-associats, que causen importants
malalties en humans.
Virus de doble cadena de RNA.
Del grup de virus de RNA de doble cadena cal
recordar els Reoviridae, ja que hi pertanyen els
rotavirus. Els rotavirus són uns patògens
bastant importants que, entre d’altres
simptomatologies, provoquen diarrees.
Virus de RNA de cadena senzilla positiva.
Dins dels virus de RNA de cadena positiva
seria bo destacar la família Bromoviridae, on
pertanyen moltes famílies de virus. A aquesta
categoria també hi trobem la família
Coronaviridae. Finalment, la família
Flaviviridae també és molt important perquè hi
pertanyen virus que provoquen malalties com
la febre groga o l’hepatitis C.
També hi ha 3 famílies molt importants en
aquest tipus de virus. Una d’elles és la
Picornaviridae. Molts virus que provoquen
malalties són picornavirus. Des de la pòlio,
els del constipat (Rhinovirus), els de l’hepatitis
A (Hepatovirus)... L’altre família és la
Tetraviridae, ara anomenada Virgaviridae. En
els virgavirus trobem el virus del mosaic
del tabac, tant important en l’evolució de la
virologia. L’última família important és la
Togaviridae ja en forma part el virus de la
rubèola (Rubivirus), molt importat en la
patologia humana.
Virus de RNA de cadena senzilla negativa.
Totes les famílies víriques de RNA de
cadena senzilla negativa són molt
importants. Hi trobem la família Filoviridae,
que conté els virus Marburg i de l’Ebola; la
Paramyxoviridae, que conté els virus
Parainfluenza, del xarampió, les paperes i el
virus respiratori sincital humà; la família
Rhabdoviridae on es troba el virus de la ràbia;
la família Arenaviridae, que té un genoma amb
fragments ambisense i produeixen malalties
molt importants, i la família Orthomyxoviridae,
a qui pertany el virus de la grip.
Famílies Víriques amb DNA de cadena senzilla
Circoviridae
Parvoviridae
Famílies Víriques amb RNA de doble cadena
Reoviridae
Famílies Víriques amb RNA de cadena senzilla positiva
Bromoviridae
Coronaviridae
Flaviviridae
Picornaviridae
Virgaviridae
Togaviridae
Famílies Víriques amb RNA de cadena senzilla negativa
Filoviridae
Paramyxoviridae
Rhabdoviridae
Poxviridae
Orthomyxoviridae
Virologia 2020
CEBIO 79
Virus de RNA amb activitat transcriptasa inversa.
Dels virus amb activitat transcriptasa inversa
tan sols cal recordar la família Retroviridae.
Pertany a la família dels retrovirus el Virus
de la Immunodeficiència humana entre
molts altres que també causen malalties
importants.
Virus de DNA amb activitat transcriptasa inversa.
De l’últim grup de virus de la classificació de
Baltimore tan sols cal recordar que hi pertany
la família Hepadnaviridae, on s’hi troba el
virus causant de l’Hepatitis B.
Canvis de nomenclatura. També és important comentar que les classificacions i nomenclatures són molt
dinàmiques i variables en el temps. Arran d’això, no cal memoritzar-ne gaire coses. Així i
tot, un parell de canvis realitzats fa poc és important que es recordin en tant que es poden
veure escrits de dues maneres diferents i això podria portar a confusió.
Per un costat trobem els virus Herpes humans. Abans rebien els noms de Herpes simplex-1,
Herpes simplex-2, Varicella zoster virus, Epstein Barr virus, Cytomegalovirus o Kaposi's
sarcoma-associated virus. Des de l’última modificació establerta per part del ICTV, els virus
de la família Herpes ara reben el nom de virus herpes humà i un nombre distintiu del 1 al 8.
El virus de la varicel·la és el 3, el d’Epstein Barr és el 4, el citomegalovirus és el 5 i el l’associat
al sarcoma de Kaposi és el 8.
Per altra banda, el virus de la pòlio, causant de la poliomielitis, rebia el nom de poliovirus
humà 1 i ara rep el nom d’enterovirus C humà.
El comitè ICTV classifica, anualment, unes 200 espècies noves de virus. El 2018 ja hi
havia 14 ordres, 150 famílies, 79 subfamílies, 1019 gèneres i 5560 espècies diferents de virus.
Aquest comitè també ha fet una estimació de les espècies víriques que hi pot haver a
la terra. En aquest estudi es va prendre una espècie ratpenat (P. giganteus) i en van estudiar
la virologia en els diferents entorns on es pot trobar l’espècie arreu del planeta. Van trobar
que tenien 58 virus propis, dels quals 55 eren nous.
Suposant que a totes les espècies d’eucariotes els pot infectar una quantitat similar de virus
(malgrat en humans sabem que en són més), el nombre d’espècies víriques puja fins als
100,939,140 virus si incloem les 1,740,330 espècies conegudes de vertebrats, invertebrats,
plantes, líquens, bolets i algues marrons.
Aquest nombre no inclou virus de bacteris, arqueus i altres organismes unicel·lulars. Tenint
en compte que hi ha 1031 partícules de virus als oceans, sobretot bacteriòfags, és probable
que el nombre sigui més elevat. Els virus que s’estan trobant als mars, a més, tenen
característiques que mai fins ara s’havien vist.
La Taula que cal saber-se. A l’examen cal saber-se una sèrie de dades sobre diferents famílies víriques. Aquests virus
són molt importats en patogènia humana o en ús humà. El que cal saber de cada virus és:
• La família a la que pertany
• El tipus d’àcid nucleic
Famílies Víriques amb RNA amb activitat transcriptasa inversa
Retroviridae
Famílies Víriques amb DNA amb activitat transcriptasa inversa
Hepadnaviridae
Virologia 2020
CEBIO 80
o RNA / DNA
o Cadena senzilla / doble cadena
o Sentit
• La quantitat de segments que té el seu material genètic
• Si té embolcall
• Quina és la seva simetria.
Hi ha certs virus que formaran part de la mateixa família i, conseqüentment, tindran les
mateixes característiques. La taula es troba a la pàgina següent. A continuació és un resum
del que s’ha vist fins ara:
oAdenoviridae
oBaculoviridae
oHerpesviridae
oPoxviridae
oPapillomaviridae
oMyoviridae (fag T4)
DNA de doble cadena
oCircoviridae
oParvoviridae
DNA de cadena senzilla
oReoviridae
RNA de doble cadena
oBromoviridae
oCoronaviridae
oFlaviviridae
oPicornaviridae
oVirgaviridae
oTogaviridae
RNA de cadena senzilla positiva
oFiloviridae
oParamyxoviridae
oRhabdoviridae
oPoxviridae
oOrthomyxoviridae
RNA de cadena senzilla negativa
oRetroviridae
RNA amb activitat transcriptasa inversa
oHepadnaviridae
DNA amb activitat transcriptasa inversa
Virologia 2020
CEBIO 81
Espècie vírica o malaltia
Família Àcid
Nucleic
Nombre de
segments Embolcall Simetria
Hepatitis A Picornaviridae ssRNA + - NO Icosaedre
Hepatitis B Hepadnaviridae DNA RT - SÍ Icosaedre
Hepatitis C Flaviviridae ssRNA + - SÍ Icosaedre
Xarampió Paramyxoviridae ssRNA - - SÍ Helicoidal
Galteres Paramyxoviridae ssRNA - - SÍ Helicoidal
Poliomelitis Picornaviridae ssRNA + - NO Icosaedre
Grip Orthomyxoviridae ssRNA - 8 SÍ Icosaedre
Rotavirus Reoviridae dsRNA 11 NO Icosaedre
Papil·loma Papillomaviridae dsDNA - NO Icosaedre
Constipat comú
Picornaviridae ssRNA + - NO Icosaedre
SIDA Retroviridae ssRNA + - SÍ Icosaedre
Mononucleosi infecciosa
Herpesviridae dsDNA - SÍ Icosaedre
Herpes simple HHV1
Herpesviridae dsDNA - SÍ Icosaedre
Ebola Filoviridae ssRNA - - SÍ Helicoidal
SARS Coronaviridae ssRNA + - SÍ Icosaedre
Varicel·la zòster
Herpesviridae dsDNA - SÍ Icosaedre
Sarcoma de Kaposi
Herpesviridae dsDNA - SÍ Icosaedre
Frebre groga Flaviviridae ssRNA + - SÍ Icosaedre
Dengue Flaviviridae ssRNA + - SÍ Icosaedre
Adenovirus Adenoviridae dsDNA - NO Icosaedre
Virus adenoassociat
Parvoviridae ssDNA + - NO Icosaedre
Rubèola Togaviridae ssRNA + - SÍ Complexa
Ràbia Rhabdoviridae ssRNA - - SÍ Helicoidal
Virologia 2020
CEBIO 82
Capítol 10 - Prions i viroides. En aquest tema analitzarem uns agents infecciosos especials. Els prions són proteïnes
infeccioses no associades a àcids nucleics. Els viroides són àcids nucleics no associats a
proteïnes. Per això també reben el nom d’agents subvirals.
L’estudi dels prions és important perquè sabem que afecten humans en diferents
malalties de baixa incidència però alta letalitat. A més, els prions no tenen ni vacuna ni
tractament. Per tant, els casos de famílies amb un cas previ d’aquesta malaltia no es poden
protegir malgrat tenir més probabilitats d’infectar-se’n.
Per altra banda, els prions han tingut un gran impacte en l’economia al també infectar
altres mamífers com les ovelles i les vaques. A finals del segle XX es va descriure una
malaltia provocada per prions i que va afectar a les vaques, de les quals se’n van haver de
sacrificar milers d’exemplars. El més impactant en aquell moment, però, va ser que el prió
causant de la malaltia a les vaques també podia afectar humans.
Aquesta infecció a humans tenia una incidència molt baixa, però va fer saltar l’alarma sobre
aquests nous agents infecciosos i de la seva potencialitat de saltar la barrera entre
espècies. De fet, des d’aquell brot s’estan realitzant controls en les diferents cries d’animals
per detectar aquests tipus de malalties.
Els prions també han significat un canvi en la manera de preparar i esterilitzar els quiròfans.
Això és perquè els prions són molt resistents, més del que ens pensàvem fa uns anys. La
conseqüència de descobrir-ho fou que es van haver de realitzar esterilitzacions de més
intensitat.
Finalment, l’estudi del canvi entre la conformació nativa i alterada de les proteïnes
priòniques pot aportar informació sobre els mecanismes moleculars d’altres malalties
conformacionals no transmissibles, com el Pàrquinson i l’Alzheimer. Un bon model per fer els
estudis de prions són els llevats, que permeten el seu seguiment en condicions controlades
de laboratori.
Per altra banda, els viroides que fins ara s’han descrit tan sols afecten a plantes. Tenen
un gran impacte econòmic en l’agricultura.
El virus de l’Hepatitis δ és un virus “especial”, ja que té unes característiques úniques
relacionades amb viroides i amb virus satèl·lits. Els virus satèl·lits són virus que requereixen
de la infecció per un altre virus, anomenat virus helper, per completar el seu cicle.
Proteïnes Infeccioses: el Prió.
Desenvolupament del concepte Prió.
La primera malaltia associada a prions que es va descriure és SCRAPIE. En castellà aquesta
malaltia rep el nom de tembladera i, en català, tremolor. Aquesta malaltia es va descriure en
ovelles, tot i que també afecta a cabres. Es va descriure per primer cop a Espanya fa més de
250 anys. Sembla ser que aparegué de forma espontània. Es sap que aquesta malaltia
cursa amb uns inicis de símptomes clínics com canvis en el comportament, separació de la
resta d’animals, hipersensibilitat al tacte, nerviosisme i por als sorolls sobtats com els
aplaudiments.
Els animals malalts mostren un caminar erràtic, és a dir, no es mouen d’una forma normal, i
tenen una gran tendència a rascar-se. Les ovelles afectades perden gran part de la llana. Els
símptomes neurològics del tremolor es van agreujant progressivament fins la mort de
l’animal.
Virologia 2020
CEBIO 83
Des de l’inici de la malaltia es va constatar que hi havia races d’ovelles que eren més
resistents que altres a contraure la malaltia. En conseqüència es va veure que hi ha un
control genètic de la susceptibilitat a desenvolupar-la.
El mètode natural de transmissió entre les ovelles no està clar. Els primers indicis d’infecció
es poden detectar a les amígdales, els ganglis limfàtics mesentèrics i als intestins de les
ovelles d’entre 10 i 14 mesos d’edat, el que suggereix una via d’infecció oral.
Quan l’animal mor, se li realitza un estudi patològic. El tret més característic s’observa al
parènquima cerebral. Al cervell es formen unes grans vacuoles. Per tant, es tracta d’una
encefalopatia espongiforme que, a més, és transmissible. Conseqüentment, és una
encefalopatia espongiforme transmissible (TSE en anglès). A dia d’avui no es coneix
tractament ni vacuna per aquesta malaltia i la seva incidència es controla per tres vies:
• Selecció de races.
• Sacrifici dels animals infectats i tots els animals de l’explotació ramadera afectada.
• Control d’importació.
El control d’importació funciona quan cada país que detecta un brot té l’obligació de notificar-
ho per tal que la resta de països puguin activar els mecanismes de control duaner de
mercaderies de països afectats.
Al principi es va postular que aquesta malaltia estava causada per un virus i que tenia
un període d’incubació llarg, però els estudis realitzats per microscòpia no van detectar la
presència de partícules compatibles amb virus. Aleshores es va postular la segona teoria: la
del virió.
La hipòtesi del virió establia que l’agent infecciós consistia en una petita partícula formada
per àcid nucleic de DNA o RNA associat a una proteïna de l’hoste. Així i tot, aquesta teoria
no es va poder provar mai perquè ni els tractaments d’àcids nucleics ni les proteases
inactivaven l’agent infecciós. L’únic tractament que funcionava era el fenol, que sabem
que elimina proteïnes.
Amb aquesta informació es va presentar la tercera teoria: una petita partícula de proteïna
resistent a la majoria de tractaments i amb la capacitat de reproduir-se sense material
genètic. Aquesta teoria “xocava” contra un dels dogmes de la biologia molecular en referència
a la presència d’àcids nucleics en totes les entitats biològiques detectades fins aleshores. Els
estudis que van demostrar aquesta teoria els va realitzar Prusiner.
L’estudi consistia en la generació d’uns models animals de tremolor en hàmsters. Per
aconseguir-ho, va inocular extracte cerebral d’ovelles infectades amb SCRAPIE a aquests
animals. Stanley Prusiner va demostrar així que l’agent infecciós era una forma variant d’una
proteïna cerebral normal.
A la forma normal de la proteïna la va denominar PrPc, mentre que a la forma infecciosa
la va denominar PrPsc. El superíndex SC és arran d’haver aconseguit la proteïna
d’SCRAPIE. A ambdues formes, la normal i la variant, les va anomenar prions, que significa
“partícula infecciosa proteínica”. Per aquests estudis en la naturalesa proteínica dels prions,
Prusiner va rebre el 1997 el premi Nobel de medicina.
La funció fisiològica de la proteïna priònica normal no està clara. Pot ser que jugui un paper
en el desenvolupament neuronal i la sinapsi. També podria ser que estigui relacionada amb
l’homeòstasi de la mielina. Alguns estudis indiquen que pot jugar un paper important en
l’homeòstasi d’ions metàl·lics.
Virologia 2020
CEBIO 84
Una característica d’aquesta proteïna és que pot adoptar diverses conformacions. Això vol
dir que una única estructura primària (una única seqüència d’aminoàcids) adopta un mínim
de dues conformacions. D’aquesta manera es pot explicar l’existència de PrPc i de PrPsc.
Quan es van comparar les estructures secundàries de les isoformes de PrP mitjançant
microscòpia òptica es va trobar que eren marcadament diferents. Els estudis d’infraroig per
transformada de Fourier (FTIR) i dicroisme circular mostraren que la PrPc, la normal, conté al
voltant d’un 40% d’hèlix α i una petita fulla β. La forma alterada, en canvi, està composta per
al voltant d’un 30% d’hèlix α i un 43% de fulla β. Així i tot, aquetes proteïnes tenen la mateixa
seqüència d’aminoàcids.
L’amiloide.
L’esdeveniment fonamental en el desenvolupament de la malaltia priònica és la conversió
conformacional de la proteïna priònica PrP des de la seva forma normal en una forma
causant de la malaltia. Un cop formada, la PrPsc es replica, induint la conversió de la PrPc en
molècules addicionals de PrPsc.
Les molècules de PrPsc són resistents a la proteasa, formant agregats amiloides.
Aquests agregats poden detectar-se al parènquima cerebral d’un animal infectat. Si s’analitza
per immunohistoquímica, els agregats formats es veuen marrons. Aquesta patologia recorda
a les malalties amiloides com el síndrome d’Alzheimer, la malaltia de Pàrquinson i
l’Esclerosi Lateral Amiotròfia; que es caracteritzen pel dipòsit de proteïnes de conformació
anormal a diversos òrgans i que també s’anomenen Encefalopaties Espongiformes.
Síntesi i processament de PrPc.
Com que la proteïna priònica PrP prové d’un gen cel·lular, buscant aquest gen al genoma i
trobant-lo, veurem que té el nom de PRNP. A totes les cèl·lules que expressen el gen es
produeix un mRNA a partir de dos exons. En tots els casos, la proteïna adopta la seva
conformació nativa o normal PrPc.
Formació de PrPsc i propagació de prions.
En una situació normal, la proteïna PrPc dimeritza i va a membrana. Si aquesta proteïna en
conformació nativa interacciona amb una proteïna en conformació alterada, PrPsc, es produeix
un canvi de conformació des de la normal a l’alterada. Aquest procés és la replicació de
l’agent infecciós. Així doncs, totes les còpies de PrPc que es van produint en una cèl·lula on
hi hagi conformacions alterades van passant a PrPsc gradualment. Es formen així uns
agregats anomenats plaques amiloides.
Pruisner, per demostrar la presència d’agregats de la proteïna priònica resistent a
proteases va fer un Western blot de 4 carrils. En aquest, els carrils 1 i 2 contenien extractes
cerebrals d’hàmsters normals i els carrils 3 i 4, extractes cerebrals d’hàmsters infectats. Els
carrils 1 i 3 es van carregar amb la mostra recollida, mentre que els carrils 2 i 4 es van carregar
amb la mostra tractada amb proteases.
Tant al carril 1 com al carril 3 es va veure una banda corresponent a la proteïna priònica.
La diferència és que al carril 1 hi havia banda única i al carril 3 hi havia múltiples bandes
(arran de les agregacions). Analitzant el carril 2, però, l’efecte de la proteïnasa k sobre la
proteïna priònica en la seva forma nativa va resultar en la completa eliminació de la
proteïna.
Al carril 4, en canvi, el que es podia veure era una banda d’un pes lleugerament inferior al de
la proteïna priònica identificada al carril 1 i que es devia a l’efecte de la proteïnasa tan sols
sobre la capa més externa de l’agregat.
Virologia 2020
CEBIO 85
El que es va produir en el western blot es pot explicar en base a la biologia molecular de la
proteïna. El ORF del gen Prnp codifica per una proteïna de 254 aminoàcids, els quals es
redueixen a 209 en la modificació post-traduccional. La PrPsc és una conformació
alternativa amb mateixa estructura primària que PrPc.
La proteòlisi limitada de PrPsc trenca l’extrem N-terminal i produeix un proteïna més curta,
d’aproximadament 142 residus, i un pes molecular aparent al gel d’entre 27 i 30kDa. Arran
d’aquesta segona característica, rep el nom de PrPsc 27-30.
La proteïna té una modificació post-traduccional molt característica que li permet
adherir-se a la membrana cel·lular per l’extrem C-terminal. Aquesta modificació consisteix
en l’addició d’un glicolípid Glicofosfatidilinositol (GPI).
Encefalopatia Espongiforme Bovina.
El gen Prnp es troba molt conservat en mamífers. En conseqüència, existeixen altres
malalties priòniques que afectes mamífers diferents de les ovelles i les cabres. Una
d’elles és la BSE o malaltia de les vaques boges. Aquesta malaltia va aparèixer de forma
espontània a finals dels 80s. Les vaques mostraven un comportament alterat i morien. Fent
una examinació microscòpica dels teixits cerebrals es van detectar tant degeneracions
espongiformes com gliosis astrocítiques.
Els primers casos de la BSE es van donar al bestiar boví del Regne Unit el 1986. Va tenir
el pic d’infeccions el 1992 i va anar disminuint anualment fins arribar als 0 casos que avui
encara mantenim. La primera hipòtesi sobre l’origen de la malaltia proposava que era de
proteïna provinent d’ovelles infectades amb tremolor que havia entrat a la cadena alimentària
de les vaques.
La hipòtesi era coherent amb la tesi que la transmissió d’aquesta malaltia era per via oral. Així
i tot, quan es va aïllar l’agent infecciós es va veure que no hi havia coincidència amb les
característiques fisicoquímiques que tenia l’agent infecciós del tremolor. També es va
comprovar que l’agent infecciós és una conformació diferent a l’alterada del tremolor, el que
suposa un nou agent infecciós.
Es pressuposa que es va generar de forma espontània a algun punt del regne unit i
que, a través del consum d’animals que havien tingut la infecció, es va transmetre
exponencialment a la resta d’animals. Es creu que va ser perquè les proteïnes infeccioses
tornaven a entrar a la cadena alimentària. Això va forçar unes directives que impedien
l’entrada de la proteïna al cicle alimentari, el consum de restes bovines de teixits tous i el
consum de teixits tous d’altres animals no bovins. Per evitar la infecció, calia eliminar tots
els animals d’una explotació bovina si es detectava un sol cas infectat.
