UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN ALTIPLANO

OESTE

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE

INGENIERO AGROINDUSTRIAL

Efecto antimicrobiano de chilcuague (Heliopsis longipes) sobre

Staphylococcus aureus, Escheriquia coli, Staphylococcus faecalis y

Klebsiella pneumonae

PRESENTA:

GLENN ESAÚ LEGASPI RAMOS

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA

ASESORES:

Dr. GREGORIO ÁLVAREZ FUENTES

Dr. JUAN ÁNGEL MORALES RUEDA

NOVIEMBRE 2018

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN ALTIPLANO

OESTE

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE

INGENIERO AGROINDUSTRIAL

Efecto antimicrobiano de chilcuague (Heliopsis longipes) sobre

Staphylococcus aureus, Escheriquia coli, Staphylococcus faecalis y

Klebsiella pneumonae

PRESENTA:

GLENN ESAÚ LEGASPI RAMOS

SINODALES:

PRESIDENTE: DR. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA ______________________

SECRETARIO: DR. GREGORIO ÁLVAREZ FUENTES ______________________

VOCAL: DR. JUAN ÁNGEL MORALES RUEDA ______________________

Agradecimientos

A mi padre Oscar Ociel Legaspi Balderas por todo el apoyo, paciencia y

confianza que tuvo hacia mí para lograr terminar mi carrera, así mismo, a mi

madre y hermanos que me dieron su apoyo cuando lo necesite. Al Dr. Juan

Antonio Rendón Huerta por todas las enseñanzas profesionales y personales,

así como la oportunidad y confianza que me dio para realizar mí trabajo de

investigación, al Dr. Juan Ángel Morales Rueda por sus consejos y su confianza.

A mis compañeros de generación de Ing. Agroindustrial por sus consejos y

todos los momentos que compartimos juntos. A mis amigos que siempre

estuvieron presentes, y a todos los profesores que formaron parte de mi

formación profesional.

Dedicatoria

Esta tesis es dedicada a mis padres Oscar Ociel Legaspi Balderas e Hilda Ramos

Sánchez por todo el apoyo y sacrificio que han realizado para poder terminar

mi carrera profesional, así como a mis hermanos Oscar Manuel Legaspi Ramos

y Karen Nohemí Legaspi Ramos que cuando necesite de su apoyo me lo

brindaron.

ÍNDICE

- 1.0 INTRODUCCIÓN 7

- 2.0 ANTECEDENTES

- 2.1 IMPORTANCIA DE LA PRODUCCIÓN LECHERA

- 2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS DE GANADO LECHERO

- 2.2.1 SISTEMA INTENSIVO

- 2.2.2 SISTEMA EXTENSIVO

-2.2.3 DOBLE PROPÓSITO

-2.2.3 FAMILIAR

- 2.3 DEMANDA DE LECHE A NIVEL NACIONAL

- 2.4 INDUSTRIA LACTEA

- 2.5 IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA INDUSTRIA LACTEA

- 2.6 ESTÁNDARES DE CALIDAD DE LECHE CRUDA DE

ACUERDO A LAS NORMAS OFICIALES MEXICANAS

9

11

12

13

14

16

17

18

- 3.0 PRINCIPALES ENFERMEDADES EN GANADO LECHERO

DEBIDO A MICROORGANISMOS PATÓGENOS

- 3.1 MASTITIS

- 3.1.1 MASTITIS SUBCLINICA

- 3.1.2 MASTITIS CLINICA

- 3.2 SINTOMAS

- 3.3 CICLO DE ENFERMEDAD

19

20

21

22

- 4.0 ETIOLOGÍA MICROBIANA

- 4.1 CÉLULAS SOMÁTICAS

- 4.2 Staphylococcus aureus

- 4.3 Streptococcus agalactiae

- 4.4 Escherichia coli

- 4.5 Klebsiella pneumoniae

- 4.6 EFECTOS NEGATIVOS EN LA PRODUCCIÓN EN VACAS

INFECTADAS CON MASTITIS

- 4.7 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA MASTITIS BOVINA

- 4.7.1 OBSERVACIÓN Y PALPACIÓN DE LA UBRE

23

24

25

26

28

29

30

- 4.7.2 PRUEBAS FÍSICAS

- 4.7.2.1 PRUEBA DEL PAÑO NEGRO

- 4.7.2.2 PRUEBA DE LA TASA PROBADORA

- 4.7.3 PRUEBAS QUÍMICAS

- 4.7.3.1 PRUEBA DE CALIFORNIA PARA MASTITIS (CMT)

- 4.8 CONTROL DE LA MASTITIS

- 4.9 PLANTAS MEDICINALES CON POTENCIAL

ANTIMICROBIANO PARA EL CONTROL DE LA MASTITIS

BOVINA

31

32

34

- 5.0 DESCRIPCIÓN DE BOTÁNICA DEL CHILCUAGUE (Heliopsis

longipes)

35

- 6.0 JUSTIFICACIÓN 37

- 7.0 OBJETIVO 38

- 8.0 MATERIALES Y MÉTODOS

- 9.0 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 40

- 10.0 RESULTADOS 41

- 11.0 DISCUSIÓN

- 12.0 CONCLUSIONES

- 13.0 REFERENCIAS

45

51

52

7

1.0 INTRODUCCION

La ocurrencia de enfermedades en los bovinos dentro de la industria alimentaria

representa uno de los problemas que impactan negativamente a todos los sistemas

de producción, especialmente a los de nivel intensivo y semi-intensivo. La

enfermedad más común en los hatos lecheros es la mastitis que generalmente se

presenta en la época de lluvias en distintas regiones y es de mayor importancia

económica debido a las pérdidas por disminución en la producción y calidad de la

leche, aunado a esto, los tratamientos son costosos (Keefe, 1997). La mastitis

bovina es una inflamación de la glándula mamaria que se produce en respuesta a

una lesión o infección en la glándula mamaria, Las infecciones se deben a los

siguientes microorganismos que invaden la glándula mamaria en especial bacterias

como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, S.

dysgalactiae, S. uberis, Arcanobacterium pyogenes, Klebsiella pneumonae,

mycoplasmas y levaduras (Early, 2000; Marco-Leal, 2015). Las pérdidas de leche

por mastitis en los hatos lecheros presentan una disminución en la calidad, así como

un descenso en la producción que va del 4% hasta el 30% (Bedolla y Ponce de

León, 2008).

Existen diversos tratamientos para la prevención y control de mastitis que

generalmente son a base de antibióticos y sulfas. La herbolaria tradicional en

México tiene una gama de más de 4,500 especies vegetales consideradas como

medicinales, que son utilizados para tratar algunos padecimientos de diversa índole

(Barragán, 2006). Los metabolitos secundarios de estas plantas es lo que permite

utilizarlas como alternativa a los medicamentos debido al efecto sobre algunos

8

microorganismos, entre las especies más utilizadas encontramos, árnica

(Heterotheca inuloides cass.), cuachalalate (Amphipterygium adstringens), tila (Tilia

mexicana), gordolobo (Gnaphalium sp.), salvia (Salvia officinalis), cola de caballo

(Equisetum robustum) y boldo (Peumus boldus) (Huerta, 1997; García de Alba et

al., 2012). En un trabajo realizado por Márquez et al. (2003) hace mención de una

recopilación de 2 fuentes naturales (plantas y microorganismos) de los cuales se

aislaron metabolitos secundarios, siendo los compuestos bioactivos los que han

demostrado tener un efecto inhibitorio en algunos microorganismos. Por otro lado,

la planta conocida por su nombre común como chilcuague (Heliopsis longipes) es

considerada en la herbolaria tradicional como una planta con efectos medicinales,

es una hierba perenne endémica de la región conformada por porciones de la Sierra

de Álvarez y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los Estados de San Luis

Potosí, Guanajuato y Querétaro (Cilia-López et al., 2008). La planta del chilcuague

presenta una actividad importante como insecticida (Fisher, 1957). Esta planta tiene

un compuesto activo llamado afinina el cual se ha probado su efecto analgésico

sobre el sistema nervioso, así como el efecto antifúngico y antibacteriano (Ramírez

et al., 2000, Cilia-López et al., 2010). El objetivo de este ensayo fue estudiar el efecto

inhibitorio del extracto acuoso y etanólico de chilcuague sobre cuatro bacterias

(Staphylococcus aureus, Staphylococcus faecalis, Klebsiella pneumonae y

Escheriquia coli) que están asociadas a la enfermedad de mastitis en mamíferos

rumiantes de interés pecuario como bovinos, caprinos y ovinos.

