manual de practicas de virologia

Manual de Prácticas de Virología Enero 2009

1 Dr. Andrew Ch. Snydelaar H.

I. Propósito del Sistema de Prácticas.

Las prácticas son las actividades de formación del conocimiento que permiten al alumno

desarrollar habilidades psicomotrices y expresar actitudes que vinculan al objeto de estudio

con el ejercicio profesional del Médico Veterinario Zootecnista.



I.I Introducción

La virología reviste una particular importancia tanto por el gran número de enfermedades

virales que afectan a la ganadería produciendo mermas severas en la producción pecuaria

como por la relevancia de éstas en la salud pública.

Difícilmente se pueden establecer diagnósticos virales precisos sin una confirmación

mediante estudios de laboratorio debido a la gran diversidad y similitud de los signos clínicos

que estas producen y a los factores climático-ambientales, infecciones secundarias,

virulencia del biotipo y del estado general del animal.

Por su pequeño tamaño, los virus solo pueden observarse mediante el microscopio

electrónico o de barrido lo que implica una gran inversión para este fin. Por ello las técnicas

diagnósticas en el laboratorio más usuales incluyen procedimientos serológicos para la

detección de anticuerpos específicos al agente viral del que se sospecha o bien para la

detección del agente viral mediante anticuerpos específicos previamente obtenidos,

identificados o titulados. El aislamiento del virus es un recurso diagnóstico de mayor

confiabilidad y certidumbre, sin embargo, por su alto costo y tiempo requerido solo es

utilizado en casos que así específicos.

Las técnicas serológicas requieren de la evaluación de sueros sanguíneos pareados, uno

obtenido al inicio de la enfermedad y el segundo, obtenido cuando se encuentra ya avanzada

la enfermedad. Los aislamientos virales y la propagación del virus en cultivos celulares y la

posterior reproducción de la enfermedad en especies susceptibles es el procedimiento más

confiable para el diagnóstico de una enfermedad viral.

Este manual proporciona las herramientas necesarias a futuros médicos veterinarios para

que conozcan algunos de los procedimientos más utilizados en el diagnóstico viral y puedan

interpretar los resultados de los análisis.



I. II Competencias Profesionales.

Las prácticas de Virología que realizarás durante el semestre te permitirán desarrollar las

habilidades y destrezas necesarias para las materias clínicas subsecuentes contribuyendo a

que obtengas las competencias necesarias para tu ejercicio profesional al concluir la carrera

de Médico Veterinario Zootecnista.

Estas prácticas corresponden al contenido temático de la asignatura de Virología cuya clave

en el documento curricular corresponde al M.CS32.110 que se imparte en el cuarto semestre

de nuestro programa de estudios.



I. III Niveles de desempeño. El nivel de desempeño que lograrás será del nivel III debido a que tendrás un importante

nivel en la toma de decisiones y tendrás bajo tu responsabilidad recursos materiales con los

que opera el laboratorio de Virología.



II. Programa del Sistema de Prácticas.

Las prácticas que desarrollarás están orientadas a la aplicación de los conocimientos que

habrás de adquirir durante la impartición de la asignatura de Virología.

Las prácticas son secuenciales y van de lo más simple a lo más complejo y serán

desarrolladas en unisesiones y multisesiones.

Tema Prácticas programadas Ámbito de desarrollo Duración

Equipo, materiales 1- Descripción y manejo Laboratorio 1

y esterilización de equipo

I.I- Selección y esterilización Laboratorio 1

I.II- Material de cristalería Laboratorio 1

Diluciones 2- preparación de diluciones Laboratorio 1

Concentraciones y calculo de concentraciones

Obtención de 3- Recolección de muestras Laboratorio 1

Muestras para laboratorio

Inoculaciones 4- Inoculaciones Laboratorio 1

y sangrado sangrado de animales

de laboratorio

Inoculaciones 5- Inoculaciones en embrión Laboratorio 1

En embrión de pollo

Vacunas 6- Preparación de una vacuna Laboratorio 1

autógena

Serología 7- Técnica serológicas Laboratorio 1

7.1- Técnica de Laboratorio 1

inmunofluorescencia

7.2- Técnica ELISA Laboratorio 1

7.3- Virus y suero neutralización Laboratorio 1



Tema Prácticas programadas Ámbito de desarrollo Duración

Integración 8- Sesión integradora Aula 1

del uso e interpretación de

resultados de las técnicas

serológicas



Reglamento del Laboratorio de Virología.