Encefalopaties Espongiformes Transmissibles Humanes.
El gen Prnp està molt conservat en mamífers. Els humans som mamífers. Els humans tenim
el gen Prnp. De malalties relacionades amb conformacions alterades d’aquesta proteïna
n’hi ha unes quantes.
La primera que es va descriure va ser la Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) i té 3 formes. La
forma esporàdica rep aquest nom quan el pacient no té antecedents familiars ni d’intervenció
al sistema nerviós central. La forma iandrogènica es defineix quan el pacient té un risc
reconegut d’haver rebut una intervenció al sistema nerviós central i que aleshores hagi entrat
la malaltia. La forma familiar és aquella que es dona quan es tenen un avantpassat que hagi
patit la malaltia.
Virologia 2020
CEBIO 86
L’insomni fatal familiar passa al haver-hi una mutació puntual d’un aminoàcid del gen
Prnp a la posició 178. Un canvi d’àcid aspàrtic a asparagina augmenta les possibilitats de
canvi de la forma normal a la forma alterada.
La malaltia Gerstmann-Strussler-Scheiken (GSS) té un component genètic hereditari
dominant i, en conseqüència, la presència d’avantpassats que hagin patit la malaltia
augmenta en gran part les possibilitats de patir-la.
La malaltia kuru està erradicada i es donava en tribus de nova guinea que realitzaven
canibalisme de la gent per honorar-ne l’ànima. Com que el ritual exigia la ingesta dels
teixits tous dels morts per part de les seves parelles i els seus fills, la infecció tenia major
incidència en dones i joves.
Els anys 90, va aparèixer la vCJD en humans. Es correspon amb la forma humana de
l’agent infecciós causant de la BSE i la transmissió es va donar per la ingesta de menjar
contaminat. En contrast a la CJD, que es dona en gent gran, la vCJD es dona en gent més
jove i té unes característiques clíniques atípiques.
Les característiques clíniques de la vCJD inclouen símptomes psiquiàtrics o sensorials i
l’aparició tardana d’anormalitats neurològiques. La vCJD va tenir un desfasament temporal
respecte la malaltia de les vaques boges i una molt menor infectivitat en humans, ja
que la transmissió entre espècies era molt complicada.
Barreres entre espècies.
Els agents infecciosos tenen com una barrera entre espècies que en alguns casos es pot
creuar. Malgrat haver-hi hagut una detecció de BSE a humans, mai s’ha trobat tremolor en
humans.
Així i tot, Pruisner havia de demostrar aquesta barrera entre espècies. Per fer-ho, va tenir
accés a tres tipus d’animals: hàmsters, ratolins i ratolins transgènics sense el gen Prnp de
ratolí però amb el gen Prnp de hàmsters.
L’experiment va començar amb dos grups d’animals. Per un costat, pren hàmsters infectats i
en fa unes extraccions de cèl·lules del cervell. Per altra banda, pren ratolins infectats i també
en fa un extracte de cervell. Amb els dos extractes, Pruisner injectà el material als tres grups
d’animals que tenia preparats.
En cas que hi hagués una barrera entre espècies, la transmissió ratolí-ratolí i hàmster-
hàmster hauria de ser fàcil i efectiva, mentre que les transmissions hàmster-ratolí i
ratolí-hàmster haurien de ser complicades i inefectives. Exactament això és el que va
veure. Els ratolins amb el gen Prnp de hàmster reben molt fàcilment la infecció per part de
hàmsters. En canvi, reben molt poc eficientment la infecció per part dels ratolins. Amb aquest
experiment, Pruisner va demostrar l’existència d’una barrera entre espècies per aquesta
malaltia.
Posteriorment, Pruisner va infectar, a partir dels ratolins transgènics, un grup d’hàmsters i un
grup de ratolins. El que va veure va ser sorprenent. Els extractes de ratolins transgènics
infectats a partir d’hàmsters eren molt eficients en la infecció a hàmsters i molt dolents en la
infecció a ratolins. Per altra banda, els extractes de ratolins transgènics infectats a partir de
ratolins normals eren molt eficients en la infecció a ratolins i molt dolents en la infecció a
hàmsters.
Aquest comportament experimental és el que es va anomenar soques priòniques. Això
demostrava que el que es transmet no és l’agent priònic en si mateix, sinó que es
Virologia 2020
CEBIO 87
transmet la conformació. Els animals transgènics eren genèticament iguals però els agents
infecciosos que provenien de diferents espècies tenen diferents conformacions. Això significa
que els agents infecciosos depenen de cada espècie.
Les proteïnes priòniques d’hàmster tenen dues conformacions possibles: normal i
alterada. Ambdues en son favorables energèticament. En cas que una proteïna alterada es
trobi amb una proteïna normal, el canvi serà fàcil i ràpid. No passa el mateix amb les proteïnes
de ratolí, que tenen unes diferents conformacions normal i alterada.
En conseqüència, la infecció de ratolins modificats amb proteïnes de hàmster és eficaç
(és la mateixa conformació) mentre que la infecció amb proteïnes de ratolins normals no
ho és (és una conformació molt diferent).
Les proteïnes de l’animal infectat que canviïn de conformació prendran l’anòmala de
l’animal original del que s’ha extret la infecció. En conseqüència, una segona infecció serà
eficient sobre la mateixa espècie de la que s’hagi fet la extracció original.
Diversitat fenotípica dels prions: Soques.
El concepte que Prusiner va descriure de les soques de prions és la més acceptada
actualment i està relacionada amb la diversitat conformacional d’aquestes proteïnes. Les
dades recopilades fins ara indiquen que la proteïna pot adoptar un núvol de
conformacions alterades. Cadascuna d’aquestes seria una soca. L’estructura primària de
la proteïna de cada espècies és el principal determinant de la diversitat conformacional i de
l’associació de cada conformació amb una malaltia. Si es tenen diferents espais
conformacionals per l’espècie A, B o C; cadascuna d’aquestes espècies pot compartir
conformacions amb altres espècies primàries.
Així és com s’explica que l’agent priònic del BSE hagi creuat la barrera d’espècie i hagi
infectat humans. Això és explicable per la teoria perquè seria una conformació alterada en
un espai conformacional compartit entre diferents espècies. Si es fa referència al tremolor, en
canvi, s’ha de considerar que l’espai conformacional de la proteïna priònica d’ovelles no
comparteix espai conformacional amb la proteïna provinent d’humans.
Prions de llevats.
En llevats també hi ha proteïnes que es comporten com els prions de mamífer. N’hi ha
diverses, com l’extrem N-terminal de la proteïna Sup35, que fenotípicament rep el nom de
[PSI-]. La Sup35 forma part d’un complex proteic finalitzador de la traducció. Si hi ha una
factor diferent, agrega i ja no es pot unir al ribosoma, que continuarà la traducció i formarà
poliproteïnes més llargues del normal. En llevats es relacionen els prions amb el fitness
cel·lular, l’adaptació i a la resistència a fàrmacs, així com amb la resistència cel·lular.
Viroides.
Estructura i dominis constants.
Els viroides són agents infecciosos que només afecten plantes. Són molècules de mRNA
molt petites (d’entre 246 a 399 nucleòtids) que no tenen cap proteïna associada. Són de
cadena senzilla, però són circulars i tancats amb un gran aparellament intern. No codifiquen
per cap proteïna i, per aquest motiu, depenen dels enzims de la planta per la seva replicació
i altres funcions.
Hi ha més de 280 seqüències de RNA subviral. S’han classificat en dues famílies per part
de la ICTV. La família Pospiviroidae replica al nucli de la cèl·lula hoste mentre que les
Avsunviroidae repliquen al cloroplast. En total, s’han identificat 32 espècies. Una espècie de
la família dels Pospiviroidae és el responsable del tubercle fusiforme de la patata.
Virologia 2020
CEBIO 88
Hi ha un gran aparellament intramolecular. Tenen diferents regions o dominis constants.
Per un costat, trobem els extrems terminals. Aquests tenen una estructura secundària
concreta que evita la funció de les RNAses, a la part central tenen una regió rica en citocines
i guanines molt important per la replicació dels glioides.
A la dreta hi ha una regió variable on una cadena son rizampurines i en l’altre són
rizampirimidines. També tenen una repetició d’adenines que cobreix les regions
patogèniques. Aquestes zones s’han descobert mitjançant estudis controlats als laboratoris
fent diferents infeccions de variants.
Possibles mecanismes de patogenicitat.
No es té un gran coneixement sobre els mecanismes de simptomatologia dels viroides
a les plantes. Sembla ser que provoquen una alteració del metabolisme normal de la planta.
Hi ha viroides estranys que no respecten del tot l’estructura anterior. Un exemple és el virus
del mosaic latent de préssec. Es tracta d’una molècula de mRNA tancada amb una gran
aparellament intramolecular. La característica d’aquests mRNA i dels de la família
Avsunviroidae és que tenen una activitat riboenzim. Això implica que poden tallar
l’estructura en unes posicions concretes (indicades per una fletxa a la figura). L’activitat
riboenzim és essencial per la seva replicació.
Els viroides no es repliquen al citoplasma, com si que fan els típic virus de RNA de plantes.
Repliquen al nucli o al cloroplast. A més, l’activitat enzimàtica de replicació la realitza la
RNA polimerasa II de la cèl·lula. La patogenicitat dels viroides sembla estar relacionada
amb l’alteració de l’expressió gènica de l’hoste per la interacció entre el genoma del viroide i
el de la cèl·lula hoste. Sembla ser que això està relacionat amb siRNA derivats del genoma
viroide que poden provocar el silenci de gens del genoma de l’hoste.
Algunes infeccions per viroides donen lloc a malalties benignes. Altres poden suposar
un impacte econòmic molt elevat en plantes de molt interès com la patata, infectada pel viroide
PSTVd. Al contrari que els virus, els viroides són paràsits de la maquinària
transcripcional de l’hoste.
Satèl·lits. Els satèl·lits són virus que no poden infectar i replicar en un hoste per si sols, sinó que
necessiten que les cèl·lules estiguin infectades per un altre virus. Aquest segon és el
virus helper. Són virus de RNA de cadena senzilla però són més grans, d’entre 500 i 2000
nucleòtids. No hi ha molta similitud de seqüència entre els virus satèl·lits i els virus helper.
Quan un individu està infectat pels dos virus, els símptomes poden ser diferents a quan
s’està infectat tan sols pel virus helper. La replicació dels satèl·lits interfereix a la replicació
del virus helper. Això no passa en virus de genomes defectius. En aquest cas, les seqüències
entre els dos virus són molt semblants però als defectius li falta alguna part.
Els virus satèl·lits codifiquen per un parell de proteïnes estructurals que fa servir per
encapsidar el seu genoma i anar passant de cèl·lula a cèl·lula. Així doncs, té vàries
diferències amb els viroides.
Els satèl·lits necessiten d’un virus helper i codifiquen per proteïnes, els viroides no. Els
viroides repliquen fent servir els enzims del virus helper al nucli o al citoplasma i els viroides
repliquen al nucli o al cloroplast fent servir la RNA polimerasa II de la cèl·lula.
Virologia 2020
CEBIO 89
Hepatitis delta virus. El virus de l’hepatitis δ pertany al regne Riboviria, no té una família assignada, és del gènere
deltavirus i n’és l’única espècie: Hepatitis delta virus. El seu genoma és de DNA de cadena
senzilla amb polaritat negativa, fa servir el virus de l’hepatitis B com a virus helper, es replica
per la cèl·lula hoste i s’encapsida amb proteïnes estructurals del virus de l’hepatitis B.
Té un genoma gran, d’uns 1640 nucleòtids, i al seu extrem esquerre hi ha una regió amb
molta homologia amb la regió central conservada del viroide de la patata.
El virus de l’hepatitis δ té una sèrie de proteïnes estructurals a la seva membrana que
estan extretes de les proteïnes estructurals de la hepatitis B. El virus de la hepatitis delta
codifica per una proteïna, la proteïna antigen δ. Aquesta es complexa amb el RNA per formar
la nucleocàpsida que s’inclou dins d’una membrana. Així doncs, aquest virus té propietats
mixtes entre les de satèl·lit i les de viroide.
Els seus 1640 nucleòtids confirmen la classificació del virus de l’hepatitis δ amb un
virus satèl·lit. Per altra banda, depèn d’un altre virus i fa servir proteïnes estructurals del
virus de l’hepatitis B. A més, és capaç de codificar per una proteïna, la qual fa servir per
encapsidar el seu RNA genòmic.
També té característiques de viroide, com una seqüència amb molta homologia a la regió
central conservada del viroide de la patata, relacionada amb la replicació d’aquest viroide. A
més, l’hepatitis δ no codifica per una RNA polimerasa dependent de RNA. El genoma d’aquest
virus és replicat per la RNA polimerasa II de la cèl·lula que depèn de DNA. Finalment, també
té activitat de viroide perquè tant la cadena negativa com la complementària tenen una
activitat de riboenzim essencial per la seva replicació.
Virologia 2020
CEBIO 90
Capítol 11 – Bacteriòfags.
Ús dels bacteriòfags en genètica molecular i Biotecnologia.
Què és un Bacteriòfag?
Els bacteriòfags es van descobrir a principis del segle XX per dos grups d’investigació
treballant paral·lelament. El grup de F. Twort els va descobrir el 1915 i el de F. d’Herelle, el
1917. Van descriure aquests organismes com virus que infecten bacteris. El seu nom deriva
del grec, on fagos significa menjar o devorar.
Aquests virus es troben adaptats a qualsevol ecosistema i són molt abundants, s’estima que
n’hi ha 1031. Són, també, molt diversos. Això és perquè el 50% dels genomes de fags
seqüenciats no tenen cap homòleg en cap base de dades. A més, el 20% dels genomes de
bacteris corresponen a seqüències de pròfags. Un pròfag és un fag que ha quedat atrapat
al genoma del bacteri, indicant que hi ha una coevolució entre els bacteriòfags i els seus
possibles hostes.
El descobriment dels bacteriòfags ha tingut un gran impacte en la biologia i genètica
moleculars. Gràcies al seu estudi es sap que el DNA és un material genètic, es va poder
definir un gen, es va descobrir el RNA i es van aconseguir diverses eines que ara es fan servir
molt a la biologia molecular. Entre aquestes eines que els bacteriòfags han permès descobrir
es troben:
• Els enzims de restricció.
• La transducció.
• La mutagènesi insercional.
• Els vectors d’expressió i clonatge.
Els bacteriòfags tenen un munt d’aplicacions biotecnològiques. En destaquen els usos com
a:
• Sensors de bacteris.
• Eines antimicrobianes (importantíssim en la lluita contra els bacteris resistents).
• Vehicles per l’entrega de fàrmacs o gens.
• Biomaterials per la construcció òssia.
Una altre possibilitat que els bacteriòfags obren la porta a explotar és com a eines
d’expressió de pèptids per a la producció d’anticossos i per a l’evolució molecular dirigida.
Malgrat tot, treballar amb aquest tipus d’entitats biològiques pot tenir seriosos
problemes. Això és perquè s’usen en la indústria alimentària, on els bacteris són essencials
en els bioprocessos que s’hi realitzen. L’eliminació de bacteriòfags és molt complexa
perquè són organismes molt resistents als tractaments habituals per descontaminar.
Ús dels bacteriòfags com a sensors per a la detecció de bacteris.
Una possible aplicació dels bacteriòfags és la detecció de patògens en una mostra.
Aquesta mostra podria ser, per exemple, d’aigua corrent amb sospites de contaminació fecal.
Per comprovar-ho, es fa servir un kit de detecció d’E. coli. En aquest kit, entre altres
components, s’hi troba un bacteriòfag específic d’espècie modificat genèticament.
El fag λ del kit té afegit el gen luxi. Aquest gen, al entrar en un individu E. coli viable, inicia la
producció de N-acil-homoserina-lactona, la qual entra en les cèl·lules marcadores del kit
(reporter strain). La lactona s’uneix al promotor de la luciferina, un enzim el producte del
Virologia 2020
CEBIO 91
qual és luminescent. D’aquesta manera, es pot detectar d’una manera senzilla i ràpida la
presència de patògens en una mostra. Es poden analitzar en paral·lel diverses mostres.
A les mostres d’aigua que hagin contingut E. coli però els hagin matat durant el procés de
fabricació, el test donarà negatiu. El sistema només donarà positiu quan hi hagi patògens
viables. Si això no es dona, no hi haurà la lactona, la cèl·lula marcadora no produirà luciferina
i no hi haurà luminescència. Aquesta prova, doncs, és molt efectiva. Més efectiva, com a
mínim, que la PCR, la qual donaria positiu si quedessin restes del patogen.
Apart de detectar patògens en mostres alimentàries, aquesta tècnica també es pot fer
servir per a la desinfecció, l’agricultura o per evitar atacs bioterroristes.
Ús de bacteriòfags com a eines antimicrobianes.
Els bacteriòfags es poden fer servir, i ja es fan servir, com a eines amb activitat
antimicrobiana. Tant als Estats Units com a Rússia hi ha productes d’aquest estil. Als Estats
Units el camp està més desenvolupat i els productes disponibles són per tractar plantacions
de tomàquets i pebrots infectats per Xantomonas campestris pv. vesicatoria i per
Pseudomonas syringae pv. Tomato. Aquest producte rep el nom d’OmniLytics.
Els Estats Units també tenen disponibles al mercat additius per al menjar compostos per
bacteriòfags. En concret, en tenen 2. ListShield és un additiu que ataca a Listeria
monocytogenes i EcoShield és un producte que es polvoritza sobre la carn vermella abans
de picar-la per fer hamburgueses i així matar Escherichia coli, que podria causar fortes
gastroenteritis.
Per altra banda, al mercat rus ha paregut un producte d’aspecte de tireta que conté, a part
dels bacteriòfags, altres agents que ajuden a la cicatrització de ferides molt profundes. Aquest
producte, anomenat Phagobioderm, és una pel·lícula polimèrica biodegradable.
En relació a l’aplicació dels bacteriòfags com a eina antimicrobiana, s’està treballant en l’ús
dels bacteriòfags específics contra salmonel·la per subministrar-los a pollastres. Els
pollastres infectats amb salmonel·la no presenten símptomes, però el consum d’aquest
bacteri per part dels humans resulta en una salmonel·losi severa.
Una solució proposada des d’un laboratori d’investigació de la UAB és la ingesta de
bacteriòfags protegits per liposomes. En quant aquests bacteriòfags arriben a l’intestí,
eliminen els bacteris de la salmonel·la. Els liposomes són essencials per al subministrament
del “tractament” perquè, sinó, l’estomac degrada les càpsides.
Ús de Bacteriòfags com a vehicles de subministrament de medicaments o gens.
Els bacteriòfags es poden fer servir com un transportador de gens o fàrmacs. Aquesta
aproximació encara no està disponible al mercat, però les investigacions al respecte
prometen. Per una banda, en un model cel·lular es va fer servir un bacteriòfag amb un fàrmac
antitumoral incorporat i va aconseguir eliminar les cèl·lules cancerígenes del model.
En un altre article s’ha aconseguit que un bacteriòfag derivat de λ transfereixi un gen d’un
dels virus del papil·loma humà i alteri el cicle cel·lular. Aquesta estratègia es va pensar com
a mecanisme de vacunació.
Ús de bacteriòfags com a biomaterials per la construcció òssia.
Els bacteriòfags es poden fer servir com a materials. En aquest context, la capacitat de
multiplicació vírica queda anul·lada per diferents motius. S’ha vist que les càpsides dels virus,
arran de la seva estructura de nanopartícula biodegradable, faciliten el creixement cel·lular.
Virologia 2020
CEBIO 92
Això és gràcies a l’atracció de les cèl·lules de mamífer per les estructures regulars i sortints a
les que es poden adherir i créixer a sobre.
Ús de bacteriòfags com a eines d’expressió peptídiques (Phage Display).
El Phage Display és una tècnica que ha revolucionat la selecció de pèptids, proteïnes i
anticossos que tinguin unes propietats molt concretes contra unes partícules diana.
Desenvolupada als anys 90, aquesta tecnologia es basa en la presència de proteïnes
d’interès a la superfície de les partícules víriques bacteriofàgies. A més, aquestes
partícules víriques tenen dins d’elles el genoma associat als gens que codifiquen per
aquestes proteïnes d’interès.
Dit d’una altra manera, hi ha una connexió directa entre genotip i fenotip. Gràcies a això, la
selecció d’un fenotip (selecció de les partícules víriques que mostrin a la seva superfície
una proteïna amb una característica concreta), equival a la selecció del genotip que el
codifica.
El Phage Display funciona en base a un gran nombre de variants de seqüències de DNA
que codifiquen per una gran multitud de molècules que es poden clonar en fags.
Posteriorment, es poden rescatar individualment fags concrets de les grans col·leccions
mitjançant la interacció de les proteïnes amb un lligand concret.
La selecció rep el nom de Phage Display Panning. Un cop seleccionats els fags, es poden
amplificar infectant bacteris. Aquest és un sistema que fa servir procariotes, pel que és
bastant senzill i qualsevol persona amb un mínim de coneixements de laboratori pot realitzar-
los ràpidament.
Els virus que es fan servir pel Phage Display són fags filamentosos del gènere Inovirus. Són
virus de DNA de cadena senzilla circular tancada i tenen una càpsida proteica molt
allargada, de 6.5nm de diàmetre i 930nm de longitud. El receptor cel·lular per aquests virus
és el pili de la cèl·lula. Arran d’això, l’hoste natural d’aquests bacteriòfags són els bacteris
d’E. coli que tenen el plasmidi F.