9

2.0 ANTECEDENTES

2.1 Importancia de la producción lechera

La introducción de la ganadería en México y en específico la del ganado lechero,

comenzó en el siglo XVI con la llegada de los españoles durante el periodo de la

conquista, cuando se construyeron las primeras haciendas destinadas para la

producción de carne y leche pare el consumo interno (SAGARPA, 1990).

Desde esa época y hasta principios de los años noventa se han venido

introduciendo distintas razas de bovinos, caprinos y ovinos productores de leche.

En la década de los 90, México dio un incremento en producción de leche con una

tasa media anual del 1.3%, el cual lo posicionó en el lugar dieciséis en la producción

mundial de lácteo con un 3% del total. Sin embargo, en la producción interna del

país contribuye con el 80% del consumo nacional, por lo que México aún no

satisface la demanda nacional, lo cual lo posiciona como el primer lugar mundial en

importaciones de leche en polvo con un 9% de las importaciones globales (Loera y

Banda, 2017).

En el año 2017, la leche de vaca fue considerada como el tercer producto pecuario

en importancia económica, con el 17.22% del valor nacional, sólo por detrás de la

carne de bovino (30%) y la carne de ave (23%); esta actividad genera más de 200

mil empleos directos, permanentes y remunerados (INFORURAL, 2018). De

acuerdo con la información recopilada por SIAP-SAGARPA (2018a) durante el

periodo de 2008-2017 se han registrado incrementos constantes en la producción

de leche de bovino del 11.5% mientras que la leche de cabra tuvo un decremento

10

en la producción de 2008 al 2013, posteriormente en ese año se volvió a

incrementar, tal como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Producción nacional de leche de bovino y caprino entre 2008 y 2017(SIAP

2018a).

No obstante, la producción de leche en México aún se encuentra por debajo de la

demanda nacional, por lo que a corto plazo no se visualiza la autosuficiencia de

leche en el país (Mellado-Bosque, 2010).

Los sistemas de producción que son utilizados para las explotaciones lecheras

varían según su tecnificación. Por un lado, se tienen explotaciones intensivas con

instalaciones, manejo y producciones similares a las encontradas en países

desarrollados. Y, por otro lado, se encuentran las explotaciones pequeñas y rusticas

con bajos niveles de producción de leche debido a la carencia de infraestructura

(Mellado-Bosque, 2010).

145,000

150,000

155,000

160,000

165,000

170,000

9,800,000

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11,200,000

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2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

Pro

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Pro

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ovin

o

Años

Leche Bovino

Leche Caprino

11

2.2 Sistemas de producción de leche en México

Los sistemas de producción de leche bovina se definen como un conjunto de

manejos y prácticas agropecuarias interrelacionadas entre sí, tales como el manejo

de los animales en pastoreo, los programas de sanidad de las vacas, además de

otros factores y variables como lo es el tipo de suelo, la producción de alimentos

para la formulación de las dietas, la tecnificación, mano de obra, la pureza de la raza

que conforma el hato, maquinaria, inclusión de concentrados en la dieta que,

ordenados de una manera organizada en un proceso productivo pueden determinar

la producción y eficacia del establo lechero (Smith., 1999). Los sistemas productivos

se dividen en intensivo, semi-intensivo, doble propósito y familiar. Los que más

aportan a la producción nacional son el intensivo con el 50.6% y el semi-intensivo

con el 21.3%, mientras que el doble propósito y el familiar aportan el 18.3% y 9.8%

respectivamente (SIAP, 2011; Loera y Banda, 2017).

2.2.1 Sistema intensivo

Los sistemas intensivos actuales se crearon con base en una copia del modelo

Holstein Americano, que se enfoca principalmente en aumentar la productividad de

todos los recursos que han invertido, es por esto y por los altos costos unitarios que

requieren grandes volúmenes de producción y tener altos precios para generar

utilidades. Principalmente se utiliza ganado muy productivo como la raza Holstein

que tiene una producción promedio 7-9 mil litros/vaca/año, las vacas se mantienen

con instalaciones especializadas y procesos mecanizados sobre todo en la ordeña

(Ortíz-Salazar et al, 2005). La alimentación es basada en forraje de alta calidad

como son el ensilaje de maíz y sorgo, heno de alfalfa, avena y cebada, así como

12

grandes cantidades de concentrados. En la mayor parte de estos sistemas se utiliza

la inseminación artificial y se tienen programas de sanidad y vacunación. La leche

que se produce se destina sobre todo a plantas pasteurizadoras o transformadoras,

la mitad de la leche producida en el país proviene de estos sistemas, además de

toda leche que se pasteuriza, este sistema contribuye con el 80% (Loera y Banda,

2017). Cabe señalar que los estados donde se concentran estos sistemas son:

Durango, Coahuila, Guanajuato, Jalisco, Aguascalientes, Chihuahua, México, San

Luis Potosí, Hidalgo, Querétaro y Baja California (Mellado-Bosque, 2010).

2.2.2 Sistema extensivo

Los sistemas extensivos se basan principalmente en la utilización de especies

ganaderas capaces de aprovechar los recursos naturales para su alimentación por

medio de pastoreo en agostaderos extensos (Martin-Bellido, 2001).

De acuerdo con Boyazoglu (1998) estos sistemas comparten tradicionalmente

varias características comunes como lo son: número limitado de animales por

unidad de producción, deficientes avances tecnológicos, baja productividad por

animal, alimentación basada principalmente por pastoreo natural, entre otras.

Este sistema tiene como característica que los animales los tiene en condiciones de

semiestabulación que se desarrollan en pequeñas extensiones de terreno, la ordeña

puede ser manual o mecanizada, así como mantienen un nivel medio de tecnología

y en ocasiones cuentan con algunos sistemas de enfriamiento (INFORURAL, 2012).

13

2.2.3 Doble propósito

Son aquellos dedicados a la producción simultánea de leche y carne. Son

caracterizados por la predominación del tipo de ganado que suele ser una cruza de

Suizo con Cebú o Criollo; es alimentado en forma extensiva con base en plantas

nativas o pastos cultivados, suministrándole ocasionalmente suplementos

alimenticios y la mayoría de los productores realizan la ordeña manual, así como

también carecen de sistemas de refrigeración, recursos sanitarios y tecnológicos

(Pech-Martínez et al., 2007).

2.2.4 Familiar

Este tipo de sistema se caracteriza por ser explotaciones pequeñas, en el fluctúan

animales entre 3 y 40 vacas que se encuentran dentro de terrenos familiares y su

manejo es realizado por la familia. La alimentación de las vacas se basa

principalmente en esquilmos de la agricultura (rastrojo de maíz, avena, sorgo y

trigo), residuos de hortalizas y, en las zonas áridas el nopal. Los animales de este

sistema son normalmente vacas Holstein de bajo potencial genético, las cuales

presentan producciones de 2500 litros de leche por lactancia, además de no contar

con tecnificación. En general la leche que se produce bajo este sistema se vende

como leche “bronca” o se destina para la producción de queso fresco. Los

principales estados donde se desarrollan estos sistemas de producción son Jalisco,

Michoacán, Distrito Federal, Hidalgo, Durango, Zacatecas, Aguascalientes,

Chihuahua, Coahuila y Nuevo León (Mellado-Bosque, 2010).

14

2.3 Demanda de leche a nivel nacional

En México, la producción lechera se desarrolla en todo su territorio, pero durante el

periodo de 2008 a 2017 se concentró en cuatro estados, los que contribuyeron

juntamente con el 48 hasta 50% de la producción nacional. En este período se

destacan Jalisco, Coahuila, Durango y Chihuahua, en orden de mayor a menor

(SIAP, 2018b). Si bien existen desde los ranchos más grandes y tecnificados y

modernos (la laguna, y algunas granjas de gran tecnificación que se encuentran en

los estados de Baja California, Querétaro e Hidalgo, algunos con más de 2 mil 500

vacas en producción) hasta ranchos con menor tecnificación como los que se

encuentran en el estado de Jalisco cuyas ganancias se basan en el número de

animales que tienen y no en términos de producción. Existen muchas razas de

bovino con destino a producción de leche en el mundo. En México las de mayor

arraigo son: Holstein Freisian, Jersey y algunas otras razas como lo son: Pardo

Suiza Americana, Airshire, Guernsey, entre otras.

