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Un metodo para la determinación de dos toxinas alternaría, alternariol y éter monometilicoeternariol, en productos de tomate

ABSTRACTO

Los tomates, como cualquier fruta de piel suave, son altamente susceptibles a la pudrición por hongos. Alternaria es el género más encontrado en los tomates. Un alternata y otro spp han demostrado que producen éter monometilalternariol (AME) y alternariol (AOH) en los tomates. Se ha desarrollado y evaluado un método para determinar AME y AOH en los tomates. El método involucra extracción con etanol, clasificación con sulfato de amonio y partición con cloroformo. La cuantificación fue conducida por cromatografía liquida de alta eficiencia con detector de diodos (DAD). El porcentaje de recuperación fue de 98,7% y 84,1% para AME y AOH respectivamente. Los límites de cuantificación del método, definidos como la cantidad mínima que permitieron la cuantificación y confirmación por el detector DAD, fueron 2,0 ng/g para AME y y 5,0 ng/g para AOH.

PALABRAS CLAVE: alternaría, micotoxinas, éter monometileternaril, alternariol, tomates

INTRODUCCION

El géneroalternaria contiene muchas plantas patógenas. Este coloniza un gran número de plantas agriculturalmente importantes. Este puede invadir tanto materiales sanos como debilitados o muertos antes de la cosecha y en determinadas condiciones dañará productos almacenados, El género produce 71 micotoxinas y ficotoxinas conocidas Entre las micotoxinas, alternariol (AOH) y éter monometílicoalternariol (AME) (Fig. 1) se informa que las toxinas producidas en grandes cantidades por toxigénicaAlternariaspp. Entre las fuentes de hongos conocidos para estas toxinasson A. alternata, A. dauci, A. cucumerina, A. solani y A. tenuissima.

Ambas toxinas causan efectos tóxicos agudos débilmente como se muestra por su LD50 que es superior a 400 mg / kg de peso corporal para los ratones. AME es citotóxica y AOH y AME muestran efectos sinérgicos. AOH es letal para los ratones no nacido a niveles de 100 mg / kg bw. Los estudios han indicado que AME es carcinógeno y mutágeno tras una semana de prueba de AMES utilizando Salmonella typhimurium, Se actuó como un fuerte mutágeno en las pruebas con Escherichiacoli, en AOHse observó no mutagenicidad.

Las toxinas de AME y AOH se han encontrado en el sorgo, semillas de girasol, cebada, trigo, avena, aceitunas, tomates, mandarinas, naranjas, pimientos y melones. Las cepas de Alternaria inoculadas en manzanas, tomates, arándanos, naranjas y limones

Producen las toxinas, demostrando su potencial de contaminación.

La alternaria presenta un problema especial para los tomates ya que es su invasor más frecuente. Esto abre la posibilidad de la presencia de micotoxinas en los productos y su evaluación se vuelve aconsejable con el fin de evaluar si existe un riesgo para los consumidores.No existen tales datos sobre los productos brasileños. Para lograr ese objetivo se realizó una búsqueda en la literatura para un método analítico adecuado para la AME y AOH en productos de tomate.

se ha descrito para la extracción de AME y AOH a partir de tomates el uso de cloroformo, cloroformo/etanol (4:1) acidificado y metanol/hexano (15:7), o columna de silica abierta, se ha descrito y la separación final y para cuantificación de las toxinas de tomates y otros alimentos se ha

empleado cromatografía de capa fina o cromatografía liquida de alta eficiencia con detección por absorbancia en el ultravioleta, por fluorescencia o por la electroquímica. Sorprendentemente, el detector de diodos (DAD) ha sido poco utilizado para micotoxinas y no ha sido utilizado para AME y AOH. Sin embargo, puede ser una herramienta útil para determinaciones de micotoxinas. El proceso de cuantificación puede también proporcionar al analista con los espectros UV del compuesto de interés y del patrón empleado. Si el compuesto de interés eluye sin interferencias, el analista puede ser capaz de confirmar la identidad de la toxina mediante la comparación de los espectros del pico de sospecha y del patrón, esto liberará al analista de tener que utilizar otras técnicas para la confirmación de la identidad del analito. Dichas técnicas pueden implicar reacciones químicas, espectrometría de masa, métodos de espectrometría de inmunoafinidad o infrarrojos o ultravioleta y puede ser tedioso y costoso o, en el caso de la espectrometría de masas, simplemente no está disponible en la institución donde se realiza el trabajo.