Dins dels Inovirus, la classe que més es fa servir pel Phage Display és la Ff. Dins d’aquesta,
en destaca el fag M13. En aquest es va basar el primer vector de clonatge que es va
desenvolupar. Aquests bacteriòfags tenen el DNA envoltat per una gran quantitat de còpies
de la proteïna VIII, que es troba en 2700 unitats aproximadament. Als extrems de la càpsida
s’hi troben unes proteïnes amb un menor nombre de còpies.
Les proteïnes dels extrems de la càpsida dels fags M13 són la proteïna VII i la proteïna IX,
amb 5 còpies de cadascuna, i les proteïnes III i VI. La proteïna VI té 403 residus, la proteïna
III en té 112. Les proteïnes VII i IX són de 50 i 33 residus respectivament. La proteïna
encarregada de la interacció del virus amb la cèl·lula hoste és la proteïna III.
Com que aquestes proteïnes han de formar part de la partícula vírica i aquesta té un procés
de gemmació especial on no es recull la membrana de la cèl·lula, totes aquestes proteïnes
tenen un pèptid senyal.
El Phage Display es pot realitzar sobre qualsevol de les proteïnes d’aquest virus. També
es poden realitzar vàries modificacions en vàries proteïnes de la seva superfície per assegurar
que tingui afinitat per diferents lligands.
Així i tot, les modificacions que més es fan servir és la de la proteïna VIII, amb una gran
quantitat de còpies i present en tota la longitud del virus, i la de la proteïna III, de poques
còpies i exposada en tan sols una “punta” del bacteriòfag.
Virologia 2020
CEBIO 93
Cal tenir en compte que, per tal que aquesta tècnica funcioni correctament, les partícules
víriques han de mantenir la seva capacitat infectiva i han de poder realitzar el cicle víric.
D’entre les dues modificacions mencionades, la que més es fa servir és la modificació de la
proteïna III, la proteïna encarregada de la interacció entre el bacteriòfag i l’hoste. Dins de les
possibilitats de modificació de la proteïna III, hi ha dues aproximacions: la modificació
completa i la modificació híbrida.
La modificació completa es basa en l’obtenció de bacteriòfags on totes les còpies de la
proteïna III s’han modificat de tal manera que se’ls hagi afegit un fragment de DNA codificant
per pèptids d’uns 12 residus. Modificar totes les còpies de la proteïna III amb un pèptid llarg
seria perjudicial per mantenir la capacitat infectiva, per això es fa servir per pèptids petits.
Per quan es vol realitzar un Phage Display amb proteïnes grans s’ha desenvolupat la
tecnologia híbrida, on alguna de les còpies de la proteïna III està completament modificada
però encara hi ha unes quantes còpies de la proteïna III original. Això li permet continuar
infectant les cèl·lules d’E. coli i alhora ser seleccionada del pool de bacteriòfags modificats.
Modificació completa.
Existeixen cases comercials, com New England BioLabs, que sintetitzen químicament els
nucleòtids que codifiquen per modificacions completes de la proteïna III del fag M13.
Aquestes modificacions es fan per aleatorietat. New England BioLabs té unes llibreries
consistents en col·leccions de bacteriòfags amb insercions d’uns 12 aminoàcids a l’extrem N-
terminal de les proteïnes III. La casa comercial, quan entrega el producte, afirma que hi ha
uns 109 bacteriòfags diferents amb unes 100 còpies de cadascun aproximadament. Aquest
material s’entrega en un eppendorf amb 10µl.
El primer pas que es realitza quan es rep una col·lecció de bacteriòfags provinent d’una casa
comercial és amplificar, ja que amb els 10µl no es pot fer gaire cosa. Per amplificar, es fa
servir el sistema natural de multiplicació: la infecció natural a la cèl·lula hoste.
Per poder amplificar cal tenir un cultiu controlat d’E. coli creixent en fase exponencial al
laboratori. A aquest cultiu se li ha d’afegir la col·lecció de bacteriòfags que s’ha adquirit. En
conseqüència, cal afegir les 1011 partícules víriques que es tenen en 10µl a un cultiu
d’aproximadament 1011 cèl·lules d’E. coli repartides en 1L. La infecció es dona de manera
natural ja que la proteïna III, malgrat tenir les modificacions, encara és capaç d’interaccionar
amb el pili de la cèl·lula.
Quan es dona la interacció, la partícula vírica internalitza el genoma dins la cèl·lula hoste.
En conseqüència, ja es té la còpia completa del genoma dins el citoplasma d’aquesta.
Aquesta presència al citoplasma permet l’expressió de tots els factors proteics del
genoma, siguin estructurals o funcionals.
Una de les proteïnes estructurals que es forma és la proteïna III, la qual es localitza a la
membrana interna del bacteri gràcies a la seqüència senyal. Arribats a aquest punt, el
genoma es replica i surt de la cèl·lula arrossegant les proteïnes de la càpsida i generant una
gran multitud de partícules víriques per cèl·lula.
Phage Display Panning.
Feta l’amplificació, es disposa de la mescla amplificada de totes les variants presents al tub
inicial de 10µl. Cal buscar quines d’aquestes variants poden interaccionar amb la partícula
diana.
Virologia 2020
CEBIO 94
Suposem que la nostra partícula diana és un receptor cel·lular marcador de les cèl·lules
cancerígenes. Per detectar quines variants s’hi uneixen, cal fer una placa ELISA. En aquesta,
es decora la superfície dels pous amb la proteïna diana de la que volem trobar un pèptid que
s’hi uneixi molt específicament. Sobre els pouets s’hi afegeix la mostra inicial de bacteriòfags.
La majoria d’ells no tindran activitat biològica respecte la proteïna diana. És per això que
cal fer una sèrie de rentats per tal d’eliminar la majoria de bacteriòfags, els que no s’hi hagin
unit. Aquests rentats es poden fer amb unes condicions que cada cop requereixin més afinitat
per la molècula diana.
Un cop fets tots els rentats, cal realitzar una elució per eliminar les interaccions
intermoleculars que s’han donat. Amb tots els bacteriòfags aïllats, cal fer una nova ronda
d’amplificació. El resultat de l’amplificació dels seleccionats també requereix d’una selecció.
De fet, el procés complet (Amplificació-Rentat-Elució) cal que es realitzi entre tres i quatre
vegades com a mínim. El procés de selecció consistent en el rentat i elució de les plaques
d’ELISA, quan es realitza com a part del Phage Display, rep el nom de Panning.
Realitzades 3 o 4 rondes de Phage Display Panning, s’alliberen uns bacteriòfags que cal aïllar
mitjançant una titulació de virus. Amb aquest mecanisme, es poden aïllar clonalment
cadascun dels bacteriòfags que s’obtenen de les plaques d’ELISA de l’últim Panning. En
aquest mecanisme, cadascuna de les calbes que es formen es correspon amb un clon
diferent que té afinitat per la molècula diana. Aïllat el clon d’interès, es pot seqüenciar i saber
quins són els aminoàcids que codifiquen per un pèptid amb gran afinitat per la nostra proteïna
diana.
Modificació Híbrida.
L’estratègia híbrida es fa servir per obtenir pèptids més grans, de fins a quiloDaltons. Un
exemple d’ús d’aquesta tecnologia és per l’aïllament d’anticossos, la qual s’està imposant
al mercat biomèdic. Per a fer servir aquesta tecnologia calen dos components. Per un costat,
cal fer servir un virus helper. Per l’altre banda, cal un vector. Els plasmidis que es fan servir
al Phage Display com a vectors són els fagèmids.
El virus helper és un virus M13 salvatge. Els diferents gens que conté codifiquen tant per les
proteïnes estructurals com per les no estructurals. Dins del genoma hi ha també un origen de
replicació, així com un Packaging Signal. El Packaging Signal és un fragment de DNA molt
important, ja que és a partir d’ell que es generarà un senyal per tal que el material genètic
replicat surti de la cèl·lula.
En aquest bacteriòfags, la proteïna III no està modificada i conté tant el pèptid senyal com
tota la resta del gen intacte. Així doncs, els fags M13 helper presenten, a la seva superfície,
la proteïna III salvatge.
Vector Fagèmid.
El fagèmid és el vector que es fa servir. Aquest plasmidi és un DNA de doble cadena que
conté:
• Un gen de resistència a antibiòtic
• Un origen de replicació de fag
• Un origen de replicació de plasmidi
• Un Packaging Signal
• Un gen heteròleg incorporat.
Virologia 2020
CEBIO 95
Aquest gen heteròleg és el gen de la proteïna III truncat. Aquesta part heteròloga podria ser
un fragment dels anticossos que contingui les regions variables de la cadena senzilla i la
cadena pesada, per exemple.
En el cas de l’estratègia completa (full), la varietat ve marcada pel nombre de residus que es
seleccionen de la llibreria. En el cas de l’estratègia híbrida, la diversitat (la quantitat de gens
III diferents que es poden incorporar al vector de clonació) depèn de l’origen de la mostra que
s’hagi recollit.
Si es vol recollir varietat en la producció d’anticossos, cal aïllar les cèl·lules B d’un individu
al que haguem provocat la immunitat contra un antigen concret. Aïllades les cèl·lules,
cal purificar-ne el RNA, passar-lo a cDNA i fer PCRs per amplificar les regions variables dels
anticossos. Aquestes regions es poden obtenir en una sola molècula on les parts variables
de cada cadena estiguin unides covalentment.
El plasmidi es pot amplificar a E. coli, per exemple. S’ha d’introduir dins de les cèl·lules i
cultivar-les. Amb això es pot seleccionar les cèl·lules que hagin incorporat el plasmidi.
Aquesta selecció es fa aplicant l’antibiòtic pel qual el plasmidi en codifica la resistència.
Un cop amplificat el plasmidi, el nostre objectiu és incorporar les proteïnes quimèriques a
les superfícies dels virus M13 i després seleccionar les partícules víriques amb afinitat per
la nostra molècula diana.
L’experiment de producció de les partícules víriques comença amb un cultiu d’E. coli en fase
exponencial al qual s’afegeix el fagèmid perquè es transformi. Aquesta transformació es
pot fer relativament fàcil amb un shock tèrmic. Seleccionades les E. coli que han desenvolupat
resistència, entra en funcionament el virus helper. Per tal que el virus entri a les cèl·lules es
fa servir la via natural de la infecció. Dins les cèl·lules hi ha, doncs, el genoma del virus, el
genoma de l’hoste i el fagèmid.
Quan comença el cicle del virus s’expressen tant les proteïnes no estructurals com les
estructurals. Les proteïnes no estructurals provoquen, entre altres processos, la replicació
del genoma víric. A les cèl·lules hoste d’E. coli, però, també s’hi troba el fagèmid. Tots dos
es replicaran al tenir un origen de replicació víric. Finalment s’expressen els gens
estructurals. Al fagèmid en tenim un preparat per ser expressat en presència del virus, ja que
disposa dels senyals per ser reconegut. S’expressen tant els gens estructurals del fag com
el del fagèmid.
En quan comença el moment de “sortida”, cal assegurar que el DNA que surti sigui el del
fagèmid. Això requereix una molt alta efectivitat en la sortida del fagèmid per evitar que els
genomes sortints siguin els del virus original. En conseqüència, el Packaging Signal del
fagèmid ha de ser millor que el del virus original.
Phage Display Panning.
Un cop es té la col·lecció de partícules víriques amb diferents fagèmids, es tenen partícules
víriques amb molècules de la proteïna III salvatge i la proteïna III modificada a la seva
superfície. Aquestes partícules les tenim en un líquid i amb una varietat d’entre 108 i 1011 tipus
de partícules diferents segons el sistema i l’origen de la mostra. Aquesta diversitat la farem
servir en el Panning.
El procediment és el mateix que es fa servir en el Panning de la tècnica completa. També es
repeteix el procés unes 3 o 4 vegades. Aquells bacteriòfags que es mantinguin units s’aïllen
per titulació on cada calba seria la infecció inicial. En el cas de l’estratègia híbrida, el procés
d’amplificació al final de cada ronda de Panning requereix del virus helper per poder
amplificar la mostra de partícules.
Virologia 2020
CEBIO 96
Usos i aplicacions del Phage display.
Selecció d’Anticossos.
Un dels majors usos de la tecnologia Phage Display Híbrida és la selecció d’anticossos. La
principal característica que diferència l’ús de la tècnica del Phage Display respecte al mètode
tradicional és que ja no cal fer servir animals, estalviant temps, diners i patiment.
Originalment, el procés de selecció d’anticossos consistia en diversos passos. Per començar,
calia immunitzar els animals i deixar passar uns dies fins que es produís una resposta
immunològica a les cèl·lules B. Quan aquesta es donava, s’havia de:
1) Sacrificar els animals.
2) Extreure’n la melsa.
3) Aïllar-ne les cèl·lules B.
4) Generar hibridomes.
Els hibridomes es seleccionaven aleshores clonalment per tal de poder realitzar una placa
d’ELISA on cada pou tan sols tingués un tipus una cèl·lula. Arribats a aquest punt, calia
identificar quin pou o pous contenien anticossos amb especificitat d’unió per l’antigen
que s’estava investigant.
Aquest procés es podia realitzar de diverses maneres. Això implicava, doncs, treballar amb
instal·lacions relacionades amb animals, cultius cel·lulars (i totes les complicacions de
bioseguretat i esterilitat que porten) i fent servir mitjans de gran despesa i temps. En
conseqüència, el procés podia trigar mesos.
En contraposició, el Phage Display requereix:
1) Extreure el RNA de les cèl·lules B.
2) Transformar-lo a DNA.
3) Fer una sèrie de PCR consecutives.
4) Obtenir els gens que codifiquen pels fragments de les regions variables o pels
anticossos complets.
Això, malgrat siguin vàries PCR, requereix de poc temps en comparació amb un sol cultiu
d’eucariotes. Un cop es tenen els cDNA amplificats, cal inserir-los en un fagèmid a través
de les tècniques de biologia molecular estàndards per a clonació.
Obtinguts els fagèmids, es realitza:
1) El sistema d’amplificació amb els virus helper.
2) El Panning i amplificació.
3) La selecció de les partícules víriques que s’han eluït en l’últim Panning.
D’aquestes partícules seleccionades, cal analitzar quin dels clons té l’afinitat desitjada per
l’antigen d’estudi. Tot el procés del Phage Display es realitza en dues o tres setmanes. A
més, aquest procés requereix menys temps i menys personal especialista entrenat. Tampoc
requereix d’estabulari ni de cultius cel·lulars. Aquest mètode s’ha explorat fins entrar al
mercat amb productes recombinants per usos biofarmacèutics. El primer dels quals va
parèixer el 2002.
Adalimumab és un anticòs que neutralitza el factor de necrosi tumoral. Va ser el primer
que va entrar al mercat pel tractament de malalties inflamatòries. A partir de la seva entrada,
el mercat s’ha anat expandint. Avui dia es pot dir que en 20 anys s’han detectat molts pocs
Virologia 2020
CEBIO 97
casos d’immunogenecitat en pacients tractats amb aquests anticossos. Comparat amb qui
ha rebut anticossos animals, on encara hi ha un percentatge d’immunogonecitat no desitjada.
Identificació de nous lligands.
Un altre dels usos interessants d’aquesta tecnologia és la identificació de nous lligands.
Una utilitat seria que aquests nous lligands poguessin interaccionar amb molècules
farmacològiques, com receptors sobre-expressats en cèl·lules tumorals per exemple.
L’aïllament de bacteriòfags amb l’habilitat d’interaccionar específicament amb teixits o
òrgans consta de diversos passos.
Es parteix d’una col·lecció inicial del fag amb una diversitat aproximada de 1012 partícules
víriques diferents. S’introdueixen en un animal i es deixa un temps per tal que els
bacteriòfags vagin arribant als diferents òrgans i s’hi uneixin alhora que s’alliberin que no
ho han fet. Passat aquest temps prudencial, es sacrifica l’animal i se’n recullen teixits i
fluids (sang, cor, fetge, ronyó, melsa i pulmó).
De cadascun dels teixits es separen les diferents subpoblacions de bacteriòfags específics i
es repeteix el procés en altres individus animals. El procés, que rep el nom de biopanning
al ser el mateix que un Panning però en animals, es repeteix entre tres i cinc vegades. El
resultat del biopanning són subpoblacions dels bacteriòfags capaços d’unir-se específicament
als diversos teixits i òrgans. De les subpoblacions es poden aïllar els clons de cada teixit,
seqüenciar-se i obtenir els pèptids específics per a cada tipus de cèl·lula.
Aquest procediment es pot fer servir per generar fàrmacs que es dirigeixin tan sols a un sol
teixit o òrgan enlloc de distribuir-se per tot l’organisme (cosa que passa ara). El fet de poder
formular els fàrmacs amb alguna molècula que el pugui guiar a un tipus cel·lular concret pot
disminuir els efectes secundaris adversos del seu subministrament.
Des que es va començar a desenvolupar la tècnica, s’han anat publicant col·leccions de
pèptids que mostren especificitat per diferents tipus cel·lulars. Aquest sistema té una gran
potencialitat per obtenir pèptids d’interaccions altament específiques per un sol tipus
cel·lular.
Evolució molecular dirigida. En el Phage Display es parteix d’una població amb una diversitat concreta. Aquesta
diversitat la pot donar la natura (el conjunt de possibilitats de recombinació a les cèl·lules B)
o es pot tenir una diversitat fruit de l’atzar (els pèptids petits que s’afegeixen a les proteïnes
III). Així i tot, es pot afegir una amplificació per mutagènesi.
A partir de la distribució inicial, que és la que hem fabricat nosaltres per aleatorietat o la que
hem recollit de la natura, se’n fa un Panning i una selecció per obtenir una subpoblació.
Aquesta, però, és la millor del conjunt inicial. No és la millor de totes les possibles poblacions.
Afegint un pas de mutagènesi posterior a aquesta primera selecció s’aconsegueix crear una
nova subpoblació de bacteriòfags. D’aquesta, molts no es trobaven representats a la
distribució inicial.
Virologia 2020
CEBIO 98
El que s’obté, doncs, és una subpoblació amplificada. Fent servir aquesta subpoblació
amplificada per realitzar un Panning, es poden aïllar unes proteïnes que s’uneixen de
manera molt més específica i afí a un antigen o molècula diana. Això va més enllà de la
diversitat que es troba a la natura i que permet trobar molècules amb característiques que no
s’han trobat fins ara.
Ús del Phage Display en la selecció d’insecticides. Una de les aplicacions del Phage Display és la generació d’unes proteïnes toxines per part
de Bacillus thuringiensis. Aquesta toxina, que cristal·litza, és produïda per Bacillus en
condicions adverses juntament amb unes espores del microorganisme. Aquests cristalls de
proteïna es fan servir com insecticida en gran quantitat de productes del mercat.
Aquest sistema biològic, a la natura, afecta a les erugues. Les erugues mengen fulles, les
quals poden estar contaminades amb espores i cristalls d’aquesta proteïna tòxica de
Bacillus. Un cop l’eruga ingereix la fulla, les restes d’aquesta circulen per l’aparell digestiu fins
arribar a l’intestí mitjà, on hi ha un canvi a pH alcalí. Aquest medi promociona la dissolució
dels cristalls de toxines, formant una protoxina que s’activarà a toxina.
La toxina és capaç d’unir-se a receptors cel·lulars de les cèl·lules de l’intestí, promovent-ne
la lisi i provocant una perforació de la membrana intestinal. Aquesta perforació permet que
les espores de Bacillus germinin, proliferin i envaeixin els teixits adjacents a l’entrada.
A través de Phage Display i l’evolució molecular dirigida s’ha aconseguit modificar aquestes
toxines i obrir una ventall de toxines específiques per insectes concrets que afectin tant a
l’agricultura com als humans.
Aquesta tecnologia permet modificar les toxines depenent de les necessitats sempre i quan
es compleixi el requisit de tenir accessible la diana biològica de la toxina.
Població diversa
PanningSubpoblació
Mutagènesi
Virologia 2020
CEBIO 99
Capítol 12 – Patogènia Viral La patogènia viral és el procés pel qual un virus genera una malaltia. És important
recordar que no tots els virus causen malalties. Això, però, és una informació relativament
nova, doncs fins fa poc es pensava que els virus eren entitats biològiques que només podien
causar malalties. En paraules de Medawar and Medawar:
“No es coneix cap virus que aporti beneficis. S’ha dit, correctament, que
un virus és una mala notícia embolicada en proteïna ”.
A tall d’exemple de com d’equivocat estava, els virus poden arribar a fer una simbiosi amb
el propi hoste. Hi ha vegades, com passa amb els Polydnavirus, que acaben formant part
de l’hoste. Aquesta espècie vírica infecta ous de vespes i els ajuden a sobreviure en les larves
dels altres insectes on es desenvolupen.
Un altre exemple són els Retroviridae, els quals formen part del nostre genoma i evolució. El
gen de la sincitina, que forma part dels retrovirus, és el que ens ha permès desenvolupar una
placenta en el nostre procés evolutiu.
Hi ha virus que disminueixen la possibilitat d’estar infectats per altres virus que podrien
causar malalties més greus. La infecció per Citomegalovirus, per exemple, redueix la
possibilitat d’infectar-se pel virus de la SIDA. Un altre exemple és el virus de l’hepatitis, doncs
la infecció pel virus de l’hepatitis A dificulta la infecció pel virus de l’hepatitis C, molt més greu.
S’ha arribat a donar que els virus ens protegeixin contra malalties no víriques al estar
estimulant la nostra resposta immunològica. Per exemple, la infecció per part d’un virus
oncolític pot prevenir la diabetis tipus 1. Els virus oncolítics són aquells que ataquen les
cèl·lules canceroses.