1. Los usuarios deberán entrar al laboratorio utilizando una bata blanca limpia y

debidamente abrochada.

2. No se permite introducir o ingerir bebidas y alimentos en el laboratorio.

3. Los alumnos deberán presentarse a sus prácticas con su manual del laboratorio

correspondiente y materiales que se les haya solicitado previamente.

4. Los alumnos no podrán entrar al laboratorio después de 5 minutos de haberse iniciado

la práctica.

5. Una vez en el laboratorio, los alumnos no podrán salir del mismo hasta que finalice la

práctica salvo por indicación expresa del instructor.

6. Durante la realización de la práctica los alumnos deberán respetar el área de trabajo

de los diferentes equipos y guardar un buen comportamiento.

7. Al concluir la práctica, los alumnos deberán limpiar debidamente su área de trabajo y

dejar los instrumentos y reactivos ordenados.

8. La basura orgánica, inorgánica o contaminada resultante de la práctica deberá ser

depositada en el recipiente correspondiente.

9. El alumno que sea sorprendido manchando o rayando las mesas de trabajo o las

paredes del laboratorio se hará acreedor al pago correspondiente para su reparación.

10. Cuando la práctica involucre la utilización de algún animal vivo, los alumnos deberán

tratarlos humanísticamente y evitar el maltrato de los mismos.

11. Solamente el coordinador del edificio y el jefe del laboratorio podrán autorizar el uso

del laboratorio.

Cualquier sanción por el incumplimiento del reglamento será aplicado por el jefe del

laboratorio, el coordinador del edificio o la administración de la Facultad según sea requerida.

Dr. Andrew Charles Snydelaar H. M.C. Jaime Luis Rábago Castro. Jefe del laboratorio de Virología Coordinador del Edificio Multidisciplinario II y de Inmunología.



Práctica No. 1

Descripción y manejo del equipo y cristalería del laboratorio y proceso de esterilización de materiales.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. U.A.T.

Responsable de la elaboración:

Dr. Andrew Charles Snydelaar Hardwicke



Descripción y manejo del equipo del laboratorio y la cristalería del laboratorio y del proceso de esterilización de materiales.

Podrán ser atendidos 15 profesionales en formación por unidad de práctica.

Introducción.

La eficacia del trabajo de laboratorio exige utilizar adecuadamente el equipo en cantidad y

calidad, tenerlo en buenas condiciones, preparado e identificado para poderlo utilizarlo

inmediatamente en cualquier momento que este sea requerido.

Toda técnica debe ser cuidadosamente planeada, preparando todo el equipo que se necesite

para su desarrollo.

Propósito específico de la práctica:

Esta práctica tiene como propósito prepararte para que consigas el objetivo de describir,

utilizar y definir las aplicaciones del equipo y la cristalería de laboratorio de virología así como

el proceso de esterilización de materiales.

Criterios de desempeño:

• Serás competente para describir y utilizar los equipos del laboratorio de Virología así

como definir sus aplicaciones cuando concluya la práctica.

• Serás competente para describir, identificar y detallar el uso de las diferentes piezas

de cristalería cuando concluyas la práctica.

• Serás competente para realizar correctamente la esterilización de materiales y

cristalería cuando concluyas la práctica.



Normas de seguridad de la práctica:

Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso de accidente

Descargas Evita tocar los puntos Avisa inmediatamente a tu

eléctricas de conexión de los equipos instructor

Cortaduras Maneja con cuidado la Lava concienzudamente

cristalería la herida, utiliza el equipo

de primeros auxilios y avisa

inmediatamente al instructor

Quemaduras utiliza guantes de asbesto Utiliza el equipo de primeros

al utilizar el autoclave auxilios y avisa inmediatamente

al instructor

Disposición de desechos:

No se generarán desechos en esta práctica.

Desarrollo de la práctica:

Se te dará una explicación y se realizará una demostración física del manejo y uso de los

diferentes equipos del laboratorio de Virología, de la cristalería y del proceso de esterilización

y se te explicarán los usos de cada uno de ellos.



La práctica 1 se realizará en tres sesiones:

En la sesión I.I se te mostrarán los equipos de laboratorio, su funcionamiento y los usos de

los mismos.

