unidad 4 mutagénesis
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Unidad 4. Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis
Francisco Hernndez-Luis, Mara Elena Bravo-Gmez, Perla
Castaeda-Lpez, Circe Mouret-Hernndez
Facultad de Qumica, Departamento de Farmacia, UNAM
Contenido 4.1 Mutagnesis ................................................................................................ 1
4.1. Niveles de accin de mutgenos .............................................................. 3
4.2. Interaccin de xenobiticos con el ADN .................................................. 3
4.2.1. Agentes desaminantes ........................................................................... 3
4.2.2. Agentes alquilantes ................................................................................ 4
4.2.2.1. Agentes alquilantes que necesitan bioactivarse ............................... 7
4.2.3. Agentes intercalantes ............................................................................. 9
4.3 Evaluacin de la actividad mutagnica de xenobiticos ....................... 10
Bibliografa ...................................................................................................... 17
4.1 Mutagnesis
Mutacin es todo cambio transmisible en el material gentico de un
organismo. Algunos de los agentes fsicos y qumicos que producen dichos
cambios son: la radiacin ionizante, mostazas nitrogenadas, epxidos,
sulfonatos de metilo.1
Es importante sealar la diferencia entre dos trminos que con
frecuencia suelen utilizarse como sinnimos: mutagnesis y genotoxicidad.
La mutagnesis es la capacidad de un xenobitico para causar alteraciones
en el material gentico que lleguen a ser transmisible a la progenie celular.
La genotoxicidad esun trmino que incluye alteraciones al material gentico,
tales como intercambio de cromtidas hermanas o rupturas de hebras de
ADN, que no necesariamente son transmitidas a la decendencia.1
Los tipos de efectos genotxicos que se pueden presentar
dependern si la interaccin se llev a cabo sobre el ADN o sobre los
cromosomas. En el primer caso, se denomina microlesin; si la alteracin se
manifiesta en la progenie se denotar como una mutacin puntual. En el
segundo caso, la alteracin se denomina macrolesin.2
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De las alteraciones que se producen en el cido desoxiribonuclico (ADN),
no todas son necesariamente dainas, ya que muchas mutaciones han
ocasionado mejores adaptaciones de los individuos en los procesos
evolutivos. El peligro se presenta con aquellas mutaciones cuyos efectos
provocan reacciones adversas para el organismo. Las consecuencias
nocivas de las mutaciones incluyen desordenes en la fertilidad, muerte
embrionaria y perinatal, malformaciones, enfermedades hereditarias, y
cncer. Los propsitos de la toxicologa en este campo son:
a) Identificar aquellas sustancias que presenten potencialidad
genotxica (mutagnica).
b) Tratar de establecer el mecanismo de accin y las consecuencias
fenotpicas de los agentes que provocan mutaciones.
c) Establecer los parmetros o condiciones necesarias para minimizar
la exposicin humana a los genotxicos, con el propsito de evitar
alteraciones en la informacin hereditaria que ya posee el individuo.
La probabilidad de que un xenobitico pueda causar dao gentico
depende de los siguientes factores:
a) Concentracin del xenobitico en el medio ambiente.
b) Ingreso del xenobitico y su distribucin corporal.
c) Biotransformacin por el tejido en el cual el compuesto es
distribuido.
d) Reactividad del xenobitico, o sus metabolitos, con las
macromolculas, especialmente con el ADN.
e) Capacidad de la clula para rectificar o amplificar el dao y que ste
se exprese.
f) Competencia del tejido para reconocer y suprimir la multiplicacin de
las clulas con propiedades aberrantes
Por todos estos factores, es importante tener en cuenta que para que un
compuesto presente en el medio ambiente, afecte al material gentico no es
un evento simple y fcil de llevarse a cabo.
Figura 4-1. Paradigma toxicolgico
excrecin
aproximacin al ADNtraslado por la membrana
del ncleo
riesgo de exposicin
ruta de ingreso y
distribucin fisiolgica
biotransformacin
reaccin con el ADN
(mutacin)
procesos de
reparacin
expresin
trastorno biolgico
(reaccin adversa)
traslado por membranas
celulares
etapa
toxocinticaetapa
toxodinmica
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4.1. Niveles de accin de mutgenos
Las consecuencias de la mutagnesis se pueden esquematizar en
la siguiente forma segn sea afectada una clula somtica o una clula
germinal.