També hi ha virus que van a matar altres virus. Hi ha molt exemples de bacteris infectats
per un virus que produeixen toxines d’origen virals que les protegeixen d’altres virus. El cas
més extrem és el de virus que poden ajudar a l’hoste a sobreviure en condicions extremes.
S’ha vist que hi ha virus de plantes que n’infecten el rizoma i que les poden ajudar a sobreviure
en freds extrems.
Fets bàsics. Respecte els virus i les malalties, seria important tenir la idea que vivim en equilibri amb els
virus. Si els nostre sistema immunitari fos perfecte, no existiria cap virus que ens infectés. Si
els virus poguessin eliminar el nostre sistema immunitari i infectar-nos d’una manera directa,
ja no existiríem com espècie.
Al llarg de les evolucions vírica i humana, els virus han desenvolupat diferents sistemes
per eludir el nostre sistema immunitari alhora que nosaltres anem desenvolupant
sistemes de defensa per protegir-nos millor d’ells. Així i tot, segueix havent-hi un equilibri:
ni els virus han aconseguit eliminar-nos ni nosaltres hem aconseguit eliminar els virus.
Vivim i prosperem en un núvol de virus, literalment.
Fins i tot pensant en aquells virus que podrien produir una malaltia, els humans vivim en un
núvol de virus literal. Som minoria en aquest planeta i tenim desenes de “trobades” diàries
amb virus que, la majoria de vegades, no ens fan desenvolupar malalties.
Virologia 2020
CEBIO 100
El fet que haver entrat en contacte amb un virus no tingui cap conseqüència significa
que aquest virus no ens ha arribat a infectar. Això pot ser perquè ha arribat a un lloc sense
cap cèl·lula viva, perquè ha estat destruït directament en arribar o perquè ha estat destruït en
infectar una o més cèl·lules.
Així i tot, hi ha virus que ens infecten i són inaparents perquè no generen símptomes.
D’alguns en som conscients d’haver patit la infecció perquè en una analítica ens han
descobert anticossos contra aquell virus, però d’altres no ens n’assabentem mai. Així i tot,
per molt que les infeccions siguin inaparents, no podem oblidar que igualment les podríem
transmetre a altres individus.
Qüestions fonamentals de la patogènia viral. L’estudi de la patogènia viral es fa a partir de 6 preguntes:
El primer que s’esperaria és que els virus fossin capaços d’infectar-nos a través de la
pell, ja que és l’òrgan que tenim més exposat a l’exterior. Així i tot, no és el cas perquè la
nostra epidermis, la capa més externa de la pell, està formada per cèl·lules mortes. En
conseqüència, un virus seria incapaç d’infectar-nos a través de la pell.
A més, a la pell hi ha un pH baix que també protegeix de les infeccions víriques. Per si fos
poc, existeixen els pèptids antimicrobians, alguns dels quals estan produïts per bacteris que
es troben a la nostra pell. Una altra manera d’entrar dels virus pot ser a través de ferides,
per les que entrarien directament a l’organisme o fent servir vectors. En cas que un virus
entrés a través d’un mosquit, aquest virus travessaria la dermis.
Quan no poden entrar a través de la pell, els virus entren per aquelles cèl·lules vives que
estan exposades a l’exterior: les cèl·lules de les mucoses. Aquestes poden ser:
• Les mucoses conjuntives als ulls.
• Les mucoses del tracte respiratori al nas i la boca.
• Les mucoses del tracte digestiu que es troben exposades a l’exterior per la boca o
l’anus.
• Les mucoses del tracte genitourinari a través de la uretra o la vagina.
Vies de transmissió.
Les principals vies de transmissió vírica entre individus se separen en dos patrons:
horitzontal i vertical. La transferència horitzontal és entre individus i la vertical és aquella
que es produeix entre progenitors i progènie fruit d’aquesta relació.
Com arriba el virus a
l’organisme?
Com es distribueix el virus per l’organisme?
Quin tipus d’infecció produeix?
Existeix un tropisme del virus
cap a un tipus concret de teixit?
El virus s’elimina o produeix una
infecció persistent?
Com es transmet el virus a altres
individus?
Vies de transmissió vírica
Transferència Horitzontal Transferència Vertical
Virologia 2020
CEBIO 101
D’entre les principals causes de transmissió horitzontal es troba la que es produeix via aèria
per aerosols que surten per la saliva al parlar, esternudar o respirar; com passa amb el virus
de la grip.
L’altre és la oral fecal, com la que es produeix en molts virus que produeixen diarrees com
els rotavirus. La transmissió oral-fecal no és tan directe com el nom diu.
Es pot considerar una transmissió directa com la que es pot donar entre humans i animals
tal i com passa amb el virus de la ràbia, que es transmet per la mossegada d’un animal
infectat.
Un tipus de transmissió horitzontal és per mitjà d’un vector, com passa amb els bunyavirus,
que es transmeten a traves d’un mosquit.
Una última via de transmissió vírica horitzontal és la sexual.
L’altre bloc és la transmissió vertical, la que es produeix entre mares i fills o pares i fills. Entre
mares i fills és molt probable que la infecció vírica de la dona embarassada es transmeti al
fetus per la placenta. És la via placento-fetal, com amb el virus de la Rubèola. La placenta
no és un bon filtre perquè, malgrat ser una barrera, els virus poden passar perfectament
aquesta barrera mentre que els interferons o els anticossos no la poden traspassar.
Un altre mètode de transmissió vertical és en el moment del part. En el moment del
naixement, la sang de la mare i el nounat estaran en contacte. D’altre forma, les infeccions
vaginals es transmeten al nounat durant el part. Aquesta transmissió durant el part es dona
els virus Herpes i de la SIDA.
També es dona una infecció per transmissió vertical quan es fa una lactància, doncs els virus
poden passar fàcilment a la llet materna i d’allà al bebè. Per aquest motiu es recomana no
donar el pit en els casos del virus de la SIDA o el virus limfotròpic humà.
Per últim, si un virus s’insereix al genoma d’una de les cèl·lules de la línia germinal
aquestes poden transmetre-li la infecció. Part del nostre genoma està compost per retrovirus
que no ens causen malalties.
Vies de transmissió vírica
Transferència Horitzontal
Via aèria
Virus de la Grip
Via oral fecal
Rotavirus
Transmissió directa
Virus de la Ràbia
Via vector
Bunyavirus
Via sexual
VIH
Transferència Vertical
Vies de transmissió vírica
Transferència Horitzontal
Transferència Vertical
Via placento-fetal
Rubèola
Via part
VIH
Lactància
VLH
Inserció genòmica
Retrovirus
Virologia 2020
CEBIO 102
Les infeccions iatrogèniques o nosocomials són les que s’adquireixen en els hospitals,
on hi pot haver persones malaltes amb infeccions, on un hi està en condicions de salut
compromeses que fan més susceptible de rebre una infecció...
Infeccions congènites.
En la transmissió vertical, una mare infectada pot transmetre el virus al seu fill mentre
duri l’embaràs de forma bastant probable perquè hi ha una vulnerabilitat en el fetus. El
fetus s’està desenvolupant ràpidament, té un sistema immunitari immadur i la barrera
placentària no actua bé com a tal.
Els virus poden travessar perfectament la barrera placentària, mentre que els
anticossos produïts per la mare no són capaços de travessar-la. Les úniques
immunoglobulines que travessen la barrera placentària durant un temps de l’embaràs són les
IgG maternes. Les immunoglobulines A, E i M no travessaran la placenta i el fetus no produirà
immunoglobulines fins pràcticament haver nascut.
Transmissió respiratòria.
La transmissió per via aèria o transmissió
respiratòria és un tipus de transferència
lateral. En un esternut s’estima que es
produeixen unes 10,000 gotes de saliva. Per
aquestes gotes de saliva poden transmetre’s
els virus. També es generen gotes de saliva
al parlar o al respirar.
Les gotes més grans cauen a menys d’un
metre de distància i no es poden transmetre
gaire lluny. Una segona categoria de gotes
poden arribar a un metre o dos de distància.
Al parlar es generen partícules
minúscules que s’anomenen aerosols i
que poden viatjar fins a 40 metres i es
queden suspeses a l’aire per minuts, més
de 30 i tot. Aquests aerosols són els que més
faciliten en la transmissió respiratòria.
També hi ha factors ambientals que influeixen en la transmissió respiratòria. Són la
humitat i la temperatura de l’ambient. A 5ºC, com més sec sigui l’ambient més fàcil serà la
transmissió. A 20ºC, l’augment de la humitat fins al 50% provoca una reducció de la
transmissió del virus. Passada aquesta, i prop del 80% d’humitat, la capacitat de transmissió
és més fàcil ja que els aerosols són més estables.
Hi ha molts estudis fets respecte la transmissió aèria. S’han fet estudis sobre la transmissió
de la grip en un avió partint d’un sol infectat i en funció de la distància a la que es trobaven
d’ell. En un avió de 60 passatgers i un sol infectat, on l’espai és tancat i l’aire es
recircula, al cap de 3 dies 57 de les 60 persones estaran infectades.
Malgrat el que hem vist sobre la transmissió a través de l’aire, el principal mecanisme de
transmissió dels virus amb transmissió aèria són objectes com els poms, els telèfons
i els bolígrafs entre d’altres similars. Això és perquè és probable que posem algun d’aquests
objectes prop o dins de la boca, que ens toquem la cara després de tocar-los o que dues
persones obrint una porta abans i després de tocar-se la cara.
Parlar Esternudar
Gotes de saliva
Grans
<1 metre
Mitjanes
1 - 2 metres
Aerosols
40 metres
30 minuts
Respirar
Virologia 2020
CEBIO 103
Estem constantment tocant-nos la cara i és molt difícil no fer-ho. Cada cop que hi ha una
gran pandèmia, es recomana no compartir objectes, netejar bé els objectes amb alcohol
abans de deixar-los, no donar la mà, no donar dos petons, no estar en un lloc tancat i ple de
gent...
Paradoxalment, com més virulent és un virus, menys probabilitats hi ha de transmetre’l.
Això passa perquè l’hoste es sent molt malament i fa que es quedi a casa. Quan el virus és
més lleuger i no fa que la persona que el té es senti malament, aquesta fa vida normal i
interacciona amb molta gent, augmentant la transmissió.
Alguns exemples de virus que es transmeten via respiratòria són el de la grip, el del constipat
comú, el del SARS, el de la verola, el xarampió, la rubèola, la varicel·la...
Transmissió entèrica.
El segon medi de transmissió horitzontal és el mitjà de la transmissió oral fecal. Aquesta
transmissió no és molt directa. Això si, imaginem que no hi hagués lavabos. Les necessitats
s’haurien de fer a l’aire lliure. Les defecacions caurien al terra i algú les podria tocar, o caurien
a l’aigua i es contaminarien els aliments que amb ella es reguin o les persones que en
beguin...
És molt fàcil infectar-se per una via de transmissió oral-fecal si no hi ha higiene
respecte les necessitats fisiològiques o quan es fan servir inodors secs. És molt fàcil
que els virus es transmetin d’aquesta manera. Al haver-hi banys, tan sols ens hem de
preocupar de rentar-nos les mans, però hi ha 2,500 milions de persones al món que no tenen
un lavabo. El seu risc de contagiar-se i d’infectar-se per malalties de transmissió oral-fecal és
molt major.
En els diagrames que expliquen la transmissió oral fecal sol aparèixer la paraula
mosca. Les mosques poden semblar animals molestos i indefensos. Així i tot, a les mosques
els agrada posar-se a les restes fecals i al menjar. La relació és fàcil de fer. Cal intentar
mantenir les mosques fora del menjar perquè un mai sap on s’han posat abans.
Els virus que es transmeten per via oral fecal són el de la
poliomielitis (enterovirus C), el causant de l’hepatitis A, els
virus que produeixen diarrees... Els virus que es
transmeten per la via oral fecal són virus sense envolta,
alguns dels quals tenen doble o triple càpsida. Això els fa
més resistents a la sequera, als rajos UVA, al pH baix, al
calor, als detergents... Poden aguantar dies, fins i tot
setmanes, al medi ambient i conservar la seva capacitat
infectiva. A la imatge, un rotavirus. Imatge extreta de
ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics.
Malalties de Transmissió Sexual.
La transmissió sexual és un altre tipus de transmissió lateral. Són malalties de
transmissió sexual la SIDA, l’hepatitis B, l’herpes genital, els papil·lomes genitals... Es sol
pensar que s’ha de cuidar molt amb qui es tenen relacions sexuals per no patir una malaltia
amb aquest tipus de transmissió. Així i tot, el que s’ha de tenir en compte no són les parelles
sexuals que nosaltres escollim, sinó les parelles sexuals que les nostres parelles sexuals
hagin tingut. Això pot influir molt fàcilment en el nostre risc d’infecció.
Virologia 2020
CEBIO 104
La quantitat de parelles sexuals a les que
hem estat exposat té una tendència
exponencial suposant que les nostres
parelles sexuals han estat amb tantes
persones com nosaltres. L’extrem és en el
cas que nosaltres haguéssim tingut 12
parelles sexuals cadascuna de les quals
hagués estat amb 12 parelles sexuals, doncs
haguéssim estat exposats a 4095 persones
que molt probablement no coneixeríem.
En molts casos, les malalties de transmissió sexual no són clarament visibles i una
persona es pot assabentar que té una malaltia de transmissió sexual al cap de molt de
temps. Es considera que una persona, per tal de saber si ha agafat alguna malaltia de
transmissió sexual, cal tenir en compte les parelles dels últims 10 anys.
Això significa que, realment, un hauria de fer servir protecció en les relacions sexuals i que
quan dues persones vulguin tenir relacions sexuals sense preservatiu, ambdós
participants s’haurien d’haver fet una analítica per descartar malalties de transmissió
sexual.
Parlant del VIH, es sol pensar que és un cas molt
llunyà, que no afecta a la persona. Es sol pensar
que la SIDA només afecta a homosexuals. Mirant
les dades de causa d’infecció als EEUU, la gent pot
pensar que si no és homosexual o no es droga
intravenosament no té gaires probabilitats d’agafar
la SIDA. Així tot, no és el que passa a la resta del
món, on més de 80% dels casos de transmissió
del VIH són per sexe heterosexual. La imatge del
VIH està extreta de PDB-101
(https://pdb101.rcsb.org/).
Altres vies de transmissió.
Hi ha altres vies de transmissió horitzontal.
La ràbia es transmet per mossegades
d’animals, la febre groga es transmet per un
mosquit... La hepatitis C no té molt ben
definida la seva via principal de
transmissió natural. Fins l’any 1992, amb
l’aparició del virus de la SIDA, la principal
causa de transmissió eren les transfusions
de sang de les que no es feien tests. A partir
del VIH es van fer anàlisis per saber si la
sang està infectada.
Es creu que l’hepatitis C es transmet per contacte directe de sang al fer tatuatges amb
material no estèril, el compartir màquines d’afaitar, en odontologia, de mares a fills... S’han
arribat a veure casos de transmissió sexual, tot i que és més estrany. La imatge del virió de
l’hepatitis C està extreta de ViralZone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics.
Virologia 2020
CEBIO 105
Tropisme Víric.
Un cop entren al cos, els virus tenen tendència a anar a alguns òrgans i teixits. Per això
es parla de virus respiratoris quan tendeixen a anar a les vies respiratòries, virus entèrics
quan van al sistema digestiu, virus neurotròpics quan tendeixen a infectar neurones i virus
dermotròpics o dermatotròpics quan tendeixen a anar a la pell. Hi ha diferents virus de cada
tipus de tropisme i, molts cops, els virus no tenen un sol tropisme.
Els virus del xarampió o el de les galteres són respiratoris i neurotròpics. El virus que causa
la poliomielitis és un virus entèric però també és neurotròpic. Aquells virus que tenen el
tropisme cap a òrgans exposats a l’exterior, com els virus respiratoris o entèrics, tenen
vies d’entrada respiratòria i digestiva.
Sol coincidir el tropisme amb el mecanisme d’entrada. Com que ni les neurones ni la pell
es poden infectar directament, els virus entren per diferents vies, viatgen per l’organisme fins
les cèl·lules per les quals tenen el tropisme i les infecten. Els virus dermotròpics i neurotròpics
tenen diferents vies d’entrada, com la intestinal, respiratòria, la sang...
Les neurones tenen la barrera hematoencefàlica i estan bastant blindades. Els virus
poden arribar a les neurones per diferents vies. Es pot arribar a través dels limfòcits. Es poden
infectar limfòcits, que poden travessar la barrera i arribar a les neurones.
Els virus poden viatjar a través del sistema nerviós perifèric. Per fer-ho, els virus han
d’infectar neurones sensorials exposades a l’exterior, anar per les vies nervioses aferents i
arribar al sistema nerviós central. Poden infectar a través de plexe coroideu, ja que el
control de la barrera hematoencefàlica per aquest plexe no és tan estricte i és més
probable que el virus travessin l’estructura.
Virus Tropisme
Xarampió
Pell
Vies Respiratòries
Sistema Nerviós Central Ràbia
Rinovirus Vies Respiratòries Superiors
Virus Sincitals
Coronavirus Sistema Gastrointestinal
Virus de la Grip Vies Respiratòries Baixes
Adenovirus Gola
Ulls
Sistema Gastrointestinal
Virus Epstein Barr Faringe
Citomegalovirus
Ulls
Virus Herpes Pell
Herpes Simple tipus 1 Boca
Virologia 2020
CEBIO 106
Herpes Simple tipus 2 Aparells Sexuals
Paratilitis Glàndules Salivals
Virus Coxaqui Sistema Cardiovascular
Pàncrees
Verola
Pell Rubèola
Papil·loma Aparells Sexuals
Pòlio Sistema Nerviós Perifèric
Rotavirus Sistema Gastrointestinal
VIH Aparells Sexuals
Determinants del tropisme.
La susceptibilitat és la presència de receptors per tal que un virus pugui reconèixer unes
cèl·lules. La permissivitat és que aquelles cèl·lules tinguin la maquinària necessària perquè
el virus s’hi repliqui dins. Aquest dos conceptes són molt importants en el tropisme.
A nivell de tot l’organisme, cal tenir en compte que el tropisme es veu afectat per
l’accessibilitat i la defensa. Si hi ha moltes barreres entre les cèl·lules i el virus, no és gaire
important la susceptibilitat i la permissivitat, ja que el virus no hi podrà arribar. Les nostres
defenses ens protegiran de les infeccions víriques. Malgrat les cèl·lules siguin accessibles,
permissives i susceptibles, el sistema immune de vegades impedeix que el virus hi arribi.
Independentment del tropisme, els virus poden produir infeccions localitzades o
sistèmiques depenent d’on s’escampi la infecció.
Si un epiteli és infectat per un virus, allà es multiplica el virus. Si el virus es quedés en
aquest punt d’infecció, seria una infecció localitzada. Si l’epiteli és respiratori, la infecció
és localitzada a les cèl·lules respiratòries. Si l’epiteli és intestinal, la localització seria a l’intestí.
En aquest punt hi pot haver una transmissió a altres individus per contacte directe, com
l’herpes simple o el papil·loma. Si el virus produeix una infecció sistèmica, viatjarà per
l’organisme.
Primer anirà al sistema limfàtic, el qual té un bon contacte amb els epitelis. Viatjant pel
sistema limfàtic, el virus acabarà als nòduls limfàtics, on pot ser que s’hi multipliqui. Com que
entre el sistema limfàtic i el sistema vascular hi ha un contacte molt íntim, és molt fàcil per
un virus passar a la sang. La fase on el virus es troba en sang rep el nom de virèmia.
En la virèmia primària arriben a la sang molt poques partícules víriques, pel que no hi
pot haver una transmissió per contacte sanguini. A través de la sang arribarà als òrgans
molt vascularitzats i amb un gran flux sanguini, com el múscul, el fetge, la melsa o els vasos
sanguinis. En aquests òrgans, els virus es poden multiplicar. D’allà poden tornar a la sang,
on seria una virèmia secundària.
En la virèmia secundària és factible una transmissió sanguínia entre individus, com
passa amb el VIH, l’hepatitis B o el virus causant de la poliomielitis. Des de la virèmia
secundària, els virus aniran als òrgans pels quals tenen més tropisme. Aquests poden ser la
pell, les mucoses respiratòries o digestives, els ronyons, o les neurones. Des d’aquests
òrgans pels quals tenen tropisme, els virus es poden transmetre a altres individus.
Virologia 2020
CEBIO 107
En el tropisme respiratori, per vies respiratòries. En l’enterotropisme, via oral fecal o contacte
directe. En el cas dels virus amb un tropisme nerviós, no hi pot haver un contagi directe a no
ser que un neurocirurgià estigui operant sense protecció. Les malalties víriques
neurotròpiques es donaven més quan hi havia canibalisme pensant que alimentant-se
del cervell de l’adversari s’adquiririen els seus coneixements.
Independentment del tropisme, hi ha virus que produeixen infeccions localitzades i altres
que produeixen infeccions sistèmiques. El virus del papil·loma fa una infecció localitzada
al quedar-se a l’epiteli o a la dermis. El seu equivalent del virus Herpes pot anar fins a les
cèl·lules limfàtiques o les cèl·lules del sistema nerviós, pel que viatja per l’organisme. Els
Rhinoviridae , causants del constipat comú, fan una infecció localitzada en vies respiratòries.