15

Figura 2. Comparación de la producción de leche contrastando los estados más

productivos (Jalisco, Coahuila, Durango y Chihuahua) con la producción Nacional

(SIAP, 2018b).

Sin embargo, las importaciones de otros países se han incrementado en un 43.6%.

Por otro lado, las exportaciones tuvieron una tendencia de disminuir entre 2013 y

2014, en el 2015 se volvieron a incrementar (cuadro 1), en cuanto al consumo

aparente y per cápita sus valores tienen una tendencia a subir siendo los datos más

altos, los registrados en el año 2015 (SIAP, 2016).

No obstante, al primer trimestre del año 2018 la producción de leche bovina alcanzó

2 mil 807 millones de litro de leche lo cual indica un crecimiento de 1.8% en

comparación con el año 2017, de los estados que presentaron un incremento en su

producción se encuentran Puebla (6.7%), Jalisco (6.6%), Chihuahua (3.9%) y

Chiapas (3.9%), en contraste, con una disminución con su producción se

encuentran los estados de México (3.5%), Coahuila (0.8%) y Durango (0.4%). Para

0

2,000,000

4,000,000

6,000,000

8,000,000

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14,000,000

16,000,000

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

Pro

du

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n d

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e, m

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e litro

s

Años

Suma Estados Productores

Total Nacional

48.7% 48.0% 48.1% 48.4% 48.8% 49.2% 49.3% 50.1% 50.2% 50.5%

16

el cierre del año se tiene una expectativa de producción de leche de 12 mil 26

millones de litros, lo que significaría un incremento de 1.9% con respecto al año

2017. Desde el año 2010 se ha visto un incremento de producción de leche y para

el año 2018 se estima siga la tendencia de incremento (SIAP, 2018c).

Cuadro 1. Consumo aparente y per cápita de leche en México entre 2011 y 2015

Componente 2011 2012 2013 2014 2015 Promedio

2011-2015

Producción 10,724,288 10,880,870 10,955,632 11,129,622 11,394,663 11,019,015

Importaciones 2,067,224 2,196,573 2,400,000 2,426,000 2,970,000 2,411,959

Exportaciones 128,204 138,761 119,752 90,000 120,000 119,343

Consumo

aparente 12,663,309 12,938,682 13,245,880 13,465,622 14,244,663 13,311,631

Consumo per

cápita **/ 109.5 110.5 106.9 112.6 114.0 110.7

**/ La estimación del año de referencia, se calcula con base en la población a mitad de año.

2.4 Industria láctea

Los productos lácteos fueron uno de los consumos clave en el desarrollo de la

transición nutricional que pautó el cambio alimentario en occidente durante los siglos

XIX y XX. Una combinación de factores biológicos, tecnológicos, económicos y

culturales impidió que la leche fuera un componente importante de las dietas antes

de finales del siglo XIX, pero a partir de entonces tendió a convertirse en un bien de

consumo masivo (Collantes, 2013). El aumento en el consumo de productos lácteos

como son los quesos y los yogurts, así como las leches industrializadas:

pasteurizada, ultrapasteurizada y en polvo, ocupan los primeros lugares de

comercialización manifestando una tendencia hacia el abastecimiento de las zonas

17

urbanas, ya que estas poseen vías de comunicación accesibles y concentran grupos

con niveles de ingreso más altos (SE, 2012)

El complejo lácteo, es uno de los subsistemas agroalimentarios de mayor

complejidad productiva y tecnológica, a lo largo de todas las etapas que lo

conforman. En el procesamiento industrial, tanto en la producción de los diversos

tipos de leche fluida y en polvo, como en la de productos frescos y quesos son

importantes las tecnologías de proceso, de productos, de envases,

almacenamientos, logísticas, de distribución y de comercialización (Bisang et al.,

2000).

2.5 Importancia económica de la industria láctea

La productividad de la ganadería lechera como una de las principales actividades

primarias para la economía mexicana y su estrecha relación con la industrialización

y el comercio hacen de éste un tema de relevancia para la economía. Así mismo, la

industria láctea toma una importancia relevante en la producción de alimentos a

nivel mundial siendo el queso el producto más representativo. Durante el año 2007

se llegó a una producción de 14.5 millones de toneladas, sin embargo, ese mismo

año hizo una distinción de los principales productores. Los que destacan son la

Unión Europea con 6.9 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos con una

producción de 4.4 millones de toneladas, en contraste México aporta 0.15 millones

de toneladas (Cervantes et al., 2010).

En el año 2016 se cerró con una población de 2.48 millones de cabezas de ganado

lechero (FAOSTAT, 2017). En el 2016 se produjeron 11,608 millones de litros de

18

leche, lo cual supone un récord en la historia lechera de México. Como se mencionó

anteriormente, esta producción principalmente se divide en seis regiones del país

que concentran el 63.3% del total producido: Jalisco (19.2%), Coahuila (12.2%),

Durango (9.8%), Chihuahua (9.1%), Guanajuato (7.1%) y 6.1% en el estado de

Veracruz (Cesín et al, 2007). De acuerdo con cifras obtenidas por el SIAP hasta el

año del 2017, se tuvo un registro de 11.8 millones de litros de leche (SIAP, 2018a).

Sin embargo, existe una problemática debido a la pérdida económica ocasionada

por enfermedades principalmente la mastitis que es considerada la enfermedad

infecciosa más costosa de las vacas lecheras ya que ocasiona una baja de

producción de 4 a 30% de leche, así como la calidad de la leche disminuye, además

de tener un alto costo en el cuidado del hato lechero y su prevención (Bedolla y

Ponce de León, 2008). Este impacto económico varía dependiendo del país, la

estabilidad económica de cada empresa, médico veterinario, los tratamientos que

se les aplique, y la leche que es desechada por la contaminación por antibióticos,

entre otros factores (Kleinschroth, 1991).

2.6 Estándares de calidad de leche cruda de acuerdo a las Normas Oficiales

Mexicanas

Los sistemas de producción de leche y de derivados lácteos deben cumplir con

especificaciones de las Normas Oficiales Mexicanas en cuanto a calidad de leche,

especificaciones sanitarias y conteo de células somáticas (cuadro 2) esto con la

finalidad de garantizar el contenido de nutrientes, la baja o ausencia de

microorganismos patógenos, así como la baja conteo de células somáticas que

indican que la leche no proviene de animales enfermos ().

19

Cuadro 2. Límites máximos permitidos del contenido de microorganismos

patógenos y células somáticas.

Microorganismo Límite Máximo

permitido

Producto

*Staphylococcus

aureus

<10 UFC/g por

siembra directa

Leche, fórmula láctea y producto

lácteo combinado pasteurizado

*Escherichia coli < 3 NMP/g o mL Leche utilizada como materia prima

para la elaboración de quesos

**Células somáticas,

CCS/mL

Máx. 400,000 Leche cruda

* NOM-243-SSA1-2010

** NMX-F-706-COFOCALEC-2012

3.0 Principales enfermedades en ganado lechero debido a microorganismos

patógenos

3.1 Mastitis

Uno de los mayores problemas económicos y de sanidad a nivel industrial es la

presencia de enfermedades como la mastitis. La mastitis bovina es una inflamación

de la glándula mamaria que se produce en respuesta a una lesión o infección en el

tejido. Las lesiones suelen ser físicas, pero generalmente la infección se debe al

accionar de microorganismos que han invadido la glándula mamaria, en especial

bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae (Early, 2000).

Mientras que Marco-Leal (2015) define la mastitis como la inflamación de la glándula

mamaria que puede deberse a diversas etiologías, entre las que se encuentran

bacterias como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus

dysgalactiae, S. uberis, Arcanobacterium pyogenes, Klebsiella pneumonae,

20

mycoplasmas y levaduras. Esta enfermedad se caracteriza por la entrada de células

somáticas, principalmente neutrófilos polimorfonucleares (PMN) a la glándula

mamaria y por un aumento en el contenido de proteasa en la leche producida (Kerr

y Wellnitz, 2003).

