técnico en análisis y técnico en producción tecnología de...

Página de

Página 1 de 122

Técnico en Producción

Módulo IITecnología para la conservación y transformación de la leche

Submódulo IIEfectuar análisis fisicoquímicos a la leche y productos lácteos

Técnico en Análisis y Tecnología de los

Alimentos

Módulo IIProcesa alimentos a base de leche

Submódulo IIIEfectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos

Versión 1.0 Junio, 2009

Página de

Página 3 de 122

Guillermina Galindo Figueroa Nayarit

Enrique Gómez Sánchez Tabasco

Víctor Hernández Coello Yucatán

Ana Isabel Soto Rojas Veracruz

Adriana García Ortiz Hidalgo

Antonio Ix Chuc Campeche

Manuel G. Méndez Monforte Yucatán

Página de

Página 4 de 122

En este módulo que actualmente cursas, aprenderás todo lo relacionado a la obtención y análisis de

alimentos procesados a base de leche, por lo tanto también deberás comprender sobre los análisis

microbiológicos necesarios e imprescindibles para el aseguramiento de la calidad de la leche y de los

productos lácteos, lo que permitirá garantizar la inocuidad, la calidad microbiológica y la aceptabilidad

de los alimentos.

Serás guiado durante el transcurso del submódulo tres para que seas capaz de realizar análisis

microbiológicos a leche y sus derivados; aprenderás sobre conteo de hongos y levaduras, coliformes

totales, coliformes fecales, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y

mesofílicos aerobios, a leche y productos lácteos; con los datos obtenidos de los análisis podrás

realizar los reportes correspondientes.

No olvides que lo importante es que tus habilidades y destrezas se desarrollen cada vez mejor y lo

lograrás con los ejemplos, ejercicios y prácticas que te proporcionaré más adelante. Al final de todo el

seguimiento de esta guía de aprendizaje, habrás adquirido las competencias del submódulo 3, con

base en el programa de estudios.

Página de

Página 5 de 122

Página de

Página 6 de 122

Módulo II Procesa Alimentos a Base de Leche

Submódulo III Efectúa Análisis Microbiológicos a Leche y Productos Lácteos

Competencia 1 Competencia 2

1.-Realiza análisis microbiológicos a la leche procesada de acuerdo a las normas vigentes en la materia

2.-Realiza análisis microbiológicos a derivados de la leche, de acuerdo a las normas vigentes en la materia.

Atributos de la Competencia Atributos de la Competencia

• Realiza el conteo de hongos y levaduras.

• Realiza la determinación de coliformes totales

• Realiza la determinación de coliformes fecales

• Realiza la determinación de Salmonella

• Realiza la determinación de Staphylococcus

• Realiza la determinación de bacterias mesofílicas aerobias

• Realiza la determinación de Listeria monocytogenes

• Realiza el conteo de hongos y levaduras. • Realiza la determinación de coliformes

totales • Realiza la determinación de coliformes

fecales • Realiza la determinación de Salmonella • Realiza la determinación de

Staphylococcus • Realiza la determinación de bacterias

mesofílicas aerobias • Realiza la determinación de Listeria

monocytogenes

Saberes Saberes

• Características generales de los microorganismos.

• Métodos de esterilización. • Preparación de medios de cultivo.

• Características generales de los microorganismos.

• Métodos de esterilización. • Preparación de medios de cultivo.

Técnico en Análisis y Tecnología de los Alimentos

Página de

Página 7 de 122

• Preparación y dilución de la muestra. • Cuenta de bacterias mesofílicas

aerobias en base a la NMX-F-253-1977.

• Cuenta de microorganismos coliformes totales en base a ala NOM-113-SSA1-1994.

• Conteo de hongos y levaduras en base a la NMX-F-255-1978.

• Determinación de Salmonella en base a la NMX-F-304-1977.

• Determinación de coliformes fecales en base en la NMX-F-308-1992.

• Determinación de Staphylococcus en base a la NMX-F-310-1978.

• Determinación de Listeria en base a la NOM-143-SSA1-1995.

• Preparación y dilución de la muestra. • Cuenta de bacterias mesofílicas

aerobias en base a la NMX-F-253-1977. • Cuenta de microorganismos coliformes

totales en base a ala NOM-113-SSA1-1994.

• Conteo de hongos y levaduras en base a la NMX-F-255-1978.

• Determinación de Salmonella en base a la NMX-F-304-1977.

• Determinación de coliformes fecales en base en la NMX-F-308-1992.

• Determinación de Staphylococcus en base a la NMX-F-310-1978.

• Determinación Listeria en base a la NOM-143-SSA1-1995.

Actitudes: Actitudes:

• Responsabilidad • Orden • Limpieza

• Responsabilidad • Orden • Limpieza

Página de

Página 8 de 122

Página de

Página 9 de 122

Hola, soy tu amigo Microscopio y te acompañaré durante el seguimiento de esta guía de

aprendizaje!!! Estas por comenzar el tercer submódulo del módulo dos de tu formación profesional:

Efectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos. En el módulo uno: Procesa Alimentos a

Base de Frutas y Hortalizas, tuviste tu primera experiencia en lo que se refiere a este fantástico

mundo de los microorganismos y su relación con los alimentos procesados.

Los microorganismos, o microbios como se conocen comúnmente, son de interés sobresaliente en la

industria de la transformación de alimentos, ya que son causantes de enfermedades en los humanos,

al contaminar los alimentos y descomponerlos. En éste submódulo obtendrás conocimientos sobre

los patógenos que pueden contaminar la leche y los productos lácteos; aprenderás también sobre las

diferentes técnicas para la identificación de tales patógenos; vas a adquirir conocimientos de

toxicología, análisis de alimentos, microbiología de alimentos y procesos de calidad. Para que logres

los conocimientos que te acabo de mencionar, voy a guiarte a través de actividades prácticas que

incluyen desde tomar muestras, hasta realizar los análisis respectivos, todo para que logres

interpretar tus resultados y puedas realizar el reporte correspondiente. Se dice fácil, ¡¡¡pues sí, lo es!!!

Ya que para eso estoy contigo, para facilitar tu aprendizaje de manera amena y divertida.

Para que tu aprendizaje sea completo, será importante que sigas las indicaciones con orden, limpieza

y responsabilidad. Todo lo que aprendas te permitirá desarrollar los atributos de cada una de las

competencias profesionales planteadas, necesarias para que puedas laborar en el campo del control

de calidad microbiológica de la leche y los productos lácteos.