El virus de la grip viatja a través de tot l’organisme i es multiplica en altres òrgans. Els rotavirus
són els típics virus amb tropisme intestinal que provoquen una infecció local a l’aparell
digestiu. Els virus de la poliomielitis, a més de multiplicar-se a l’intestí, poden entrar als teixits
limfàtics i arribar al teixit nerviós perifèric.
Virus Tipus d’Infecció
Virus del Papil·loma Localitzada a la dermis
Virus Herpes Sistèmica
Rhinoviridae Localitzada a vies respiratòries
Virus de la Grip Sistèmica
Rotavirus Localitzada a l’aparell digestiu
Poliomielitis Sistèmica
Les infeccions, en funcions de l’extensió, poden ser localitzades o sistèmiques. Les
infeccions també es poden classificar en funció del que duren en el temps. Les classes
són aguda i persistent. La càrrega vírica de cada tipus de virus és diferent. Una infecció aguda
pot ser la grip, un constipat comú o una diarrea vírica banal. Les infeccions víriques agudes
duren pocs dies. En les infeccions víriques agudes, es sol seguir el següent procés:
1) Augment de la càrrega vírica.
2) Arribada al punt més àlgid de la càrrega viral.
3) Aparició de símptomes i possibilitat de transmissió.
4) Pas del temps.
5) Eliminació per part de les defenses del cos.
Les infeccions persistents més típiques són com les que produeix el virus de la
poliomeningitis limfocítica. En les infeccions víriques persistents, es sol seguir el següent
procés:
1) Augment de la càrrega vírica i possibilitat de transmissió
2) Incapacitat d’eliminació del virus
3) Gran càrrega vírica i possibilitat de transmissió
4) Mort causada per la simptomatologia.
Hi ha altres tipus d’infeccions persistents.
Un tipus d’infecció persistent és la que fan els virus latents, com la que produeixen els
herpes simples. En aquesta, com l’herpes labial, apareix en algun moment amb un màxim de
càrrega viral i algun símptoma i es pot transmetre durant aquell període de temps. Al cap d’un
temps, desapareixen símptomes i càrrega vírica. El que succeeix és que aquell virus no
marxarà mai. Hi haurà estades amb una alta càrrega viral i cap símptoma, moments amb una
alta càrrega viral i algun símptoma...
Virologia 2020
CEBIO 108
Quan augmenta la càrrega viral ja es pot transmetre la malaltia. El virus de l’herpes no
pot desaparèixer mai perquè es manté latent als ganglis i tornen a aparèixer diferents
vegades. L’últim tipus d’infecció és una variant de les infeccions persistents: són les infeccions
causades per virus lents.
Les infeccions causades per virus lents tenen dos exemples: la panencefalitis esclerosant
subaguda que produeix el virus del xarampió i que és una complicació de la seva infecció o
la infecció pel virus de la SIDA. En aquestes infeccions s’observa que quan es contrau el
virus es tenen uns símptomes persistents que triguen una mica en marxar i durant els
quals es pot transmetre la malaltia. Aquesta infecció pot passar desapercebuda.
A partir d’aquell moment, el sistema immunitari s’encarrega de mantenir la càrrega vírica
molt baixa. Durant tot el període de càrrega viral baixa, que pot durar anys, es continua
podent transmetre el virus. Arriba un moment que el sistema immunitari està tan afectat que
no pot vèncer el virus i es dona la mort. Quan el sistema immunitari no pot més apareixen els
símptomes de càncer, infeccions oportunistes...
D’aquestes característiques, aplicables al VIH en la seva total plenitud i tenint en compte que
la fase inicial es passa com si fos una grip forta, el que no produeix el virus de la
panencefalitis esclerosant subaguda és la transmissió durant el període de latència
amb càrrega vírica baixa.
El virus de la varicel·la es contrau per les vies respiratòries o conjuntives. El virus es multiplica
als ganglis limfàtics cervicals. D’allà farà una virèmia primària. Anirà als òrgans més irrigats:
fetge, músculs i melsa. Farà una virèmia secundària. Anirà a l’òrgan pel qual té tropisme: la
pell. Quan el virus arriba a la pell han passat 14 dies. Durant aquests hi ha hagut una gran
capacitat de transmissió. Per això quan un nen passa la varicel·la al cap de poc la passen
tots els nens de la seva classe.
Quan la varicel·la arriba a la pell, el virus produeix vesícules a la pell que s’assequen i
que piquen. No s’han de rascar si es volen evitar cicatrius. Les crostes acaben caient i els
pares es queden a gust pensant que el nen ja ha passat la varicel·la. El que els pares no
saben és que el virus de la herpes zòster és un virus latent. Mai marxa de l’organisme.
Aquest virus de les terminacions de la pell aprofita les vies aferents sensitives fins on
es troben els cossos neuronals de les neurones sensitives: els ganglis d’arrel dorsal.
Són unes cadenes de ganglis nerviosos en ambdós costats de la columna vertebral. En
situacions d’estrès o quan el sistema immunitari baixa, el virus pot reactivar-se, començar a
produir proteïnes víriques i tornar a anar a la pell.
Hi tornarien a través de les fibres nervioses sensitives. Quan torna a aparèixer l’herpes,
apareixen “culebrilles” en una zona del tronc. És la que està innervada sensitivament per
un determinat gangli d’arrel dorsal. Per això el virus de l’herpes zòster, quan torna a parèixer
és en franges en aquella zona.
Contracció per vies respiratòries o
conjuntives
Multiplicació als ganglis limfàtics cervicals
Virèmia primària cap a fetge, músculs i melsa
Virèmia secundària cap a la pell
Producció de vesícules
Virologia 2020
CEBIO 109
Altres infeccions latents poden ser dels virus herpes simple dels diferents tipus que
n’hi ha. Aquest virus infecta l’epiteli i d’allà pot passar a altres cèl·lules de l’epiteli i infectar
les neurones sensitives que estan innervant l’epiteli. Viatgen de manera retrògrada per les
neurones sensitives fins on es troben els ganglis d’arrel dorsal.
Des del gangli es poden transmetre a altres neurones del gangli. Al sistema nerviós no hi ha
una gran vigilància de les nostres cèl·lules per evitar que els virus s’hi quedi de forma latent.
En alguns casos es podria passar des de l’epiteli fins la sang pel sistema limfàtic, però
no és el més comú.
Quan el virus es reactiva pot tornar per aquesta via aferent a l’epiteli, tornar a sortir i
produir les petites ferides a la mucosa labial o genital. En alguns casos quan hi ha
complicacions, podria anar viatjant per les neurones sensitives fins al sistema nerviós central
provocant una infecció molt greu que pot conduir a la mort. Passa en molts pocs casos.
Els virus herpes poden estar de manera latent sense produir proteïnes víriques i, en un
moment donat, reactivar la infecció que estava latent. No es sap bé el perquè de la
reactivació, però es creu que és perquè el sistema immunitari no es troba en condicions
òptimes o perquè hi ha hagut una radiació ultraviolada. El sistema immunitari no es troba
en condicions òptimes quan té estrès o per la presència d’una altra malaltia.
Els principals tipus de virus latents en humans són els virus herpes. Tant en els tipus 1,
2 i varicel·la la latència és a les neurones dels ganglis d’arrel dorsal. Els virus Epstein Barr,
els citomegalovirus i herpes 6 fan latència als limfòcits. El virus de l’hepatitis C a hepatòcits,
el virus del papil·loma a l’epiteli i el VIH pot fer latència als limfòcits, macròfags i neurones.
No és l’habitual que el VIH es trobi a les neurones.
Factors que modifiquen la patogenicitat. Molts cops, el mateix virus no causa la mateixa severitat en diferents individus, Això
depèn de diferents factors. Alguns són vírics, altres depenen de l’hoste i altres són fruit de la
interacció entre virus i hoste.
Els factors de l’hoste que poden afectar a la severitat de la malaltia són quatre:
L’estat metabòlic és el primer. Les dones embarassades, persones amb malnutrició,
dèficit de vitamina A són més vulnerables i tindran major incidència negativa per part
de les infeccions. La vitamina A és molt important perquè manté el bon funcionament dels
epitelis. Si no hi ha un recanvi cel·lular adequat per manca de vitamina A, els virus ho tindran
més fàcil per entrar. La vitamina A també és important en la maduració de cèl·lules de la
immunitat innata i humoral.
Una altre factor important és l’edat. Els nens molt petits tenen el sistema immunitari poc
desenvolupat i la gent molt gran no el tindran a ple funcionament. Això els fa vulnerables.
La gent immunodreprimida patirà infeccions molt més greus al no tenir una bona
resposta.
Per últim, alguns individus no tenen uns determinats receptors que els virus poden fer
servir per infectar. Això els fa resistents a la malaltia. Passa amb el virus del VIH. Gent no
Estat metabòlic Edat ImmunosupressióReceptors disponibles
Virologia 2020
CEBIO 110
s’ha infectat perquè tenen coreceptors defectuosos i no els ha pogut infectar el virus malgrat
haver-hi entrat en contacte.
També s'ha vist que hi ha variacions al sistema major d’histocompatibilitat que poden
influir en la susceptibilitat a tenir una infecció i la gravetat que aquesta pot tenir. Hi ha
factors de l’ambient que poden influir en la gravetat de a infecció. Són la contaminació, el
fumar, l’estrès...
Hi ha una sèrie de soques més virulentes que altres. Les variacions degudes a mutacions
que es produeixen i que fan que una soca sigui més virulenta que una altre es donen en
canvis en el funcionament de gens que es troben implicats o bé al cicle cel·lular viral, en els
efectes patogènics a nivell cel·lular, en com s’estén el virus en l’organisme o bé en la
modulació de les defenses. Són gens importants en com el virus és capaç d’evadir-se
del sistema immune de l’hoste.
Hi ha cops que la pròpia cèl·lula hoste té elements que poden facilitar al virus la
infecció. Hi ha microRNA que facilita la virulència del virus de l’hepatitis C. Hi ha cops que
els factors cel·lulars afectaran negativament al virus.
El virus de la immunodeficiència en simis no els produeix cap malaltia perquè a les
seves cèl·lules hi ha un factor trim-5-α que dissol la càpsida del virus abans que pugui realitzar
la seva activitat transcriptasa inversa, impedint que iniciï el cicle víric.
Dins de la virulència, el virus té estratègies per evadir la resposta immunològica. Una
opció és fer infeccions latents, doncs un cop es troben dins d’una cèl·lula es molt difícil que
el sistema immunitari les pugui eliminar. Una altre és mutant o canviant per mutagenic shift o
drift, de tal manera que els antígens vírics ja no podran ser reconeguts pel anticossos.
Una altre manera és interferint amb les nostres defenses.
En la resposta antiviral és molt important el paper de les citocines. Les citocines son
produïdes per cèl·lules de les nostres defenses, seran reconegudes per determinats
receptors i dispararan una resposta immunològica.
Els virus produeixen citocines o falsos receptors de citocines: les viroquines i els
viroreceptors. Les viroquines són elements semblants a una citocina i que es poden unir als
seus receptors però sense disparar cap resposta immunològica. Altrament, els virus poden
generar viroreceptors per les citocines per tal que s’hi uneixin i així impedir la unió als
verdaders receptors.
Una altra estratègia és destruir les cèl·lules del sistema immunitari, com fa el VIH. L’última
estratègia és la inhibició del sistema del complement.
Mecanismes de dany cel·lular. De totes formes, la major part dels símptomes d’una infecció són produïts per la
resposta immune. Els virus, a nivell cel·lular, poden:
Molts símptomes de l'estil de febre, dolor generalitzat i dany tissular són efectes produïts pels
limfòcits TCD4, TCD8, anticossos, interferó i la inflamació. Es parla de la immunopatologia:
el mal que causa el nostre sistema immunitari a l’organisme.
Induir la mort cel·lular
ApoptosiCèl·lules sincitals
Inhibir àcids nucleics
Inhibir la síntesi de proteïnes
Virologia 2020
CEBIO 111
Un exemple greu de la immunopatologia es dona amb la queratitis herpètica, on es produeix
una inflamació a la còrnia que pot arribar a induir una ceguera fruit de la inflamació.
Un altre exemple és el de la malaltia hemorràgica del dengue. En la primera interacció amb
el dengue, la malaltia és normal. En una segona interacció es pot produir una hemorràgia
generalitzada fruit de la resposta immunològica per la extravasació de cèl·lules
sanguínies. Pot ser letal.
Virologia de plantes. Molts cops, els virus de plates es transmeten a través de les parts de les plantes que es
fan servir quan es planten. Pot ser per esqueixos, bulbs, tubercles... quan s’infecten els
meristemes d’una flor, el fruit d’una flor podria contenir llavors infectades.
El mecanisme principal de transmissió d’infeccions en plantes sol ser a través de
vectors. Mosquits o cucs que es troben prop de les arrels. Els mosquits poden anar
transmetent el virus d’una planta a una altra. Si els virus es poguessin multiplicar dins dels
mosquit, aquest seria un vector de transmissió per tota la vida.
L’últim mètode de transmissió és l’ésser humà. Com que toquem plantes, arranquem
fruites, trenquem branques o portem pol·len d’una planta, podem estar transmetent el virus
sense voler.
Un cop el virus entra dins la planta, es transporta d’una cèl·lula a la del costat o al
floema. Les cèl·lules de planta tenen unes parets molt rígides amb uns petits canals
anomenats plasmodesmes. A través d’aquests poden passar els virus. Com que els forats
són molt petits, els virus també ho han de ser i han de ser helicoidals. A més, els virus de
plantes solen generar proteïnes que amplien activament el plasmodesma per anar a
una altra cèl·lula o al plasmodesma per anar a una altra part de la planta.
Virologia 2020
CEBIO 112
Capítol 13 – Resposta Immune Antivírica. L’objectiu de les vacunes és poder-nos protegir d’un virus eficaçment al llarg de la
nostra vida. La idea és fer-ho com quan passem una infecció vírica de l’estil del xarampió o
la rubèola. El xarampió i la rubèola només es passen una vegada i això garanteix una resposta
immune que ens protegirà per tota la vida.
La vacuna de la pòlio. La vacuna de la pòlio és de les millor estudiades. La humanitat porta convivint amb la pòlio
des de l’antic Egipte. La pòlio provoca atròfies. La pòlio no va començar a suposar un
problema fins a mitjans del segle XX a les grans ciutats, on la gent viu en grans
concentracions. Passava sobretot a EEUU.
Els primers cultius de cèl·lules animals al laboratori es van desenvolupar per tal de
poder produir vacunes per la pòlio. Es van realitzar 2 tipus de vacunes: inactivades i
atenuades.
A les vacunes inactivades es generen gran quantitats de virus i s’inactiven
químicament tot perdent la capacitat infectiva. Aquestes s’apliquen per injecció.
Simultàniament es van generar vacunes de subministració oral: les vacunes atenuades. En
aquestes, el virus està “viu”. En les vacunes atenuades, virus manté la seva capacitat de
multiplicar-se però no pot produir la malaltia. Aquesta vacuna es pren via oral perquè
s’intenta donar-la per la mateixa via d’infecció i la pòlio és una malaltia intestinal.
L’atròfia d’una de les cames és una complicació de la pòlio que només es dona en molt
poca gent. Es dona en una fracció del 5% de la gent que pateix la malaltia. L’atròfia de la
cama es dona quan el virus gastrointestinal passa a infectar les neurones del sistema nerviós
perifèric. Quan moren les neurones que innerven els músculs de les extremitats inferiors,
aquests s’acaben atrofiant.
Les vacunes formades per virus atenuats s’aconsegueixen de forma empírica. En el
procés d’atenuació s’obliga al virus a fer un salt d’hoste. S’apliquen partícules víriques a
cèl·lules d’una altra espècie. Això no està preparat i molts pocs cops tindrà èxit. Si
aconsegueix infectar, podria ser que el virus acabés desenvolupant mutacions que li permetin
infectar i multiplicar-se en cèl·lules de mico. El virus ja està mutat i no serà igual que l’original.
S’estima que calen entre 5 i 10 mutacions per fer un salt d’hoste complet.
Un cop han passat aquestes mutacions es prova de fer créixer els virus sobre cèl·lules
humanes i es mira si poden provocar efectes citopàtics. Si són prou diferents com per no
provocar la malaltia als humans però no ho són tant del virus original que poden disparar una
resposta immunològica que també el pugui afectar, es disposa d’un virus atenuat.
Vacunes
Atenuades
Virus amb capacitat multiplicativa
Virus sense capacitat
patogènica
Inactivades
Gran quantitat de virus
Incapacitat infectiva
Virologia 2020
CEBIO 113
Per tal de considerar un virus com atenuat, calen dues coses: prou diferències com per no
desenvolupar malaltia però prou semblances per tal de desenvolupar resposta
immunològica. En el cas de la vacuna de la pòlio, és un virus capaç de multiplicar dins
l’organisme però no serà neuronal.
La vacuna inactivada pot rebre les sigles IPV al ser injectada i la vacuna atenuada pot
rebre les sigles OPV al ser oral en el cas de la vacuna de la pòlio. Ambdues vacunes
poden produir anticossos IgG en sang. La resposta produïda per les IgG és una resposta
lenta després del contacte amb el patogen però es manté més temps al cos.
Les IgM, en canvi, tan sols duren una setmana. Les IgM només serveixen en les analítiques
per saber si hem tingut un contacte recent amb el virus. La resposta immune local, la que
produeixen les IgA a l’intestí, tan sols s’aconsegueix amb la vacuna atenuada i no amb la
inactivada.
A més, la duració de la immunitat és major en les vacunes atenuades que en les
inactivades. La resposta immune davant el virus inactivat requereix de diversos recordatoris
per aconseguir una resposta immune eficaç. En el cas de la vacuna atenuada, en tant que el
virus es replica dins de l’hoste, no cal més que una dosi inicial. El virus es replica a l’intestí i
s’acaba obtenint una immunitat efectiva. Amb la vacunació oral el cost és més baix ja que
només cal fer-ho una vegada. En el cas de la vacuna atenuada, no cal personal especialitzat.
Precisament per totes aquestes característiques ràpidament es va passar a la vacuna
atenuada enlloc de la inactivada.
Així i tot, el fet que els virus hagin de mantenir la seva capacitat de multiplicar-se implica
que la vacuna s’ha de mantenir en una cadena de fred. Si en un moment donat no es pot
mantenir la vacuna en una refrigerador, aquella vacuna no serà eficaç.
Amb la vacuna atenuada es pot transmetre la malaltia a altres individus sense voler.
Quan es vacuna un nen, el virus es multiplicarà a l’intestí i el nen estarà alliberant virus a les
defecacions.
De normal, tenint en compte que el virus està atenuat, no hi hauria d’haver problemes amb
ningú. Així i tot, si els que entren en contacte amb els virus són persones immunodeprimides,
embarassades o avis entre d’altres, la susceptibilitat augmenta i poden veure’s afectats pels
virus malgrat sigui atenuat. Precisament per aquest motiu mai s’aplicarà una vacuna
atenuada a una dona embarassada.
Un altre inconvenient és que el virus atenuat podria mutar i revertir les seves mutacions
per tornar a l’estat original. Seria una cosa estranya, doncs caldria revertir entre 5 i 10
mutacions. Clarament, això tan sols pot passar en una freqüència d’un entre un milió de
vacunes. Malgrat tot, ni la FDA ni la EMA permetrien subministrar una vacuna amb aquest
risc. És per això que fa uns anys es va tornar a canviar de la vacuna atenuada a la
inactivada.
Vacunes atenuades
Avantatges
Produeix IgG Produeix IgA Duració llarga
Desavantatges
Requereix una cadena de fred
Pot transmetre la malaltia a tercers
Podria tornar a l’estat original
Virologia 2020
CEBIO 114
A finals dels anys 80, els països que tenien casos de poliomielitis era increïblement gran. Per
això es va iniciar una campanya global de vacunació contra el virus de la pòlio. L’any 2012
no s’havia aconseguit erradicar la malaltia i hi havia 3 països que encara la tenien. Per tal
d’assegurar que els casos restants no eren culpa de la vacuna atenuada, es va fer el
canvi a vacuna inactivada els anys 90.
L’any 2019, tan sols queden dos països on el virus de la pòlio sigui endèmic:
l’Afganistan i el Pakistan. Així i tot, hi ha uns quants països que tenen caos aïllats de
poliomielitis. No hem aconseguit erradicar el virus tal i com si vam poder amb la verola.
El virus de la verola tenia una sèrie de característiques que van permetre la seva
erradicació i el de la pòlio no. El virus de la verola té un sol serotip, mentre que la pòlio en
té tres. D’aquests, existia una vacuna atenuada per tots ells, però la vacuna inactivada no ho
era.
Per altra banda, en el virus de la verola tan sols hi havia transmissió simptomàtica per
contacte directe. El virus de la pòlio, en canvi, es transmet asimptomàticament en el 95% de
la gent i té una transmissió oral-fecal amb una finestra de transmissió de dies. La verola no fa
infeccions persistents, només es contagia quan es tenen símptomes. El virus de la pòlio fa
infeccions persistents. Durant setmanes, l’hoste anirà eliminat el virus.
Hi ha uns quants virus que tenen vacuna. Molts pocs són com la pòlio i no disposen de
vacuna atenuada i inactivada alhora. El xarampió és una de les malalties que té vacunació.
En alguns casos, el xarampió pot ser mortal per complicacions neurològiques. L’aparició de
la vacuna del xarampió va reduir dràsticament la quantitat de morts anuals per aquesta
malaltia. Per això es considera que les vacunes, juntament amb els antibiòtics, han estat
uns descobriments que han canviat de forma dramàtica la qualitat de vida de la
humanitat. No només augmentant-ne la llargada, sinó també el benestar.
