UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISIÓN : CIENCIAS BÁSICAS E INGENERh

CARRERA : LICENCIATURA QUíMICA

INFORME DEL PROYECTO TERMINAL :

" ESTUDIOS ESPECTROSCOPICOS SOBRE EL REPLEGAMIENTO DE LA ENZIMA PAPAÍNA

FECHA : MAYO DE 1997

LAURA VALLE MERCHAND PRESENTA :

MATRkULA : 91226098

ASESOR :

íNDICE

1 Introducción

1.1 Introducción general 1.1.1 Proteínas 1.1.2 Papaína

1.2 Objetivos 1.2.1 Objetivos Generales 1.2.2 Objetivos Particulares 1.2.3 Justificación

2 Materiales y Métodos

2.1 Papaína y otros reactivos

2.2 Técnicas experimentales 2.2.1 Mediciones de actividad enzimatica 2.2.2 Espectroscopía U It ravioleta 2.2.3 Espectrof luoromet ría

3 Desarrollo del proyecto

3.1 Equipo utilizado

3.2 Etapas de realización 3.2.1 Medición de actividad enzimática 3.2.2 Fluorescencia

4 Resultados

4.1 Resultados, conclusiones y perspectivas

5 Referencias bibliográficas

1 INTRODUCCI~N.

1 .I Introducción general

1. I. 1 Proteínas

Las proteínas constituyen sin duda uno de los grupos de moléculas de gran trascendencia en los seres vivos. Todas las proteínas son polipéptidos de peso molecular elevado, una proteína simple contiene solo aminoácidos, una compleja contiene además otras moléculas como homo, vitaminas, carbohidratos, etc. Las proteínas desempeñan una gran variedad de funciones en el organismo, las enzimas en especial, catalizan reacciones químicas celulares , así pues, las proteínas son quizá las macromoléculas más versátiles, que se responsabilizan en gran parte de las funciones metabólicas y de la morfología de los seres vivos.

Salvo algunas excepciones las enzimas son proteínas; cada proteína enzimática está diseñada para catalizar una reacción específica, y cada una de las reacciones celulares está catalizada por una enzima diferente, por Io que las enzimas poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus substratos, aceleran reacciones químicas específicas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperaturas y pH.

La vida y el crecimiento celular requieren la continua síntesis de macromoléculas acoplada a procesos proveedores de energía. El acoplamiento controlado de las reacciones químicas mediante la acción de enzimas es propiedad única de las células vivas. Entre las miles de sustancias presentes en cada célula, las enzimas constituyen la parte más importante de las proteínas celulares. Esencialmente, todas las reacciones bioquímicas son catalizadas por enzimas.

A las proteínas se les denotan varios niveles estructurales que se definirán brevemente a continuación:

Estructura primaria, se refiere al orden de los aminoácidos en la cadena polipeptídica, la fuerza estabilizadora de esta estructura es el enlace covalente (peptídico) ;en esta estructura se incluye, además de la secuencia de aminoácidos, la localización de los puentes disulfuro (cistina).

Estructura secundaria, en virtud de la estructura coplanar del enlace peptídico y los ángulos de rotación $ y y~ de las proteínas, surge una estructura particularmente estable que es la a-hélice, donde la cadena polipeptídica se pliega adoptando una forma helicoidal con giro a la derecha.La máxima estabilidad de la hélice está determinada por puentes de Hidrógeno que se establecen entre el grupo carbonilo (C=O) de un enlace peptídico y el amino (N-H), por otra parte, la conformación p (hoja p), esta formada por dos o más cadenas polipeptídicas que pueden ser paralelas o antiparalelas y se estabilizan también por puentes de Hidrógeno, esta conformación es extendida y se dispone a la manera de acordeón con los grupos R proyectados por encima y por debajo

de los planos generados por las cadenas polipeptídicas. Dentro de la estructura secundaría pueden existir algunas regiones de las proteínas que no son algunas de las anteriores, sino que son conformaciones enrolladas al azar. (’)

Estructura terciaria, es un arreglo tridimensional que forma diversos repliegues específicos. Los tipos de enlace que estabilizan la estructura terciaria son: atracción electrostática de tipo salino, puentes de hidrógeno, interacciones de cadenas polares y fuerzas de Van der Waals; las estructuras tercianas nos permiten agrupar las proteínas en familias y subfamilias, por ejemplo proteínas fibrosas de forma alargada y proteínas globulares de forma esferoidal.