En la sesión I.II se te mostrará la cristalería y se te darán los nombres de las diferentes

piezas así como el uso adecuado de cada pieza.

En la sesión I.III Se te explicará el uso y funcionamiento del autoclave y los materiales que

deben y pueden esterilizarse.



Sesión I.I Equipo:

a).-Balanza analítica

b).-Baño maría

c).-Agitador de pipetas de toma

d).-Autoclave

e).-Horno caliente

f).-Potenciómetro

g).-Espectrofotómetro

h).-Microscopio

i).-Centrifuga

Sesión I.II Materiales:

1.- Matraz Herlenmeyer

2.- Matraz de fondo plano

3.- Matraz de aforación

4.- Tubos de ensaye con tapón de rosca

5.- Vaso de precipitado

6.- Probeta

7.- Pipeta serológica

8.- Pipeta volumétrica

9.- Gradilla para tubo de ensaye

10.- Caja de petri

11.- Jeringas

13.- Frascos de reactivo

14.- Mortero de porcelana

15.- Laminillas (portaobjetos)



Sesión I.III

Selección y esterilización.

Todo material debe esterilizarse inmediatamente después de su empleo para que pueda ser

manipulado sin peligro de infección cuando se vaya a lavar.

El alumno no solamente tiene que saber manejar todos los instrumentos de su equipo, sino

que además debe reconocer las razones para elegir el mismo con una finalidad determinada.

En el laboratorio de Virología debe emplearse material de vidrio duro de buena calidad como

Kimax y Pirex

Es esencial que el material de vidrio este perfectamente limpio, el lavado y enjuagado

escrupuloso del material de vidrio con agua corriente y agua destilada, estas dos prácticas

constituyen las dos prácticas más críticas en un laboratorio de virología.

El material de plástico se usa una vez y se tira, no todos los plásticos son adecuados para el

laboratorio de virología, debido a la composición de este material. Esto adquiere especial

importancia en cultivo de tejidos ya que las células no crecen en todos los plásticos.

Materiales:

Autoclave

Cristalería y materiales diversos.



Sistema de evaluación:

Evaluación intermedia no calificativa:

Se te realizará un Interrogatorio oral sobre el manejo y uso de los equipos, la

cristalería y el uso correcto del autoclave.

Evaluación calificativa:

Participarás en el manejo de los equipos, la cristalería y el autoclave.

Escribirás un reporte detallando cada uno de los equipos, piezas de cristalería y el

autoclave incluyendo sus descripciones y usos de los mismos.

Anotaciones del profesional en formación.



Práctica No. 2

Preparación de diluciones y cálculo de concentraciones






Preparación de diluciones y cálculo de concentraciones.


Introducción.

Para la realización de cualquier prueba serológica con fines diagnósticos se requiere realizar

una serie de diluciones y calcular las concentraciones de los reactivos necesarias para

obtener resultados satisfactorios y confiables según los protocolos establecidos para dichas

técnicas.

Por estos motivos es necesario aprender a realizar correctamente los cálculos para este fin.


Esta práctica tiene como propósito que alcances el objetivo de realizar diferentes tipos de

diluciones y que puedas calcular las concentraciones que sean requeridas para cada una de

las técnicas serológicas con fines diagnósticos.


Serás competente para realizar diferentes diluciones y calcular las concentraciones de

manera correcta cuando concluyas esta práctica.



Normas de seguridad:

Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso

de un accidente

Cortaduras Manejar cuidadosamente Utilizar el botiquín de

la cristalería primeros auxilios y avisar al

instructor


Los materiales utilizados deberán ser desechados en los recipientes indicados.


Materiales:

Colorantes

Agua destilada

Tubos de ensaye

Pipetas

Cloruro de sodio

Balanza granataria

Espátula

Suero de Bovino



Procedimiento:

Preparación de diluciones:

Diluciones de fracciones:

• Una dilución de 1/10 se prepara añadiendo una parte de la solución de provisión a 9

partes del diluyente para hacer 10 partes en total.

• Una dilución de 1/10 significa 1 parte en 10 partes en total.

• Una dilución de 1/5 significa 1 parte en 5 partes en total.