Hi ha una sèrie de criteris per considerar que una vacuna és eficaç. Per un costat hi ha
el criteri de seguretat. Aquest va canviat amb els anys. Abans, per tal de protegir a milions de
persones, no era gaire important que una entre un milió tingués la malaltia. Avui en dia, això
es considera inadmissible. Les vacunes han de ser totalment segures i no poden causar
la malaltia. A més, els efectes secundaris han de ser mínims. S’accepta que la vacuna causi
una inflamació en el punt d’administració o una febre molt lleugera. No s’accepta més.
Per altra banda, una vacuna ha de produir una resposta immune protectora a nivells
cel·lular, innat i humoral. Finalment, els governs solen tenir en compte qüestions pràctiques
a l’hora d’admetre una vacuna en el seu programa de vacunació. Aquestes consisteixen en
el cost d’una dosi, si la vacuna és estable biològicament, si es pot guardar i acumular, si és
fàcil d’administrar i l’acceptació pública.
Criteris d’aprovació d’una vacuna
Seguretat
No poden causar la malaltia
Protecció
Resposta cel·lular
Resposta humoral
Resposta innata
Practicitat
Preu / dosi
LogísticaOpinió pública
Virologia 2020
CEBIO 115
Quan apareix una vacuna, sol haver-hi certa controvèrsia. Va passar amb la del
papil·loma. És molt important que el públic general estigui ben informat perquè no estigui
preocupat ni espantat d’aquells nous medicaments que desconeixen.
Molts cops, la complaença pública pot ser perillosa en qualsevol programa de
vacunació. Hi ha qui diu que no es vacunarà, que les malalties víriques són coses del passat,
que algunes malalties no han passat en molt de temps, que mai agafen la grip, que les
vacunes causen autisme, que els nens haurien de tenir la resposta immune natural, que no
es posaran res estrany al cos...
Això posa en risc la seguretat de la resta. En ciència hi ha un concepte anomenat immunitat
del ramat. Això significa que, quan la major part dels individus estan vacunats, faran de
mur per evitar que una determinada malaltia infecciosa es transmeti. Això és perquè la
malaltia no pot passar a través d’ells cap a gent que no es pugui vacunar.
Per tal que es doni la immunitat de ramat cal una quantitat concreta de gent que estigui
vacunada. En el cas del xarampió, és del 75%. En altres casos pot arribar a ser del 90%,
però el mínim del 75% de la població sempre s’ha de donar.
Si seguim amb la metàfora del mur o de la muralla, la gent sense vacunar són les finestres.
Unes poques finestres no passa res, doncs és molt poc probable que l’enemic hi passi a
través. Ara, unes finestres de la mida dels vitralls de la sagrada família són una
protecció una mica fluixa.
A Catalunya, el calendari de vacunació inclou els tres recordatoris per l’hepatitis B, la
pòlio (que ara és inactivada) i la diftèria entre d’altres. La vacuna de la triple vírica inclou
el xarampió, la rubèola i la parotiditis. La vacuna de la varicel·la és bastant nova. També inclou
les vacunes pel virus de papil·loma i el virus de l’hepatitis A. Imatge extreta del web oficial del
departament de Salut de la Generalitat de Catalunya.
Virologia 2020
CEBIO 116
Fins ara hem parlat de les vacunes clàssiques, que tenen un gran inconvenient: impliquen la
manipulació industrial de lisats vírics. Això vol dir que no són biosegures. En conseqüència,
s’intenta aconseguir vacunes més biosegures mitjançant la producció de proteïnes
víriques de forma recombinant.
La primera vacuna recombinant que es va produir va ser per l’hepatitis B. Es produeix
una glicoproteïna de la membrana en llevats. És completament biosegura perquè no pot
produir la malaltia al no haver-hi virus. En els estudis clínics, amb un patró de 3 dosis es
protegeix al 90% dels individus sans. No es produeix una bona resposta en persones
immunodeprimides, gent molt gran, obesitat mòrbida, fumadors empedreïts...
El virus del papil·loma també té desenvolupada una vacuna recombinant. El 2008 es va
donar el premi Nobel a 3 viròlegs (2 homes i 1 dona). A la dona i un dels homes, per descobrir
el VIH. Al tercer, per associar el càncer de coll uterí amb el virus del papil·loma.
El virus del papil·loma és un virus de
simetria icosaèdrica despullat i un
genoma de doble cadena de DNA circular.
Té més de 100 serotips diferents. El 70%
dels càncers de coll uterí estan causats pels
serotips 16 i 18. Imatge extreta de
ViralZone, SIB Swiss Institute of
Bioinformatics.
Per demostrar que aquest virus era el responsable de molts càncers de coll uterí, es va fer
un Southern blot del DNA de cèl·lules de càncer de coll uterí de pacients. La hibridació es va
fer amb el genoma del virus del papil·loma. La conclusió de l’experiment, doncs, és que les
cèl·lules del coll uterí tenen el genoma del virus del papil·loma.
El virus de papil·loma es transmet sexualment. Entra a través de la vagina i arriba a les
cèl·lules del coll uterí. Les cèl·lules del coll uterí formen un epiteli pseudoestratificat on les
cèl·lules basals estan constantment proliferant i són les que produeixen la resta de les
cèl·lules d’aquest epiteli. El virus arriba a aquestes cèl·lules i les infecta fàcilment donat
que estan constantment proliferant. Al cap d’unes setmanes, tot l’epiteli estarà infectat i la
malaltia es pot transmetre a altres individus.
En la majoria dels casos, l’individu s’haurà curat de la malaltia als dos anys. En alguns,
però, el genoma del virus s’insereix dins el genoma de les cèl·lules hoste i inhibirà l’expressió
de gens supressors de tumors com el de la p53 o el dels retinoblastomes. Alguna de les
cèl·lules es convertirà en una cèl·lula tumoral, creixerà descontroladament i, al cap d’entre 10
i 30 anys, generarà un càncer amb bastant mal pronòstic per ser molt invasiu. Passa al 0.8%
de la gent infectada. Així i tot, la incidència estimada de càncer cervical és de centenars
de milers a tot el mon.
Això es deu a que el 80% de la població està infectada pel virus del papil·loma. I n’hi ha
que no ho saben.
La transmissió és sexual i, malgrat els casos més descrits són de càncer de coll uterí, també
s’han vist càncers de vulva, de vagina, de gola, de penis o d’anus. En general, la infecció és
asimptomàtica i subclínica des que es pot transmetre fins que es resol al cap de dos
anys. En alguns casos apareixen berrugues.
La millor manera de prevenir l’alta incidència de càncer cervical és la vacunació a
nenes abans que tinguin relacions sexuals. La vacuna consisteix en tres dosis.
Virologia 2020
CEBIO 117
La vacuna és recombinant i es produeix la proteïna L1 de la càpsida del virus. Hi ha dos
tipus de vacunes: la tetravalent, que es produeix en llevat contra els serotips 6, 11, 16 i 18; i
la vacuna bivalent, que es produeix en baculovirus contra els serotips 16 i 18. Al ser una
vacuna recombinant, la proteïna no pot produir la malaltia.
Quan es produeix la proteïna L1 del virus del papil·loma, aquesta proteïna té tendència
a autoensamblar-se formant Virus-Like Particles. Són partícules semblants a virus però
que estan buides. De fet, moltes de les vacunes recombinants tendeixen a autoensamblar-
se.
Hi ha vacunes recombinants per diferents malalties. Es troben al mercat les de les hepatitis A
i E i la del papil·loma. També hi ha vacunes en assajos clínics com el de la grip o el norwok.
En general, els sistemes d’expressió que es fan servir per produir vacunes
recombinants són els llevats, les cèl·lules d’insecte o Escherichia coli.
Un altre tipus de vacunes que s’intenta desenvolupar són vacunes basades en pèptids. Un
epítop antigènic té una longitud d’entre 5 i 20 aminoàcids. Produint pèptids de 20
aminoàcids ja es podria desenvolupar una resposta immunològica. S’estan
desenvolupant vacunes basades en pèptids per l’encefalitis japonesa. Encara no es troben al
mercat. Aquesta aproximació requereix de les zones més immunològiques després
d’analitzar-les. Això podria portar a que la vacuna no tingui èxit. Escollint unes bones zones
podria ser eficaç.
Altres vacunes que s’estan desenvolupant són les de DNA. No cal produir una vacuna
recombinant si el propi individu pot produir la proteïna. Tan sols cal incloure un vector
d’expressió d’una proteïna vírica amb un promotor que s’expressi en l’espècie a vacunar. El
vector d’expressió tendirà a ser lisat si és de DNA. Així i tot, la seva injecció al múscul dona
la oportunitat que una part del vector s’introdueixi a les cèl·lules i que, malgrat produir
una petita part de la proteïna original, aquesta part expressada desencadeni la resposta
cel·lular i humoral.
Hi ha vàries vacunes de DNA comercialitzades pel seu ús en animals. Entre d’altres, es
troba la vacuna contra l’encefalitis japonesa. La vacuna pel West Nile Virus es va retirar fa
uns anys.
Pel seu ús en humans, s’estan desenvolupant moltes vacunes de DNA per combatre
infeccions víriques, càncers i altres malalties. Cap està aprovada per ser comercialitzada
però es troben en assajos clínics.
Vacunes de DNA. Fer servir vacunes de DNA té una sèrie d’avantatges. Entre aquests, en destaquen:
• La facilitat de disseny per enginyeria genètica.
• La facilitat de producció.
• La seguretat.
• L’estabilitat.
• El disparar la resposta immune.
Per començar, la seva producció és un procés més ràpid i econòmic que produir una proteïna
recombinant. En aquesta producció, a més, no es produeixen virus totals. Es realitza la
síntesi d’una cadena de DNA que fa que les cèl·lules del cos tan sols copiïn patrons
d’expressió d’una proteïna vírica, el que no pot derivar en una malaltia.
Virologia 2020
CEBIO 118
Les proteïnes són làbils i s’acaben degradant si es mantenen a temperatura ambient. En
canvi, el DNA no necessita d’una cadena de fred i pot aguantar mesos a temperatura
ambient, el que el fa més fàcil de transportar i guardar. S’ha vist que el DNA dispara una
resposta immune.
Encara no existeixen vacunes de DNA aplicables a humans per preocupacions que generen
aquestes vacunes en els organismes reguladors que les han d’aprovar. Hi ha 4 preocupacions
principals:
• La integració al genoma del pacient.
• L’autoimmunitat.
• La resistència a antibiòtics.
• La baixa intensitat de resposta.
Una de les preocupacions d’aquests organismes reguladors com la FDA, per exemple, és que
els vectors de DNA es puguin integrar al genoma del pacient i produir malalties al mutar algun
gen important. La preocupació no és banal, i per això cal demostrar molt bé que els vectors
d’expressió no son capaços d’integrar-se al genoma.
La segona qüestió que preocupa és un dubte sobre l’autoimmunitat. Es té por que, injectant
un DNA estrany, es dispari una resposta immunitària contra el genoma del pacient.
La tercera preocupació és la resistència a antibiòtics. Per fer els vectors d’expressió a gran
escala, cal fer servir un antibiòtic. Els antibiòtics que es fan servir són antibiòtics molt poc
emprats en humans.
La quarta gran preocupació és la baixa intensitat de la resposta immunitària fruit de les
vacunes de DNA. Per mirar d’incrementar la resposta immunitària desitjada fruit de les
vacunes de DNA, s’afegeixen coadjuvants.
Una altra possibilitat de transport d’aquests DNA vírics és fer servir bacteris com a vehicles.
Fent-ho d’aquesta manera, es protegiria el vector d’expressió. Així i tot, caldria fer servir
bacteris modificats genèticament per eliminar la seva patogenicitat però que alhora
siguin capaços de transportar i introduir el vector d’expressió viral a les cèl·lules.
Aquest mecanisme podria ser suficient per disparar una resposta immunològica cel·lular.
També es podrien fer servir altres tipus de vehicles enlloc de bacteris. Alguns es fan servir
actualment en teràpia gènica.
Resposta immunitària a virus. La resposta immune davant d’una infecció vírica pot ser de dos tipus: innata o
adaptativa. La resposta no adaptativa és immediata i no necessita del reconeixement d’un
antigen viral. També tenim la resposta adaptativa, que es dona després en el temps. Implica
un reconeixement antigènic i està mediada per la producció d’anticossos així com per
l’activació dels limfòcits T.
Resposta immunitària davant d’una infecció vírica
Resposta innata
ImmediataNo necessita
reconeixement d’antigen
Resposta adaptativa
TardanaNecessita reconeixement
d’antigen
Virologia 2020
CEBIO 119
En condicions normals, quan augmenta la càrrega viral d’un virus, es produeix una
resposta immediata no adaptativa. Molts cops, aquesta resposta no adaptativa és suficient
per eliminar el virus i no passa res més.
Si la resposta no adaptativa no és eficaç i la càrrega vírica supera un determinar llindar,
es dispara la resposta adaptativa. Aquesta resposta, malgrat disparar-se més lent, és eficaç
en l’eliminació del virus. També és la que generarà memòria immunològica si es produeix una
reinfecció pel mateix virus.
Resposta immunitària innata a virus.
La resposta immunitària innata funciona de manera contínua en l’hoste sense haver
estat prèviament exposat al virus. S’activa en qüestió de minuts o hores després de la
infecció. Està mediada per citocines, cèl·lules sentinella i pel sistema del complement. El
sistema immunitari innat pot informar als elements que participen en la resposta immunitària
adaptativa un cop la càrrega vírica supera un llindar que pot ser perillós per l’hoste.
Les cèl·lules sentinella són, fonamentalment, les cèl·lules dendrítiques, els macròfags
i les cèl·lules natural killer. Aquestes cèl·lules es troben patrullant en tots els teixits.
Fonamentalment, els que es troben més exposats a l’exterior: cavitats i sota les mucoses.
Són com aspiradors que detecten qualsevol signe de canvi i l’agafen.
Per un costat, les cèl·lules sentinella posseeixen una sèrie de receptors que detecten
agents estranys i respostes de les nostres cèl·lules a aquells agents estranys. Són els
Toll-like receptors. En concret dins la resposta a virus, detecten RNA de cadena senzilla i de
cadena doble.
Les cèl·lules dendrítiques tenen receptors Toll-like, receptors de citocines... Poden detectar
no només la presència de virus, sinó que també poden detectar la presència de citocines
inflamatòries, la presència de cèl·lules mortes o de cèl·lules que s’estan morint. Qualsevol
d’aquests estímuls activarà les cèl·lules dendrítiques.
Quan s’activen, les cèl·lules dendrítiques produeixen interferó, el qual té una activitat
antiviral al lloc d’infecció. Les cèl·lules dendrítiques, quan s’activen, es converteixen en
cèl·lules amb múltiples prolongacions. Al activar-se quan la càrrega vírica superi un
determinar llindar, les cèl·lules dendrítiques aniran als ganglis limfàtics a activar les
cèl·lules T naive per connectar el sistema immune no adaptatiu amb l’adaptatiu.
També formen part del sistema immune no adaptatiu o innat, el sistema del complement. El
complement té 4 funcions fonamentals.
• Induir la citòlisi de les cèl·lules infectades.
o O bé perquè detecta anticossos units a la seva superfície.
o O bé perquè detecta alguna proteïna estranya.
• Activació de la inflamació mediada per citocines.
• Funció d’opsonització.
o Cobreix les partícules víriques.
o Facilita la fagocitosi per macròfags.
• Solubilització complexes immunes.
o Es formen tanta quantitat de complexes Antigen-anticòs que poden precipitar
i fer mal als òrgans.
o Complement solubilitza complexes i evita danys irreversibles.
Virologia 2020
CEBIO 120
Com a part de la resposta innata, el complement dispara la inflamació. La inflamació és
una resposta primerenca en la infecció. És una resposta local que està mediada per citocines
com el TNF-α i que cursa amb envermelliment, dolor, calor i augment de mida de la zona
inflamada.
Les conseqüències de la inflamació són fruit d’un augment de la vasodilatació dels
vasos a nivell local i un augment de la permeabilitat capil·lar. Aquests dos elements
permeten que hi hagi cèl·lules fagocítiques que surtin dels vasos sanguinis cap a la zona
d’inflamació. Això també pot produir un dany tissular.
Hi ha citocines proinflamatòries que es produeixen localment a l’inici de la infecció com
una defensa antiviral. Si es produeixen en grans quantitats, poden entrar en la circulació i
poden tenir efectes locals a nivell del sistema nerviós central. D’entre aquests efectes hi
trobem un adormiment, letargia, dolor muscular, falta de gana, nàusees... També existeixen
citocines antiinflamatòries per tal que el procés torni a la normalitat.
Es sap que la inflamació és un procés que normalment estimula una resposta immune
molt potent. Per això, aquells virus que produeixen major inflamació al produir un dany
tissular que dispara una inflamació que dispara la resposta immune, tendeixen a produir
proteïnes que modulen d’alguna manera la resposta immune de l’hoste. Són els virus
citopàtics com els Adenoviridae, els Herpesviridae i els Poxviridae. Els virus no citopàtics
no produeixen inflamació, pel que la resposta immune a ells no és tan forta i són
capaços de produir infeccions persistents.
La resposta immunològica no adaptativa o innata consisteix en l’activació de les
cèl·lules sentinella per part d’un antigen. Les cèl·lules dendrítiques són la connexió amb
la resposta adaptativa perquè viatgen als ganglis limfàtics per activar les cèl·lules T naive i
produir una resposta immune adaptativa que pot ser cel·lular o humoral. S’activen les cèl·lules
NK i hi ha una vasodilatació perifèrica, una extravasació de macròfags i neutròfils i altres.
Per altra banda, s’activarà el complement. El complement és important en disparar la
producció de citocines, que produiran una inflamació.
L’interferó és una citocina que es produeix com una part de la resposta innata. El
produeix una cèl·lula quan està infectada. Depenent del tipus de cèl·lules es produeix un
interferó diferent. Es produeix en resposta a una infecció viral. El principal estímul per la
producció d’interferó és la presència de RNA de doble cadena. És típic en infeccions
víriques perquè fins i tot en els virus de DNA amb gens solapant-se es poden formar dobles
cadenes de RNA durant la transcripció. També dispara la producció d’interferó la
presència de RNA sense seqüència CAP ni IRES.
L’interferó, quan és secretat, té una funció i efecte a les cèl·lules del voltant encara que
siguin d’un altre tipus. Actua com a factor de transcripció, augmentant i inhibint l’expressió
de determinats gens. L’actuació de l’interferó és sobre dotzenes de proteïnes diferents.
Per un costat, l’interferó activa ribonucleases que eliminaran el RNA del citoplasma de
la cèl·lula i, per altra banda, l’interferó activa proteïnes quinases que inhibeixen l’inici
de la síntesi proteica. No distingeixen si és viral o de la pròpia cèl·lula. Per tant, l’interferó
és realment tòxic. Així i tot, la seva funció és la inducció d’un estat transitori de no suport a la
replicació vírica encara que hagi de sacrificar també l’homeòstasi de les cèl·lules.
L’interferó no només té efecte sobre aquestes proteïnes. S’ha vist que regula els nivells d’òxid
nítric sintasa i que, molts cops, indueix l’autofàgia i la síntesi de teferina.
Virologia 2020
CEBIO 121
La teferina té l’efecte d’impedir que el virus acabi de desenganxar-se de la cèl·lula
infectada. Quan el virus vol sortir, es troba ancorat a la cèl·lula per la teferina i al final acaba
tornant a ser endocitat per la cèl·lula, el que probablement l’elimina.
L’interferó també produeix efectes en l’organisme. Molts símptomes de malestar i dolor
muscular són produïts pel propi interferó i no només pel virus.
Una cèl·lula infectada per un virus produeix interferó, el qual pot actuar a les cèl·lules veïnes.
Si l’interferó arriba prou d’hora a la cèl·lula veïna, pot passar que aquesta es prepari i
produeixi proteïnes antivirals que impedeixin al virus replicar-se quan hi arribi. Fruit
d’aquesta eficiència en l’activitat antiviral, s’ha produït interferó de manera recombinant per
combatre infeccions víriques.
En concret, l’interferó α 2 recombinant produït en E. coli ha estat útil en el tractament de
les berrugues genitals produïdes pel virus del papil·loma i, en combinació amb la ribabirina,
ha estat capaç d’eliminar el virus de l’hepatitis C. És dels poquíssims exemples on un
tractament antiviral ha estat capaç d’eliminar el virus. No ha estat tan eficaç amb el virus de
l’hepatitis B. Ha servit per mantenir-lo sota control, però no per eliminar-lo de l’organisme.
Resposta immunitària adaptativa a virus.
La resposta immune adaptativa davant el virus pot ser humoral o cel·lular. En l’humoral,
quan les cèl·lules B presenten un BCR que reconeix un determinat antigen viral, s’activen i
comencen a produir anticossos constitutivament. Aquests anticossos s’alliberen al corrent
sanguini per eliminar el virus.
Per altra banda, tenim també la resposta adaptativa cel·lular, de la que n’hi ha dues vies. Es
poden activar diferents tipus de limfòcits T helper, els quals alliberaran citocines molt
importants en la resposta cel·lular i en la humoral. Per altra banda, també s’activarien els
limfòcits T citotòxics, que s’encarregaran d’eliminar les cèl·lules infectades.
La resposta adaptativa cel·lular mediada pels limfòcits T citotòxics és essencial en les
infeccions víriques. És la que realment elimina la major part de les infeccions víriques.
Aquesta resposta de limfòcits T citotòxics està induïda per les citocines que produeixen els
limfòcits T helper tipus 1.