Estructura cuaternaria, se tiene esta estructura cuando la proteína se compone de más de una cadena polipeptídica, se les denomina oligoméricas y las cadenas polipeptídicas individuales que la integran se denominan monómeros, protómeros o subunidades. (I)

Fig. 1.1 Representación esquemática del plegamiento de la cadena principal de la ribonucleasa bovina La región de a-hélice está encerrada en un óvalo y la región fl est6 sornbreada. Otas porciones constituyen un enrollamiento al azar.

Fig. 1.2 Tipo de uniones que esíabilizan el plegamiento de las proteínas. 1. Interacción electrostática; 2 Puentes de hidrógeno, entre teonina y senna; 3 Interacción dpdo - dpdo entre dos serinas; 4 unión de disulfuro. convalente. entre dos cistelnas; y 5 Interacci6n hidrofébica ente bucina e isoleucina

La actividad biológica de una proteína depende del ordenamiento tridimensional apropiado de sus grupos funcionales. De este modo, las proteínas solo funcionan

cuando están plegadas en su estructura original, conformación nativa. Debido a que las conformaciones nativas de la mayor parte de las proteínas están estabilizadas sólo por enlaces no covalentes, el plegamiento puede ser alterado por condiciones como alta temperatura, pH extremo o presencia de solventes orgánicos entre otras cosas.

La alteración de una proteína que modifique su conformación nativa se denomina desnaturalización, este cambio provoca la consiguiente alteración o desaparición de sus funciones, en una proteína se produce la desnaturalización al perder su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, conservándose la primaria (covalente). En el estado desnaturalizado los niveles de estructuración superior de la conformación nativa se encuentran al azar, es decir la proteína altamente ordenada queda reducida a un polímero estadístico formado Dor una cadena de aminoácidos.")

terciaria cua ternaria primaria secundaria

Amino- Hélice a Cadena Subunidades ácidos - - Doli WDiídiCJ ~ txlsamhlada--

Fig. 1.3 Niveles de esbuctura en proteínas

La ruptura proteolítica de enlaces peptídicos es uno de las más frecuentes e importantes modificaciones enzimáticas de las proteínas. Las proteasas se clasifican en diferentes familias deacuerdo a su función, los miembros de la misma familia tienen estructuras y mecanismos de acción similares. La papaina se encuentra dentro de la familia de cistina proteasas y es el miembro mejor estudiado de esta familia

Las enzimas no catalizan reacciones que jamás sucederían espontáneamente, es decir aquellas termodinámicamente imposibles. La aplicación del primer principio de la termodinámica (principio de conservación de la energía) a las reacciones químicas ha dado origen a la termodinámica que estudia la cantidad de calor que se absorbe o se desprende en una reacción y permite calcular la energía libre (G) y la entalpía o contenido calórico (H). Si en la reacción se absorbe calor, los productos tendrán más energía que los reactantes; los cambios de energía libre (AG) y de entalpía (AH) son positivos y se dice que la reacción es endotérmica. En las reacciones en que se desprende calor, AG y AH son negativos y la reacción es exotérmica .

AG = CG productos - CG reactivos

AH= CH productos - CH reactivos

Una reacción que es exotérmica en sentido directo, será endotérmica en sentido inverso, se hable así de calor de formación y calor de reacción.

El segundo principio de la termodinámica determina la dirección de una reacción química. Este principio establece que los procesos espontáneos tienden al equilibrio. El cambio de energía libre (AG) se correlaciona con la constante de equilibrio (Keq), la cual a su vez se rige por la ley de acción de masas. Para las proteína se tiene el equilibrio siguiente:

y la ecuación que determina el cambio de energía libre respecto al estado inicial y final es:

AG = AGO + RT in[D] /[NI

donde AGO es el cambio de energía libre en condiciones estandar : este valor es equivalente al pKa de la ecuación de Henderson-Hasselbach. En el equilibrio, no hay cambio de energía libre y AG=O, lo tanto :

AGO = - RT In Keq

Existen sistemas de reacción que se presentan en estado metaestable, es decir termodinámicamente posible; pero no espontáneo, los cuales necesitan saltar una barrera termodinámica para alcanzar el estado de transición, está energía necesaria se conoce como energía de activación. La energía de activación es la energía necesaria para pasar las moléculas reaccionantes al estado de transición y que de ahí proceda la reacción. En ausencia de catalizadores enzimaticos, muchas reacciones químicas proceden excesivamente lentas a temperaturas del organismo, no reaccionan con rapidez debido a que la energía cinética que poseen es insuficiente para superar esa barrera de energía. AI disminuir la energía de activación, las enzimas hacen que las reacciones termodinámicamente posi bles procedan con rapidez en la célula pero no modifican la constante de equilibrio.

. Fig. 1.4 Representación cualitativa de proceso de desnaturalización en dos estados de

una proteína.