Figura 4-2. Consecuencias de mutaciones en clulas somticas y germinales
4.2. Interaccin de xenobiticos con el ADN De manera general se pueden agrupar a los xenobiticos que actan
sobre el material gentico en cuatro grandes grupos.
Tabla 4-1. Genotxicos puntuales y sus mecanismos de accin
Tipo de compuesto
Mecanismo Ejemplo Alteracin gentica
Agentes alquilantes
Forman enlaces covalentes con las purinas y pirimidinas provocando los sitios alquilados
Sulfato de alquilo, mostazas nitrogenadas, nitrosourea
Transicin, Transversin
Agentes desaminantes
Desaminan adenina y la transforman en hipoxantina; y a la citosina en uracilo
cido nitroso Transicin
Anlogos de base
Sustituyen a las bases pricas y pirimidnicas normales durante la replicacin del ADN
2-aminopurina Transicin
Agentes intercalantes
Se intercalan en las hebras de ADN.
Acridinas, antraciclinas
Alargamiento que altera la lectura en el ADN
Transicin: cambio de una purina por otra purina (o pirimidina por otra pirimidina) en la replicacin del ADN; Transversin: cambio de una purina por una pirimidina en el mismo proceso.
4.2.1. Agentes desaminantes
Un ejemplo de transformacin qumica de bases es provocada por
el cido nitroso, HNO2, el cual provoca la transformacin de citosina a uracilo
o de la adenina a hipoxantina. El cido nitroso puede ser formado, en el
cuerpo humano, por la reaccin de nitritos con compuestos orgnicos
(aminas secundarias) en las condiciones cidas del estmago.
Figura 4-3. La transicin y tranversin en las bases nitrogenadas del ADN
transmisible a
la progenie
recesivodominante viablemuerte fetal
cncer
cambio recesivo
muerte celular
clula germinalclula somtica
evento mutagnico
odominante
mutgeno
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Figura 4-4. Desaminacin de bases nitrogenadas por accin del HNO2
4.2.2. Agentes alquilantes
Los agentes alquilantes pueden adicionar un grupo alquilo (metilo,
etilo, propilo, etc) al ADN, o a cualquier otra molcula de carcter nucleoflica.
En el ADN provocan alteraciones estructurales en los cidos nucleicos
(microlesiones). El mecanismo de la reaccin involucra la adicin de una
porcin nucleoflica del ADN a la parte electroflica (alquilo) del agente
alquilante.
Caractersticas de los agentes alquilantes Naturaleza electroflica Altamente reactivos Forman enlaces covalentes Alteran la funcin del ADN y muerte celular Manifiestan escasa selectividad hacia los tipos de clulas (antineoplsicos (antiproloferativos) y carcingenos) Deprimen la mdula sea
Agentes alquilantes monofuncionales y bifuncionales Entre los agentes alquilantes se encuentran varios compuestos de
importancia industrial y frmacos anticancergenos. Su toxicidad radica en
que pueden introducir un grupo alquilo en las macromolculas biolgicas,
particularmente el ADN. La mayora de ellos son genotxicos directos y se
clasifican en dos grupos: aquellos que van a provocar una sola alquilacin
(monofuncionales), y aquellos que logran provocar dos alquilaciones
(bifuncionales). Ejemplos del primer grupo lo constituyen el sulfato de dimetilo
(DMS), -propiolactona (BPL). Este ltimo ha sido utilizado en medicina como
agente esterilizante y para inactivar al virus del SIDA presente en las
muestras biolgicas.
Los agentes alquilantes bifuncionales se caracterizan porque pueden
alquilar dos sitios nucleoflicos en el ADN. Tales sustancias pueden provocar
enlaces cruzados entre una base nitrogenada y una protena o con otra base
nitrogenada, la cual puede estar en la misma hebra o en la hebra alterna del ADN.
El compuesto prototipo para los agentes bifuncionales es el gas mostaza, el cual
pertenece a su vez al grupo de los compuestos referidos como mostazas, que
pueden presentar al tomo de azufre o al tomo de nitrgeno como elemento
para la cooperacin de grupo vecino (cooperacin ananquimrica).