3.1.1 Mastitis subclínica

La mastitis subclínica es difícil de corregir ya que la vaca parece saludable, así como

la ubre no muestra signos de inflamación (Figura 3), además la leche parece normal

sin tener cambios organolépticos (Valera et al., 2005). En el mismo sentido, Gallegos

y Moncada (2011) también mencionan que no se presentan cambios en la ubre y

leche, sin embargo, se presenta una reducción en el rendimiento de la leche siendo

afectada por componentes inflamatorios y bacterias. Pastor López et al. (2010)

señalan que en la región de la comarca lagunera la presencia de mastitis subclínica

es de 39.06 %, sin embargo, no hacen referencia a la época del año en que

realizaron el estudio. En otro estudio realizado por Wilson et al. (1997) menciona

una prevalencia de mastitis subclínica del 48.5% en Nueva York y Pennsilvania. Las

visitas a los hatos lecheros se realizaron en el periodo de enero y junio.

21

Figura 3. Anomalías en la ubre causada por la mastitis subclínica. (Imagen

tomada de https://saludpublicavet.wikispaces.com/La+mastitis+en+bovinos).

3.1.2 Mastitis clínica

Tollersrud et al. (2000) define la mastitis clínica como una anomalía en la ubre

mamaria o en la leche que puede ser fácilmente observable. Además de tener

características por presentarse de manera súbita. Se presenta enrojecimiento de la

ubre, inflamación, dolor, disminución de la producción y alteraciones en los cuartos

afectados. Por otro lado, Chebel et al. (2004) dice que la mastitis clínica es la

enfermedad más importante debido a que ocasiona grandes pérdidas económicas

debido a varios factores entre los que destacan la pérdida de producción y baja

calidad de leche, en algunos casos, el sacrificio de animales afectados.

3.2 Síntomas

La infección puede ser reconocida mediante el enrojecimiento de la ubre, dolor e

hinchazón (figura 4), además de anormalidades físicas en la leche, en algunos

22

casos se presentan síntomas con mayor complicación como dolores rectales,

anorexia, e incluso la muerte Heringstad et al., (2000). La mastitis clínica se puede

presentar de manera aguda y crónica. La forma aguda se caracteriza por presentar

anormalidades en la leche, dolores en la ubre y enrojecimiento (Djabri et al., 2002).

Mientras que la forma crónica se presentan cambios en el tejido al realizar la

palpación del tejido, así como una infección de larga duración con cambios

anormales en la leche (Schrick et al., 2001).

Figura 4. Identificación de mastitis por hinchazón de los cuartos (Imagen tomada

de https://www.icbf.com/wp/?page_id=2274)

3.3 Ciclo de enfermedad

Por lo regular esta enfermedad se contagia entre los ordeños, así como cuando el

animal se encuentra en estado de transición (3 semanas antes de parto a 4

semanas post-parto) siendo más difícil el control de esta misma (Corbellini., 2002).

De acuerdo con Azócar (2001) en estudios realizados en Santiago de Chile, Chile,

la incidencia de mastitis clínica es de 48.70 casos/100 animales/año, mostrando una

variación mensual de 0.75% a 10.61%, tendiendo a mostrar valores más elevados

23

en junio y julio. Los niveles más altos de incidencia se mostraron en invierno

(22.22%) primavera (14,41%) y finalmente en verano y otoño con un 6% de

incidencia. Uno de los microorganismos más infecciosos causantes de esta

enfermedad es Staphylococcus aureus, su relevancia radica en que no es un

patógeno obligado de la ubre por lo que se puede encontrar en lesiones de la ubre,

en las camas, en las manos de los ordeñadores, así como en los equipos de ordeño.

Debido a esto las prácticas de manejo en los hatos lecheros puede hacer que este

agente etiológico alcance el conducto del pezón y por lo tanto desencadenar una

reacción inflamatoria (Calderón y Rodríguez, 2008).

4.0 Etiología microbiana

Se han encontrado hasta 140 especies, subespecies y serovariedades microbianas

dentro de la glándula mamaria que son el factor causante de la infección. Estos

microorganismos se han dividido en patógenos contagiosos y ambientales. Dentro

de los patógenos contagiosos de mayor importancia se destaca el Staphylococcus

aureus, Streptococcus agalactiae, Corynobacterium spp, y Mycoplasma spp.

Mientras que los patógenos ambientales (destacan por su facilidad de transmisión

durante el proceso de ordeño) son bacilos entéricos gram-negativos (Escherichia

coli, Klebsiella spp), Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis y

Enterococcus spp (Bedolla, 2017). Mientras que Corbellini (2002) menciona que los

organismos causantes son diferentes tipos de bacterias, micoplasmas, hongos,

levaduras, y hasta algunos virus, sin embargo, los géneros Staphylococcus,

Streptococcus, Corynebacterium, y algunos gérmenes Gram negativo, son

24

responsables del 90% de casos clínicos y subclínicos. Osteras et al., (2006) afirman

que los casos clínicos son producidos por bacterias que solo se encuentran por un

corto periodo de tiempo desencadenando claros signos (Eschericha coli). Por el

contrario, en la mastitis subclínica es causada por bacterias patógenas que pueden

estar presentes por largos periodos causando signos leves, entre ellas se encuentra

la bacteria Staphylococcus aureus. Considerando la etiología, la mastitis contagiosa

es producida por bacterias que su principal hábitat se encuentra en el canal de

pezón, así como en la pared de la ubre lo que ocasiona el contagio por medio del

ordeño.

4.1 Células somáticas

El hablar de calidad engloba diferentes parámetros dentro del sector lechero, uno

de los más concurridos y de mayor importancia es el conteo de células somáticas

(CCS) el cual se utiliza para saber la condición y viabilidad de la leche y por ende el

estado de salud del bovino. Las células somáticas están constituidas por una

asociación de leucocitos y células epiteliales. Los leucocitos se introducen en la

leche en respuesta a la inflamación que puede aparecer debido a una enfermedad

o, a veces, a una lesión. Las células epiteliales se desprenden del revestimiento del

tejido de la ubre (Blowey y Edmondson, 1995). De igual manera, Bradley y Green

(2005) definen el CCS como el número de células presentes en un mililitro de leche,

siendo este un buen indicador para saber la concentración del número de leucocitos

presentes y así mismo verificar la salud de la glándula mamaria. Además, Wolter y

Kloppert (2004) hacen mención que para realizar la evaluación de un hato lechero

utilizando el conteo de células somáticas con relación a la leche del tanque no es

25

representativa, ya que cuando un hato está libre de S. aureus o de S. agalactiae y

tienen un bajo nivel de células (<150,000 células/ml).

4.2 Staphylococcus aureus

Esta especie está formada por cocos Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5

μm, agrupados como células únicas, pares, tétradas, cadenas cortas o formando un

racimo de uvas (Cervantes-García et al., 2014). S. aureus ha sido aislado de la

mastitis bovina (Watts, 1988) y puede ser transferida directamente por leche

infectada, productos lácteos o indirectamente a través de la contaminación

ambiental en el manejo y procesamiento (Jorgensen et al., 2005). Durante su

crecimiento en la leche, las cepas de S. aureus son capaces de producir

enterotoxinas que si se ingieren pueden causar, vomito, nausea y diarrea (Jablonsky

y Bohach, 1997). Dicha especie tiene una gran capacidad de adaptación por lo cual

afecta a todas las especies conocidas de mamíferos, por ese motivo tiene una

facilidad de transmisión (Zandejas-Manzo, 2014). Debido a la peligrosidad de los

patógenos mamarios, se informó a nivel internacional de un aumento de resistencia

bacteriana a los antimicrobianos que son utilizados habitualmente para la mastitis.

En un estudio realizado en rebaños lecheros en Finlandia donde aislaron las cepas

de S. aureus se visualizó un incremento de resistencia de 36.9% a un 63.6% entre

los años 1985 y 1995 (Myllys et al., 1998). Todas las cepas de S. aureus tienen la

capacidad de coagular el plasma sanguíneo, sin embrago, solo el 30% se relaciona

con la producción de enterotoxinas implicadas en la toxiinfección alimentaria

(Forsythe y Hayes., 2012).

26

4.3 Streptococcus agalactiae

La bacteria Streptococcus agalactiae pertenece al grupo B de Streptococcus, es un

microorganismo gram-positivo, frecuentemente crece en medios líquidos y en leche.