1.1.2 Papaína

Las moléculas de aminoácido que forman las enzimas, se unen de forma covalente a través de un enlace amida sustituido, denominado enlace peptídico, este enlace se forma por eliminación de los elementos del agua del grupo a-carboxilo de un aminoácido y el grupo a-amino del otro. El enlace peptídico es el enlace covalente mas importante que une aminoácidos en los péptidos y proteínas, este se pueden hidrolizar mediante los enzimas denominados proteasas. Los enzimas proteolíticos (que rompen proteínas) se encuentran en todas las células y tejidos en donde degradan proteinas que ya no se necesitan, o que están dañadas, o bien ayudan a la digestión de los alimentos; entre este grupo se encuentra la enzima de estudio del presente proyecto, la papaína.

La papaína se extrae del látex del fruto del papayo, al pinzar sus diversas partes verdes se obtiene el látex de gran aplicación en la farmacia, en las industrias de alimentación para ablandar las carnes, en la textil para macerar las fibras de lana y algodón, y en la industria de tenería para el curtido de pieles. Este látex puesto a secar en recipientes de cristal o porcelana, forma al final una sustancia, la papaína, pulverulenta y grumosa, de color blanco amarillento, casi inodora y de sabor parecido a la pepsina, que es soluble en agua e insoluble en alcohol y éter.

La papaína por ser una enzima proteolítica tiene la propiedad de digerir las proteínas, - pudiendo llegar a licuar hasta mil veces su peso de sustancias albuminoides, y actúa al

revés de la pepsina en medios neutros o alcalinos; de aquí su empleo en farmacia como digestivo.

El residuo de aminoácido mayormente catalítico en la papaína es la cistina 25, la catálisis procede vía intermediario thiol ester y es facilitado por las cadenas laterales de la histidina 159 adyacente y el ácido aspártico 158. (*)

Respecto a su estructura, la papaha es una enzima globular compuesta por dos dominios (fig.l.5) con 212 residuos de aminoácidos, los cuales parten la cadena de polipéptidos en dos . El sitio activo se encuentra en un lugar clave entre los dominios y consiste en siete subpartes (S4, S3, S p , Si, SIi, SIp y SI3), para siete residuos del sustrato peptídico. El sitio catalítico es definido por residuos de ambos dominios. En particular, el residuo Cys 25, que forma las interacciones acyl enzima junto con la cercana His 159 del dominio adyacente.

- Fig. 1.5 Los dominios de la papaína.

Por otra parte se sabe que al momento de activarse, la papaína desprende una parte de su cadena, llamada pro-papaína, la cuál se cree es la parte estabilizadora de las helices de la estructura secundaria en la enzima nativa, de está forma en condiciones fisiológicas la papaína lleva a cabo una reacción termodinámicamente irreversible, puesto que una vez realizada su función es inactivada completamente.

1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivos Generales

Anteriormente se hizo mención acerca de la importancia que se ha encontrado en las proteasas ya que estas forman parte de una gran variedad de procesos fisiológicos de importancia en las funciones celulares. Múltiples estudios se han realizado para conocer la estructura y función de algunas proteasas. La papaína ha sido parte de diversas investigaciones, su estructura cristalográfica es conocida. El presente estudio es una continuación de una investigación efectuada en el laboratorio del Área de Biofisicoquímica , cuyo propósito es entender detalladamente los principios que dictan la formación de la estructura nativa de la papaína, así como las fuerzas que lo estabiiizan, es importante tomar en cuenta que el desplegamiento de la papaína es termodinámicamente irreversible y que después de realizar su función como enzima se desprende de una parte de su estructura.

1.2.2 Objetivos Particulares

Determinaremos el mecanismo por el cual la papaína tiene la conformación nativa que la caracteriza, específicamente en los estudios realizados en este trabajo, se utilizaron diferentes reactivos que hicieron la función de la parte estructural que la enzima de estudio desprende después de su función, los reactivos fueron Trifluoroetanol , etanol y metanoi, los cuales por sus características estabilizadoras de estructura secundaria, se prevé llevarán a cabo la función de la parte pro desprendida, lo que nos conduciría a comprobar que la parte pro estabiliza la estructura nativa.

1.2.3 Justificación

En las Últimas décadas las enzimas proteolíticas se han vuelto foco de atención por el papel tan importante que tienen en una gran variedad de procesos fisiológicos. El estudio de los cambios conformacionales es interesante no solo porque muestra los factores que estabilizan o desestabiiizan la conformación nativa, sino porque además ilustra sobre el mecanismo de ensamble de conformaciones organizadas y específicas, desde la cadena polipeptídica sin estructuración.