Alquilacin intracatenaria Alquilacin intercatenaria
Figura 4-5. Tipos de alquilaciones en las hebras de ADN
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Figura 4-6. Modos de alquilacion del ADN
Figura 4-7. Forma de accin de un agente alquilante bifuncional
Estos compuestos inicialmente no fueron identificados, en pruebas
con animales de laboratorio, como agentes carcinognicos. Posteriormente,
fueron implicados como tales, al estudiarse los casos de trabajadores
japoneses quienes laboraban en la fabricacin de gas mostaza con fines
blicos. Estos trabajadores presentaron alta incidencia de cncer en el tracto
respiratorio.
Tabla 4-2. Ejemplos del algunos alquilantes mono y bifuncionales
Xenobitico Estructura
Alquilantes monofuncionales
Alquiliminas
Etilenimina
steres de sulfato
Sulfato de dimetilo (CH3)2SO4
Lactonas pequeas
-propiolactona (BPL)
Compuestos con halgeno activo
Cloruro de bencilo
Yoduro de metilo CH3I
Alquilantes bifuncionales
Alquilenepxidos
1,2,3,4-butadienepxido
Mostazas
Sulfuro de bis(2-cloroetilo), (gas mostaza,
yperita)
S
CH2CH2Cl
CH2CH2Cl
agente alquilante bifuncional
+
ADN
protena
OH
alquilantehidrolizado
alquilacindos hebras
alquilacinuna hebra
alquilacinADN-protena
alquilacindos ADN
H2C CHR
N
H
O
O
CH2Cl
H2C CH CH CH2O O
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Bis(2-cloroetil)amina NH
CH2CH2Cl
CH2CH2Cl
Ciclofosfamida (cytoxan)
(necesita bioactivarse)
Los ejemplos de lo sitios mono-alquilados que se han encontrado se muestran a
continuacin.
Figura 4-8 La alquilacin de la guanina (G) en el oxgeno exocclico en posicin 6 (O6MeG)
es la primera lesin que ocasionan los agentes alquilantes y su presencia ha correlacionado
con la aparicin de tumores en ratas. La O6MeG provoca la transicin GA (adenosina) en
el proceso de replicacin de ADN. Sin embargo, existe en las clulas de los mamferos una
enzima no inducible llamada la AGT que se encarga de reparar el dao ocasionado al
revertir el proceso de alquilacin y recuperar a la G para que siga realizando su funcin en
el ADN.
AGT: O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa
Figura 4-9. Reparacin de una monoalquilacin3
ClCH2CH2N P
O
ClCH2CH2 O
N
H
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4.2.2.1. Agentes alquilantes que necesitan bioactivarse
Las nitrosaminas
La mayora de los carcingenos N-alquilados requieren de
activacin enzimtica para transformarse en compuestos activos contra el
ADN. Estas biotransformaciones involucran generalmente reacciones de
oxidacin mediadas por el citocromo P 450. Como ejemplo presentamos a
continuacin, la bioactivacin de la N,N-dimetilnitrosamina (NDMA).
Figura 4-10. Activacin y alquilacin por una nitrosamina
El diazometano parece ser el intermediario en la accin de estos
compuestos sobre el ADN al transferir directamente el grupo metilo a esta
macromolcula.
Las nitrosoureas y nitrosoguanidinas
Algunos agentes alquilantes, necesitan hidrolizarse para liberar a la
especie reactiva, tal es el caso de las nitroureas, nitrosoguanidinas y
nitrosouretanos. La N-metil-N-nitrosourea (MNU) se hidroliza rpidamente a
pH 7 y 37 C, para dar hidroxildiazometano, mientras que la N-metil-N-nitro-
N-nitrosoguanidina (MNNG), lo hace lentamente. Como resultado de esto,
se ha postulado que una forma acelerada de alquilacin por MNNG,
implicara una catlisis de un grupo tiol de las clulas.
Este tipo de compuestos se utilizan en los laboratorios de sntesis,
como precursores de diazometano.