Es una especie considerada como una de las principales bacterias causantes de las

infecciones intramamarias bovinas que desarrollan enfermedades como la mastitis

subclínica (figura 5) (Keefe, 1997). Es un patógeno altamente contagioso de la

glándula mamaria, siendo este el que más periodos de larga duración sobrevive

(Martínez et al., 2000). En la región de América del norte es considerada una de las

mayores causantes de infecciones intramamarias bovina (Poyart et al., 2001).

Figura 5. Colonias de Streptococcus agalactiae en medio Granada (Tomado de

https://es.wikipedia.org/wiki/Agar_granada#/media/File:Streptococcus_agalactiae_

on_Granada_medium.jpg).

4.4 Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) forma parte de la flora normal del intestino del hombre.

Entre sus principales características se encuentra que es un bacilo gram-negativo,

anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu Escherichia. Sin

embargo, existen cepas que son patógenas y pueden causar daño como diarrea

27

(Rodríguez-Ángeles., 2002). La cepa de E.coli O157:H7 es uno de los

microorganismos más importantes debido a los daños que puede ocasionar a la

salud que van desde una ligera diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico

hemolítico. Los casos de intoxicación se relacionan con el consumo de carne,

productos lácteos, así como la leche, subprocesados con calor (Roberts et al.,

2000). En un trabajo realizado por Soujala et al. (2018) menciona que la mastitis

bovina causada por Escherichia Coli, puede ir desde una infección subclínica de la

glándula mamaria, hasta una enfermedad sistémica grave. Los únicos tratamientos

con evidencia científica son las fluoroquinolonas y las cefalosporinas, sin embargo,

debido a que la evidencia de la eficacia del tratamiento antimicrobiano para la

mastitis por E. coli es muy limitada y no se puede recomendar.

Figura 6. Colonias de E. coli en agar MacConkey (izquierda) y en agar Eosina y

Azul de Metileno (derecha) https://www.microbiologyinpictures.com/bacteria-

photos/escherichia-coli-photos/e.-coli.html, http://www.labprobio.com/2014/08/el-

control-de-e-coli-una-prioridad.html

28

4.5 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pseumoniae es un agente común de la mastitis clínica y subclínica en

establos lecheros, es un bacilo gram negativo, no móvil, de la familia

Enterobacteriaceae (figura 7). Usualmente desarrolla una cápsula que es un factor

importante en la virulencia de la bacteria (López y Echeverri., 2010). La importancia

de esta bacteria radica en ser la causante del al menos el 4% de la mastitis clínica,

cifra que va en aumento a medida que va disminuyendo el conteo de células

somáticas, siendo más frecuente en conteos bajos de 150,000 cel/mL de leche. Sin

embargo, tal como menciona Langoni et al. (2015) la mastitis ocasionada por K.

pneumoniae se vuelve más severa debido a la nula reacción de los tratamientos con

antibióticos, así como a la rápida evolución de distancias sustancias tóxicas que

pueden ocasionar la muerte del animal.

Figura 7. Colonias de Klebsiella pneumoniae en agar sangre de carnero (Sharma

et al., 2015).

29

4.6 Efectos negativos en la producción en vacas infectadas con mastitis

Diversos estudios evidencian que las vacas que contraen la enfermedad de mastitis

pueden presentar pérdidas en la producción de leche en el primer mes de la

lactancia, que van desde 0.5, 0.8 y 1.1 kg/d en el primer, segundo y tercer parto,

respectivamente (Detilleux, 2018). Mientras que en un estudio realizado por Pinzón

et al. (2009) hace mención de que aproximadamente el 93% de las pérdidas

económicas son causadas por la mastitis subclínica en la cuenca lechera del Alto

Chicamocha en Colombia.

4.7 Métodos de detección de la mastitis bovina

Debido a la sospecha de indicios de enfermedad en los hatos lecheros, se realizan

pruebas y técnicas a nivel de campo y nivel laboratorio para la detección de la

mastitis, entre estas pruebas se encuentran la observación y palpación de la ubre.

Dentro de las técnicas a nivel de laboratorio se encuentran: pruebas bacteriológicas,

conteo de células somáticas, determinación de enzimas entre otras. Según Pérez

et al., (2005) las pruebas físicas solo son útiles cuando la mastitis ya se encuentra

en una etapa avanzada y no detectan mastitis subclínica, o se utilizan aparatos para

el conteo de células somáticas. Dentro de las pruebas físicas se encuentran:la

prueba del paño negro y la taza probadora. Dentro de las pruebas químicas se

encuentran: Conductividad térmica de la leche, papel indicador de mastitis y la

prueba de Whitheside, el cual, dentro de esta última prueba Pérez et al (2005)

menciona que el procedimiento químico es muy variable por lo cual no es

recomendable sea prueba única. Por otro lado, Ashraf e Imran (2018) mencionan

que los métodos que aún son muy utilizados son: el recuento de células somáticas

30

y el cultivo microbiano, sin embargo en algunos países, estas técnicas han estado

siendo reemplazados parcialmente con reacción bioquímica como la prueba de

polimerasa y pruebas basadas en secuenciación, además de que la nanotecnología

y pruebas basadas en proteínas han estado ganando mucha atención y algunas de

estas pruebas podrían ser futuros candidatos para el diagnóstico de la mastitis

bovina.

4.7.1 Observación y palpación de la ubre

En la mastitis subclínica es difícil determinar si algún cuarto de la glándula se

encuentra infectada, esto debido a que durante esta etapa de la enfermedad los

principales signos de infección son visualmente indetectables. Sin embargo, la

infección puede provocar la inflamación de los cuartos además de incremento de

temperatura, enrojecimiento y dolor (Pérez et al., 2005).

4.7.2 Pruebas físicas

4.7.2.1 Prueba del paño negro

Esta prueba se realiza durante la preparación de la vaca para la ordeña, en la cual

consiste en la detección de grumos en la leche pasándola a través de una malla

oscura o bien en una cubeta especialmente diseñada para esto. Esta prueba es

recomendada utilizarla en todos los ordeños ya que además de detectar una leche

anormal, se pueden eliminar bacterias que son encontradas principalmente en los

primeros chorros (Pérez, 1986).

31

Figura 8. Prueba del paño negro

4.7.2.2 Prueba de la tasa probadora

Esta prueba consiste en examinar los primeros chorros de leche sobre un recipiente

(figura 9) en busca de anormalidades como: coágulos, hilos, materia fibrosa, color

anormal, entre otras; estas anormalidades son indicadores de un problema en la

leche. Cabe mencionar que en la mastitis crónica la leche no tiene anormalidades

visibles (Carrión, 2001).

Figura 9. Prueba de la taza probadora

32

4.7.3 Pruebas químicas

4.7.3.1 Prueba de california para mastitis (CMT)

La prueba de California se utiliza para la detección visual de mastitis bovina en

ganado lechero a nivel de campo (Morresey, 1999; Radostits, 2000; Cepero et al.,

2005; Erskine, 2001; Bedolla et al., 2007). Esta prueba se desarrolló en la

Universidad de California (EUA), el reactivo de California (Sodio dodecyl sulfato, 2

g, o también llamado alquilauril sulfonato de sodio), consiste en el agregado de un

“detergente” a la leche, el cual causa la liberación de los leucocitos presentes en la

ubre que en combinación con agentes proteicos de la leche forma una gelatina

(Smith 1990; Saran y Chaffer, 2000; Cepero et al., 2005).

Los resultados obtenidos se interpretan en 5 clases, desde el resultado negativo

donde hay ausencia de reacción entre la leche y el reactivo encontrándose en

estado acuoso, hasta la coagulación de las dos sustancias indicando la presencia

de la mastitis (Figura 10) (Pérez, 1986; Blowey y Edmonson, 1995; Bedolla, 2007).

Negativo Trazas Uno (+)

Dos (++) Tres (+++) Mastitis clínica

33

Figura 10. Interpretación de los resultados de la prueba California (Bedolla et al.,

2007).

Los valores determinados para la interpretación de resultados de mastitis con la

prueba de California se muestran en el cuadro 3.

Cuadro 3. Relación de escala CMT con nivel de células somáticas e interpretación

y registro de resultados se realiza bajo criterio

Escala de

CMT

Amplitud relativa del nivel

de células somáticas

(cs/ml)

Interpretación

Negativo:

0

< 200.000 El estado de la solución permanece

inalterado. La mezcla sigue en estado

líquido. El 25% de las células son

leucocitos polimorfonucleares.