Página de

Página 10 de 122

Página de

Página 11 de 122

Mi palabra es la ley

Pero cómo cambia el clima

¿Puedo vivir aquí?

A que no me ves

¿Me llevas?

¿Cuánto tiempo crees que viviré?

Realiza análisis microbiológicos a la leche procesada de acuerdo a las normas vigentes en la materia

1

Página de

Página 12 de 122

Conteo de hongos y levaduras

Conteo de coliformes totales y fecales

Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias

Determinación de Salmonella

Determinación de Staphylococcus aureus

Determinación de Listeria monocytogenes

Página de

Página 13 de 122

En los métodos de procesamiento de alimentos a base de leche es importante el control de calidad

por lo que debes aprender la realización de análisis fisicoquímicos y microbiológicos; éstos últimos

son necesarios e imprescindibles para el aseguramiento de la calidad de la leche y de los productos

lácteos, lo que permitirá garantizar la inocuidad, la calidad microbiológica y la aceptabilidad de los

alimentos. Para lograr lo anterior se han desarrollado técnicas para promover el crecimiento y

desarrollo de los microorganismos e identificarlos con la ayuda del imprescindible microscopio.

¿Te gustaría saber cuáles son y cómo se ejecutan dichas técnicas? Pues con esta guía podrás

lograrlo, ya que te ayudará para que de una manera práctica desarrolles habilidades y destrezas con

la finalidad de que logres desempeñarte en el área de control de calidad microbiológica en las

empresas procesadoras de lácteos.

Para apoyarte en tu aprendizaje visitarás empresas procesadoras de lácteos donde acudirás al

laboratorio de análisis microbiológicos, además realizarás los análisis correspondientes en el

laboratorio de tu escuela a los alimentos que tú mismo hayas procesado; después deberás comparar

los resultados que obtengas con los estándares de calidad que dictan las normas oficiales, para que

realices tu reporte señalando tus conclusiones, de tal manera que puedas demostrar desempeño

durante la ejecución de los análisis y tengas evidencia a través de tus reportes.

Página de

Página 14 de 122

Encuadre grupal

ATRIBUTOS DE LA

COMPETENCIA

• Realiza el conteo de hongos y levaduras. • Realiza la determinación de coliformes totales • Realiza la determinación de coliformes fecales • Realiza la determinación de Salmonella • Realiza la determinación de Staphylococcus • Realiza la determinación de bacterias mesofílicas aerobias • Realiza la determinación de Listeria monocytogenes

RESULTADO DE APRENDIZAJE

Efectúa análisis microbiológicos a leche y derivados lácteos, de acuerdo a las normas vigentes en la materia y a los requerimientos del sector productivo lechero, siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.

Página de

Página 15 de 122

En el módulo 1, submódulo III, realizaste prácticas para la determinación de microorganismo, ahora deberás hacer determinaciones en leche procesada, y como ya has visto las técnicas para la identificación de los microorganismos están desarrolladas en Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas, mismas que puedes consultar en el catálogo de normas del siguiente portal: http://www.economia.gob.mx.

Tipo de microorganismo

Norma Oficial Mexicana o Norma Mexicana

Nombre de la norma.

Hongos y levaduras NMX-F-255-1978 Método de conteo de hongos y levaduras en alimentos

Coliformes NMX-F-308-1992 Cuenta de organismos coliformes fecales

Mesofílicos aerobios NMX-F-253-1977 Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias.

Staphylococcus aureus

NOM-115-SSA1-1994 Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

Listeria NOM-143-SSA1-1995 Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes.

Salmonella NMX-F-304-1977* Método general de investigación de Salmonella en alimentos.

*Esta última aparece en la Declaratoria de cancelación de normas mexicanas, publicada por la Secretaría de Economía el jueves 9 de octubre de 2008 en el Diario Oficial de la Federación (Segunda sección).

Nombre Mi palabra es la ley. No. 1

Instrucciones para el Alumno

Revisa en el internet el contenido de las siguientes normas e identifica los elementos que se te piden.

Saberes a adquirir

Elementos de las NOM y NMX necesarios para la realización de las prácticas.

Manera Didáctica

de Lograrlos

Analiza detenidamente cada uno de los elementos de las NOM y NMX.

Página de

Página 16 de 122

Como podrás identificar al revisar estas normas, están formadas por las siguientes partes:

1. Nombre

2. Objetivo y campo de aplicación

3. Referencias

4. Material y equipo

5. Medios de cultivo y reactivos

6. Procedimiento

7. Interpretación de resultados

8. Bibliografía

9. Concordancia con normas internacionales

10. Fecha de aprobación y publicación

11. Firma.

¿Cuáles de estas partes nos son de utilidad para la realización de prácticas en el laboratorio y para el reporte de resultados?

Página de

Página 17 de 122

Clasificación de medios de cultivo Características del medio Tipo de microorganismo que puede desarrollarse

Líquidos Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen

Semisólidos Por su

aspecto físico Sólidos Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología.

Medios selectivos Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.

Métodos selectivos de enriquecimiento

Nombre ¿Puedo vivir aquí? No. 1

Instrucciones para el Alumno Investiga y completa el siguiente cuadro

Saberes a adquirir

Tipos de microorganismo

Clasificación de los medios de cultivo

Manera Didáctica

de Lograrlos

Investigando y analizando el contenido de las siguientes Normas Oficiales Mexicanas:

NOM-065-SSA1-1993

Página de

Página 18 de 122

Medios diferenciales

Métodos para cultivar gérmenes anaeróbicos

Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.

Métodos para medir la potencia de los

antibióticos

Medios de transporte

Medios para filtración a través de membrana

Medios especiales para cultivo de hongos

y levaduras

Hongos y levaduras Por su uso

Métodos especiales para cultivo de protozoarios

Con la información que aprendiste en el Módulo 1, con la de este ejemplo, completa el cuadro para

las siguientes pruebas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria y Salmonella.

