*

IntroduccinFluorescencia, Fosforescencia, QuimioluminiscenciaCaractersticas analticas

Teora de la Fluorescencia y Fosforescencia

Tipo de espectros

Variables que afectan a la FluorescenciaFluorescencia y estructuraFluorescencia y entorno qumicoFluorescencia y concentracinInstrumentacin

Aplicaciones al anlisis de alimentos

*CONTENIDOS

1. IntroduccinMtodos luminiscentes molecularesFluorescenciaFosforescenciaQuimioluminiscenciaA A* A + h Espectro de emisinAnlisis cualitativoAnlisis CuantitativoAbsorcin de fotones (h )Reaccin qumica Basados en la emisin de radiacin electromagntica por molculas que previamente han sido excitadas. Cada especie A emite radiaciones de caractersticas Anlisis cualitativo La intensidad de la radiacin IF es proporcional a la [A] Anlisis cuantitativo*

1. Introduccin La fluorescencia es un fenmeno que fue conocido en el siglo XIX por Stoke: observ fluorescencia en el mineral de fluorita .Bajo luz del solBajo luz ultravioletaAgua tnica El agua tnica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del rbol de la quina, y tiene propiedades antipirticas, analgsicas y contra la malaria.La quinina es una sustancia fluorescenteLuz UVLuz mayorExcitacinEmisinFig. 1*Fig. 2

Caractersticas analticas*1. Introduccin

2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescenciaA + hexcitacin A* A + hemisin hexcitacin hemisin excitacin emisin E0E1hexcitacinhemisinEstados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.Estado electrnico molecular singlete: los espines de los e- estn apareados

Estado electrnico molecular triplete: los espines de los e- estn desapareadosFluorescenciaFosforescencia*

Diagrama parcial de energa para un sistema fotoluminiscente2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

La velocidad a la que un fotn de radiacin es absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s La emisin fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente ms lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso de excitacin La emisin fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ms.Velocidad de absorcin y de emisin*2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitadoProcesos de desactivacinEstado excitadoEstado fundamentalLa fotoluminiscencia slo la presentan un nmero relativamente pequeo de sistemas con caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivacin no radiantes sean mas lentos que los de emisin.*2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

Espectro de excitacin: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la emisin y variando la excitacinEspectro de emisin : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la excitacin y variando la emisin.Los anlisis se efectan seleccionando excitacin y emisin mximas.

FenantrenoExcitacinEmisin FluorescenteEmisin FosforescenteEspectros de excitacin y emisin de fluorescencia y fosforescencia*3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia Cada uno es una imagen especular del otro.Las emisin son mayores que excitacin *3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

Antracenoa) espectro excitacinb) espectro fluorescente

Cada uno es una imagen especular del otroEspectros de excitacin y emisin de fluorescencia *3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

4. Variables que afectan a la fluorescenciaEstructura qumicaEntorno qumico Sustancia fluorescenteIntensidad de emisin fluorescente*

= n molculas que emiten fluorescencia/n total de molculas excitadas = n fotones emitidos/n fotones absorbidosRendimiento cuntico de fluorescencia: K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivacin posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversin externa (Kce), conversin interna (Kci), predisociacin (Kpd) y disociacin (Kd ). Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades exaltan la fluorescencia = KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd Rendimiento cuntico y tipo de transicin:La eficacia cuntica es mayor para las transiciones -**4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y estructuraPueden presentar fluorescencia: Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.

Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas

La fluorescencia ms intensa es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromticos con transiciones * de baja energa La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin. La eficacia cuntica normalmente aumenta con el nmero de anillos y con su grado de condensacin*4. Variables que afectan a la fluorescenciaFig. 1Fig. 2AntracenoFenantreno

Fluorescencia y estructura*4. Variables que afectan a la fluorescencia

La sustitucin en el anillo bencnico produce: Desplazamientos de la de los mximos de excitacin y emisin Un aumento o disminucin de la intensidad de fluorescencia segn el sustituyenteFluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes*4. Variables que afectan a la fluorescencia

Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno

Compuesto

Frmula

Longitud de onda de la fluorescencia, nm

Intensidad relativa de la fluorescencia

Benceno

C6H6

270-310

10

Tolueno

C6H5CH3

270-320

17

Propilbenceno

C6H5C3H7

270-320

17

Fluorobenceno

C6H5F

270-320

10

Clorobenceno

C6H5Cl

275-345

7

Bromobenceno

C6H5Br

290-380

5

Iodobenceno

C6H5I

-

0

Fenol

C6H5OH

285-365

18

In fenolato

C6H5O-

310-400

10

Anisol

C6H5OCH3

285-345

20

Anilina

C6H5NH2

310-405

20

In anilinio

C6H5NH3+

-

0

cido benzico

C6H5COOH

310-390

3

Benzonitrilo

C6H5CN

280-360

20

Nitrobenceno

C6H5NO2

-

0

Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazndola a mayores l.Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transicin n-p *.Los halgenos producen efecto de tomo pesado internoLos grupos sulfnicos no modifican significativamente la fluorescencia*Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes4. Variables que afectan a la fluorescencia

= 1= 0,2 La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. La emisin fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie slida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorcin La influencia de la rigidez tambin explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando forman complejos con iones metlicos. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolena es mucho menor que la de su complejo de zincFluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural*4. Variables que afectan a la fluorescencia

TemperaturaUn aumento de temperatura provoca disminucin de I FFluorescencia y entorno qumicoIFTemperatura C DisolventeLa fluorescencia de una molcula disminuye en presencia de disolventes que contengan tomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo *4. Variables que afectan a la fluorescencia

pHInfluye en la fluorescencia de compuestos aromticos con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo.