2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Papaína y otros reactivos

AI hacer uso de la papaína en los experimentos, se debió tener mucho cuidado puesto que por lo general, las enzimas son muy sensibles, y se pueden desnaturalizar muy fácilmente, en especial la papaina es muy hidrolizable y se tuvo cuidado en tenerla en refrigeración muy bien tapada cerciorándose de que cuando se utilizara se encontrara a temperatura ambiente.

Algunas de las características de la papaína se muestran en el siguiente cuadro:

Papaína (peptidasa de papaya)

Especificidad primaria (enlace peptídico de ruptura) Arg, Lys; PI' = no específico

Fuentes/ suministro Carica papaya / sigma Muestra de ensayo normal Ba-~-Arg-ethyl éster, pH 6.2, 25°C Actividad específica 3-30 U mg-' Estabilidadalmacenamiento estable a 4OC; la actividad disminuye cerca del 20%

en 6 meses

Agentes de bloqueo sulfidrílicos, iones de metales pesados, derivados carbon ílicos y ácido ascórbico, leupeptina, PMSF, TPCK, TLCK, E-64, alfa2 macrobulina

-PI -Pi' - (Pi = no específico pero son preferidos

Condiciones de uso pH 6.0 - 7.0 In h ibidores

(3) Nota: Disponible wmo enzima insoluble dependiente de la agarosa o de la celulosa del carboxjrnetil de sigma. se denota a -PI -Pi' - corno el enlace peptídco entre el grupo amino Pi y el carboxflico Pi'

Los reactivos utilizados, características y procedencia se muestran a continuación:

Reactivo 2-2- 2 Trifluoroe tanol Etanol

Metano1 Caseína

Cisteína

EDTA disódico Hidrocloruro de guanidina

Procedencia Sigma Chemical Co. Merck

Merck Merck

Merck

J.T. Bakex Sigma Chemical Co.

Comentarios Sustancia muy irritante y volátil Se utilizó uno HPLC (de alta resolución para cromatografía) Se us6 etanol absoluto Se preparó su solución el mismo día de utilizada para evitar su descomposición Igual que la cisteína se prepara el mismo día de uso.

Su concentración fue determinada a partir del índice de refracción de sus soluciones, según el método establecido por N o d i (4).

2.2 Técnicas experimentales

En los estudios relacionados a cambios conformacionales de proteínas donde se siguen transiciones de estado nativo a desplegado, puede usarse en principio cualquier método en el que se modifique algún parámetro fácilmente medible en función de la conformación, sin embargo se requieren métodos de alta precisión y sensibilidad ya que los experimentos, se realizan a concentraciones bajas de proteína para minimizar la agregación.

Cada una de las técnicas experimentales nos proporciona un tipo de información específica, así, los métodos espectrofotométricos detectan el cambio de la conformación molecular basándose en variaciones en los niveles de energía de algunas especies, lo cuál se debe a una modificación en el entorno del medio que los rodea y está a su vez es causada por el cambio en la conformación molecular.

La espectrofotometría es una de las técnicas analíticas más valiosas para los bioquimicos. los espectros desconocidos pueden ser identificados por su espectro de absorción característico en el ultravioleta. Las concentraciones de compuestos conocidos en disolución, pueden determinarse midiendo la absorción de la luz a una Ó más longitudes de onda.

Así un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para medir la cantidad de luz de una muestra. Los componentes esenciales de un espectrofotómetro son: una fuente de luz, un colimador o mecanismo de enfoque que transmite un intenso haz de rayos paralelos de luz, un monocromador (prisma o red) que separa las logitudes de onda que componen el rayo de luz, un mecanismo para seleccionar la longitud de onda deseada, un compartimento en el que se coloca la muestra, un detector fotoeléctrico y un registrador eléctrico que mide la salida del detector.

Ley de Lamber-Beer. La fracción de la luz incidente que es absorbida por una disolución depende del espesor de la muestra, de la Concentración del compuesto absorbente en la disolución y de la naturaleza química del compuesto absorbente. La absorción de la luz sigue tanto una ley exponencial como otra lineal . Las relaciones entre concentración, longitud de la trayectoria luminosa, y la luz absorbida por una sustancia determinada, se expresa matemáticamente como:

A = amcl donde

A es absorbancia

am es el coeficiente de absorción molar

c es la concentración de la solución y,

I es el espesor de la muestra por lo general es de 1 cm.

es así como podemos determinar la concentración de una solución espectrofotométricamente.