Trazas 150.000 – 500.000 Se forma un precipitado en el piso de

la paleta que desaparece pronto. De 1

a 30% son leucocitos

polimorfonucleares.

1 (+) 400.000 – 1.500.000 Hay mayor precipitado, pero no se

forma gel. De un 30 a 40% son

leucocitos polimorfonucleares.

2 (++) 800.000 – 5.000.000 El precipitado se torna denso y se

concentra en el centro. De un 40 a 70%

son leucocitos poliformonucleares.

3 (+++) > 5.000.000 Se forma un gel muy denso que se

adhiere a la paleta. De un 70 a 80%

son leucocitos poliformonucleares.

Fuente: DVG, 2002; Saran y Chaffer, 2000.

34

4.8 Control de la mastitis

Actualmente existen varios medicamentos para el control de mastitis bovina en el

que se encuentran agentes químicos como el Trimetropim (TMP) y sulfadiazina

(SDZ) los cuales son muy eficientes contra los gérmenes causantes de la gran

mayoría de las mastitis en periodo de lactación (especialmente Staphylococcus spp

y Streptococcus spp). La combinación de estos tiene un efecto bactericida mucho

mayor que el efecto de alguno de estos compuestos por separado por lo que esta

combinación es efectiva contra patógenos comunes Gram positivos y Gram

negativos de la mastitis (Econovet, Registro SAGARPA Q-8006-050). Sin embargo,

se ha demostrado que ciertos microorganismos como Staphylococcus aureus

pueden desarrollar resistencia a los antibióticos derivados de la penicilina en

establos lecheros de traspatio (Ochoa-Zarzosa et al., 2008)

4.9 Plantas medicinales con potencial antimicrobiano para el control de la

mastitis bovina

En todas las regiones del mundo, por muchos años los humanos han desarrollado

un conocimiento sobre las plantas de su entorno y su uso medicinal. Desde la

llegada de los españoles y la incursión de los bovinos a América, los ganaderos se

encargaban del cuidado con el uso de estas plantas. La llegada de medicinas

modernas, así como la síntesis química de nuevos compuestos ha provocado la

disminución de las plantas medicinales. No obstante, existe evidencia del uso de

uso de plantas medicinales (aceites esenciales y extractos de algunas plantas

como: Origanum vulgare y Origanun aplii (orégano), y Cymbopogon citratus (DC.)

Stapf (chinchillo, hierba-cidro y limoncillo) implementadas como antibiótico para el

35

tratamiento de mastitis en bovinos (Acosta Moreno et al., 2017). En algunos estudios

se ha documentado la actividad antimicrobiana sobre microorganismos patógenos

causantes de la mastitis, tales como E. coli, S. Aureus, B. subtilis, Klebsiella

Pneumonae, con extractos de plantas como Acacia modesta, Thymus serphylum,

Syzygium comuni L., Laportea ovalifolia entre otras tienen un efecto inhibidor (Bashir

et al., 2012; Avello Lorca et al., 2012; Srinivasan et al., 2001).

5.0 Descripción de botánica del chilcuague (Heliopsis longipes)

Heliopsis longipes es una hierba perenne endémica de la región conformada por

porciones de la Sierra de Álvarez y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los

Estados de San Luis Potosí, Guanajuato y Querétaro. Los nombres comunes de

esta planta son chilcuague, pelitre, raíz de oro y raíz azteca (Ramírez, 1902;

Martínez, 1967).

En un estudio realizado por Cilia-López et al. (2014), describen a la planta de

chilcuague como una herbacea perenne de 19.6 a 38.9 cm de alto; con raíces

fibrosas; tallos herbáceos, decumbente a subdecumbente, de color rojizo-púrpura,

leñosa en la base, hojas opuestas, pecíolo ovado a oblongo en ocasiones

lanceolado, margen serrado a ligeramente dentado o casi entero cerca del ápice;

una a tres cabezuelas terminales solitarias, sobre pedúnculos largos y estriados;

receptáculo cónico; 5 a 11 flores de rayos amarillos, hermafroditas con hojas

lineares a oblongo-elípticas, ápice tridentado, flores del disco de 40-176,

hermafroditas, castaño-amarillo glabras; aquenios triangulares o cuadrangulares,

estriados, castaños a negruzcos, vilano ausente o raramente de dos a cuatro aristas

pequeñas y membranosas (figura 11).

36

Figura 11. Ejemplar de H. longipes (Cilia-López et al., 2013).

Su distribución comprende la región compuesta por porciones de la Sierra Álvarez

y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los territorios los estados de San Luis

Potosí, Guanajuato y Querétaro (Figura 12)

Figura 12. Distribución de H. longipes en la región de la Sierra de Álvarez (Cilia-

López et al., 2008).

37

La planta del chilcuague presenta una actividad importante como insecticida (Fisher,

1957). De acuerdo con Ramírez et al. (2000) esta planta tiene un compuesto

llamado afinina (Figura 13) el cual es el activo que presenta efecto de inhibición

contra hongos y bacterias. Una de las ventajas de obtener sustancias como la

afinina, producidas por la biosíntesis de plantas es que no tiene efectos adversos

en el ecosistema.

Figura 13. Estructura química de afinina, principal compuesto activo de la raíz de

chilcuague (Ramírez et al., 2000).

6. JUSTIFICACIÓN

La leche y sus derivados son de los alimentos con mayor demanda, además de ser

una de las industrias que mayor aportan a la economía en el sector pecuario y en

pequeña escala al autoconsumo, también representan el sustento económico de

muchas familias mexicanas, por lo que la calidad e inocuidad de la leche y sus

derivados son muy importantes, para cuidar la salud de los consumidores.. Por otro

38

lado el uso los antibióticos para el control de la mastitis, puede provocar problemas

de salud en la población y resistencia de algunos de los microorganismos

causantes de la enfermedad. Una alternativa a éste problema es la gran variedad

de plantas medicinales que han evidenciado tener efectos antifúngicos y

bactericidas que pudieran tener efecto en la inhibición de microorganismos

patógenos, una de ellas es la planta de chilcuague (Heliopsis longipes) la cual no

ha sido probado para la prevención y control de este tipo de enfermedades.

7.0 OBJETIVO

Evaluar la actividad antibacteriana in vitro de dos extractos, acuoso y etanólico de

Heliopsis longipes sobre cuatro bacterias causantes de la enfermedad de mastitis

en ganado lechero, tales como Escheriquia coli, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus faecalis y Klebsiella pneumonae.

7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener un extracto acuoso y etanólico de la raíz de chilcuague (Heliopsis longipes)

para evaluar el efecto de inhibición en sensidiscos sobre cuatro principales bacterias

causantes de la mastitis.

Realizar pruebas de inhibición de crecimiento de bacterias que provocan la mastitis.

39

8.0 MATERIALES Y MÉTODOS

8.1 Preparación del material vegetal

El material vegetal utilizado fue raíz de la planta de chilcuague (Heliopsis longipes),

la cual se adquirió en el mercado local de San Luis de la Paz, Guanajuato. Con ella

se elaboró un extracto acuoso y uno etanólico. Para ello, se pesaron 200 g de raíz

de chilcuague (H. longipes) la cual fue sometida a triturado en una licuadora casera

(Oster) para disminuir su tamaño de partícula y proceder a una maceración durante

dos semanas en oscuridad en un litro de agua y etanol respectivamente.

Posteriormente, los extractos fueron filtrados usando papel filtro de tamaño de poro

de 2.5 µm (Whatman # 5). En seguida, los extractos se concentraron con un

rotavapor. Posteriormente, se tomó una muestra de cada extracto seco y se diluyó

en agua o etanol a una concentración de 0.05 g/mL, respectivamente.

Las cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 259238), Staphylococcus faecalis

(ATCC 29212) y Escheriquia coli (ATCC 25922), fueron obtenidos en el laboratorio

de microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Mientras que la cepa Klebsiella

pneumonae (ATCC 31488) nos fue otorgada por el laboratorio estatal de salubridad

pública de San Luis Potosí. Dichos microrganismos se suspendieron por separado

en tubos con agua peptonada al 0.1% a una concentración de 6.0 x 108 UFC/mL

que corresponde al 0.5 basada en la escala de McFarland de turbidez (MacFaddin,

2005).