Figura 4-11. Generacin de hidroxildiazometano por MNU y MNNG
Los hidrocarburos aromticos policclicos (HAP)
Este grupo de compuestos se presentan en forma de mezclas
complejas en una variedad de productos ambientales tales como el holln,
alquitrn, humo de tabaco, combustin incompleta del petrleo. Dos
ejemplos de este tipo de compuestos lo constituyen el benzo[a]pireno (BP) y
el dibenzo[a,h]antraceno cuyas estructuras se han presentado
anteriormente. En 1964, se demostr que el benzo[a]pireno se una
covalentemente al ADN de la piel del ratn in vivo y este fenmeno se
reprodujo in vitro utilizando microsomas de ratas como fuente de citocromo
P 450.
diazometano
(especie
alquilante)
P 450
NDMA
N
CH3
CH3
N O N
CH3
N O
CH2
OH
C
H
H
O
N=N
CH3
OH
N=N
CH3 OH
CH3 N=N+
hidroxildiazometano
cis
trans
C
NH
NHNO2
SR
MNNG
+CH3 N=N OH
(NC NH NO2)+CH3 N=N OHa
b
b
a
OH-
R SH
C
N NH NO2
N
N OCH3
H
NCH3 N=O
CNH2O
MNU
CH3 N=N OH + O=C=NH
hidroxildiazometano
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Se ha propuesto una teora denominada regin baha. En esta, se
considera que aquellos HAP que presente esta regin estructural sern de
riesgo carcinognico ya que al metabolizarse producirn dos epxidos, uno
de los cuales ser el responsable de interaccionar con el ADN.
Figura 4-12. Propuestas de biotransformacin de la teora baha
Esta biotransformacin implica algunas consideraciones
estereoqumicas que a continuacin se presentan:
Figura 4-13. Aspectos estereoqumicos en la biotransformacin del benzo[a]pireno
El BP 7,8-diol-9,10-epxido de conformacin (+)anti (dado por la
relacin entre el epxido y el hidroxilo en posicin 7) es el que va a
interaccionar con las bases nitrogenadas.
Figura 4-14. Interaccin del BP-7,8-dihidrodiol-9,10-epoxido con la guanina
Es importante puntualizar, que la biotransformacin de estos
compuestos primeramente conducir a la destoxificacin mediante la
reaccin de glucuronidacin. Slo por la saturacin de este proceso se
presentarn aquellos cambios estructurales que provoquen la produccin de
sustancias con riesgo carcinognico.
BP: benzo[a]pireno; Ah: aromatic receptor
Figura 4-15. Alternativas de biotransformacin para los HAP
(segundo epxido)( primer epxido)
regin baha 1
3
4
67
8
9
10
12
benzo[a]pireno (BP)
O
BP 7,8-epxido
HO
OH
BP 7,8-diol
HO
HO
O
BP 7,8-diol-9,10-epxido
109
7
epxido
hidrolasa
epxido
hidrolasa
epxido
hidrolasa
CYP 1
CYP 1CYP 2
CYP 2
109
7
(+) anti
O
OH
HO HO
OH
(+) syn
O
HO
HO
HO
HOO
Obenzo[a]pireno
BP 7,8-diol-
9,10-epxido
BP 7,8-diol-
9,10-epxido
78
78
HO
HO
O
N
N N
N
O
H2N
H
azucar
N N
N
O
azucar
HN
N
H
HO
HO OH
Aducto del hidrocarburo policclico y la guanina
CYP 2
ACTIVACION TOXICA
DESTOXIFICACION
BP 7,8-glucurnidoglucuronidacin
mutacinADN
mitsis
promocin
receptores
regulatorios
CYP 1
receptor Ah
BP 7,8-diol-
9,10- epxido
CYP 1
BP
7,8-diol
BP
transcripcin del ADN
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4.2.3. Agentes intercalantes
A continuacin se ilustra el fenmeno de la intercalacin en el ADN.
Figura 4-16. Intercalacin del ADN
Figura 4-17. Diagrama que muestra dos molculas de doxorrubicina intercalndose en el ADN
Los agentes intercalantes son un importante grupo de mutgenos
utilizados en los laboratorios de investigacin. La intercalacin fu primero
descrita por Lerman en 1961 como una interaccin no covalente en la cual el
agente intercalante se coloca de forma perpendicular al eje de la doble hlice.
Algunos ejemplos de agentes intercalantes se presentan en la Figura 4-14.
Los compuestos intercalantes se caracterizan por su dimensin, que
corresponde a 3 anillos aromticos condensados (o heterocclicos), la cual
es semejante al dimetro de la doble hlice del ADN. La intercalacin provoca
una separacin vertical de los pares de bases, distorsionando la
conformacin del enlace azucar-fosfato y una distorsin de la hlice tal que
la longitud de la misma se incrementar. La intercalacin ocurre
preferentemente en la secuencia pirimidina-3-5-purina que dentro de la
secuencia purina-3-5-pirimidina.