2.2.1 Mediciones de actividad enzimática

La actividad enzimática es la función correspondiente que lleva a cabo cada una de las enzimas, y es afectada por una serie de factores externos e internos que pueden ser físicos, químicos y biológicos: temperatura, pH, concentración del sustrato, de la enzima, de los inhibidores, etc; basado en esto, como primer punto, el trabajo se comenzó haciendo diversas mediciones de actividad enzimática, a condiciones donde se modificaban una o varias variables, buscando así la condiciones mas favorable para que nuestra enzima llegará a un buen grado de reversibilidad termodinámica.

Anteriormente se comentó la característica que tiene la papaina al realizar su función proteolítica, donde se desprende de una pequeña parte de su estructura para activarse, esta parte se cree estabiliza la estructura nativa, lo que en una situación normal impide volver a la enzima a su estado nativo, pues ya carece de su estructura original, es por esto que en este trabajo se hace uso del trifluoroetanol, etanol y metanol, reactivos comúnmente utilizados para estabilizar cierto tipo de estructuras secundarias, en este caso se cree que estos pueden crear puentes de hidrógeno entre las hélices separadas.

2.2.2 Espectrocopía Ultravioleta

La luz de longitud de onda entre unos 4000 A 7500 A es visible. Justo más allá del extremo violeta del espectro visible se encuentra la región ultravioleta.

Los espectrómetros ultravioleta de uso común miden la absorción de la luz en la región visible y ultravioleta <<cercana>> , es decir, en el rango de 200-750 mp. Esta luz es de frecuencia más elevada (y de mayor energía) que la infrarroja y, cuando es absorbida por una molécula, naturalmente, produce cambios que requieren más energía: cambios en estados eiectróni~os(~).

Esta técnica aplicada al campo de la bioquímica, detecta el cambio de la conformación molecular basándose en variaciones de los niveles de energía de algunos cromóforos que en la región ultravioleta son los grupos aromáticos de las cadenas laterales de tirosina, triptofano y fenilalanina.

Para la determinación espectrofotométrica por UV-Vis de concentraciones de una solución conocida, se hace uso de la ley de Beer antes mencionada.

2.2.3 Espectrofluorómetro

Muchos compuestos absorben luz e inmediatamente remiten algo de su energía en forma de luz de una longitud de onda mayor. Este fenómeno de fluorescencia puede ser utilizado mediante un instrumento llamado fluorómetro para medir muy bajas concentraciones de ciertos compuestos. Un fluorómetro se diferencía de un espectrofotómetro en que (a) la luz fluorescente emitida es observada con un ángulo de 90" respecto a la luz incidente y (b) se necesitan dos selectores de longitud de onda, uno para transmitir la h de excitación deseada y el otro para seleccionar la h de emisión

deseada. Generalmente se utilizan filtros (sencillos o combinados) para seleccionar las longitudes de onda deseadas.

La fluorometría puede ser sumamente selectiva, ya que sólo ciertas longitudes de onda excitarán a un compuesto dado. Análogamente, la fluorescencia sólo aparecerá a ciertas longitudes de onda. En otras palabras, los compuestos fluorescentes tienen un espectro de excitación característico y un espectro de fluorescencia característico. Dos compuestos con espectro de excitación y/o espectro de fluorescencia suficientemente diferentes pueden ser determinados uno en presencia de otro. Un compuesto no fluorescente puede ser a menudo química o enzimáticamente convertido en otro fluorescente.

A bajas concentraciones de un compuesto fluorescente la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentración. Así, la intensidad de fluorescencia es análoga a la absorbancia en espectrofotometría (parámetro lineal) no a la transmitancia (parámetro iogarítmico).@’

La magnitud de la señal de fluorescencia depende del voltaje del fotomultiplicador; podemos obtener dos tipos de espectros, de emisión y de excitación. Para el espectro de excitación, mantenemos la longitud de onda de emisión constante,

usualmente al máximo de fluorescencia, y entonces comenzamos a tomar el espectro, repetimos el experimento con buffer y lo restamos al espectro de proteína. El espectro de excitación en la región de 240-300 nm podría parecerse al espectro de absorbancia del respectivo fluoróforo ( solo triptofano, o la suma de tirosina y triptofano, dependiendo de la longitud de onda de emisión).