AnilinaIn anilinioFluorescencia y entorno qumicoIF = 0If = 20 Oxgeno disueltoReduce la intensidad de fluorescencia de una disolucin

*4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y concentracin La intensidad de emisin fluorescente (IF) es proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentracin de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolucin es pequea a las longitudes de onda de excitacin y de emisin . IF = k P0 cIF = K cRelacin entre la intensidad de fluorescencia y la concentracinAl aumentar P0 aumenta IF Anlisis de trazasPara concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c Anlisis cuantitativo*4. Variables que afectan a la fluorescencia

5. InstrumentacinEsquema de un espectrofluormetroen ngulo recto*Dispositivo de lecturaFuente deradiacinMonocromadorde excitacin Cubeta de muestraMonocromadorde emisinDetectorRegistradoro PCMuchaslongitudes de ondaUna longitud de ondaexcemUna longitud de ondaLuminiscencia a muchaslongitudes de onda

Detectores De mayor potencia que las que se utilizan en absorcin. La energa radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente. Lmpara de arco de mercurio, Lmpara de arco de xenn, Lseres de N2 o de ArCubetasSeleccin ex y em Filtros: fluormetro Monocromadores : espectrofluormetroFuente de luzVidrio o cuarzoRectangulares, con las cuatro caras pulimentadasTubos fotomultiplicadores.*5. Instrumentacin

6. AplicacionesAnlisis cualitativo Poca aplicacin. la fluorescencia es valiosa en la identificacin de derrames de petroleros. Anlisis cuantitativoLa aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales

Los mtodos fluorescentes son : Aplicables a intervalos de concentracin ms bajos los de absorcin Tienen sensibilidades mayores que los mtodos de absorcin. Tienen una precisin y exactitud menor que las de los de absorcin.Muy selectivos, con una selectividad mayor que los mtodos de absorcin.*

Los basados en la reaccin del analito con un agente de complejacin para formar un complejo fluorescente. Se utilizan para cationesAnlisis cuantitativoDeterminacin de especies inorgnicasSe han desarrollado mtodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgnicas, orgnicas y bioqumicas.Los indirectos, basados en la disminucin de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interaccin del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinacin de oxgeno en disolucin. Determinacin de Al (III)El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 g/mL.GAR + Al (III) GAR - Al (III)Determinacin de anin F-, se basa en la desactivacin de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III)GAR - Al (III) + F- GAR + Al(III)-F*6. Aplicaciones

Determinacin de sustancias orgnicas y bioqumicasAnlisis cuantitativoEl nmero de aplicaciones de los mtodos fluorimtricos a problemas orgnicos es muy elevado Pueden determinarse por fluorescencia los aminocidos, protenas, coenzimas, vitaminas, cidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, cido antranlico, hidrocarburos policclicos aromticos, cistena, guanina, isoniazida, naftoles, cido saliclico, triptfano, cido rico y numerosos metabolitos. Tambin muchos agentes medicinales pueden determinarse por fluorimetra, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina y dietilamida del cido lisrgico (LSD).

La aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales.

*6. Aplicaciones

Determinacin de cationes y aniones Determinacin de quinina Determinacin de colorantes Determinacin de pesticidas Determinacin de vitaminasAplicaciones al anlisis de alimentos*6. Aplicaciones

*Logo encabezado pginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Direccin web: http://ocw.um.es..Pgina 4. Fig. 1. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg. Author: Didier Descouens.Pgina 4. Fig. 2. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg. Author: User:Splarka from en:wpPgina 15, Fig. 1. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1. Author: Calvero.Pgina 15, Fig. 2. Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG. CRDITOS DE LAS ILUSTRACIONES PICTURES COPYRIGHTS

**En este tema se consideran tres tipos de mtodos pticos relacionados entre s:Mtodos Fotoluminiscentes: Fluorescencia y fosforescencia molecularQuimioluminiscencia. En todos ellos, las molculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisin suministra informacin para el anlisis cualitativo y cuantitativo. Los mtodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.Fotoluminiscencia: Fluorescencia y Fosforescencia La excitacin se consigue mediante la absorcin de fotones. La fluorescencia presenta una vida corta, cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5s). Fosforescencia: la radiacin se mantiene durante un tiempo fcilmente detectable, despus de haber acabado la irradiacin a menudo varios segundos o ms. La emisin fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la radiacin utilizada para su excitacin.Quimioluminiscencia La quimioluminiscencia, se basa en el espectro de emisin de una especie excitada que se forma en el curso de una reaccin qumica entre el analito y un reactivo adecuado. **La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los tomos y molculas se excitan con la absorcin de la radiacin electromagntica. La especie excitada se relaja al estado fundamental y emite su exceso de energa como fotones. La caracterstica ms atractiva de la fluorescencia molecular es su sensibilidad inherente, habitualmente de uno a tres rdenes de magnitud mayor que con la espectroscopia de absorcin. Otra ventaja de los mtodos de fluorescencia es su amplio intervalo de concentracin lineal, significativamente mayor que en la espectroscopia de absorcin. Sin embargo, los mtodos de fluorescencia tienen menos aplicaciones que los mtodos de absorcin, dado el nmero relativamente limitado de sistemas qumicos que presentan fluorescencia apreciable. Adems, esta ltima se ve sujeta a muchos ms efectos de interferencia ambiental que los mtodos de absorcin. *************************