Para hacer otras diluciones los denominadores de las fracciones son multiplicadas para

determinar la nueva dilución. Ejemplo

• Una dilución de 1/5 diluido ¼ nos dará una dilución de 1/20

• Una dilución de 1/7 diluido 1/3 nos dará una dilución de 1/21

Diluciones seriadas

• Se utilizan en serología para preparar en forma práctica volúmenes pequeños de

soluciones diluidas comúnmente usadas.

Ejemplo.

Se ponen una serie de tubos con 1 ml del diluyente. En cada tubo se agrega 1 ml de la

muestra dando un resultado de 1/2 una vez mezclado.

1ml de la dilución del diluyente de ½ en el tubo No 1 se añade al tubo No 2 resultando

en una dilución del diluyente de ¼ (una dilución de ½ de la dilución de ½)

Al continuar con esta dilución en serie el tercer tubo tendría una dilución de 1/8 el cuarto de

1/16 y así sucesivamente.



Cuestionario de evaluación: Ejercicios:

1. Utilizando una solución salina fisiológica como diluyente prepare las siguientes

diluciones:

a) Una dilución 1/12 de suero bovino

b) Una dilución de 1/12 de suero bovino de una solución de 1/6 de suero bovino.

c) Una dilución de ½ de suero bovino

d) 5 ml de una dilución de ½ de suero bovino

e) 5ml de una dilución de 1/10 de suero de bovino de una dilución de suero de bovino

f) 10ml de una dilución de 1/50 de suero bovino partiendo de 10% de suero bovino

g) 1.5ml de ½ de suero bovino.

2. Prepare una dilución seriada de 5 tubos en suero bovino.

a) Dilución seriada en múltiples de dos con un volumen final de 0.5ml en cada tubo indique la

dilución de suero en cada tubo de la serie.

b) Dilución seriada en múltiples de cuatro de suero bovino usando 1ml de diluente por tubo.

Indique la dilución de suero

1. Prepare 50ml de una solución de 3% de cloruro de sodio partiendo de una solución de

provisión de 15%



-Realizarás correctamente diferentes tipos de diluciones en el laboratorio.

-Realizarás de manera correcta los cálculos necesarios para determinar diferentes

concentraciones.




Resolverás de manera escrita los problemas de diluciones y concentraciones planteados al

final de esta práctica y los entregarás un día hábil posterior a la misma.

Conclusiones del profesional en formación:



Práctica No. 3

Procedimiento para la recolección de muestras sanguíneas e inoculaciones en animales de laboratorio.






Procedimiento para la recolección de muestras sanguíneas e inoculaciones en animales de laboratorio.


Introducción:

El sangrado y la recolección de muestras sanguíneas de animales de laboratorio son de

importancia toda vez que los procesos experimentales de proyectos de investigación con

frecuencia requieren la utilización de estos animales.

Los procedimientos realizados en forma correcta son de especial relevancia para obtener los

mejores resultados posibles y evitar además el sufrimiento innecesario de estos animales.

Objetivo:

Realizarás la recolección de las muestras adecuadas para su envío al laboratorio de

Virología.

Propósito específico de la práctica.

La práctica tiene como propósito que puedas cumplir el objetivo de que puedas obtener

muestras sanguíneas y realizar inoculaciones en animales de laboratorio con fines

experimentales evitando el sufrimiento innecesario de los animales de laboratorio.


Serás competente para tomar muestras sanguíneas y para la realización de inoculaciones

cuando concluyas esta práctica.



Normas de seguridad: Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso

de un accidente

Precauciones para evitar Utilizar cuidadosamente Avisar al instructor

Pinchazos las agujas

Desechar adecuadamente Utilizar los recipientes Avisar al instructor

las agujas utilizadas. Adecuados para este fin

Evitar el contacto directo Manejar cuidadosamente Avisar al instructor

con sangre. A los animales




El instructor dará una explicación previa a la práctica y una demostración de las técnicas

correctas para la obtención de muestras sanguíneas y técnicas de inoculación.

Los alumnos practicarán estos procedimientos.

Materiales.

• Jeringas y agujas

• Algodón

• Xileno y alcohol

• Animales de laboratorio

• Material para torniquetes

• Tubos de ensayo

• Agua bidestilada.



Procedimiento y destreza en la colección de muestras sanguíneas y en el proceso de

inoculación.


Entrega de un reporte escrito sobre la metodología correcta para el sangrado y la inoculación

así como los posibles motivos para inocular animales de laboratorio.

La entrega del trabajo deberá hacerse dos días hábiles después de haber concluido la

práctica.