40

La prueba de inhibición se realizó en placas Petri con agares específicos para cada

microorganismo para lo cual se utilizó agar Baird Parker (BD Bioxon) inoculado con

1.0 mL (mediante la técnica por extensión en placa) de la suspensión por separado

de S. aureus, y S. faecalis. La inoculación de E. coli se realizó en agar EMB (BD

Bioxon) con 1.0 mL de la suspensión. Para el crecimiento de Klebsiella pneumonae

se prepararon cajas de Petri con agar McConkey (BD Bioxon).

Las placas se dividieron en cuatro cuadrantes y en cada cuadrante se colocó un

disco de papel filtro de 0.5 cm de diámetro previamente esterilizado e impregnado

con la solución correspondiente al tratamiento. Los tratamientos probados fueron;

agua destilada, etanol 96%, extracto acuoso y extracto etanólico de H. longipes y

fármaco comercial Antimastitis intramamario para bovinos, caprinos y ovinos

(Econovet, Registro SAGARPA Q-8006-050), el cual contiene sulfato de kanamicina

1 g/100 mL, sulfato de neomicina 1 g/100 mL y sulfato de gentamicina 1 g/100 mL.

El proceso de inoculación se realizó en una campana de flujo laminar (Thermo

scientific, grado II 1300 SERIES A2), posteriormente las placas se colocaron en una

incubadora (Yamato IN 804) a 35° C durante 24 horas. El parámetro medido fue el

diámetro (en mm) del halo de inhibición con vernier (marca TRUPER).

9.0 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados de diámetro de inhibición se analizaron por medio de un diseño

estadístico por bloques al azar, donde los bloques corresponde a las cuatro

bacterias (S. aureus, S. faecalis, E. coli y Klebsiella pneumonae) y los tratamientos

41

fueron los extractos, (agua destilada, etanol 96%, extracto acuoso y extracto

etanólico de H. longipes y fármaco comercial) y los bloques corresponden a cuatro

tipos de bacterias y la variable de respuesta fue el halo de inhibición en sensidiscos

con una n=12 por placa. Además, se realizó una prueba de medias de Tukey

(p<0.05) con el paquete estadístico R Studio (R Core Team, 2016).

10.0 RESULTADOS

Los resultados se presentan en la figura 14 y 15, donde la variable medida fue el

diámetro de halo de inhibición, se encontraron diferencias altamente significativas

debido a los tratamientos mostrados en la figura 14 (p<0.0001), donde se encontró

que el tratamiento de medicamento, tal como se muestra en la figura 16, fue el que

obtuvo el mayor diámetro de inhibición (19.65 mm) en todas las cepas de

microorganismos, sin embargo, en menor proporción el tratamiento etanólico de H.

longipes también mostró efecto inhibidor (6.96 mm), el extracto acuso no mostró

efectividad, y finalmente, como era de esperarse en el tratamiento con agua, todas

las bacterias crecieron sin ninguna restricción.

42

Figura 14. Resultados de la prueba inhibición in vitro sobre cuatro bacterias

patógenas con cinco sustancias (tratamientos). Valores medios y las barras de error

corresponde al error estándar de la media.

Por otro lado, en la figura 15 se muestran los resultados del halo de inhibición por

tipo de bacteria (bloque), el cual muestra diferencias significativas (p>0.0001),

donde Klebsiella es el microorganismo más sensible a los tratamientos, se registró

una inhibición de 9.37 mm, en contraste las dos especies de Staphylococcus fueron

las más resistentes y que registraron menor halo (6.36 y 4.53 mm). Para estudios

futuros, se podría incrementar la dosis del extracto etanólico para ver mayor

reacción.

-1

4

9

14

19

24

Agua Ext. Acuoso Etanol Ext. Etanolico Medicamento

Dia

met

ro d

e hal

o d

e in

hib

icio

, m

m

Tratamientos

e

a

b

c

d

43

Figura 15. Resultados de halo de inhibición por bacteria patógena (bloque). Valores

medios y las barras de error corresponde al error estándar de la media.

En el mismo sentido, en la figura 16 cuando se realizó el análisis por interacción

tratamiento-bacteria, se observó que K. pneumonae fue la especie que mayor halo

de inhibición presentó debido al tratamiento de medicamento y al extracto de H.

longipes, mientras que el menor efecto de inhibición lo presentaron S. aeurus y S.

faecalis.

0

2

4

6

8

10

12

S. faecalis S. auerus E. coli K. pneumonae

Dia

met

ro d

e hal

o d

e in

hib

icio

, m

m

Bacteria

a

b

c

d

44

Figura 16. Halos de inhibición (mm) en cada una de las bacterias, por cada uno de

los tratamientos.

Finalmente, en la figura 17 a modo de ejemplo se muestran dos ejemplos de los

halos de inhibición uniforme de S. faecalis y E. coli con el tratamiento del

medicamento.

Figura 17. Resultados de halo de inhibición con medicamento comercial sobre a)

S. faecalis sobre agar estafilococos 110 y b) E. coli en agar EMB.

-5

0

5

10

15

20

25

30

E. coli S. aureus S. faecalis klebsiella

halo

de in

hib

ició

n, m

m

Bacterias

Agua Alcohol Extracto Medicamento

a) b)

45

11.0 DISCUSIÓN

La finalidad de este trabajo fue estudiar la reacción de extractos de raíz de

chilcuague como una alternativa ambientalmente amigable, para el control de

microrganismos patógenos comúnmente relacionados con la mastitis subclínica en

bovinos estabulados, usados para la producción de leche y derivados lácteos entre

los que destacan vacas, borregos y cabras.

Existen diversos trabajos donde se han estudiado las cualidades del principio activo

de la raíz de chilcuague, algunos de ellos destacan el efecto antimicrobiano,

analgésico y tóxico. Martínez-Loredo et al. (2016) mencionan que el extracto

alcohólico de H. longipes en contacto con esperma de ratones, puede tener efecto

espermaticida del 100% a una concentración de 2,000 mg/mL en un tiempo de 30

min.

En un estudio realizado por Molina-Torres et al. (1999) se evaluó el efecto

antimicrobiano del extracto alcohólico de H. longipes, sobre el crecimiento de

Escherichia coli, Pseudomonas solanacearum, Bacilus subtilis y Sacaromyces

cerevisiae, donde se observó que el extracto inhibió el crecimiento de E. coli y S.

cerevisiae a concentraciones de 25 µg/mL, el mismo autor comenta que se tuvo que

incrementar la dosis a 75 µg/mL para inhibir el crecimiento de P. solanacearum y B.

subtilis. Sin embargo, a pesar de que encontraron efecto inhibidor, el tiempo de

experimentación fue más corto (8 horas) en comparación con el presente

experimento (48 horas) y, además, en sus resultados se observa una tendencia a

incrementarse la carga microbiana, que posiblemente en 24 horas las cargas

microbianas sean parecidas a las del tratamiento testigo.

46

De igual manera, Ramírez et al. (2000) realizaron un trabajo in vitro para el control

de Sclerotium cepivorum y S. rolfsii en agar papa dextrosa, para esto se analizó el

efecto del extracto purificado y del extracto crudo de raíces de H. longipes en

acetato de etilo como disolvente a concentraciones de 5 a 25 µg/mL. Según los

autores, los resultados mostraron que con una concentración de 25 μg/mL de afinina

purificada, o del extracto crudo, el desarrollo micelial de las dos especies de

Sclerotium se inhiben completamente. Al respecto, las diferencias marcadas con

respecto al presente estudio se pueden deber al disolvente que utilizaron para

extraer la afinina y otros compuestos, que, en presente caso no se utilizó acetato de

etilo.

González et al. (2011) analizaron el efecto in vitro de H. longipes sobre el

crecimiento del hongo Fusarium oxysporm F. sp lycopersici. Se realizó un extracto

etanólico a una proporción de 1:10, es decir, 1 gramo de extracto con 9 mL de etanol

al 98%, y lo dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 días, donde la dosis

letal media estimada fue de 164.2 μg/mL de afinina, y la dosis letal90 fue de 348.6

μg/mL para el control del hongo. Por otro lado, en el presente trabajo, la maceración

se realizó en un lapso de 15 días, lo cual pudiera ser un factor que considerar en la

extracción de la afinina.