Para el espectro de emisión, los siguientes criterios son relevantes para una buena selección de la longitud de onda de emisión, Si una máxima intensidad y una excitación de tirosina y triptofano son convenidos, puede ser usada la excitación máxima alrededor de los 280 nm. En el caso de una alta absorbancia, longitudes de onda lejanas del máximo pueden ser usadas, donde la absorbancia es baja. Para mediciones selectivas de emisiones de triptofano, las longitudes de onda de excitación pueden ser mayores que 295 nm. Así el espectro de buffer podría ser tomado bajo las mismas condiciones instrumentales y ser restado del espectro de proteína. (7)

3 DESARROLLO DEL PROYECTO

3.1 Equipo utilizado

Photon counting Spectrofluorometer PC1 ISS UV 160U, UV-Visible recording spectrophotometer, Shimadzu. pHmetro, pH/ion analizer 350, Corning

3.2 Etapas de realización

Este trabajo se dividió principalmente en dos partes, la primera fue el estudio de la actividad enzimática de la papaína a distintas condiciones de temperatura, concentración y pH, en la segunda parte se realizó un estudio utilizando la técnica espectroscópica de f I u o rome t r ía .

3.2.1 Medición de la actividad enzimatica

La guanidina es uno de los agentes desnaturalizantes, más utilizados en proteínas. Puesto que a temperatura ambiente puede no actúar eficazmente, se utilizan concentraciones muy grandes para asegurar una buena desnaturalización de nuestra proteína; al inicio se realizan pruebas de desnaturalización a varias concentraciones de guanidina, para encontrar la más Óptima para que nuestra enzima se desnaturalice completamente, en este último estado, ya podremos determinar el grado de reversibilidad de la desnaturalización con ayuda de la estabilización que nos pueda proporcionar el tfe.

En este estudio se utilizó a una concentración de 8M -para asegurar una desnaturalización completa-, en muestras de papaína 0.01 M en solución reguladora de acetatos 0.1 mg/mI pH 5 con una concentración 0.001M de una sal de Mercurio (para evitar la autoprotólisis), se coloco un volúmen fijo de guanidina y volúmenes variables de proteína, aforando con regulador cada una de las muestras a un volúmen final igual en todas las muestras, se dejarón incubar durante 24 hrs, para posteriormente medir la concentración final de proteína desnaturalizada espectrométricamente a una absorbancia de 280nm. Los resultados obtenidos mostrarón un mejor desnaturalización a una concentración de guanidina de 2M. Posteriormente se realizarón los experimentos con la proteína y el trifluoroetanol (tfe), a concentraciones de O M como testigo y 2M de guanidina, y 1 O, 15 y 20% de tfe los pasos del experimento fuerón los siguientes:

1 .- Se preparó una solución de papaína, con absorbancia de 1 .O0 a 280nm

2.- Se coloco a varias muestras cantidades iguales de proteína y guanidina (8M), y se preparó un testigo a los mismos volúmenes de proteína, pero regulador en lugar de guanidina, se dejarón reposar bien cerradas y en refrigeración, durante un día, para asegurar su desnaturalización completa,

3.- AI segundo día se diluyerón al mismo volúmen con tfe y regulador de tal modo que obtuvimos soluciones con 1 O, 15 y 20% de tfe, y dejando nuestros testigos de guanidina y tfe con solo regulador a los mismos volúmenes, esperamos un día,

4.- AI día siguiente medimos la cantidad de proteína que regreso al estado nativo, midiendo la absorbancia en el UV-Vis, restando los testigos.

Posteriormente se realizó un experimento, utilizando otra de las formas de desnaturalización de proteínas, las temperaturas altas, teniendo cuidado de no llegar a la temperatura de descomposición total de la proteína pues resultaría Prácticamente imposible a cualquier condición regresarla a su naturaleza nativa.

Los pasos de este experimento fuerón :

1 .- Se preparó un baño a una temperatura de 80°C, en el que colocarón durante 5 min. las muestras que contenían solución de proteína 0.125 mg/ml, con 20% tfe y otra testigo sin tfe, a parte de una solución testigo que no se calento, posteriormente se dejan enfriar las muestras durante una hora,

2.- se prepara otro baño a una temperatura de 35OC, y una solución activadora con 0.01 de cisteína y 0.001 de EDTA en regulador de pH 7,

3.- colocamos en tubos de ensaye 0.25 ml de'enzima y 0.25 ml de solución activadora en el baño de 35C durante 5 min.,

4.- pasado este tiempo adicionamos a cada una de los tubos Iml de caseína, en los testigos adicionamos antes de esta 3ml. de TCA ( tricloroacético), esperamos 1 O min. Y agregamos TCA a las demás muestras,

5.- centrifugamos las muestras a 500 r.p.m. durante 5 min., cuantas veces sea necesario, para que no se tenga sobrenadante visible en los tubos,

6.- medimos por UV-Vis la absorción de la proteína que quedo en la solución transparente de los tubos

7.- repetimos cada uno de los pasos pero variando las condiciones de pH y tem pe ratu ras,

En el capítulo de resultados se puede observar una tabla con los resultados de este experimento a distintas condiciones.