Práctica No. 4

Procedimiento para las Inoculaciones en Embriones de Pollo.






Procedimiento para las inoculaciones en embriones de pollo.


Introducción. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado, fue empleado por primera vez por Burnet en

1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de

estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso.

Los virus solo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente se

deben inyectar en la región apropiada. El método exacto de inoculación y la edad del

embrión que se emplea, dependen del virus problema. Por ejemplo, para aislar en forma

primaria el virus de la influenza a partir de material obtenido de la garganta, suele inocularse

este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente

en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras en

el amnios. Los lugares más utilizados para la inoculación, además de las cavidades

amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.

Propósito de la práctica:

El propósito de esta práctica es que logres el objetivo de realizar correctamente

los diferentes tipos de inoculación en huevos embrionados.


Serás competente para realizar inoculaciones en huevos embrionados cuando concluyas la

práctica.





de un accidente

Precauciones para evitar Utilizar cuidadosamente Avisar al instructor

pinchazos las agujas


las agujas utilizadas. Adecuados para este fin


Material:

• Embrión de pollo

• Agujas

• Mechero

• Lápiz

• Alcohol.

• Manguera de látex

• Jeringa

• Punzón

• Vibrador con punta de metal

• Parafina

• Ovoscopio



Existen varias vías de inoculación en el embrión de pollo y depende del virus o la vía de

inoculación así como la edad del embrión del pollo.

Vías de inoculación:

Vía Edad

Cavidad alantoidea 9 - 11 días

Cavidad amniotica 9 - 11 días

Saco vitelino 3 - 5 días

Membrana corion alantoidea 9 - 11 días

Intracerebral 13 -15 días

Endovenosa 14 - 15 días

Cavidad alantoidea:

1. Se toma un huevo embrión de 9 a 14 días de edad

2. Se ovoscopea

3. Se marca con lápiz la cámara de aire

4. Se desinfecta el cascarón con yodo, alcohol o mertiolate.

5. Se pica el cascarón 3mm arriba de la membrana corioalantoidea en la cámara de aire

sin dañar la fárfara y del lado contrario al embrión.

6. Posteriormente y con una aguja calibre 22 de 1 a 1 ½ pulgada de largo se introduce

en forma vertical, se deposita el inoculo y se retira la aguja.

7. El siguiente paso es sellar el orificio del cascarón con silicón, barniz de uñas, parafina

o resistol y se incuba.



Procedimiento y destreza para las inoculaciones por las diferentes vías.




Entrega de un reporte escrito explicando la diferentes vías de inoculación utilizadas para los

diferentes virus.

El trabajo deberá entregarse tres días hábiles después de concluida la práctica.




Práctica No. 5

Preparación de una vacuna autógena.






Preparación de una Vacuna Autógena.


Introducción:

La vacuna (del latín vaccinus-a-um, 'vacuno'; de vacca-ae, 'vaca') es un preparado de

antígenos que una vez dentro del organismo provoca una respuesta de ataque, denominada

anticuerpo. Esta respuesta genera memoria inmunológica produciendo, en la mayoría de los

casos, inmunidad permanente frente a la enfermedad. La primera vacuna descubierta fue la

usada para combatir la viruela por Edward Jenner en 1796.

Las vacunas se clasifican en dos grandes grupos

• Vacunas vivas o atenuadas

• Vacunas muertas o inactivadas

Existen varios métodos de obtención:

• Vacunas avirulentas preparadas a partir de formas no peligrosas del microorganismo

patógeno.

• Vacunas a partir de organismos muertos o inactivos.

• Antígenos purificados.

• Vacunas genéticas.

Las vacunas se administran por medio de una inyección, o por vía oral (tanto con líquidos

como con pastillas).

Propósito de la práctica: El propósito de esta práctica es que logres el objetivo de producir una vacuna

autógena utilizando tejido papilomatoso bovino.




Serás competente para preparar una vacuna autógena contra el papiloma bovino cuando

hayas concluido esta práctica.



de un accidente


el material utilizado. adecuados para este fin

Evitar el contacto directo Manejar cuidadosamente Avisar al instructor

con el tejido. el tejido.

Desarrollo de la práctica: Explicación de del instructor sobre los principios bajo el cual actúan las vacunas.