Els limfòcits T citotòxics reconeixen una cèl·lula infectada per un virus perquè mostra
uns antígens estranys. S’uneix a aquella cèl·lula infectada formant una sinapsi
immunològica i s’encarrega d’eliminar-la per dues vies diferents. Per un costat, indueix
l’apoptosi i, per altra banda, li transfereix uns grànuls que contenen enzims com la perforina
o les granzines, que produeixen forats en aquesta cèl·lula infectada i l’eliminen.
El fet que predomini la resposta adaptativa humoral o cel·lular depèn de la diferenciació
dels limfòcits T helper. Depèn de si predominarà una diferenciació cap a limfòcits T helper
tipus 1, que produeixen citocines que activaran principalment la resposta cel·lular, o si es
diferenciaran a limfòcits T helper tipus 2, que produeixen citocines que afavoreixen
especialment la resposta humoral.
Els limfòcits T helper de tipus 1 són molt eficients en eliminar infeccions víriques a
través de l’activació dels limfòcits T citotòxics que formen part de la resposta cel·lular.
Mentre que els limfòcits T helper tipus 2 secreten citocines que activen les cèl·lules B,
el que afavoreix la producció d’anticossos. Aquesta resposta humoral és especialment
eficaç per eliminar bacteris o cucs, però no és prou per eliminar la major part de les infeccions
víriques.
Virologia 2020
CEBIO 122
El predomini d'una resposta o una altra depèn del que es digui als limfòcits T helper
per part de les cèl·lules sentinella.
El fet que predomini un tipus de resposta sobre un altre és una decisió que es pren als
ganglis limfàtics perifèrics. Quan la infecció o càrrega vírica arriba a una llindar determinat
i les cèl·lules sentinella, sobretot les dendrítiques, s’activen i van als ganglis limfàtics a activar
els limfòcits, hi aniran amb una sèrie de citocines que produeixen o una sèrie d’antígens que
presentaran als limfòcits.
Les citocines i els antígens que presentin les cèl·lules sentinella als ganglis limfàtics
és el que determinarà que el tipus de limfòcit T helper que es diferenciarà. Segons si els
limfòcits T helper es diferencien en limfòcits T helper tipus 1 o tipus 2 segons el tipus d’infecció
farà predominar més una resposta immune cel·lular o humoral. Aquest és el moment en que
es pren una decisió, amb la informació que porten les cèl·lules sentinella als ganglis limfàtics.
Resposta immunitària de bacteris enfront virus.
Els bacteris també tenen una resposta immune amb memòria. Al genoma dels bacteris hi
ha una sèrie de seqüències repetitives separades per seqüències amb fragments del
genoma viral. Els bacteris aconsegueixen aquestes seqüències fruit de diverses infeccions.
Cada cop que l’infecta un determinat virus, una part del genoma d’aquest s’incorpora al
genoma del bacteri. Per altra banda, aquests fragments separats per seqüències repetitives
es troben prop de seqüències codificants per enzims que tallen el DNA. Són els enzims CAS.
Aquests gens o fragments de gens virals es transcriuen, es tallen pel propi sistema d’enzims
CAS i s’obtenen els crRNA. Els crRNA poden funcionar com sondes de reconeixement
del genoma viral. Formen un complex amb els enzims CAS. Si un determinat virus torna a
infectar al bacteri, aquest tindrà la seqüència de reconeixement associat a la proteïna CAS
per tal que, un cop reconegut, es talli el genoma viral i s’eviti la infecció del virus.
Aquest sistema tan primitiu i eficaç és el que fet servir les doctores Dadna i Carpentier per
crear un sistema bastant revolucionari en teràpia gènica: el sistema CRISPR-CAS. Serveix
per editar el genoma i corregir els defectes. És un sistema que cal corregir i millorar i que
encara no està al mercat. És molt prometedor. Cal polir que aquest sistema d’edició no és
tant específic. Si hi hagués un petit canvi, seria capaç d’induir el tall igualment.
Virologia 2020
CEBIO 123
Capítol 14 – Aplicacions dels Virus. Els virus poden ser una font d’inspiració en nanomedicina. Sobretot en dos camps:
teràpia gènica i teràpia dirigida. Es poden fer servir vectors vírics o virus artificials.
Les partícules víriques es poden considerar com nous nanomaterials. Per escala i
dimensions, ja entren dins de la definició però, a més, poden tenir diferents estructures,
simetries, mides... Com a nanomaterials en nanomedicina, els virus poden tenir diferents
aplicacions.
Els virus poden ser vacunes, com hem comentat en el capítol anterior. Però els virus també
poden ser elements de teràpia gènica o vehicles per teràpia dirigida d’un fàrmac, com
comentarem en aquest tema. Poden servir per diagnòstic al transportar material fluorescent
que permeti visualitzar diferents zones. Poden fer-se servir en enginyeria de teixits com a
elements que decorin superfícies que ajudin en la proliferació cel·lular.
S’estan fent servir virus per la seva activitat oncolítica, com virus Herpes modificats
genèticament que només poden infectar cèl·lules que proliferen i que han demostrat tenir una
gran capacitat oncolítica. Els virus que es fan servir així no només destrueixen les cèl·lules
tumorals, sinó que també augmenten la resposta immune contra aquests tumors. També
s’estan fent servir bacteriòfags com alternativa a antibiòtics ara que comença a haver-
hi el problema amb aquests.
Les partícules víriques poden tenir una gran plasticitat. Les proteïnes de la càpsida
s’associen formant-la. Així i tot, es pot treure el genoma del virus i introduir-ne un altre per fer
teràpia gènica o, fins i tot, es pot introduir un fàrmac que es vulgui transportar.
Les proteïnes de la càpsida es poden modificar per enginyeria genètica introduint
segments de proteïnes o proteïnes que tinguin una funció concreta. Aquests nous
segments o proteïnes poden ser terapèutiques, poden millorar la unió d’un determinat fàrmac
o d’una seqüència d’àcids nucleics...
També es poden modificar les proteïnes de la càpsida tot unint-hi components
químicament. D’entre aquests components es troben lligands per tal que la partícula vírica
s’uneixi a un determinat receptor o elements químics que li permetin passar desapercebuda
respecte el sistema immunitari entre d’altres opcions.
Les partícules víriques són molt més plàstiques del que ens imaginem. De la mateixa manera
que podem treure elements patògens es poden incloure elements que poden ajudar en
l’activitat terapèutica.
Teràpia Gènica. La teràpia gènica consisteix en la introducció d’un gen per tal de produir una proteïna
terapèutica o d’inhibir l’expressió d’un gen que pot ser nociu o causant d’una malaltia.
Qualsevol malaltia pot ser tractada per teràpia gènica. El problema és que requereix saber-
ne les bases moleculars per tal d’identificar quines proteïnes han d’augmentar o disminuir en
la seva expressió per tal de millorar la malaltia. La teràpia gènica es pot fer servir en càncers
i en malalties cardiovasculars, infeccioses, genètiques, neurològiques...
El tipus d’àcid nucleic que es fa servir en teràpia gènica depèn del que es vol
aconseguir. Si es vol augmentar l’expressió d’un gen terapèutic, es faran servir plasmidis
que serveixin com vectors d’expressió d’aquell gen. Si es vol inhibir l’expressió d’un gen que
pot ser nociu en una malaltia, es faran servir seqüències anti-sense que reconeguin el RNA
missatger corresponent al gen i que impedeixin que es tradueixi.
Virologia 2020
CEBIO 124
Tenim seqüències antisentit en diversos formats, com oligodeoxinucleòtids, siRNA, microRNA
o PNAs. Un PNA és un Àcid Nucleic Peptídic. Un PNA consisteix en un híbrid on les bases
dels àcids nucleics s’insereixen en una columna d’enllaços peptídics. Al ser un híbrid,
són menys susceptibles de ser degradats per les nucleases o les peptidases.
També, un sistema molt nou i molt potent que s’està provant en assajos clínics és el
sistema CRISPR-CAS. El sistema CRISPR fa la detecció d’una determinada seqüència que
volem modificar, mentre que el sistema CAS acoblat talla la seqüència del genoma en aquell
punt. Un cop tallat el DNA, el propi sistema de reparació de la cèl·lula l’arreglarà amb
els nucleòtids adequats.
Inhibicions de gens.
Quan es vol inhibir un gen, sempre es pensa en els oligonucleòtids antisentit que
reconeixen una seqüència d’un RNA missatger. Aquests oligonucleòtids actuen al
citoplasma sobre el RNA missatger del gen que volem inhibir. Els nucleòtids antisentit
reconeixen la seqüència de RNA missatger, s’hi uneixen, s’hi hibriden i impedeixen de forma
estèrica la traducció. L’impediment estèric consisteix en bloquejar que el ribosoma pugui anar
llegint el RNA missatger.
Un siRNA és un mecanisme més complet, ja que no només inhibeixen la traducció. A més,
els siRNA formen un complex que degrada el RNA missatger. A part dels
oligodeoxinucleòtis que hibriden al RNA missatger, també es pot inhibir l’expressió d’un gen
a altres nivells.
Un gen es pot inhibir al nucli al introduir-hi un oligodeoxinucleòtid que hibridi
específicament amb el gen que es vol inhibir. Pot ser en la regió promotora d’aquest o bé
en alguna zona expressable del gen. La inhibició d’un gen al nucli fruit d’oligodeoxinucleòtid
es fa per la tècnica TFODN (triplet forming oligodeoxinuclotides). Impedeixen la transcripció
del gen.
També es pot fer una inhibició post traduccional del gen. La inhibició post traduccional
d’un gen demana que, un cop s’acaba de sintetitzar la cadena polipeptídica, s’hi uneixi
un pèptid que la reconegui de forma específica. Aquesta unió ha de provocar un
impediment del plegament correcte i de la funcionalitat de la proteïna.
La inhibició post-traduccional d’un gen es fa amb una tècnica consistent en l’expressió
d’un segon gen que produeix el que s’anomena intracòs. Un intracòs és una cadena
polipeptídica que reconeix la proteïna acabada de formar, s’hi uneix i la inhibeix.
Una altre opció de la inhibició post-traduccional és a través d’haptàmers. Els heptàmers
són oligonucleòtids que reconeixen una seqüència proteica específica i que, al unir-s’hi,
impedeixen que aquella proteïna acabada de sintetitzar es plegui correctament i sigui
completament funcional.
Inhibició genètica
Nucli
TFODN
Citoplasma
RNA antisense
siRNA
Post-traducció
Intracòs Haptàmer
Virologia 2020
CEBIO 125
Tipus de teràpies gèniques.
La teràpia gènica es pot aplicar ex vivo o in vivo. Una aplicació ex vivo és aquella que es
fa fora de l’organisme. Una aplicació in vivo és aquella que es fa directament a l’individu per
mitjà d’una injecció intravenosa o local o una inhalació.
Aplicar la teràpia gènica ex vivo és la solució ideal perquè no cal introduir res a
l’organisme. Es poden treure les cèl·lules que es volen tractar de l’organisme i, al laboratori,
se’ls pot fer la teràpia gènica. Això significa:
• Tractar les cèl·lules
• Introduir els àcids nucleics que interessa
• Transfectar les cèl·lules
• Tornar-les a introduir en l’organisme.
Com que són les pròpies cèl·lules de l’organisme, aquest no les rebutjarà. La teràpia ex
vivo només es pot aplicar a malalties de la sang com leucèmia, limfoma...
En canvi, quan s’aplica la teràpia gènica in vivo, la situació és molt més complicada i
complexa. S’ha d’imaginar com una carrera d’obstacles. Si s’injecta intravenosament, és
possible que es degradi per la major part per les nucleases del torrent circulatori. Altrament,
pot ser eliminat pels ronyons a través de la orina, pot ser fagocitat pels macròfags del sistema
reticuloendotelial o pot ser filtrat pel fetge.
Superats tots els obstacles que volen menjar-se la teràpia, cal que aquesta travessi
l’endoteli vascular, arribi a la cèl·lula diana que es vol tractar i en travessi la membrana
plasmàtica.
Els àcids nucleics són macromolècules que no travessaran de forma espontània la
membrana citoplasmàtica de la cèl·lula diana. Entrant per endocitosi, els àcids nucleics es
degradaran per la transformació de la vesícula en un lisosoma. Això es pot evitar si
s’aconsegueix que aquests àcids nucleics s’escapin de la vesícula abans no es doni la
transformació.
Si la funció dels àcids nucleics és inhibir l’expressió d’un gen al citoplasma, escapant
de la vesícula ja hauria de poder dur a terme la seva funció. Així i tot, si són vectors
d’expressió, cal que el DNA entri al nucli. Com que els porus nuclears són molt petits, han
d’entrar de forma activa. Per tant, cal superar moltes barreres i menys del 0,01% del material
genètic que entri a l’organisme podrà realitzar la seva funció i ser eficaç.
Teràpia gènica mitjançant virus. En canvi, hi ha uns ens que són capaços de fer tota aquesta carrera d’obstacles de
forma exitosa. Són uns elements capaços de:
• Entrar en un individu
• Escapar del sistema immunitari
• Travessar l’endoteli
• Entrar a les cèl·lules per un receptor
• Escapar dels endosomes
• Entrar al nucli si cal per tal de realitzar la seva replicació
Aquests elements són els virus. Els virus són els principals vehicles que s’estan fent
servir per dur a terme la teràpia gènica in vivo.
Virologia 2020
CEBIO 126
Les principals famílies de virus que es fan servir en teràpia gènica són:
Però existeix una “marca blanca” dels virus: els bioplex. Els bioplex són complexos d’àcid
nucleics amb vehicles no vírics. De vegades, però, aquests vehicles estan inspirats en
virus. Serien les VLP. Les principals característiques importants en l’eficàcia gènica són:
La mida màxima del material genètic transportable és un handicap per alguns virus,
com els de la família Retroviridae i els virus Adeno-associats. Aquestes dues famílies víriques
tan sols poden transportar material genètic relativament petit, d’unes poques quilobases. En
canvi, els Adenovirus i els virus Herpes poden transportar gens grans. Quan s’aplica DNA
despullat, no hi ha límit. Tampoc n’hi ha per les VLP.
Un cell target és un anglicisme per definir el concepte d’especificitat per un tipus cel·lular.
Tots els virus presenten cell targeting, doncs requereixen d’un reconeixement de
receptor. Cal tenir en compte, però, que alguns receptors vírics són bastant ubics i es troben
en molts tipus cel·lulars. Aquesta norma no es compleix tant amb els Adenovirus. En el cas
dels DNA despullat, no hi ha especificitat cel·lular i en les VPL es pot donar.
La capacitat d’integració permanent al genoma és un factor que presenten tant els
Retrovirus com alguns virus Adeno-associats. Integrar-se presenta l’avantatge que la
informació codificada s’expressarà amb major duració, el que interessa molt en la teràpia
gènica. Integrar-se, però, també presenta el risc que, en introduir-se al genoma de la
cèl·lula hoste, es provoquin mutacions. El perill augmenta molt més al tenir en
consideració que aquestes mutacions poden ser molt perjudicials al provocar tumors,
alteracions de funcionament...
Per altra banda, els virus que no s’integren tenen una duració d’expressió més reduïda
però tenen menys efectes secundaris. Com que ni el DNA despullat ni els bioplex es poden
integrar al genoma, tenen una expressió transitòria. Així i tot, no presenten els riscos que
comporta poder-se integrar al genoma.
Aquells virus que normalment infecten als individus poden produir una resposta
immunitària que pot ser més o menys gran. Això passa amb els Adenoviridae i els virus
Herpes. No passa amb els DNA despullats i els Bioplex.
La resposta immune pot fer que la teràpia no sigui eficaç a més de poder provocar
inflamacions greus i reaccions que poden induir a la mort. Això no passa en virus que no
solen infectar, com els virus Adeno-associats o els Retrovirus. Tampoc passa, per motius
obvis, en el DNA despullat i en les VLP.
Retroviridaelentivirus
AdenoviridaeVirus Adeno-
associatsHerpes
Simplex Virus
Mida màxima del material genètic
transportable
Existència d’un cell target
Capacitat d’integració
Tipus de resposta immunitària
Velocitat de producció
Virologia 2020
CEBIO 127
Finalment, la producció de virus és lenta, passa per vàries fases i necessita un alt control de
qualitat perquè pot tenir problemes de bioseguretat. Dit d’una altra forma, produir virus pot
ser lent i perillós. Això no passa amb el DNA despullat i les VPL, que són fàcils de produir i
no requereixen un control de qualitat tan intensiu com la producció virus.
Quan un gen terapèutic s’integra al genoma, la seva expressió dura en el temps. Això
és perquè, encara que la cèl·lula es divideixi, la integració en el genoma fa que el gen es
conservi i que les cèl·lules filles segueixin expressant aquell gen.
Per la banda contrària, quan el gen terapèutic es manté de manera episomal i no s’integra al
genoma, la divisió de la cèl·lula provocarà que el gen es vagi perdent en tant que només una
de les cèl·lules filla tindrà el gen. A mesura que les cèl·lules es vagin dividint, es perdrà el
gen. Per això, els gens que no s’integren tenen una expressió transitòria en el temps.
Famílies víriques per a teràpia gènica.
Hi ha altres dues famílies víriques que es fan servir en teràpia gènica. Una és la família
Togaviridae, amb els α virus. L’altra és la família Poxviridae amb el vaccinia virus. En el cas
dels Togaviridae, es poden transportar gens petits que no superin les 7.5 quilobases. En els
Poxviridae, es poden transportar gens més grans amb un límit màxim de 25kb.
En general, els virus que es fan servir per teràpia gènica poden actuar tant en cèl·lules
que es divideixen com les que no. Això s’aconsegueix en tant que no s’integren al genoma
(excepte pels virus Adeno-associats o els Retroviridae o els virus Herpes). La família vírica
dels Retroviridae, no només integra el genoma, necessita que les cèl·lules s’estiguin dividint
per fer-ho.
Per preparar un Retrovirus perquè funcioni com un vehicle en teràpia gènica, es produeixen
les diferents parts del virus en vectors d’expressió diferents. Un conté la zona gag-pol,
un altre la zona env i un altre conté el gen terapèutic. Traient les zones LTR i les zones
reguladores víriques s’eviten recombinacions dels vectors que podrien produir virus complets
que no volem.
Assajos clínics de teràpies gèniques. Els assajos clínics corresponents a la teràpia gènica aprovats des del seu començament va
anar augmentant fins l’any 2000, nivell que s’ha mantingut surant més de quinze anys sense
incrementar-se. Des de l’any 2000 ja no se n’aprovaven. A partir de l’any 2016 hi va haver un
repunt en tant que aquell any es van començar a aprovar productes per a la teràpia gènica.
Els assajos clínics per a teràpia gènica són, fonamentalment, per càncers i per
malalties immunogèniques.
Els principal vehicles que es fan servir per teràpia gènica són virals: Adenovirus, Retrovirus
lentivirus i virus Adeno-associats. També es fa servir DNA despullat malgrat no ser gaire
eficaç. La injecció de DNA despullat al múscul pot ser útil sempre i quan no es
requereixi d’una expressió molt alta, com amb les vacunes de DNA. Es troben molts pocs
vehicles no vírics en estudis clínics. El 90% dels virus es troben en fase 1 o fase 2. Això indica
que costa molt avançar a últimes fases d’assajos clínics que puguin portar un producte al
mercat.
L’any 2000 va passar una cosa que va fer disminuir la quantitat d’assajos per teràpies
gèniques. Aquell any es van tractar 10 nens amb un síndrome d’immunodeficiència
combinada severa associada a un defecte genètic. Són els que es coneixen com a nens
bombolla. No tenen defenses i han de viure aïllats perquè la infecció més lleu els podria
causar la mort. Tenen una esperança de vida bastant baixa.
Virologia 2020
CEBIO 128
L’any 2000 es va començar un assaig clínic amb un Retrovirus modificat que aportava
el gen que ells tenien mutat. Dels 10 nens, 7 es van recuperar sense cap efecte secundari
al cap de 6 anys. Així i tot, 3 nens van desenvolupar leucèmia al cap d’entre 2 i 5 anys com a
conseqüència de la integració del retrovirus al genoma. Els nens amb leucèmia es van tractar
amb quimioteràpia. 2 es van recuperar i 1 va morir.
El fet que un 10% dels pacients tractats morin a conseqüència del tractament és una
cosa inadmissible des d’un punt de vista regulatori. Fruit d’aquest error, es va ser molt
més restrictiu a l’hora d’acceptar nous productes per teràpia gènica. La teràpia gènica fent
servir virus és una eina molt poderosa, però té uns possibles efectes secundaris molt severs.
La Xina és un país que funciona a part en quant a productes en el mercat per teràpia
gènica. Porten aprovant productes des de l’any 2003, però ho han estat fent una mica
d’esquenes a la comunitat científica internacional. Els resultats d’aquests assajos s’han
publicat en revistes xineses i no s’han repetit o no s’han pogut confirmar per altres laboratoris.
Per tant, són productes que no s’han aprovat ni a Europa ni als EEUU.
Els productes de teràpia gènica aprovats a Europa i als EEUU que es poden trobar al
mercat són escassos. Així i tot, ja s’ha aconseguit molt perquè s’ha trigat dècades a aprovar
un sol producte. El primer que es va aprovar, Glybera, ara es troba fora del mercat. La via
d’administració sol ser ex vivo o local, doncs és més segur. Es fan servir virus Adeno-
associats i virus Herpes. Són tractaments molt poc assequibles. El més “econòmic” costa
800,000$ i el més car costa 2,000,000$. Per aquest motiu, la sanitat pública no pot incloure
teràpies gèniques en la seva llista de tractament coberts.