3.2.2 Fluorescencia

El siguiente paso fué realizar experimentos ayudándonos de un aparato más sensible a los cambios de conformación de las proteínas como lo es el espectrofotómetro, este mide el cambio que se da en los fluoróforos que en las proteínas están representados por los aminoácidos tirosina y triptofano, un espectro de fluorescencia antes y después

de un proceso de desnaturalización no es el mismo, la intensidad va disminuyendo al desplegarse la proteína, lo que nos muestra el grado de desplegamiento de la enzima. Las mediciones en el aparato las tomamos utilizando rejillas de un ancho del #2, una

emisión de =280nm y excitación de = 400 nm y 10 amperes de corriente, y utilizando para las muestras celdas de cuarzo, dado que necesitamos soluciones muy diluidas, utilizamos enzima a concentración de 1 O pg/ml es decir con una absorción de 0.025.

Los experimentos realizado en esta parte fuerón de dos tipos, el primero se describirá a continuación:

Cinética lenta 1 .- Tomamos el espectro de la solución de papaína y a partir de ahí obtenemos la mejor longitud de onda para realizar la cinética lenta (que fue 313.5), también sacamos el espectro del buffer,

2.- agregamos a la celda un volúmen medido de papaína y le comenzamos a tomar un espectro de cinética lenta de 3 y media horas, tomando el tiempo y elevando poco a poco la temperatura hasta casi 80 Co mediante un recirculador,

3.- una vez llegada a esta temperatura se vuelve a disminuir lo más pronto posible hasta la temperatura inicial o ambiente,

4.- tomamos el espectro final,

5.- realizamos los mismos pasos para otros experimentos, pero agregando diferentes porcentajes de tfe, etanol y metanol -en volúmen-, en el momento que se comience a bajar la temperatura.

Este experimento se reemplazó por el siguiente debido a las grandes diferencias que se encontrarón entre espectros de iguales características y que se debían principalmente a la dificultad que se encontró al elevar y disminuir la temperatura en forma constante .

Para el segundo experimento se realizó un calentamiento y enfriamiento parejo para todas las muestras, el procedimiento se describe a continuación:

1 .- En varios frascos se coloca el mismo volúmen de enzima, y se calientan a baño maría hasta una temperatura de 39OC,

2.-una vez en esta temperatura se les agrega un volúmen igual pero de diferentes concentraciones de tfe, etanol o metanol y una testigo, colocándose inmediatamente en un baño a temperatura ambiente,

3.- se dejan las muestras por espacio de 20 min. Ó más , y se toma el espectro de cada una.

Los espectros de estos experimentos se pueden observar al final.

4 RESULTADOS

4.1 Resultados, conclusiones y perspectivas

La enzima de estudio a condiciones fisiológicas lleva a cabo una función cuyo proceso es irreversible, debido al desprendimiento de la pro-papaína; energéticamente el proceso es de la siguiente forma: se proporciona energía a las moléculas, las cuales logran pasar la barrera de energía llegando a un estado de menor energía (estado metaestable), pero tan profundo que resulta casi imposible el regreso (fig. 4.la). AI realizar modificaciones en las condiciones del proceso de desnaturalización como lo son pH experimental de 5 , adición de un alcohol estabilizador de la estructura, a concentraciones de 15% y 20% en volúmen, se logro obtener un buen porcentaje de reversibilidad en la enzima desplegada, lo que energéticamente se traduciría como una disminución de la barrera energética (fig. 4.1 b); estos resultados fueron obtenidos en ambas técnicas, en forma cualitativa principalmente, siempre tomando en cuenta que los resultados estuvieran fuera del margen de error del aparato utilizado, en los diversos experimentos se pudo constatar que el alcohol que menos estabilizó estructura fué el metanol, en el método espectrofluorométrico el tfe y etanol mostrarón una capacidad estabilizadora semejante, aunque estos resultados por ser cualitativos no se pueden confirmar con certeza en las mediciones de actividad enzimática por las incertidumbres tan grandes que se pueden dar pero se encontró que el etanol fue mejor estabilizador que el tfe.