Figura 4-18. Agentes intercalantes del DNA
Las investigaciones sealan que los agentes intercalantes interfieren
con la topoisomerasa II. Esta enzima cataliza la ruptura pasajera de la doble
hlice de ADN para propsitos tales como replicacin o transcripcin. Aunque
la separacin ocurre en presencia de los intercaladores, la topoisomerasa II
quinacrina
N
OCH3
Cl
NHN
C2H5
C2H5
P = pptido
actinomicina
PP
O
N
O
CH3 CH3
C CO O
bromuro de etidium
+ -Br N
NH2H2N
C2H5acriflavina
NH2N NH2
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permanece firmemente unida en el punto daado y entonces previene el
acoplamiento de las hebras nuevamente. Actualmente, se piensa que la
intercalacin es la primera etapa en una serie de eventos que provocarn
dao al ADN por otros mecanismos.
Figura 4-19. Afectacin de la topoisomerasa
4.3. Evaluacin de la actividad mutagnica de xenobiticos
Muchas sustancias qumicas y agentes fsicos pueden provocar
citotoxicidad por diferentes mecanismos, uno de los cuales involucra la
interaccin con los cidos nuclicos provocando alteraciones de la
informacin gentica, con la consecuente produccin, ya sea, de un efecto
letal para la clula o daos dbiles o severos a una o ms de las funciones
celulares a nivel de ARN, membranas, protenas y enzimas. Los
experimentos para poder evaluar estos efectos llegan a ser complejos y
prolongados ya que implican animales completos, y estudios a travs de
varias generaciones. Ante tal situacin, se han desarrollado una serie de
pruebas in vitro de corta duracin (short-term) utilizando microorganismos,
plantas, insectos y cultivos celulares de mamferos. Estas pruebas sirven
para monitorear (screening) posibles agentes con actividad mutagnica,
teratognica y/o carcinognica.
Pruebas para la evaluacin de actividad mutagnica en procariotes
Basados en la hiptesis de que los carcingenos son inicialmente
mutgenos, Ames y colaboradores en la dcada de los 70s, realizaron
experimentos con varios microorganismos para encontrar sustancias con
actividad mutagnica. La cepa bacteriana que mejores resultados
proporcion fu la Salmonella typhimurium. (En la actualidad tambin se
utiliza Escherichia coli WP2 uvr A-). Las cepas originales fueron
genticamente incapaces de sintetizar histidina (his-). En este ensayo, se
incuban cepas de esta bacteria con algn xenobitico y en medio de cultivo
sin histidina. En estas circunstancias, un crecimiento de colonias es indicativo
de accin mutagnica del compuesto estudiado, al convertir un organismo
auxotrfico que requiere de un nutriente especfico para subsistir (histidina)
hacia un organismo prototrfico, que puede sintetizar el nutriente requerido
desde un precursor ms simple presente el medio de cultivo.
Figura 4-20. Prueba de Ames www.bioreliance.com/AMES_assay.html
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Dos variantes de esta tcnica, se utilizan al verter las mezclas de
microorganismos y xenobiticos, a las cajas de petri para posterior
incubacin. Estas variantes son: la incorporacin inmediata y la
preincubacin.
En la incorporacin inmediata, el control, el microorganismo y el
xenobitico, una vez que han sido mezclados, se vierten inmediatamente a
las cajas de Petri, para enseguida incubarlas a 37 C durante 48 h. sta
variante se presenta esquemticamente en la figura 4-11.
Figura 4-21. Pruebas para la actividad mutagnica en bacterias
Un aspecto adicional a considerar es la adicin de la fraccin S9.
Esta fraccin se obtiene del hgado de mamferos (usualmente ratas), a las
cuales se les administra previamente Aroclor 1254 (en la actualidad se
prefiere una mezcla de fenobarbital y 5,6-benzoflavona) para inducir las
enzimas que metabolizan xenobiticos.
Figura 4-22. Obtencin de la fraccin S9
Para mejores resultados, se prepara la mezcla S9 que consiste en
fraccin S9 (0.1-0.3 mL), MgCl2 (0.4 M, 0.02 mL), KCl (1.65 M, 0.02 mL),
glucosa 6-fosfato(1M, 0.005 mL), NADPH (0.1 M, 0.04 mL), NADH (0.1M,
0.04 mL), amortiguador de fosfato de sodio (0.2M, 0.5 mL). Todo esto se
afora a 1 mL.