Microorganismo Método de

enriquecimiento

Tiempo de

incubación

Tipo de siembra Método de

aislamiento

Escherichia coli

Staphylococcus

aureus

Listeria

Salmonella

Página de

Página 19 de 122

La toma de muestras es el acto de separar de una partida determinada, una muestra

representativa, a efectos de determinar mediante análisis organoléptico y/o de laboratorio la aptitud o no del alimento puesto a consideración. En la práctica profesional de la Microbiología de Alimentos antes de tomar las muestras hay que tener un “plan de muestreo” que es el criterio de aceptación del punto de vista microbiológico para un determinado lote de alimento. Para elegir un plan de muestreo se tiene en cuenta cuatro puntos:

1. La peligrosidad del microorganismo.

2. La cantidad de microorganismos presentes en el alimento.

3. Las condiciones que será sometido el alimento antes de consumir.

4. La población que va a consumir ese alimento.

Luego de esto se procede al envasado de las muestras y su transporte, los cuales tienen cada uno sus peculiaridades, para luego pasar al análisis sanitario que es la determinación bromatológica para establecer la calidad de aptitud o no del alimento, tendiente a preservar la salud pública o individual del consumidor, realizado de acuerdo a la normatividad aplicable.

Nombre ¿Me llevas? No. 1Instrucciones

para el Alumno

Identifica las precauciones y condiciones para la toma de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

Actitudes a formar

Orden y responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas

Analizar el contenido de la Norma Oficial Mexicana NOM-F-285-1977. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

Competencias Genéricas a

Desarrollar

• Toma decisiones a partir de la valoración de las consecuencias de distintos hábitos de consumo y conductas de riesgo.

Manera Didáctica de

Lograrlas

Análisis de la Norma Oficial Mexicana NOM-F-285-1977. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

Página de

Página 20 de 122

Completa la tabla siguiente:

Apartado de la NOM-F-285-1977 Recomendaciones

Colectar la muestra

Muestra de alimentos envasados

Muestra de alimentos a granel o de

recipientes o piezas grandes

Muestras de alimentos perecederos

o semiperecederos

Página de

Página 21 de 122

Bacterias Termodúricas, Termófilas y Psicrófilas.

La temperatura de la leche durante su transporte y almacenamiento es uno de los factores más

importantes que afectan el crecimiento bacteriano y por lo tanto determinan su tiempo de

conservación. Este factor influye igualmente en los tipos de micoorganismos que se desarrollan y por

ende en los cambios o tipos de descomposición que experimenta el producto.

Cuando la leche se mantiene a temperatura normal, sin refrigeración, generalmente experimenta

acidificación debido al crecimiento de bacterias lácticas (flora normal) con producción de ácido láctico

por fermentación de la lactosa, bajando el pH e inhibiendo así el desarrollo de otros micoorganismos

y ocasionando la precipitación de la caseína al acercarla a su punto isoeléctrico (ph 4.7). Estos

microorganismos reciben el nombre de mesófilos por tener temperaturas óptimas de crecimiento

entre la de un ambiente normal y la temperatura corporal.

Si la leche cruda se conserva a temperaturas de refrigeración, la velocidad de acidificación se reduce

al disminuir el crecimiento de las bacterias lácticas comunes /v.g. Lactococcus lactis), es probable

que ocurran ciertos cambios en el sabor y olor que se produzca proteólisis láctea por acción de

gérmenes capaces de crecer a temperaturas relativamente bajas. Estos microorganismos reciben la

denominación de psicrófilicos (v.g. Pseudomona fluorescens).

Nombre ¡Cómo cambia el clima! No. 4

Instrucciones para el Alumno Contesta el cuestionario.

Saberes a adquirir

Clasificación de los microorganismos según su comportamiento frente a la temperatura.

Manera Didáctica

de Lograrlos

Análisis de la lectura

Página de

Página 22 de 122

Cuando la leche cruda es sometida a la pasteurización comercial, aproximadamente un 95-99% de

los microorganismos son destruidos, entre ellos todos los patógenos, pero pueden sobrevivir ciertos

gérmenes termoresistentes, no patógenos que se han clasificado en dos grupos: termofílicos que son

capaces de reproducirse a temperatura de pasteurización baja (63°C/30 min) como por ejemplo el

Lactobacillus termophilllus, y los termodúricos, que resisten la pasteurización, pero no pueden

desarrollarse a esa temperatura, presentado más bien el comportamiento mesófilo para su

crecimiento, como es el caso del Streptococcus salivarius subsp themophillus. Ambos grupos son

responsables de altas recuentos bacterianos en la leche pasteurizada.

En las industrias lácteas, los recuentos de estos grupos de micoorganismos es de interés debido a

que pueden ocasionar muchos problemas de carácter funcional. Por lo tanto, altos recuentos de ellos

deben evitarse mediante buenas prácticas de producción y procesamiento, y en caso de presentarse,

deben ponerse en evidencia las causas que las originaron y corregirse, a continuación se estudia

cada grupo en particular:

1. Bacterias termodúricas en la leche.

Las bacteroas termoduricas son microorganismos termoresistentes, generalmente mesofílicos en su

mayoría no esporulados, que frecuentemente se presentan en la leche cruda bajo malas condiciones

sanitarias o procesada en plantas mal limpiadasy saneadas y/o que utilizan malas prácgticas de

procesamiento. Se incluyen en este grupo el Strestococcus termophyllus y otros Streptococcus (S.

bovis, S. zymogenes, S liquefaciens, S. faecalis) asi como el Microbacterium lacticum, ciertos

Micrococcus y algunas especies esporuladas de género Baccillus. Cuando los establos o los

utensilios de ordeño no son bien lavados o saneados pueden darse condiciones bajo las cuales

mueren las especies o cepas microbianas más débiles, pero sobreviven aquellas más resistentes al

calor, las cuales crecen en la superficie de estos utensilios, representando una fuente de

contaminación. Otras veces suele ocurrir que una o varias vacas, frecuentemente animales viejos,

presenten como huéspedes crónicos de la ubre, especies o cepas bacterianas muy resistentes al

calor (v.g. ciertas cepas de micrococos), en estas condiciones es muy posible la contaminación de la

leche con termodúricos que luego van a contaminar el producto almacenado en la planta lechera.

Por otra parte, la contaminación con termodúricos puede ocurrir en la planta, cuando los métodos de

limpieza y saneamiento de los equipos son inadecuados o cuando se mezcla la leche cruda con el

producto pasteurizado sobrante. Una de las causas más frecuentes de contaminación con estos

microorganismos es la práctica errónea de emplear leche descremada pasteurizada para

estandarizar, o la de re-pasteurizar las leches sobrantes.