Materiales:

• Tejido papilomatoso

• Mortero de porcelana estéril

• Formol al 10%

• Antibiótico (penicilina G procaína)

• Agua destilada

• Embudo de vidrio

• Papel filtro

• Jeringa de 3ml

• Papel filtro

• Cristalería estéril



Procedimiento:

1. Se maceran aproximadamente 2g de tejido papilomatoso

2. Una vez macerados se agregan 5 ml de formol al 10% y se sigue macerando. El

formol es utilizado para inactivar los virus.

3. Después se le agregan 80,000UI de penicilina G procaína, (0.2ml de pemprocilina) con

el fin de no permitir la contaminación por bacterias.

4. Luego se le agregan 4.3 ml de agua destilada para hacer la solución.

5. Después de esto se pasa por un embudo con un filtro.

6. La solución es nuevamente filtrada utilizando un filtro con diámetro de poro de .22

micrómetros.

7. Una vez filtrado se divide la solución en condiciones estériles en dos frascos.

8. Estos son sometidas a congelación una vez realizada la vacuna

• La vacuna autógena será aplicada al animal en dos dosis, la primera por vía

subcutánea.

• La segunda dosis se aplicara ocho días después por vía intramuscular.


Evaluación no calificativa:

-Participación activa en la práctica.

Destreza en la preparación de la vacuna.


-Reporte escrito detallando la metodología utilizada que deberá entregarse antes de dos días

hábiles de haber concluido la práctica.



Práctica No. 6

Técnicas Serológicas.






Técnicas serológicas. Podrán ser atendidos 15 profesionales en formación por unidad de práctica.

Introducción. La serología es el estudio del suero sanguíneo para la detección de anticuerpos contra un

agente infeccioso específico.

Las técnicas serológicas actualmente conocidas y desarrolladas constituyen una

herramienta de gran utilidad diagnóstica, tanto por su relativa sencillez procedimental como

por su bajo costo y relativa rapidez en la obtención de los resultados.

La sensibilidad y especificidad varía según la técnica serológica utilizada, por ende, es

necesario precisar el fin que se persigue al seleccionar una u otra técnica.

Para que una prueba serológica sea de utilidad diagnóstica, se requieren utilizar sueros

pareados (sueros obtenidos del mismo animal al inicio del cuadro clínico y durante la

convalecencia del mismo) para demostrar el incremento o la ausencia del mismo en los

títulos de anticuerpos contra el agente infeccioso causante de una enfermedad que se

pretende diagnosticar.


El propósito de esta práctica es que logres el objetivo de identificar la técnica serológica mas

conveniente para el diagnóstico de una enfermedad viral en particular o bien para otro fin

específico, tal como la determinación de incidencias o prevalencias de enfermedades.

Asimismo, podrás entender y describir los principios de acción de las técnicas serológicas.




• Serás competente para expresar los principios y procedimientos de cada técnica

serológica así como para interpretar los resultados obtenidos en las mismas.



de un accidente

Sangre contaminada Evitar el contacto con Dar aviso al instructor

con un agente sangre y suero

infeccioso.

Exposición oral con Seguir el reglamento Dar aviso al instructor

reactivos del laboratorio

Desecho de materiales Desechar en depósitos Dar aviso al instructor

adecuados


Se te dará una explicación y se realizará una demostración física y se te explicarán los

principios y usos de las distintas pruebas serológicas.

La práctica 6 se realizará en cuatro sesiones:

En la sesión 6.I Se te dará una explicación y se realizará una demostración física de los

principios y usos de la prueba de inmunodifusión en gel de agar.

En la sesión 6.2 Se te dará una explicación y se realizará una demostración física de los

principios y usos de la prueba de inmunofluorescencia.


principios y usos de la prueba ELISA.




principios y usos de la prueba de neutralización viral.

Sistema de evaluación: Las cuatro sesiones de la práctica serán evaluadas de la manera que

a continuación se describe:


Interrogatorio oral sobre procedimientos y principios y aplicaciones de las técnicas

serológicas.


Reporte escrito detallando los usos, bondades y limitaciones de cada técnica serológica, así

como la forma de interpretar los resultados de las mismas.

Sesión 6.I Técnica de Inmunodifusión. Materiales:

• Agarosa o noble agar con 1.5% de solución fosfato bufferada y 0.2% en agua

desionizada.