La variante de preincubacin se describe a continuacin. Cantidades
disponibles (108 microorganismos/ mL) de microorganismo mutante, son
incubados en tubos de ensayo por 30 o 60 min, con medios pocos nutritivos,
una capa de agar y en presencia o ausencia del xenobitico a evaluar.
Transcurrido el tiempo, el contenido de los tubos se vierte sobre cajas de
petri que contiene una cantidad mnima de medio de cultivo y son incubadas
a 37 C por 48 h.
rataadministracin
del inductor
sacrificar y
extraer el
hgado
homogeneizar
en fro con
solucin salina
centrifugar
a 10, 000 g
el sobrenanante
se centrifuga a
102 000 g
al precipitado
se le denomina
fraccin micro-
somal S9
al sobrenadante
se le llama fracin
citoslica S100
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Los tubos de ensayo deben presentar 108 organismos por mL. En el tubo (A) se presenta medio de cultivo ms agar, en el tubo (B) se presenta el medio de cultivo ms la fraccin S-9 del hgado de rata inducido por Aroclor 1254; el tubo (C) presenta el medio de cultivo, la fraccin S-9 y el compuesto qumico que se va a evaluar. Los tubos se incuban a 37 C por 48 Hr. Sobre un rango de concentraciones del compuesto de prueba, el nmero de colonias debe incrementarse al aumentar la cantidad de sustancia.
Figura 4-23. Pasos generales de la prueba de Ames
Un aspecto importante a considerar es la concentracin del
xenobitico que se va a estudiar. Por esta razn, primero se lleva a cabo un
estudio de sensibilidad de la cepa a diferentes concentraciones del
xenobitico. Las concentraciones txicas (pendientes negativas, Figura
siguiente) de entrada se rechazan.
Para cada estudio se recomienda de 5 a 6 concentraciones diluidas
a una relacin del doble o triple. Cada estudio por duplicado. En la grfica
siguiente, la recta de pendiente positiva es la de utilidad. De esta parte se
determina el valor de dicha pendiente (m) que se interpreta como la actividad
mutagnica especfica, parmetro que nos sirve para evaluar la actividad
mutagnica del xenobitico estudiado.
m = actividad mutagnica especfica (n.c./mg) n.c. : nmero de colonias
Figura 4-24. Consideraciones para la prueba de Ames
En la actualidad se disponen de varias cepas de Salmonella
typhimurium para realizar las evaluaciones de actividad mutagnica. Algunas
de ellas se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 4-3. Algunas cepas de salmonella utilizadas para la prueba de Ames
Cepas de Salmonella typhimurium
Tipos de mutaciones detectadas
TA 1535 Detecta mutaciones por sustitucin de pares de bases
TA 100 Es derivada de la TA 1535, pero contiene el plsmido pKM101, el cual incrementa la sensibilidad al provocar fallas en los procesos de reparacin del ADN.
TA 102, TA 104 Detectan mutaciones por sustitucin de pares de bases que no detectan las cepas TA 1535 y TA 100.
TA 1537 Detecta mutaciones por adicin de bases. Presenta una mutacin en el gen hisC3076
n.c./caja
mg/caja
0
0 | | | |
efecto txico
sobre el
microorganismom
10 20 30 40
_
_
_
_
_
100
200
300
400
500
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TA 1538 Detecta mutaciones por adicin de bases. Presenta la mutacin en el gen hisD3052
TA 98 Es derivada de la TA 1538, presenta el plsmido pKM101
TA 1535 Detecta mutaciones por delecin de bases
YG 1024 Cepa sensible a aminas aromticas heterocclicas Claxton, L.D.; Allen, J.; Autetta, A.; Mortelmans, K.; Nestmann, E.; Zeiger, E. Guide for the Salmonella thyphimurium/mammalian microsome tests for bacterial mutagenicity. Muatation Research 1987, 189, 83-91.
Para ilustrar la aplicacin de la prueba de Ames, se presenta a
continuacin los resultados obtenidos al evaluar al caf soluble (Nescaf) con
este procedimiento.