Página de

Página 23 de 122

Una vez contaminada la leche cruda con termodúricos, cualquiera que sea la causa, puede suceder

que el tratamiento térmico involucrado en la pasteurización no reduzca el número de bacterias,

determinando que el producto no cumpla las normas sanitarias para leche pasteurizada, o que se

descomponga con gran facilidad bajo condiciones deficientes de refrigeración. Para solucionar esos

problemas se debe establecer y corregir la causa de la contaminación. En tal sentido es

recomendable hacer recuentos de bacterias termodúricas en la misma planta utilizando muestras

recolectadas en diferentes etapas del procedimiento y en caso de que la planta no sea responsable,

debe hacerse análisis demuestras de cada productor hasta localizar al causante de la contaminación.

2. Bacterias termofílicas en leche.

Las bacterias termofílicas son aquellas que, además de resistir la temperatura de pasteurización baja,

son capaces de crecer a esa temperatura. Generalmente son bacilos no esporulados, aunque no

necesariamente (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus). No son patógenas pero su presencia

en la leche es indeseable porque producen acidez, sabores desagradables y tendencia de la leche a

coagular después de la pasteurización. Además, junto con los termodúricos, son responsables de

recuentos bacterianos elevados en leches pasteurizadas. Crecen bien a 55°C pudiendo hacerlo

hasta más de 70°C.

Las fuentes de contaminación con bacterias termofilicas más frecuentes son: la leche cruda obtenida

bajo condiciones sanitarias deficientes (utensilios mal lavados y saneados, agua de lavado), los

equipos de planta mal limpiados y saneados, el empleo de precalentadores, tanques de retención u

otros equipos de calentamiento o mantenimiento de la leche caliente por tiempos prolongados sin

sanearlos (3-6 horas); los filtros de tela empleados para filtrar leche caliente, cuando se usan por más

de 1-2 horas sin cambiarlos, y la práctica de re-pasteurizar la leche. La existencia de bacterias

termofílicas se pone de manifiesto cuando en las placas de agar, obtenidas en recuentos estándar,

aparecen numerosas colonias puntiformes; o por la observación de muchos bacilos grandes

coloreados en las frotis obtenidos por el método de recuento microscópico directo.

3. Bacterias psicrofílicas en la leche.

En microbiología general se define con el nombre de bacterias psicrofílicas aquellas que crecen

“mejor” a temperaturas de refrigeración. En las industrias lácteas, el término se aplica a las bacterias

que se desarrollan relativamente rápido a temperaturas por debajo de 15°C, aún cuando su

temperatura óptima está por encima de ese valor.

Página de

Página 24 de 122

Son gérmenes no patógenos, pero que al crecer lentamente a bajas temperaturas (1-10°C) ocasionan

problemas en el almacenamiento de muchos productos lácteos, originando recuentos bacterianos

elevados que a su vez determinan disminución de la calidad de la leche, y a menudo producen

sabores u olores extraños descritos corrientemente como “a sucio”, a “frutas”, “rancia”, “agrio”,

“pútrido”, etc. Tales alteraciones generalmente ocurren cuando los recuentos de estos

microorganismos llegan a 5-20 millones por mL y se deben a su acción sobre los sustratos más

importantes de la leche, especialmente sobre las proteínas y las grasas.

En estos grupos de bacterias están incluidas especies de los géneros Pseudomonas, Alcaligenes,

Flavobacterium y Acinetobacter e incluso algunas cepas de Enterobacter que pueden encontrarse en

el polvo (suelo), agua, vegetales y equipos de ordeno o de la planta mal limpiados y saneados. Se

presentan como bacilos Gram negativos, no esporulados que se destruyen fácilmente por el calor.

También se incluyen en este grupo, al menos en las industrias lácteas por los problemas que causan,

algunas especies de Stresptococcus y ciertos mohos y levaduras.

Los microorganismos psicrofílicos, invariablemente contaminan la leche cruda en la planta, ellos

constituyen parte de la flora normal de la leche cruda, al igual que los colifirmes, termodúricos y

termofílicos. Los métodos modernos de conservación de la leche cruda en tanques refrigerados a

nivel de las haciendas, favorecen el crecimiento de estos gérmenes y retardan el desarrollo de las

bacterias lácticas. Afortunadamente, bajo buenas condiciones de producción y conservaciónb no

alcanza a desarrollarse en números capaces de ocasionar los problemas mencionados y además se

destruyen por la pasteurización, con excepción de algunos estreptococos entéricos, que pueden

sobrevivir al tratamiento térmico y crecer luego a temperaturas por encima de 7°C.

La presencia de psicrófilos en productos lácteos pasteurizados no se considera normal y es indicativa

de posible contaminación post-pasteurización en equipos mal limpiados o saneados, o bien tratados

con aguas de lavado contaminadas. Por ello, el recuento de bacterias psicrofílicas en la leche

pasteurizada da información sobre la bondad del tratamiento post-pasteurización y de la vida

comercial del producto (bajo refrigeración).

La presencia de algunas bacterias psicrofílicas en la leche recién pasteurizada o de altas cuentas

después de 3-4 dias de almacenamiento, refleja deficiente limpieza y saneamiento de los equipos en

contacto con la leche después de la pasteurización. Estos resultados indican además que la leche no

podrá mantenerse por mucho tiempo sin descomponerse, es decir que su tiempo de conservación

normal (vida útil) será reducido.

Página de

Página 25 de 122

Contesta el siguiente cuestionario.

1. Menciona los grupos de micoorganismos que pueden ocasionar problemas en la producción e

industrias de la leche y derivados.

2. ¿Cuáles son las diferencias que existen entre las bacterias termodúricas, termofílicas y

psicrofílicas en lo que respecta a la temperatura óptima de crecimiento y resistencia a la

pasteurización?

3. Mencione los problemas que pueden derivarse de la presencia de bacterias termodúricas,

termofílicas y psicrofílicas en la leche y derivados.

4. ¿Cuáles son las principales especies de bacterias termodúricas, termofílicas y psicrofílicas

que pueden presentarse en la leche y derivados?

5. ¿Qué precauciones deben adpotarse en una planta lechera para evitar la contaminación con

bacterias termodúricas, termofílicas y psicrofílicas?

Página de

Página 26 de 122

Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos difíciles de eliminar que

colonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y

las fosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Staphylococcus aureus es un coco Gram

positivo aerobio o anaerobio que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa positivo.

Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría componentes de la pared celular, y una

variedad de proteínas solubles o exoproteínas que facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas

propiedades, hacen que los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que

van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como neumonías, meningitis,

intoxicaciones alimentarias, shock séptico y desórdenes autoinmunes. De gran preocupación, es el

hecho de que S. aureus sea un importante agente de infecciones nocosomiales fulminantes.