Vehicles de teràpies gèniques. En general, hi ha 2 tipus de teràpia gènica. Un tipus de teràpia gènica fa servir vectors
vírics, amb el gran avantatge de l’eficiència i l’important desavantatge dels efectes secundaris
(com la resposta immune, la inflamació o les alteracions genòmiques). L’altre tipus de
teràpia gènica fa servir vectors no vírics. Més segura però amb els desavantatges que
l’expressió gènica o l’efecte del gen que transporten serà transitori i de baixa expressió.
En general, la gent que treballa en vehicles vírics busca disminuir els efectes
secundaris i fer-los més segurs i la no vírica busca fer vehicles més eficaços.
Vehicles no vírics.
Els vehicles no vírics es poden classificar en funció de la seva composició. Poden estar
formats per:
Que els lípids o polímers siguin catiònics pot ser beneficiós en el cas de la teràpia
gènica, doncs els àcids nucleics tenen càrrega negativa. Fer un vehicle de càrrega
positiva permet establir interaccions electroestàtiques entre aquest i els àcids nucleics, el que
permetrà condensar, compactar i unir-los millor.
Els vehicles no vírics de lípids catiònics tendeixen a unir i compactar àcids nucleics
per transportar-los. El seu desavantatge és que no realitza una teràpia dirigida. Per això
se’ls sol decorar amb pèptids o elements de reconeixement d’un receptor específic.
Els vehicles no vírics proteics poden ser les VLP. Consisteixen en proteïnes de la càpsida
vírica amb la capacitat de transportar el gen o fàrmac que es vulgui. Podrien disparar una
resposta immunitària, però és un element interessant quan volem produir vacunes.
Lípids PolímersLípids i
polímersProteïnes
recombinantsPèptids
Virologia 2020
CEBIO 129
Els vehicles no vírics poden ser de natura proteica i estar formats per diferents
proteïnes si es vol que cadascuna tingui una funció concreta. Aquestes funcions poden
ser d’entre altres, de:
• Reconeixement d’un receptor
• Unió a àcids nucleics
• Escapament endosomal
• Entrada al nucli
Les proteïnes afegides a les VLP s’uneixen a l’àcid nucleic i el transporten on sigui necessari.
Vehicles vírics.
Els virus són eficaços en teràpia gènica per una sèrie de característiques que els
vehicles no vírics intenten imitar. Per un costat, els virus són capaços d’unir, condensar i
estabilitzar els àcids nucleics que transporten, els quals són el seu propi genoma. Per altra
banda, poden reconèixer un receptor, unir-se a ell i internalitzar. La unió a un receptor no
suposa de per si una internalització, són dues propietats no necessàriament unides.
Els virus són capaços d’escapar dels endosomes abans de ser degradats pels
lisosomes. A més, un cop es troben al citoplasma, els virus i les nanopartícules no víriques
són molt petits i poden arribar al nucli cel·lular per unió a les dineïnes dels microtúbuls.
Aquestes els transporten cap al nucli d’una forma ràpida que evita la seva degradació per part
de les nucleases de la cèl·lula.
Si són virus DNA o vehicles que necessiten entrar al nucli per expressar un gen, l’entrada al
nucli és un pas extremadament essencial. Aleshores, els virus entren al nucli de forma
natural enganyant a la cèl·lula, la qual té mecanismes per introduir proteïnes dins del nucli
com els factors de transcripció.
Aquest mecanisme és la unió a les importines, les quals permeten passar els porus nuclears
de forma activa. Les importines de la cèl·lula permeten una entrada activa. Els virus imiten
els llocs de reconeixement de les importines, les quals els introdueixen dins del nucli
com si fossin factors de transcripció. En els vehicles no virals, es poden copiar els dominis
virals per entrar al nucli.
Vehicles proteics.
Es poden fer vehicles de teràpia gènica proteica molt senzills. Es necessita que tinguin dos
dominis: una cua de lisines carregada positivament i un domini RGD copiat del virus
de la febre aftosa. La cua de lisines serveix per unir els àcids nucleics que es volen
transportar. El domini RGD és necessari per tal que el vehicle pugui reconèixer les integrines
d’alguns tipus cel·lulars.
L’estratègia per generar vehicles proteics en teràpia gènica o teràpia dirigida comença
per la cerca dels dominis funcionals que es necessita. O bé es copien de la natura a partir
de virus, altres microorganismes o pèptids naturals que es modifiquen o bé es treuen de
llibreries combinatòries per buscar lligands específics del receptor.
Un cop feta la cerca dels dominis, es seleccionen pèptids funcionals específics pel que
es necessita. Les funcions que es pot necessitar que tinguin són:
Reconeixement de receptors
Transport d’àcids nucleics
Escapada de l’endosoma
Moviment dins del citoplasma
Arribada al nucli
Virologia 2020
CEBIO 130
A partir d’aquests elements es generen uns vectors d’expressió de forma racional o
per assaig error.
La forma racional de generar els vectors d’expressió es coneix com estratègia
insercional. L’estratègia insercional consisteix en fer servir una proteïna coneguda de la que
se’n sap:
• L’estructura cristal·logràfica
• Els llocs que es poden mutar sense que perdi la funció
• Els llocs exposats al solvent
Els llocs que compleixin els dos últims punts serien bones posicions per introduir els
dominis funcionals. Això sí, caldria fer servir el coneixement sobre l’estructura
cristal·logràfica per assegurar que no hi ha impediments estèrics.
La forma per assaig error es coneix com estratègia fusional. L’estratègia fusional consisteix
en generar vehicles proteics només incloent els dominis funcionals un darrere l’altre.
Cal fer estudis bioinformàtics in sílico per comprovar que els dominis no es destorben els uns
als altres. De qualsevol de les dues maneres es pot produir la proteïna que servirà de vehicle
en un sistema d’expressió adequat en funció de les necessitats.
Un cop produïda la proteïna a la que es poden afegir dominis per autoassemblatge i
que es formin nanopartícules, s’hi unirà un àcid nucleic o fàrmac que es vulgui
transportar. És el que s’anomenen virus artificials. Cal caracteritzar-los físicament, doncs
tindran una mida i una càrrega que seran fonamentals en el seu comportament in vivo. La
seva biodistribució un cop injectada depèn d’això.
També cal fer estudis in vitro on es miri, entre d’altres paràmetres, si:
• Es pot expressar un gen
• Es pot transportar correctament el fàrmac
• És tòxic
• La partícula suposa un avantatge respecte la subministració de contingut sense
aquesta
Si els resultats dels estudis in vitro són positius, es passa als estudis in vivo. En els
estudis in vivo es determina la toxicitat, la biodistribució, l’estabilitat i la immunogenecitat dins
l’animal.
Si els resultats in vivo són prometedors i indiquen una millora respecte la subministració del
fàrmac sol, es podria passar a fer assajos clínics per demostrar que en humans també és
eficaç.
Propietats dels vehicles de teràpia gènica. Els vehicles de teràpia gènica necessiten una sèrie de propietats en funció de les
diferents fases que cal superar. Per tant, necessiten unes característiques que els ajudin
en la biodistribució, en el reconeixement d’un receptor, en la capacitat de fer un escapament
endosomal...
Hi ha dues característiques molt importants per poder controlar la biodistribució d’una
nanopartícula: la càrrega i la mida. Les partícules més grans de 200nm tendiran a
acumular-se als capil·lars pulmonars. Les partícules més petites de 8nm seran eliminades
pels ronyons. És important tenir nanopartícules més grans de 10nm i més petites de
200nm. Curiosament, és el rang de mida dels virus.
Virologia 2020
CEBIO 131
La càrrega de la partícula és l’altre factor important. Les nanopartícules amb càrrega
positiva tendeixen a acumular-se en pulmons o el fetge. Si es necessita que vagin al cervell
o al sistema nerviós central és important incloure algun domini lipofílic.
Una tercera característica que influeix en la biodistribució, tot i que no amb la mateixa
rellevància que les altres dues, és la forma. S’han fet molts estudis fent servir nanopartícules
de la mateixa mida però amb diferent forma i s’ha comprovat que hi ha formes amb
tendència a acumular-se més a uns òrgans que a altres. S’ha vist que les nanopartícules
amb forma toroide (moneda) tendeixen a acumular-se al cor mentre que les nanopartícules
allargades, semblants a la simetria helicoidal dels virus, tendeixen a acumular-se en tumors.
Un cop s’ha fet una correcta biodistribució, toca arribar a la cèl·lula diana que es vol tractar i
que es faci un reconeixement específic mediat per receptor. Els virus tenen vàries
estratègies pel reconeixement, internalització i evasió endosomal a les cèl·lules.
En el cas dels virus amb envolta, les glicoproteïnes d’aquesta poden reconèixer un receptor
que, a més, indueixi la fusió de les membranes del virus i de la cèl·lula. Això permetria
l’entrada de la càpsida directament al citoplasma.
Els virus amb membrana també poden fer una altra cosa, doncs poden entrar per endocitosi
a la cèl·lula hoste un cop reconegut el receptor. Dins de les vesícules endocítiques, les
glicoproteïnes permeten la fusió de l’envolta viral amb la membrana de la vesícula. Acaba
sortint la nucleocàpsida al citoplasma.
Els virus despullats sempre tenen un reconeixent del receptor, una internalització endocítica
i proteïnes de la càpsida que permeten obrir forats a les vesícules endocítiques per poder
sortir directament al citoplasma.
Resumint, l’entrada pot ser directa per alguns virus amb envolta, o bé via endocítica
però amb mecanismes d’escapament endosomal.
Els receptors i els lligands que es poden fer servir per aconseguir una entrada específica són
variats. Alguns dels receptors i els lligands que fan servir per entrar a les cèl·lules tenen
el desavantatge que no solen ser específics d’un sol tipus cel·lular. És una excepció el
receptor d’asiaglicoproteïna, el qual és específic d’hepatòcits. La resta són receptors que
tenen la major part de les cèl·lules però que pot ser que es sobreexpressin en alguns tipus
cel·lulars.
Passa amb els receptors de folat, de transferrina o d’epidermal growth factor, que es
sobreexpressen en cèl·lules tumorals. Majoritàriament són molt ubics. Hi ha molta feina a fer
i és molt important el desenvolupament de noves dianes a través de la tècnica de phage
display, que pot ajudar a trobar dianes específiques de cèl·lules amb una determinada
malaltia.
Mecanismes d’internalització de la partícula.
Un cop la nanopartícula o el virus artificial s’ha unit al receptor, s’internalitza. Resumint molt,
hi ha 3 vies endocítiques principals. La via de les clatrines, la via de les clavèoles i
l’endocitosi. Cadascuna d’aquestes vies és principal en un tipus cel·lular diferent. Cal
tenir en compte les cèl·lules diana i la via endocítica que en aquesta predomina. Així sabrem
quines rutes d’escapament endosomal hem de fer servir. Un fet important és que la mida aquí
també importa Les clavèoles tenen una mida màxima de 100nm per poder-se fer servir.
La via de les clatrines és la més universal perquè és la que sol mediar la endocitosi per unió
amb un receptor. No accepta partícules de més de 200nm.
Virologia 2020
CEBIO 132
La macropinocitosi es dona en alguns tipus cel·lulars, accepta fins 500nm i és bastant
estrany que succeeixi.
La via de les clavèoles es dona, sobretot, en l’endoteli vascular. És bastant específica de
l’endoteli, però sempre és essencial per anar a una cèl·lula diana, travessar l’endoteli.
La mida també és important en l’endocitosi, com també és important tenir en compte
el tipus de via endocítica que predomina a la nostra cèl·lula diana. D’això dependrà la
via d’escapament endosomal que posem.
La via de les clatrines és la més comuna ja que és la que es dona en l’endocitosi mediada
per receptor. En el trànsit intracel·lular de quan es dona aquesta via, les vesícules es
transformen en lisosomes amb el pas del temps. Es degradaria el contingut per part dels
enzims lisososmals. Caldria una via d’escapament endosomal abans que això succeís.
Aquest escapament hauria de ser dependent de pH. D’aquesta amanera, la transformació
en lisosoma dispara l’escapament, com passa en alguns virus.
En l’entrada per la via de les clavícules tenim claveosomes. En aquest tipus d’entrada no
és tan necessari un escapament, doncs moltes de les vesícules fan transcitosi i acaben
sortint per la membrana basolateral de la cèl·lula de l’endoteli vascular. La caveòles són
típiques de l’endoteli vascular. Els claveosomes es poden fusionar amb les membranes del
reticle endoplasmàtic o amb els lisosomes o endosomes tardans i degradar-se. Per tant, una
part de les partícules sí que hauria de tenir escapament endosomal.
Quan s’entra per macropinocitosi, una part dels macropinosomes poden tornar a sortir a
la superfície, com passa en una part dels endosomes primerencs de la via de les clatrines.
Els macropinosomes tendeixen a retenir al seu interior el contingut, però en solen deixar sortir
una part. Alguns macropinosomes es fusionen amb els endosomes tardans. També caldria
un escapament endosomal però que no depengués de pH ja que els macropinosomes no
s’acidifiquen si no són els que s’uneixen als endosomes.
Veient el destí del trànsit intracel·lular que segueixen les diferents vies endocítiques es pot
afirmar que cal un escapament endosomal, el qual pot o no ser dependent de pH segons
la via que es fa servir. En el cas que es necessiti introduir un vector d’expressió dins del
nucli per expressar-lo, caldria un senyal de localització nuclear (NLs). En cas que sigui per
transportar un RNA, ja no seria necessària.
Tres dels principals mecanismes d’escapament endosomal que es fan servir en els
vectors no vírics estan copiats de mecanismes virals.
Un mètode és la formació de porus a la vesícula endocítica. És dependent de pH. El fa
servir el virus de la grip a través de la proteïna hemaglutinina. Són proteïnes que, quan el pH
s’acidifica, es converteixen en molècules amfipàtiques es que es col·loquen travessant
membranes. Això pot acabar formant porus que permetin buidar el contingut de l’endosoma
a l’exterior.
El segon mètode és el que fan servir els virus amb envolta o en fàrmacs administrats en
liposomes. És un mecanisme anomenat de “flip-flop”. Mitjançant aquest, la membrana del
virus es fusiona amb la de la vesícula endocítica. S’acaba alliberant el contingut al citoplasma.
El tercer mecanisme s’anomena d’esponja de protons. El fan servir els polímers de vehicles
no virals. La polietilinimina, que és catiònic, o pèptids rics en histidines com els que tenen
alguns virus i que es copien en vehicles no proteics. Quan l’endosoma es va acidificant, entren
protons en gran quantitat.
Virologia 2020
CEBIO 133
Queden atrapats pel polímer o les histidines. Queden amb càrregues molt positives que
provoquen l’entrada d’ions clorur per compensar. Això provoca que augmenti molt la
osmolaritat endocítica. Per equilibrar l’osmolaritat, l’aigua comença a entrar en les vesícules,
les quals es van inflant fins que exploten i alliberen el seu contingut al citoplasma.
Determinades proteïnes de virus tenen diferents mecanismes per escapar dels
endosomes.
Totes les característiques o funcions extres que es poden incloure en un vehicle de teràpia
gènica o dirigida es poden incorporar afegint un pèptid que pot ser molt curt, de vegades.
Aquestes característiques o funcions són la capacitat d’unir àcids nucleics, d’unir-se a un
receptor, fer un escapament endosomal o arribar al nucli. N’hi ha que són de 5 aminoàcids i
que igualment tenen una funció concreta.
Per tal que un vehicle pugui dipositar de forma eficient el fàrmac o l’àcid nucleic dins la cèl·lula,
caldrà afegir un lligand al vehicle per tal que pugui reconèixer la cèl·lula diana. També
és important incloure un escapament endosomal perquè, sinó, una gran part quedarà
atrapada i degradada dins d’aquests. En cas que sigui un vector d’expressió, caldria
incloure un senyal de localització intracel·lular. Això és molt important per dirigir el trànsit
intracel·lular com nosaltres vulguem.
També cal tenir en compte altres coses. Per exemple:
• La mida de la partícula
• El tipus de contingut que es transporta
• El tipus cel·lular que es tractarà
La mida de la partícula condiciona la via endocítica. No és el mateix transportar un àcid nucleic
que un fàrmac. Això pot fer que una via d’internalització hagi de ser d’una forma o d’una altra.
El tipus d’unió de la nanopartícula proteica respecte el contingut que transporta també pot ser
molt important en la via d’internalització. Segons el tipus cel·lular predominarà una via
endocítica sobre un altre. En el cas que siguin vehicles proteics, la concentració del pèptid
pot determinar el tipus de via endocítica.
Cal tenir en compte moltes coses. Potser, l’important no és generar un bon vehicle per
teràpia dirigida i després trobar-ne utilitats. L’important és pensar en les cèl·lules que es
volen tractar i veure la via endocítica que hi predomina, el receptor que es sobreexpresa de
forma principal, el promotor que fan servir les cèl·lules... En base a aquestes característiques
es fa un vehicle fet a mida pel tractament. Aquesta és la manera racional de fer un vehicle
per a una teràpia dirigida. Fet al revés, probablement no funcioni pel que un vol.
El vehicle ideal per una teràpia gènica és una utopia. Seria una nanopartícula que
transporta un àcid nucleic terapèutic i que es troba rodejada per un polímer o una proteïna
que el protegeix mentre circula pel torrent sanguini. Presentaria o estaria decorada amb uns
receptors. Aquesta construcció aniria pel torrent sanguini fins reconèixer, a través del seu
receptor, la cèl·lula diana. Entraria per endocitosi. Al lisosoma es degradaria part de la coberta
protectora i li quedarien unes estructures per escapar de l’endosoma.
Al final quedaria una miniestructura formada per àcids nucleics units a
nucleoproteïnes. Una li serveix per ser transportada ràpidament cap al nucli. L’altre és una
senyal de localització intracel·lular per entrar-hi. Això seria el vehicle ideal, que té uns quants
elements per diferents funcionalitats. No existeix cap vehicle així.
Virologia 2020
CEBIO 134
Tots els vehicles dissenyats tenen 2 o 3 elements com a mínim. Reconeixement del
receptor, unió d’àcids nucleics, escapament endosomal o senyalització nuclear. Són pocs
elements i no estan gaire sofisticats. Però està bé saber on es voldria arribar per tenir uns
vehicles molt eficaços.
Hi ha uns elements que s’inclouen en vehicles per teràpia amb una certa freqüència. Són els
pèptids de penetració cel·lular. Són pèptids amb la capacitat de travessar membranes i
que permetrien entrar en qualsevol cèl·lula. Tenen el desavantatge que són inespecífics.
No tenen especificitat. Poden entrar, a través de les membranes, en qualsevol tipus cel·lular.
El primer en ser descobert va ser la proteïna tat del VIH. És un factor de transcripció però es
va veure que tenia aquesta capacitat de travessar membranes.
És un pèptid molt ric en arginines. També s’han descobert altres pèptids de penetració
cel·lular copiats o modificats de la natura. Tots es caracteritzen per ser pèptids altament
catiònics. Hi ha persones que han fet dissenys de pèptids de penetració cel·lular per conferir-
los la capacitat de penetració cel·lular.
S’han creat el que anomenen pèptids de penetració cel·lular intel·ligents. Els pèptids
originals són actius i travessen les membranes perquè són catiònics. El que fan per dissenyar-
los és afegir-hi un domini de càrrega negativa que neutralitza el pèptid i el fan no funcional.
L’afegeixen a través d’un linker que es pot degradar en condicions concretes.
Per exemple, suposem que el vehicle amb el pèptid neutralitzat, en condicions més àcides,
perd el linker d’unió del domini negatiu. Això el fa perdre el domini negatiu també. Això allibera
el pèptid de penetració cel·lular i el deixa actiu. Aquest pèptid entrarà a les cèl·lules. Serà
actiu, doncs, en les condicions que es vulgui.
En els tumors, per exemple, el voltant és més àcid fruit del propi metabolisme cel·lular.
El pèptid de penetració cel·lular és inactiu. Arriba al tumor, el linker es degrada, s’activa el
pèptid de penetració i entrarà de forma inespecífica però a les cèl·lules que es vulgui.
Suposem que el linker que uneix el pèptid de penetració cel·lular i que l’inactiva és sensible
a les metal·loproteases Aquestes són enzims que abunden al voltant dels tumors en tant que
les cèl·lules tumorals les fan servir per envair les cèl·lules adjacents. Pot ser que el
pèptid de penetració cel·lular es trobi inactiu però que, en arribar al tumor, les
metal·loproteases degradaran el linker, el pèptid s’activarà i si hi té unit un fàrmac anti-tumoral
entrarà dins les cèl·lules tumorals i els portarà el fàrmac de forma específica.
Un dels talons d’aqueles quan toca fer una teràpia dirigida és trobar vehicles que
travessin la barrera hematoencefàlica de forma eficaç quan es vol actuar sobre el
sistema nerviós central. D’entre els pèptids que s’han fet servir per creuar la barrera hi ha
el TAT, un pèptid derivat d’una glicoproteïna del virus de la ràbia, anticossos contra el receptor
de la insulina o de la transferrina, el domini de la Apo E...
Non sempre funcionen els pèptids mencionats. Depèn de a què s’uneixin i què és el que
transporten.
Una via que s’està explorant bastant és la via nasal (esnifar els fàrmacs a través de la
mucosa nasal). Les cèl·lules epitelials sensitives de la mucosa nasal tenen un contacte
bastant directe amb el sistema nerviós central a través de la làmina rinosa. Aquesta seria una
bona via per aconseguir entrar en el sistema nerviós central.