Tabla 4-4. Actividad mutagnica especfica (n.c./mg) del caf soluble
Incorporacin inmediata Preincubacin
Cepa Sin S9 Con S9 Sin S9 Con S9
TA 98 1.92 0.91 negativo 9.15 0.90 2.43 0.24 TA 100 5.02 0.70 negativo 28.11 2.85 6.66 0.94 TA 102 15.05 0.61 9.83 0.57 30.38 2.87 26.70 2.87 TA 104 negativo negativo 34.10 2.28 negativo YG 1024
negativo negativo 14.47 3.77 negativo
Duarte, M.P.; Laires, A.; Gaspar, J.; Le o, D.; Oliveira, J.S.; Rueff, J. Genotoxicity of instand cofee: possible involvement og phenolic compounds. Mutation Research 1999, 442, 43-51
Los resultados obtenidos con cepas de distintas sensibilidades a
compuestos genotxicos, sugieren que los componentes del caf soluble
lesionaron al ADN por mecanismos diferentes. En este estudio, el procedimiento
de preincubacin previa fue ms eficiente en detectar la actividad mutagnica
que el de incorporacin inmediata. En ambos casos, la adicin de la fraccin S9,
disminuy la actividad mutagnica del caf, lo que indica que los compuestos
responsables, al metabolizarse perdieron sus caractersticas genotxicas.
Prueba SOS en bacterias (Escherichia coli) (Chromotest)
http://www.ebpi-kits.com/SOS-ChromoTest.pdf
Figura 4-25. El ensayo de SOS chemotest
Pruebas de mutagenicidad con clulas eucariotas in vitro
Intercambio de cromtides hermanas (SCE)
Esta prueba ha sido utilizada para detectar rupturas cromosmicas
por xenobiticos
-
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ClulaXenobitico
Fraccin S-9
.
lavar BrdU Colchicina
Replicaciones
No 1 No 2
ausencia de luz
Cromosomas en metafase
Preparacin de cortes
Teir
Observacin de
cromosomas
"arlequines" BrdU: bromodesoxiuridina
Figura 4-26. Pasos generales para la prueba de intercambio de cromtidas
Del cultivo celular de ovario de hamster (CHO) o pulmonares (V79)
se toman muestras que se incuban con el xenobitico en presencia y en
ausencia de alcuotas de la fraccin S-9 durante 2 h. En seguida, se lava
para remover el compuesto que no haya sido absorbido; las clulas son
transferidas a un medio que contiene 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) y se
permite que ocurran dos replicaciones de ADN (24 o 30 Hr). Transcurrido el
tiempo, se adiciona colchicina para detener el proceso de reproduccin en la
etapa de metafase. Cortes son preparados y teidos con colorantes
fluorescentes, expuestos a la luz ultravioleta, y fijados con Giemsa. Los
daos causados por la exposicin al xenobitico (rupturas, fragmentaciones,
etc.) se vern reflejados en el intercambio de piezas entre cromosomas. Este
efecto se observar en el microscopio por la presencia de una variedad de
patrones luminosos y obscuros en los cromosomas, quienes reciben el
nombre de arlequines.
Pruebas de mutagenicidad con clulas eucariotas in vivo
Pruebas con Drosophila melanogaster
La mayor ventaja de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster)
como un organismo de prueba en estudios toxicolgicos se enlistan a
continuacin:
- Una especie eucariota de reproduccin sexual
- Paralelismo entre sus clulas germinales con las del ser humano
- Genticamente bien conocido
- Presenta tres cromosomas grandes
- Muchas mutaciones con efectos visibles son marcadores tiles
- Presenta cromosomas especiales combinados con marcadores y
rearreglos
- Tiempo de generacin corto y gran nmero de progenie
- Es capaz de metabolizar una gran cantidad de xenobiticos, lo que
resulta conveniente en la transformacin de promutgenos a
mutgenos.
Uno de los sistemas de prueba se basa en que los machos de una
especie tienen un gen ligado al cromosoma X, que le da un color amarillo a
su cuerpo. Los machos de 2 das de edad son expuestos al xenobitico a
probar, disuelto a diferentes concentraciones en agua con azcar. Los
machos sobrevivientes son apareados con hembras. Si no hay machos de
cuerpo amarillo en la progenie, se asume que ha ocurrido una mutacin letal.
Con cantidades menores a la concentracin letal, se podrn observar
algunos machos de cuerpo amarillo, cuyo nmero guardar una relacin
-
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inversa con la concentracin de xenobitico a la que los progenitores han
sido expuestos.