El presente documento describe un método para la determinación de AME y AOH en productos de tomate. Las etapas de extracción y limpieza son simples de realizar y utilizar disolventes y reactivos fácilmente disponibles.Se utilizaron la cromatografía líquida de alta eficiencia y la detección por red de diodos (DAD) para la cuantificación y la confirmación de la identidad. También se describe la evaluación intralaboratoriodel funcionamiento del método.

MATERIALES Y METODOS

Reactivos

Se obtuvo metanol grado analítico, cloroformo, sodio anhidro sulfato y hepta hidrato de sulfato de zinc y grado HPLC metanol de Merck (Darmstadt, Alemania). Los estándares de éter monometílico de alternariol y alternariol fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Las soluciones que contienen 0,133 mg / ml AME y 0,500 mg / ml AOH se prepararon en metanol. Los patrones de trabajo se

prepararon a continuación, con la necesidad. Las soluciones estándar se sometieron a ultrasonidos antes de su uso.

Preparación de la muestra

Productos de tomate como el jugo de tomate, pulpa, pasta, puré, y tomates cocidos enteros se mezclaron o sacudidos por homogeneidad.A 50 g portion of the product was weighed and transferred to blender with the help of 150 ml of methanol.Se mezcló a baja velocidad durante 3 minutos y se transfirió a un embudo de vidrio equipado con un papel de filtro estriado. Unos 50 ml de metanol adicional se utilizaron para lavar los residuos que quedaron en el vaso mezclador dentro del papel de filtro, Una alícuota de 200 ml del filtrado se recogió en un vaso de precipitados y se añadió 60 ml de una solución de sulfato de amonio al 10%, La mezcla se filtró a través de papel de filtro estriado. Luego se transfirió una alícuota de 200 ml del filtrado, o menos, a un embudo de separación y 50 ml de agua a 8 ° C, a continuación se añadieron. Se llevaron a cabo dos extracciones con 40 ml de cloroformo, agitando cada vez durante 2 minutos. Todo el cloroformo se recogió en un embudo de separación y se lavó con 30 ml de agua ultrapura a 5 - 8 ° C. A continuación, el cloroformo se transfiere a un cilindro graduado y el volumen observó para los cálculos futuros, El extracto de cloroformo se evaporó en un evaporador rotatorio a 35 ° C. El residuo se disolvió en metanol 2 ml y se filtró a través de sulfato sódico anhidro.

Cromatografia liquida

El sistema de HPLC consistió en un Hewlett-Packard HP 1050 cromatógrafo líquido (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EE.UU.) equipado con una válvula de muestra Rheodyne equipado con un bucle de 20 ml y un detector de matriz de diodos HP (modelo 1050, Phoenix y softwares Spectro macro). La columna analítica fue Spherisorb ODS-2, 5 mm, 250 mm (Fase Separaciones, Deeside, Chwyd, UK). Las soluciones de muestra y los patrones se sometieron a ultrasonidos durante 30 segundos antes de

la inyección en el cromatógrafo. La fase móvil fue metanol / agua (80:20) que contiene 300 mg ZnSO4 .H2O / L, 0,7 ml / min. La longitud de onda de cromatogramas de grabación fue de 250 nm. Una curva de calibración se construyó con fines de cuantificación utilizando los estándares de la toxina y que correlacionan pico del área frente a la concentración. La identidad de pico se confirmó por medio de la comparación del espectro del patrón con el pico presuntamente positivo en la muestra después de la normalización.Los límites cuantificación del método se tomaron como la cantidad mínima de la toxina detectada en el producto que permitió la confirmación por el detector de longitud de onda múltiple. Los límites de detección de las toxinas puras por el detector DAD se midieron como tres veces la variación estándar de línea de base en las mismas condiciones empleadas para los productos de tomate.