Nombre A que no me ves No. 1


Analiza la siguiente información y escribe en el cuadro el nombre de la colonia que está representada en la imagen.

Actitudes a formar

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas

Investigar qué es una cepa de referencia.

Identificar cepas al microscopio.

Competencias Genéricas a Desarrollar

• Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones.

• Estructura ideas y argumentos de manera clara, coherente y sintética.


Lograrlas

Analiza el contenido de la lectura e identifica el tipo de cepa.

Página de

Página 27 de 122

Listeria monocytogenes, es un microorganismo que frecuentemente se encuentra en alimentos

como leche no pasteurizada, carne cruda, aves y mariscos, así como numerosas variedades

procesadas de lácteos, carne, pescado y mariscos. Los vehículos confirmados de infección incluyen

ensalada de repollo, leche chocolatada, quesos, paté, carnes frías, pollo y ostras ahumadas. Este

microorganismo es el agente causal de la enfermedad llamada listeriosis, que es una enfermedad

grave, siendo considerada actualmente la infección de origen alimentario con mayor tasa de letalidad

(20 a 30 % de los casos), teniendo costos elevados tanto desde el punto de vista médico como

dentro de la industria agroalimentaria.

Este microorganismo es relativamente resistente al ácido, por lo que es muy factible que atraviese la

barrera gástrica sin que haya un daño importante en las células. Esta observación es aplicable en

especial a recién nacidos, cuya producción de ácido en el estómago es menor que en el adulto.

Aunque el carácter patógeno de Listeria monocytogenes se conoce desde hace más de 60 años, el

mecanismo por el cual causa la enfermedad parece ser sumamente complejo. El proceso se ha

dividido en tres etapas: (a) penetración en el huésped; (b) sobrevivencia y multiplicación dentro del

huésped, y (c) invasión del tejido susceptible.

El poder patógeno de este microorganismo le permite no sólo sobrevivir a la digestión de los

macrófagos, sino destruirlos y liberarse a la circulación sanguínea.

Después de la invasión de los macrófagos, las cepas virulentas de Listeria pueden multiplicarse, y

destruir las células, y provocar septicemia. A partir de la sangre tiene acceso a todas las áreas del

cuerpo, incluidos el sistema nervioso central, el corazón, los ojos y otras localidades, así como el

feto en la mujer embarazada. De esta manera el daño se traduce en un aborto o en

meningoencefalitis.

Página de

Página 28 de 122

Ya que el organismo se encuentra muy diseminado en la naturaleza, la mejor protección son

medidas sanitarias básicas, tales como usar sólo productos lácteos pasteurizados, comer carnes

cocidas y lavarse bien las manos antes de preparar comidas. Las mujeres embarazadas y las

personas con sistemas inmunológicos debilitados deben evitar estos alimentos, al igual que los

quesos blandos y las salchichas crudas o recalentar bien las carnes frías antes de comerlas.

Además, es recomendable:

Utilizar lo antes posible todos los productos perecederos que estén precocinados o que vengan listos

para comer. Limpiar con frecuencia los refrigeradores. Mantener la temperatura del refrigerador a 4°

C o menos, esto es importante ya que el microorganismo puede desarrollarse en este

electrodoméstico. No tener alimentos destapados dentro del refrigerador, para evitar la

contaminación cruzada.

Bacterias coliformes.

Dentro del llamado “grupo coliforme” se incluyen todos los bacilos Gram negativos, aerobios o

anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la lactosa con producción de gas y

ácido en 48 horas, en medios de cultivo sólidos o líquidos. Los géneros que integran este grupo son

Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klehsiella (Flia Enterobacteriaceae), siendo las especies más

importantes Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El primero en particular es huésped normal

del tracto intestinal del hombre y los animales de sangre caliente, por lo cual se encuentra en grandes

cantidades en las heces, pero más frecuentemente se origina del suelo y materia vegetal en

descomposición.

Página de

Página 29 de 122

La presencia en el agua de estos microorganismos se considera inaceptable, asociándose con

contaminación fecal y por ende con la posible presencia de otros microorganismos patógenos de

origen intestinal, como por ejemplo las especies del género Salmonella productoras de la fiebre

tifoidea y disenterías bacilares.

La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes derivadas directa o

indirectamente del tracto intestinal de las vacas, animales que afortunadamente no sufren las

infecciones entéricas propias del hombre. Esta contaminación puede provenir del estiércol, polvo,

suelo, alimentos del ganado, agua, insectos (especialmente moscas) o del contacto con residuos

lácteos que quedan en utensilios de ordeño y tanques de transporte o almacenamiento, mal lavados y

saneados; donde esas bacterias pueden desarrollarse con gran facilidad. Por estas razones es

sumamente difícil producir leche cruda libre de coliformes, dándole a su presencia una significación

diferente que en el agua y aunque es indeseable, se tolera. No obstante, altas cuentas bacterianas

de colifirmes son indicativas de condiciones insanas de producción, transporte o almacenamiento y

producen defectos en la leche (sabores desagradables), razones suficientes para evitar su desarrollo,

mediante buenas prácticas de producción.

En la leche pasteurizada, a diferencia de la leche cruda, la presencia de bacterias coliformes es

inaceptable ya que a las temperaturas de pasteurización se destruyen. Por lo tanto, una prueba de

coliformes positiva en productos lácteos pasteurizados denota mala pasteurización y aunque este

hecho generalmente se descubre por la prueba de fosfatasa, la colimetría a veces resulta más

sensible. Además un resultado coliforme positivo puede indicar recontaminación post-pasteurización,

bien sea por los equipos sucios o defectuosos (escapes de leche cruda, escapes de vapor

condensado, etc) por los trabajadores (manos, ropa, etc.) o por envases mal desinfectados.

Página de

Página 30 de 122

Ahora bien, como no hay forma de establecer si los coliformes se originaron en la vaca o de un ser

humano, cuyas heces si pueden ser portadoras de otros microorganismos patógenos, la leche

pasteurizada coliforme-positiva debe rechazarse.

Las ubres de las vacas son más susceptibles a infectarse con patógenos ambientes (como los coliformes) durante el período de seca y el período peripartal.

Mastitis crónica por E. coli

La Escherichia coli puede causar con alguna frecuencia mastitis crónica (y también subclínica) – a veces recurrente –en ciertos establos; sobre todo si el clima es caluroso. En muchos casos la recuperación es espontánea. Si fuese necesario tratamiento, se recomienda cefalosporinas (ceftiofur) por vía parenteral.