• Laminillas de microscopio

• Molde acrílico

• Cinta de aislar plástica

• Pipetas Pasteur

• Suero bovino, suero de conejo, gammaglobulina de bovino, albúmina de suero bovino,

suero de ovino, suero de equino.

• Suero de conejo anti-bovino

• Thiazine red (1.0% en 1.0% ácido acético).

• 2.0% de acido acético.

• Rejillas para tinción y lavados.

• Placas de petri para el control de humedad.



Procedimiento:

1. Lava las laminillas de microscopio con jabón, enjuague y seque. Ponga las laminillas

en cajas de petri sucesivas para el lavado con etanol; permítales secar.

2. Aplica 2 capas de cinta plástica de cada lado de las laminillas dejando un espacio

aproximado de 1 pulgada cuadrada entre las orillas de la cinta.

3. Corta el exceso de la cinta sobre el filo de la laminilla con una hoja de afeitar.

4. Aplica una precubierta en el área de una pulgada cuadrada entre las cintas mediante

la inmersión de un recipiente con 0.2% de agarosa o noble agar (templado) en agua

desionizada. Déjese en posición transversal para secar.

5. El 1.5% de agarosa o noble agar en solución fosfato bufferada derretido será puesto

sobre la laminilla con una pipeta Pasteur en cantidades suficientes para cubrir el área

entre las cintas y ponga encima otra laminilla no lavada sobre las cintas.

6. Permite a las laminillas reposar hasta que se solidifique el agar. Corte el agar que se

halla derramado y póngalo en el refrigerador para que se gelifique completamente

7. Limpia los moldes plásticos que serán utilizados.

8. Saca las laminillas del refrigerador y con mucha suavidad deslice la laminilla superior

ponga el molde plástico encima de la superficie de agar.

9. Aplica los reactivos en los orificios según lo indicado: En los orificios periféricos

(exteriores) ponga la fracción de globulinas obtenidas mediante precipitación con

sulfato de amonio (el instructor los proporcionará) de suero normal bovino,

gammaglobulinas bovina, albúmina de suero bovino suero normal de conejo, solución

salina fosfato bufferada y en el orificio central ponga el suero anti bovino de conejo.

10. Permite que se realice la difusión durante 48 horas a 5 o 6·C.

11. Después de las 48 horas lava las laminillas (tras de haber removido lateralmente el

molde con suavidad) en 2 o 3 cambios de solución fosfato amortiguada durante 48

horas o más (esto elimina la proteína que no participó en la reacción).

12. Tiñe las laminillas en una solución de 0.1% de thiazina en 1% de ácido acético (el

ácido acético evita que el agar también sea teñido y además fija las proteínas en el

gel) durante 3 a 6 horas



13. Destiñe las laminillas con 2 o 3 cambios de ácido acético al 2%

14. Coloca un pedazo de papel filtro humedecido en el fondo de un plato de petri, meta las

laminillas en el plato de petri y cúbralo. (esto evita que el agar se seque durante el

proceso de la difusión).




Sesión 6.2 Técnica de Inmunofluorescencia: Materiales:

1. Auramina

2. Rodamina

3. Isotioscinato de fluoresceína

4. Naranja de acridina

5. Laminillas

6. Conjugado

7. Microscopio de epifluorescencia

8. Controles positivos y negativos

9. Soluciones de lavado

Estos son algunos de los fluorocromos más utilizados en esta técnica.

La técnica directa es la más utilizada para diagnóstico.

Procedimiento: • Técnica directa.

1. Fija el antígeno a una laminilla por el método de impronta (puede ser al aire o con

algún fijador como la acetona)

2. Aplica unas gotas de conjugado al anfígeno.

3. Incuba a 37C por un periodo variable que va de 10 minutos a una hora en cámara

húmeda.

4. Sumerge las laminillas en solución lavadora que generalmente es una solución

tampón (durante 10 minutos)

5. Saca las laminillas y sumérgelas en agua destilada 10 minutos más.

6. Sácalas y móntalas con portaobjetos mediante glicerina tamponada.

Si es positiva la muestra, aparecerán con fluorescencia bajo la luz del microscopio.

El color dependerá del fluorocromo utilizado.



Sesión 6.3 Técnica ELISA Materiales:

• Microplacas.

• Soluciones de lavado (Buffers).

• Micropipetas dosificadoras.

• Antígeno.

• Conjugado.