Cuando se quiere monitorear un gran nmero de sustancias, para
evaluar los daos letales recesivos ligados al sexo (SLRL), la Drosophila
melanogaster es la mejor eleccin. En este ensayo se detectan efectos
letales asociados con mutaciones como microlesiones, deleciones, o
rearreglos cromosmicos. Los parmetros estudiados en clulas germinales
de las Drosophila son:
- Induccin de mutaciones relativas a citotoxicidad
- La proporcin de aberraciones cromosmicas para las mutaciones
letales recesivas
- El papel de los procesos de reparacin
- La influencia del tiempo de expresin en la formacin de
aberraciones cromosmicas
- La induccin de mutaciones relativas a uniones cuantitativas al ADN
Prueba de microncleos
Un microncleo (MN) se forma durante la transicin
metafase/anafase del proceso mittico. Surge de: a) un cromosoma entero o
b) de un pedazo del mismo. stos no se incorporan al ncleo de las clulas
hijas por carecer de un centrmero. El primer caso es ocasionado por una
sustancia aneugnica y el segundo, por una sustancia clastognica.
Figura 4-27. Microncleos ocasionados por a) dao aneugnico y por b) dao clastognico
Figura 4-28. Microncleo
Los microncleos se pueden presentar en cualquier tipo de clulas
de tejidos proliferativos (tejido heptico, eritrocitos en mdula sea,
linfocitos). Estas clulas, recolectadas de animales expuestos a xenobiticos,
pueden ser utilizadas para este ensayo. El ratn es la especie preferida para
inicial
Macho: cuerpo amarillo
(ligado al cromosoma X)
progenie
Macho: cuerpo amarillo
(ligado al cromosoma X)
Si no hay machos de
cuerpo amarillo, entonces
ha ocurrido una mutacin
Exposicin al xenobiotico
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este tipo de estudios. Recientes reportes han sealado el uso de peces, los
cuales tienen eritrocitos nucleados, como especies disponibles para el
monitoreo de dao mutagnico por contaminantes de cuerpos de aguas. As
mismo, se han utilizado algunas especies vegetales como Tradescantia spp
y Vicia faba, para evaluar la actividad mutagnica de algunos contaminantes
y frmacos.
El ensayo permite la deteccin de:
- Clastgenos (sustancia que rompe los cromosomas)
- Aneugenos (sustancias que afectan el huso mittico)
- Apoptosis
- Retraso mittico
- Ruptura de cromosomas
- Prdida de cromosomas
- No disyuncin de cromosomas
Ventajas del ensayo de microncleos
- El ensayo de MN es una alternativa al test de aberraciones
cromosmicas convencional.
- Se analizan las alteraciones presentes en metafases mitticas
- Permite detectar aberraciones cromosmicas que responden a
alteraciones de tipo estructural (efecto clastognico) o alteraciones
numricas (efecto aneugnico) del agente en estudio.
El ensayo Cometa
Utilizado para evaluar el potencial genotxico de diversas sustancias
qumicas.
Figura 4-29. Representacin de ensayo cometa
Est basado en la migracin de fragmentos rotos de ADN durante
un proceso electrofortico, el cual es una tcnica sensible que detecta:
- Rompimiento de cadenas sencillas
- Sitios lcali-lbiles
- Sitios de reparacin por escisin de bases nitrogenadas
Las principales ventajas del ensayo cometa incluyen:
- La obtencin de datos genticos a nivel de clulas individuales, lo
que permite que el estudio estadstico sea robusto
- La necesidad de un pequeo nmero de clulas (
-
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b) Se realiza un corrido electrofortico despus de lisar las clulas en el
microgel de agarosa.
c) Se colorea el ADN con Bromuro de etidio y se estima el dao mediante
la visualizacin de la fluorescencia del ADN que migra.
Figura 4-30. Referencia para las mediciones en el ensayo cometa
La cola del cometa representa la migracin del ADN. La longitud se
mide en micras desde el centro del ncleo hasta el ltimo punto de
fluorescencia.
Figura 4-31
Bibliografa
1. Klaassen, C. D., Casarett and Doulls Toxicology. The Basic Science of Poisons. Eighth ed.; 2013; p 1375-1390.
2. Hodgson, E., A Textbook of Modern Toxicology. John Wiley and Sons, Inc: U.S.A., 2010.
3 Stanton L. Gerson. MGMT: its role in cancer a etiology and cancer therapeutics
Nature Reviews Cancer (2004)4,296-307.