En un ensayo realizado por Hernández Morales et al. (2012), se estudió la actividad

de la afinina contra un díptero (A. albimanus) el cual se le atribuye la capacidad de

transmisión del paludismo. Se evaluaron varias dosis del extracto 0, 2.5, 5, 7.5 y 10

ppm. Los autores mencionan que, a partir de una concentración de 5 ppm, el 100%

de las larvas se encontraron sin movilidad. La dosis letal media se encontró con la

47

concentración de 2.85 ppm. Los autores sugieren que el efecto insecticida de H.

longipes Gray Black se le atribuye a la insaturación de las posiciones 2E, 6Z y 8E

de la afinina. Además, mencionan que existe la posibilidad de que dicho efecto sea

debido a la acción sinérgica de la afinina y alcamidas encontradas en el extracto, y

no solo de la afinina como se tenía contemplado.

En un trabajo realizado por Cilia-López et al. (2010) se evaluó la actividad

analgésica de la afinina (1 mg/kg) y el extracto etanólico de la raíz de H. longipes

(10 mg/kg) y su efecto sobre el sistema nervioso de ratones albinos, los autores

concluyen que tanto la afinina purificada como el extracto alcohólico muestran una

acción analgésica similar a la del ketorolaco, y que, además, el efecto estimulante

sobre el sistema nervioso es comparable al de la cafeína.

Otros trabajos donde se estudió el efecto inhibidor de otros extractos vegetales

sobre el crecimiento de microrganismos usados en este trabajo se describen a

continuación.

Pereira et al. (2013), realizaron un experimento in vitro para evaluar la actividad

antimicrobiana de la corteza del fuste cedro (Cederla adorata), donde se evaluaron

distintos extractos químicos a 400 μg de extracto/disco; con n-hexano, cloroformo,

acetato de etilo y agua para el control de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

y Staphylococcus aureus, el estudio mostró que el extracto con hexano presentaba

un mayor halo de inhibición de 12 mm sobre S. aureus. Los autores mencionan que

los responsables de la inhibición fueron los alcaloides, triterpenos o esteroles y

quinonas presentes en el extracto.

48

En un trabajo realizado por Castillo et al. (2016) se evaluó el efecto de inhibición de

extractos acetónicos de las especies vegetales Peumus boldus, Cucurbita pepo,

Piper auritum, Plantago major, Artemisia absinthum, Foeniculum vulgare,

Parmentiera aculeata y Croton guatemalensis contra las bacterias Escherichia coli

spp y Bacillus cereus. Sus resultados mostraron que los extractos de P. major y P.

boldus presentaron un efecto inhibidor con halos de inhibición de hasta 1.0 cm en

ambos extractos contra B. cereus, mientras que para E. coli, solo los extractos de

P. boldus, P. major y C. pepo mostraron inhibición con un máximo de 0.9 cm. Los

autores señalan, que el resto de los extractos no mostraron efecto pese a que hay

evidencia de inhibición en otros patógenos.

Salazar-Aranda et al. (2009) evaluaron extractos hidroalcohólicos de diferentes

especies vegetales que son comercializados en mercados convencionales de

Monterrey, el estudio consistió en la evaluación antimicrobiana contra Escherichia

coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Los autores mencionan que las

especies de Allium sativum, Peumus boldus, Eucalyptus globulus, Mentha piperita,

o Salvia officinalis, no mostraron ningún efecto de inhibición contra E. coli, sin

embargo, los productos que contenían P. boldus, E. globulus, o S. officinalis fueron

los más activos contra S. aureus con una concentración de 62.5 µg/mL. Y

finalmente, solo los extractos de P. boldus, E. globulus y S. officinalis mostraron

actividad contra Candida albicans con la misma concentración.

Por otro lado, Miranda et al. (2012) realizaron la evaluación antimicrobiana de

extractos etanólicos y hexánicos de hojas y cortezas de Guayaba agria (Psidium

friedrichsthalianum L.), palo de sangre (Pterocarpus hayesii L.), chichimecate

49

(Tynanthus guatemalensis L.) y ciruela (Spondias purpurea L.) reportadas como

plantas medicinales en el estado de Tabasco. El estudio consistió en ver el efecto

inhibidor sobre Staphylococcus aureus, Salmonella typhymuirium y Bacillus cereus.

Los resultados de los autores mostraron que el extracto hexánico de las hojas de

cada una de las plantas evaluadas, mostraron inhibición en al menos uno de los

microorganismos evaluados, mientras que los extractos de la corteza no

presentaron actividad en ninguno de los tres microorganismos evaluados. Los

extractos hexánicos de las hojas de las cuatro especies vegetales mostraron

actividad antimicrobiana, el mayor halo de inhibición los mostró S. purpurea con un

diámetro de 15.63 ± 0.96 mm contra B. cereus, mientras que el menor fue con T.

guatemalensis con 10.20 ± 0.10 mm. Los extractos hexánicos de hoja de P.

friedrichsthalianum y S. purpurea presentaron actividad contra S. typhimurium con

halos de inhibición de 9.53 ± 1.02 y 11.11 ± 1.06 mm, respectivamente. Finalmente,

los extractos hexánicos de P. friedrichsthalianum, P. hayessii y S. purpurea

presentaron halos de inhibición de 13.38 ± 2.98, 10.45 ± 0.70 y 10.68 ± 1.33 mm,

respectivamente, contra S. aureus. Realizando una comparación con respecto a

nuestro trabajo, nos encontramos que el extracto etanólico de Heliopsis longipes si

mostraron efecto de inhibición sobre S. aureus, sin embargo, el efecto lo pudo

ocasionar el alcohol y no el principio activo de la planta como se esperaría.

En un trabajo realizado por Vega Menchaca et al., (2013) donde realizó un extracto

metanólico y acuoso de las hojas de Leucophyllum frutescens que ha sido utilizada

como remedio para enfermedades respiratorias, los extractos fueron evaluados

contra cepas de Staphylococcus aureus de un aislado clínico y uno de referencia.

50

De los extractos evaluados, solo el metanólico fue el que presentó actividad

antimicrobiana, mientras que el acuoso no mostró efecto alguno. El efecto de

inhibición del aislado clínico de S. aureus fue de 12 mm a las concentraciones de

1000 y 500 µg/mL y 10 mm a la concentración de 250 µg/mL, mientras que la cepa

de referencia mostró un halo de inhibición de 15 mm en las concentraciones de 1000

y 500 µl/mL, en cambio a la concentración de 250 µg/mL no presentó actividad

antimicrobiana. Sin embargo, el tratamiento considerado como control negativo para

ver un posible efecto sesgado del solvente extractor, no fue el mismo con el que

realizaron el extracto de la planta, no se hace mención de si el efecto de inhibición

se debe a los principios activos de la planta o al metanol.

Castro-Franco et al. (2001) evaluaron la actividad antibacterial de siete extractos de

plantas de zonas áridas, para así poder darles un uso alternativo a algunas especies

con bajo o nulo potencial forrajero como es el caso de Larrea tridentata, contra

bacterias de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes,

Bacillus cereus, y Shigella dysenteriae a distintas concentraciones. Los autores

mencionan que todos los extractos evaluados mostraron actividad antimicrobial al

menos en uno de los microorganismos probados. El extracto más efectivo fue Agave

lechuguilla, mientras que el que mostró menor eficacia de los siete fitoextractos fue

Larrea tridentata. La bacteria Shigella dysenteriae fue afectada por el 100% de los

fitoextractos; el crecimiento de Escherichia coli solo fue inhibido por Larrea

tridentata. Con respecto a la concentración mínima inhibitoria, la tendencia indicó

un efecto de inhibición en bacterias Grampositivas conforme se incrementó la

51

concentración del fitoextracto. El mayor efecto de inhibición bacterias Gram

negativas fue observado a la concentración de 28.5 mg mL-1.

12.0 CONCLUSIONES

El medicamento comercial mostró la mayor efectividad de inhibición de las cuatro

cepas patógenas, sin embargo, el tratamiento de extracto etanólico de H. longipes

también mostró efecto inhibidor de las cuatro cepas de microorganismos patógenos.

Por otro lado, la cepa que más sensibilidad presento ante los tratamientos fue la de

Klebsiella penumonae, en contraste con la cepa de Staphylococcus faecalis quien

fue la que menor inhibición presentó.

Se requiere realizar más estudios en los que se purifique el extracto y en los que se

incremente la dosis del mismo. Estudios de este tipo podrían servir para diseñar

experimentos in vivo para el control de mastitis en pequeños establos.

52

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