• Solución de parado.

• Sustrato.

• Espectrofotómetro.

Procedimiento: - Agrega el antígeno a los pocillos de la microplaca.

- Después de la incubación y lavados, agrega el suero problema.

- Lava los pocillos y agrega el conjugado y después de la incubación lava los pocillos.

- Agrega el sustrato y después de la incubación agrega la solución de parado.

- Lee la microplaca en el espectrofotómetro y registra los resultados.



Sesión 6.4 Técnica de Neutralización Viral. La Neutralización Viral se define como la perdida de la capacidad infectante de un virus por

la reacción del mismo con un anticuerpo específico.

La prueba de suero neutralización es una técnica muy sensible y específica para la

caracterización viral por métodos serológicos.

La prueba de neutralización puede ser usada para:

a) Identificación de virus o anticuerpo

b) Cuantificación de virus y anticuerpos

c) Determinación de la relación antigénica entre dos o más virus en caso de

antigenicidad cruzada.

d) Diagnóstico de infección viral demostrando aumento del título de anticuerpos

específicos.

e) Determinar niveles de protección ya que los anticuerpos neutralizantes persisten

durante tiempos más prolongados.

Materiales: 1. Suero problema

2. Gradilla

3. Pipetas de 1ml 1/10

4. Virus problema

5. Marcador

6. Cultivos celulares

7. Microscopios

8. Tubos de ensaye



Procedimiento: 1. Coloca una serie de tubos en la gradilla

2. En tubos de ensaye diluye suero en diluciones quíntuples empezando con 1/10

utilizando una pipeta por dilución.

3. Mezcla 0.5 ml de virus con 0.5ml de cada dilución de suero.

4. Incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos 22·C

5. Posteriormente a esto, inocula el sistema en un cultivo celular y después de incubar,

realiza la lectura.

Lectura:

La lectura se realiza por dilución y efecto viral del grupo control contra la dilución del suero e

inhibición del efecto viral por el suero en cuestión.




Práctica No. 7

Práctica Integradora de las Pruebas Serológicas.






Práctica Integradora de las Técnicas Serológicas. Podrán ser atendidos 15 profesionales en formación por unidad de práctica.

Introducción. Las técnicas serológicas proporcionan una gran herramienta diagnóstica siempre y cuando el

clínico veterinario sepa solicitar la prueba de laboratorio indicada en función a su diagnóstico

presuntivo. Además deberá conocer los principios de acción de las pruebas con el fin de

interpretar correctamente los resultados emitidos por el laboratorio y así poder llegar a

establecer el diagnóstico definitivo.

Propósito específico de la práctica.

El propósito de esta práctica es que logres el objetivo de integrar los conocimientos que

adquiriste en las prácticas de serología (6.I, 6.2, 6.3 y 6.4).

Criterios de desempeño.

Serás competente para expresar los principios de cada técnica serológica, solicitar las

pruebas indicadas según el caso clínico que se te presente así como para interpretar

debidamente los resultados obtenidos en el laboratorio.


Ninguna.


Ninguna.



Desarrollo de la práctica.

• Exposición por el instructor, discusión en subgrupos y presentación de las

conclusiones subgrupales.

• Sumatoria de las relatorías por el docente.



Participación en discusiones dirigidas y conclusiones emitidas.

Evaluación calificatoria:

Entrega de un reporte integral sobre los usos, aplicaciones, bondades y debilidades de cada

una de las técnicas serológicas y la manera de interpretar los resultados de cada una de

ellas.

Esta práctica será realizada en el aula.

Conclusiones del profesional en formación



Bibliografía:

Cunningham,C.H. Virología práctica. Editorial Acribia, S.A.

Fechner, J. Vacunas y vacunación de los animales domésticos. Editorial Acribia, S.A.

Krupp M.A., Tierney, E., Jawetz E., Roe R.I., Camargo C.A. Manual de diagnóstico clínico y

de laboratorio. 8 Edición. Editorial El Manual Moderno.

Merchant, I.A. y Packer, R.A. Bacteriología y virología veterinarias. Editorial Acribia, S.A.

Morgan, S.J., Darling D.C. Cultivo de células animales. Editorial Acribia, S.A.

McKenrie S.B., Woodlife H.J. Hematología Clínica. 2ª. Edición. Editorial El Manual Moderno.

manual de practicas de virologia

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