Nódulos, abscesos y tractos fistulosos en la ubre

En muchos casos de mastitis crónicas se palpan y observan nódulos fibrosos y abscesos, así como la formación de tractos fistulosos que drenan exudados – generalmente purulentos – hacia el exterior; los que raras veces cicatrizan.

Página de

Página 31 de 122

Completa el siguiente cuadro:

Cepa vista al microscopio Microorganismo

Salmonella

Página de

Página 32 de 122

El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos están determinados por factores nutricionales y

ambientales, y en condiciones de laboratorio óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento

característica de cada especie microbiana.

Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo de

adaptación al medio y condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial dando

lugar a una curva de tipo sigmodal que se acostumbra dividir en cuatro partes:

Nombre ¿Cuánto crees que viviré? No. 1


Busca en el internet información relativa a la curva de crecimiento bacteriano y complementa con la que se te presenta.

Actitudes a formar


Manera Didáctica

de Lograrlas

Búsqueda bibliográfica y en internet.


• Expresa ideas y conceptos mediante representaciones linguiísticas, matemáticas o gráficas.

• Identifica los sistemas y reglas o principios medulares que subyacen a una serie de fenómenos.


Lograrlas

Haciendo uso del internet como herramienta didáctica para desarrollar la competencia para el manejo de la información CMI.

Página de

Página 33 de 122

A) Fase de retardo, de adaptación o fase lag B) Fase de crecimiento exponencial o fase log C) Fase estacionaria D) Fase de declinación o muerte. La forma de cada proporción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de la

especie de microorganismo, la preparación del inoculo, la composición química del medio de cultivo y

las condiciones ambientales de incubación.

Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sintetizando nuevos

componentes, durante la fase exponencial los microorganismos que se dividen por fisión binaria lo

hacen a intervalos regulares. Finalmente el crecimiento de la población disminuye y la curva se

vuelve horizontal debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulación de productos residuales

tóxicos hasta que la población disminuye.

En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los micoorganismos eucarióticos y los

eucarióticos pequeños se desarrollan más rápidamente que los grandes.

El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de crecimiento, debido a la ganancia

energética que se obtiene de cada vía catabólica de obtención de energía. Así los microorganismos

fermentadores crecerán más lentamente que los respiradores.

Página de

Página 34 de 122

La siguiente figura muestra la técnica del Recuento de microorganismos viables tras diluciones seriadas:

Página de

Página 35 de 122

Investiga lo siguiente, en libros o haciendo uso del internet:

1. Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que

ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?

2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la

fase lag en la curva de crecimiento? ¿Qué condiciones la incrementarán?

3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación o tiempo de generación?

4. Investiga el tiempo de duplicación para las siguientes bacterias y completa el cuadro:

Bacteria Tiempo de duplicación (en horas) Escherichia coli Salmonella tiphy Staphylococcus aureus

Página de

Página 36 de 122

Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar

formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos

Nombre Conteo de hongos y levaduras No. 1

Competencia a Desarrollar

1. REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A LA LECHE PROCESADA DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.

Atributos de la

competencia


Instrucciones para el Alumno Realiza la práctica siguiendo las instrucciones.

Instrucciones para el

Docente

Realizar el conteo de mohos y levaduras en alimentos. NOM-111-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la Cuenta de Mohos y Levaduras en Alimentos, atendiendo las instrucciones de tu maestro.

Recursos materiales de

apoyo Equipo de seguridad personal. Material y equipo de laboratorio. Reactivos.

Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas

Atiende a las instrucciones de la técnica a realizar y a las de tu maestro.


• Administra los recursos disponibles teniendo en cuenta las restricciones para el logro de sus metas.


Lograrlas

Utilizando los reactivos en las cantidades adecuadas con base en la técnica, empleando los materiales y equipos correctos.

Página de

Página 37 de 122

sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización

en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor,

alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y

levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas

sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos

desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas.

Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer

la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias

inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia

prima inadecuada

Colonias, agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.

Se entiende por:

Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un

núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La

reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.

Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se

caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se

conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se

alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares

pueden ser de queratina o celulosa. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 °C.

Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de

colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.

Reactivos y materiales

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique

agua debe entenderse como agua destilada.

Medios de cultivo.

Página de

Página 38 de 122

Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.

Preparación del medio de cultivo.

Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C,

acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido

tartárico por 100 mL de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con

potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.

A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido

tartárico.

Soluciones.

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

FORMULA

INGREDIENTES CANTIDADES

Fosfato de potasio monobásico 34,0 g

Agua 1,0 l

Preparación:

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.

Llevar a 1,0 l de agua.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).

Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.

Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.

Solución estéril de ácido tartárico al 10%

FORMULA


Acido tartárico 10,0 g

Agua destilada 100,0 mL

Preparación:

Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de

membrana de 0,45 µm.

Materiales.

Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.

Página de

Página 39 de 122

Cajas Petri.

Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.

Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.

Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas,

etc.

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben

esterilizarse mediante:

Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a

121 ± 1,0°C.

Aparatos e instrumentos

Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro calibrado.

Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.

Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado

con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente

amplificador.

Registrador mecánico o electrónico.

Microscopio óptico.

Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Procedimiento

Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,

utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una

pipeta estéril diferente para cada dilución.

Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño

de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es

vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

Página de

Página 40 de 122

Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de

las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie

lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie

horizontal fría.

Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.

Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.

Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días,

seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja

muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los

conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de

3 o 4 días en los resultados del análisis.

Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para

distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.

Expresión de resultados

Cálculo del Método

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.

Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA1-

1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados.