A continuación podemos ver los resultados obtenidos en los primeros experimentos de actividad enzimática, utilizando calentamiento para desplegar la enzima:

Resultados de reversibilidad del desplegamiento de papaína utilizando tfe

pH de desplegamiento T de desplegamiento ( "C ) t de desplegamiento ( min.) T de actividad ( "C ) pH de actividad ABSORBANCIAS testigo chalent. 1 skalent. 2 skalent. Testigo chalent. 1 dcalent. 2 c/calent. Testigo tfe 20% 1 tfe 20% 2 tfe 20% testigo tfe 15% 1 tfe 15% 2 tfe 15% testigo 25% 1 tfe 25% 2 tfe 25%

5 85 5 35 7

0.105 0.306 0.321 0.1 33 0.1 30 0.123 0.1 17 0.1 26 0.1 08

X X X

X X X

5 80 5 35 7

0.098 0.038 0.039 0.090 0.123 0.121 0.095 0.093 0.094

X X X X

X X

3 70 2 40 7

0.084 0.334 0.322 0.099 0.332 0.441 0.076 0.086 0.092 X X X X

X X

3 75 7

35 7

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Esta última tabla no nos muestra un buen resultado, y esto se debe a los altos grados de incertidumbre que se tiene en este experimento, por lo que se recurrió a experimentos más sensibles y precisos.

Para los experimentos realizados utilizando el espectrofluorómetro, se muestran al final algunos de los gráficos que contienen los espectros de soluciones de papaina O.ipM, a diferentes concentraciones de metanol, tfe y etanol y que son representativos de la serie de experimentos que se realizarón, puesto que cualitativamente nos muestran mejor la tendencia general.

La interpretación los espectros obtenidos es la siguiente:

La intensidad nos da una medida del cambio conformacional que se produce en el proceso de desplegamiento de la enzima, es por esto que al medir el espectro de la solución en estado nativo tenemos una intensidad notablemente mayor a la del estado desplegado, al variar las condiciones, agregando el alcohol a la solución desplegada, se nota un aumento gradual en la intensidad proporcional a la concentración de solución estabilizadora agregada sin sobrepasar la intensidad del estado nativo, que se considera la máxima intensidad en el proceso (fig. 4.1).

Estos experimentos nos mostrarón condiciones a las cuales la enzima tiene un cierto grado de reversibilidad, y como es que la parte pro de la enzima juega un papel importante manteniendo la estructura nativa a plegada hasta que es requerida su función biológica in vivo, pero las perspectivas son aún mas, hay todavía mucha información que se puede obtener respecto a la conformación de la papaína, el dicroísmo circular es una buena técnica que puede mejorar las condiciones aquí obtenidas, así podremos estar aún más cerca de descifrar el gran secreto biológico de las proteínas, el código de doblado.

AVANCE DELA R E A C C I ~ N

Fig. 4.1 Energía de activaci6n de la papaína, a) en condiciones biológicas, b) condiciones de pH 5 y 20% de etand

4.1.1 Comentarios

Un factor que tuvo gran importancia fue el pH de la solución pues se encontró favorecido un medio ácido (pH 5 ) , en una solución cuyo pH fué menor la papaína no se disolvió, y a pH's mayores la actividad disminuyó.

La concentración de la papaína se midió haciendo uso del UV-Vis,el coeficiente de extinción para la papaína se conoce (25.0 a 278nm para 10 pgr./ml) a partir del cual se hace una relación con la fórmula de Beer y obtenemos la longitud de onda a la cual se tiene dicha concentración, el uso de este aparato es indispensable si se desea obtener precisión en las mediciones pues las concentraciones requeridas a lo largo del estudio son muy pequeñas.

El voltaje en el espectrofluorómetro se utilizó a 10 volts, el mínimo requerido por el aparato, algunas pruebas que se realizarón a 15 volts mostrarón como la enzima se agregaba a las paredes de la celda en el preciso lugar por donde pasaba el haz.

Durante el experimento muchos factores pueden influir para que la enzima se inactiva, como lo son la autólisis, las temperaturas muy altas, la agregación, los extremos de pH, el calor, agentes desnaturalizantes entre otros, en los experimentos efectuados se tuvo cuidado de evitar la inactivación de la papaína.

El uso de una sal de mercurio en el buffer (utilizado en todas las preparaciones) , evita que la enzima en el estado desplegado se degrade así misma (autólisis), el Hg crea una especie de inactivación de la actividad proteolitica de la enzima.

Mediante pruebas se busco la temperatura a la cuál la enzima se inactiva totalmente, y durante los experimentos se tuvo un control cuidadoso de esta.

Para evitar la inactivación de la solución de papaína, se preparaba el mismo día en que se realizaría el experimento, en los casos en que la solución era requerida al otro día se dejaba correctamente tapada dentro del refrigerador.

En los casos en que se debía pesar un reactivo o la papaína se utilizó una espátula de plástico o madera para evitar cualquier tipo de reacción oxidativa.

Las soluciones reguladoras fuerón preparadas con agua desionizada, y el material utilizado también se enjuagó con esta agua.

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