RESULTADOS Y DISCUSION

Varias técnicas para la extracción y limpieza de AME y AOH descrito en la literatura fueron juzgadAs, ya sea aislados o en combinación, con resultados insatisfactorios en términos de recuperación, el tiempo implicado en la realización del análisis, o uso de grandes cantidades de disolventes, alguno altamente tóxico. Todo esto llevó al desarrollo del procedimiento descrito en el presente documento, La evaluación intralaboratorial del procedimiento propuesto incluyó las siguientes pruebas: la recuperación, la precisión y el límite de detección y la robustez. Las recuperaciones promedio de siete niveles de adición de patrones puros a la pasta de tomate fueron 98,7% y 84,1% para la AME y AOH, respectivamente. Las recuperaciones de 70% o más se consideran aceptables para análisis de trazas en niveles ung / g. Los RSDs promedio entre duplicados para 14 preparaciones de muestras, para muestras de productos de tomate de pinchos (Fig. 2), eran 0,8% para AME y 5,4% para AOH, lo que indica una excelente precisión para el método propuesto. Horwitz et al. Demostrando que a niveles de 1 ng / g de precisión entre ensayos de laboratorio bien realizados con muestras ciegas puede

alcanzar 45%, Los duplicados de la misma muestra analizada en el mismo laboratorio pueden estar dentro de 2/3 o 1/2 de este valor. Estos valores aparentemente altos RSD son consecuencia de las dificultades para cuantificar las sustancias a nivel de trazas.Horwitz también mostró que a los 20 ng/g la mayoria de los resultados para la misma muestra tiene valores de RSD de 30% yintralaboratorios RSD de 20%.

Los límites de detección del detector DAD para patrones puros fueron tomados como tres veces la desviación estándar de la línea de base de acuerdo con las directrices de la Sociedad Química Americana Subcomité sobre Química Analítica Ambiental, La longitud de onda se estableció en 250 nm. Los límites de detección fueron de 0.6 ng y 1,0 ng de AME y AOH, respectivamente. Los límites de método de cuantificación para las mismas toxinas se tomaron como la cantidad mínima de la toxina detectada en un producto de tomate que permitió la cuantificación y la confirmación por el detector DAD, Ellos fueron 2,0 ng / g y 5,0 ng / g de AME y AOH, respectivamente. Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de uso, 0,57 a 12,04 ng / ml, con un coeficiente de correlación de 0,9932, para AME y 0,37 a 15,0 ng / ml, con un coeficiente de correlación de 0,9995, por AOH. La comparación entre los espectros de los estándares puros y de las toxinas añadidas a la matriz de tomate (Fig. 3) permite la conclusión de que la separación de la toxina era completa y que no había compuestos de interferencia.

Una prueba de resistencia se llevó a cabo de acuerdo con Wernimont, Se evalúa el comportamiento del método en la cara de pequeños cambios en las condiciones de trabajo, Las condiciones evaluadas fueron la calidad y los volúmenes de disolventes, concentración de la solución de sulfato de amonio utilizado como agente clarificante, y la temperatura utilizada para el secado final del extracto, Las recuperaciones variaron desde 85,9 hasta 88,6% y 76,3 a 92,8% para él AME y para AOH, respectivamente, Indican un buen grado de resistencia en el procedimiento que se está probando.Los factores aislados muestran la importancia

de algunos de los factores estudiados en las recuperaciones de las toxinas, también mostró que AME fue menos afectada por los cambios en el procedimiento analítico.La calidad de la cloroformo seguido por el del metanol fueron las variables más importantes para la recuperación de AOH. Las diferentes marcas de disolventes pueden contener diferentes cantidades y tipos de impurezas. estas impurezas, por lo general otros compuestos orgánicos, cambian la polaridad del disolvente y pueden afectar a la recuperación de cualquier compuesto sensible a pequeños cambios en la polaridad de una extracción o disolvente de elución