Informe de la prueba

Informar:

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa -

dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa-


Recuerda

elaborar el reporte

del análisis realizado

Página de

Página 41 de 122

• Olvidar la indumentaria requerida para el proceso • No limpiar el área de trabajo • No comprobar las condiciones del equipo • No verificar que las llaves de gas y agua estén bien cerradas • No lavar el instrumental • No esterilizar el material sucio y contaminado • No separar el medio de cultivo para su desecho • No checar el pH del medio • No apagar los equipos que no estén usándose • Olvidar verificar la temperatura y tiempo de esterilización • Olvidar verificar la temperatura de incubación • Olvidar el tiempo de incubación • Pesar de manera equivocada los reactivos • Olvidar rotular

Escribe en la columna de la derecha las posibles soluciones, de acuerdo a la contingencia planteada en la columna de la izquierda. Contingencia Posible solución

No hay agua destilada

No hay agua esterilizada

El equipo está sucio

No hay energía eléctrica

Desconoces el equipo a usar

Se descompone algún equipo

El medio está contaminado con agentes extraños

No rotulaste los cultivos

Página de

Página 42 de 122

Nombre Conteo de coliformes totales y fecales No. 1



Atributos de la competencia




Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 43 de 122

Los pasos que debes realizar para durante esta práctica son:

1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene:

• bata

• cubre boca

• cubre pelo

• guantes

2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar

3. Verifica la temperatura y/o presión de la autoclave durante el proceso de esterilización.

4. Limpia y desinfecta el área de trabajo.

5. Prepara y esteriliza los siguientes medios de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad

requeridos y el análisis a realizar

CALDO LACTOSADO (medio de enriquecimiento)

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA (selectivo)

CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (medio de confirmación)

PREPARACIÓN

1. Disuelve los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario, el medio completo

deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.

2. Ajusta el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6.9 +/- 0.2 a

25°C

3. Distribuye en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm en medio de

concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm en el medio de concentración de

1.5, cada tubo debe tener campana de fermentación.

4. Esteriliza en autoclave por 15 min a 121 +/- 1.0°C

5. Enfría rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es

claro y de color beige.

6. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán

10 mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.

7. Realiza la toma de muestras aplicando la técnica adecuada.

8. Realiza el vertido en placa y/o tubos de cultivo de acuerdo a la técnica descrita.

9. Realiza la inoculación de la muestra aplicando la técnica adecuada.

10. Toma tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración.

Página de

Página 44 de 122

11. Utiliza una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida, o 10

mL de la dilución primaria inicial en el caso de otros productos.

12. Toma tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento, usa una

pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida, o 1

mL de la dilución primaria en el caso de otros productos.

13. Mezcla suavemente el inoculo con el medio.

14. Etiqueta y rotula los tubos de ensaye de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos.

15. Realiza la incubación de la muestra a analizar a 35 +/- 0.5 °C por 24 +/- 2 hrs y observar si

hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación por 48 +/- 2 hrs.

16. Verifica la temperatura de incubación.

17. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos.

18. Cuando solo una dilución muestra tres tubos positivos, elige esta y las diluciones mayores

posteriores.

19. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elige

esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.

20. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y estos se encuentran en más de tres

diluciones, selecciona las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.

21. En cada caso se obtiene un número de tres cifras, que indica el número de tubos positivos

donde debes buscar el índice de número más probable NMP. La técnica de NMP puede

admitir gran cantidad de variaciones, por ejemplo, para una muestra sólida donde un NMP de

70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95 % de los casos variarán de 10 a 230

coliformes por gramo y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de

confianza son de 3.6 a 130 coliformes por gramo.

22. Compara tus resultados con los estándares permitidos.

23. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado.

Recuerda que esta práctica

la aplicarás en mantequilla, crema, fermentados, dulces de leche, quesos de todos tipo y helados.

Página de

Página 45 de 122

Nombre Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 46 de 122

NORMA MEXICANA NMX-F-253-1977.CUENTA DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS

METHOD FOR AEROBIC MESOPHYLIC BACTERIA COUNT

0 INTRODUCCION

Cuando se pretende investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica

más comúnmente utilizada es el recuento en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de

microorganismos y su fundamento consiste en contar las colonias que desarrollan en el medio de

elección después de cierto tiempo y temperatura de incubación presuponiendo que cada colonia

proviene de un microorganismo en la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de

variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.

En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La

variedad de especies y tipos diferenciales por sus distintas necesidades nutricionales, temperatura

requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas

constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, la ejecución de la técnica

cuando se siguen fielmente las condiciones que se señalan para su desarrollo puede llegar a

proporcionar resultados lo bastante reproducibles para darle significado a la prueba.

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN.

Esta Norma establece un método para estimar la cantidad de bacterias mesofílicas aerobias en un

alimento.

2 REFERENCIAS

Para la correcta aplicación de esta norma, se deben consultar las siguientes Normas Mexicanas en

vigor:

• NMX-F-285 Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis y

• NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.

3 MATERIAL Y EQUIPO

a) Horno para esterilizar.

b) Autoclave con termómetro, o manómetro probado con termómetro de máximas.

c) Baño maría con termostato y termómetro.

d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato con vasos esterilizables.

e) Vasos esterilizables para licuadora.

Página de

Página 47 de 122

f) Balanza granataria con sensibilidad de 0.1 g.

g) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±0.5°

h) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas.

i) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 y 1 mL graduadas en 0.1 y 0.01 mL respectivamente.

j) Frascos de dilución de vidrio para contener 99 ó 90 mL, ó tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca

para contener 9 mL de solución reguladora diluyente, en ambos casos ± 1% del volumen señalado

después de la esterilización cerrados herméticamente.

4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

a) Solución reguladora diluyente

Solución concentrada

KH2 PO4 34 gramos

Agua destilada 500 mililitros

Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con Hidróxido de Sodio IN.

Llevar a un litro con agua destilada. Esterilizar durante 20 minutos a 121°. Conservar en refrigeración.

Tomar 1.25 mL de solución concentrada y llevar a un litro con agua destilada, ésta es la solución de

trabajo. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° durante 20

minutos. El pH final debe ser 7.2.

b) Agar – Triptona - Extracto de Levadura (agar cuenta estándar)

Extracto de levadura 2.5 gramos

Triptona 5 gramos

Dextrosa (d - glucosa) 1 gramos

Agar 15 gramos

Agua destilada 1,000 mililitros

NMX-F-253-1977

Suspender 24 gramos del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.

Distribuir en volúmenes de 100 y 200 mL. Esterilizar a 1.1 kg/cm2 (121°) durante 15 minutos. El pH

final del medio debe ser 7.0 ± 0.1.

El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado para algunos alimentos en particular y

requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese

alimento.

Página de

Página 48 de 122

5 PROCEDIMIENTO

5.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que su inoculación, la adición de los

medios de cultivo y su rotación se pueda realizar cómoda y libremente.

Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación.

5.2 Para la preparación y dilución de la muestra seguir las indicaciones señaladas en la Norma

Mexicana NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.

5.3 Practicar las diluciones decimales que se estimen convenientes.

5.4 Transferir 1 mL ó 0.1 mL de la muestra y de cada una de las diluciones a cajas Petri estériles

evitando todo tipo de contaminación durante la maniobra y aplicando la punta de la pipeta al fondo de

la caja mientras escurre el líquido.

