Biología II

Cuantificación de Proteínas

Integrantes:

Turno: MañanaIntroducción

Para estimar el valor de una concentración de proteinas en una muestra hay dos métodos. Uno es la absorción de luz ultravioleta (UV) y la otra es por métodos colorimétricos.

Absorción de luz ultravioleta

Se caracteriza por la absorción de la luz ultravioleta por parte de las proteinas. Presenta dos picos máximos respecto a la absorción. 280 y 200 nm

-280 nm: Existen proteínas constituidas por aminoácidos que tienen anillos aromáticos, los cuales absorben fotones por medio de sus electrones. Ejemplos: tirosina, fenilanina, triptofano, histidina.

- 210nm: Por debajo de este, absorben fotones los encales peptídicos.

Este método se procede sin agregar ningún reactivo a la muestra, no requiere incubación, por lo tanto se lleva a cabo rápidamente y la relación entre la absorción y la concentración proteica es lineal.

Métodos colorimétricos

Este segundo método se lleva a cabo agregando diferentes reactivos químicos que reaccionan con las proteínas, en consecuencia se tiñe de color y es medido en el espectofotómetro. Al igual que la luz ultravioleta, la relación entre la absorcíon y la concentración proteica es lineal, en un determinado rango.

Mientras se lleva a cabo la coloración, se realiza una curva con diferentes diluciones de una solución patrón, a la cual se le conoce la concentración. Se estima que los valores que se obtienen, mantienen relación con la curva realizada, tomada como referencia. Todo se realiza en simultáneo con la muestra incógnita, a tener en cuenta variaciones de tiempo y temperatura, la reacción de los reguladores utilizados y su descomposición.

Objetivos

- Determinar la concenctración de una muestra proteica mediante el método de coloración de Bradford

Materiales

- Solución madre de Albúmina bovina (BSA)

- Solución ácida del reactivo de color (Coomassie Blue G)

- Alcohol

- Tubos de hemólisis

- Micropipetas

- espectrofotómetro

Metodología

Procedimiento

- Realizar diluciones de muestra conocida y de muestra incógnita

- Encender el espectrofotómetro

- Agregar 1 ml de Bradford e incubar 5 minutos

- Medir la absorbancia correspondiente de cada dilución

- Obtener la curva patrón

- Calcular las concentraciones de las muestras incógnitas

Resultados

0 1 2 3 4 5 6 7 80

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.074342686699072 xR² = 0.957599708945761

Muestra patrón 1

Concentración (mg/ml)

Abso

rban

cia

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6f(x) = 0.0739882352941177 xR² = 0.912092135519918

Muestra patrón 2

Concentración (mg/ml)

Abso

rban

cia

Referencias:

Muestra patrón 1: curva punto a punto

Muestra patrón 2: curva seriada

La muestra patrón 2 no la usaremos ya que presenta mayor error.

Obtención de las concentraciones de la muestra incógnita que se midieron (punto a punto):

Y=0.00743x (ecuación de la cual se obtienen las concentraciones)

Concentraciones obtenidas (mg/ml) AbsorbanciaA 4.56 0.339B 6.42 0.477C 7.15 0.531D 7.62 0.566

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.0742872680521669 xR² = 0.999999897615438

Muestra incógnita

Concentración (mg/ml)

Abso

rban

cia

Obtención de las concentraciones del promedio de las muestras medidas punto a punto:

Concentraciones obtenidas

Absorbancia (promedio)

A 2.73 0.203B 6.33 0.4705C 6.72 0.4995D 7.06 0.5245

0 1 2 3 4 5 6 7 80

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.0743178683139237 xR² = 0.999999926119187

Promedio muestra incógnita

Concentracion (mg/ml)

Abso

rban

cia

Conclusiones:

A partir de una curva de calibración (curva patrón), que fue medida con concentraciones conocidas, se pudo determinar aproximadamente la concentración de proteínas presentes en una solución incógnita.

Las concentraciones obtenidas no fueron las esperadas, esto puede deberse a un error experimental o de medición. Por otro lado el hecho de que la muestra c se hallaba en el límite de curva patrón y la muestra d fuera del él los resultados al no estar incluidos en la curva, no teníamos patrones para comparar que fueran cercanos a lo que se obtuvo. Para que las muestras entraran en la curva, se debió diluir al medio la solución y a la concentración obtenida multiplicarla por dos. Esto no pudo realizarse por cuestiones de tiempo.

Luego se realizó un promedio de las absorbancias medidas punto a punto y se obtuvo unos resultados más cercanos a los esperados.

Cuestionario

1- ¿Cuál es la longitud de onda a la que deberá leer las muestras luego de reaccionar con el reactivo de color?

Deberá utilizar una longitud de onda que oscile entre los 465 y 595 nm, ya que es el pico máximo de absorción del colorante luego de haber agregado la proteína, a consecuencia de las interacciones iónicas e hidrofóbicas.

2- Usted cuenta con una solución de albúmina pura y quiere determinar su concentración. Se le ha acabado el Coomassie y por problemas presupuestarios no puede comprarlo por ahora y no tiene a nadie que le preste un poco. Sin embargo cuenta en el laboratorio con un espectrofotómetro que lee hasta 280 nm, cubetas de plástico y de cuarzo.

¿Podrá calcular la concentración de la solución? ¿Qué precauciones debería tener? ¿Podrá hacer lo mismo con una solución mezcla de proteínas?

Si, se podrá calcular la concentración de la solución utilizando el espectrofotómetro, ya que es posible cuatificar mediante luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda entre 200 y 280 nm (límite). La cubeta deberá ser de cuarzo debido a que debajo de esa longitud de onda, el vidrio y el plástico absorven. Se deberá tener en cuenta el tipo de proteinas a cuantificar en solución, ya que cada una tiene una estructura y un enlace peptídico diferente; por eso mismo en la solución mezcla será más difícil de calcular sus concentraciones individuales. En conclusión, es preferible calcular las concentraciones por separado y luego la absorvancia total de la solución.