5.5 Agregar 12 a 15 mL. del medio de cultivo fundido y mantenido a una temperatura de 45° - 48° en

un baño de agua. Mezclarlo con la muestra (6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de

las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a delante) sobre una superficie lisa y

horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculó en el medio, cuidar que el medio no

moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

5.6 El tiempo transcurrido desde el momento que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que

finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

5.7 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y a la temperatura

que se requiera, según el tipo de alimento de que se trate.

5.8 Seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 30 a 300 colonias, pues es en ellas donde

será menor el error en el recuento.

5.9 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de hongos),

incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no

se pueden distinguir las colonias de pequeñas partículas de alimento.

6 INTERPRETACION DE RESULTADOS

6.1 Con el auxilio de la lente de aumento y de la cuadrícula del contador, contar todas las colonias de

las placas seleccionadas. Si el número se estima mayor de 300, y no se dispone de placas

preparadas con las diluciones subsecuentes, contar en la mitad o en un cuarto representativo de ella,

multiplicando por 2 o por 4 el número obtenido. El fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro

contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.

Página de

Página 49 de 122

6.2 Multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de colonias por mililitro o gramo de

la muestra.

6.3 Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, utilizar la placa cuyo recuento se aproxime

más a esta cifra. Si la placa correspondiente a la primera dilución es la única que presenta colonias y

éstas son menos de 10, informar el número de colonias seguidas de la frase "en la dilución 1:10".

6.4 Debe apreciarse una razonable proporcionalidad en el número de colonias que aparezcan en las

placas de acuerdo con las diluciones utilizadas. En tanto no exista esta relación el personal del

laboratorio debe adquirir la destreza necesaria hasta conseguirlo antes de efectuar estudios que sean

válidos.

Al iniciarse en el trabajo de laboratorio es recomendable inocular las cajas correspondientes de cada

dilución por duplicado y computar las medias aritméticas.

6.5 Si todas las placas:1) no muestran colonias, 2) muestran excesiva difusión de las mismas, 3)

están contaminadas o no son satisfactorias por cualquier motivo, anotar respectivamente: 1) sin

colonias, 2) colonias difusas, 3) incluyendo por accidente de laboratorio.

6.6 Redondear la cifra obtenida en el recuento de manera que sólo aparezcan 2 dígitos significativos

al inicio de esa cifra: 128 se informa como 130; 2,417 como 2,400; 49 como 49, etc.

6.7 Informar: Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias en placas de Agar Triptona

Extracto de levadura incubadas X * horas a X*

* anotar las que correspondan a cada caso particular.

Recuerda elaborar el reporte de la práctica.

Página de

Página 50 de 122

Nombre Determinación de Salmonella No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 51 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes



4. Limpia y desinfecta el área de trabajo

5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad requeridos y el

análisis a realizar. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir

las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.

Medios de preenriquecimiento Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenito-cistina,

Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solución A, Solución B, Solución C, Caldo de soya

tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de

potasio

Medios de aislamiento Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para

Salmonella y Shigella (SS), Agar entérico Hektoen.

Medios para pruebas bioquímicas Agar de tres azúcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para

Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer),

Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rápido, Caldo infusión cerebro corazón

Soluciones Solución verde brillante al 0,1% (1:1000), Solución de yodo-yoduro, Solución salina al 0,85%,

Solución salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solución de alfa-naftol al 5%, Solución de rojo de

metilo, Solución de hidróxido de potasio al 40%, Solución de gelatinasa al 5%

Página de

Página 52 de 122

Antisueros Antisuero polivalente somático (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi


7. Prepara la muestra a analizar.

Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de

1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.

Se recomienda una muestra de 25 g o más.

Procedimiento general para la preparación de muestras

• Pesa asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para

trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher).

• Adiciona 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a

menos que se indique otro) y licúalo si es necesario durante un minuto.

• Transfiere asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con

tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.

Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potenciómetro. Ajusta, si es necesario, a

un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezcla y cubre el

recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 ± 2 h a 35ºC.

Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada

• Sigue el procedimiento general para el pesado de la muestra y adiciónala lentamente a un

matraz Erlenmeyer con 225 mL de solución verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo

quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60

minutos e incúbala durante 24 horas +/-2 horas a 35°C

8. Realiza la siembra de la muestra aplicando la técnica adecuada

Aislamiento de Salmonella

• Cierra firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y

agita suavemente, transfiere respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10

mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en

sustitución del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport.

Página de

Página 53 de 122

• Incuba de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo

periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios

selectivos.

• Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estríalo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),

agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos

adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo

procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

• Examina las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo

con las siguientes características:

a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En

algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las

bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

c) Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos

las colonias pueden aparecer completamente negras.

d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras;

con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose

posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.

Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

e) Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las

colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

Identificación bioquímica

• Selecciona al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien

aisladas.

• Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azúcar

hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por

punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.

• Almacena en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario

retomar más colonias.

• Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las

colonias que den las siguientes reacciones:

Página de

Página 54 de 122

f) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa;

en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no

fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra

a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.

g) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación

de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo

en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en

este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

• Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en

los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuación:

• Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA

típicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio

LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o

sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos

medios.

• Continúa el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta

reacciones atípicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se

obtuvo el cultivo atípico anterior y siembra las pruebas bioquímicas nuevamente.

• Continúa la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI.

Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias

procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

Prueba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente

positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para

comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar

24 ± 2 h a 35ºC.

Prueba de ureasa (rápida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de

cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rápida). Incuba 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de

agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Deberás retener los cultivos que den la

prueba negativa (sin cambio de color del medio).

Página de

Página 55 de 122

Identificación serológica Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

• Coloca con asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos

secciones de una placa para aglutinación. Suspende en cada una de las gotas, una porción

del cultivo desarrollado en TSI.

• Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mézclalas con el

canto del asa o empleando aplicadores de madera.

• Agita inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un minuto.

• Observa bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

• Considera cualquier grado de aglutinación como positiva.

• La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el

antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.

• Si observas aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con

las pruebas bioquímicas complementarias.

• Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo

empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los

más frecuentes).

• Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay

aglutinación con Vi calienta el cultivo a ebullición y repite la aglutinación con el antisuero

polivalente O.

• Si se requiere, practica el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero

polivalente H).

Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a

35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya

tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adiciona 2,5 mL de solución

salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

• Coloca 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x

100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Prepara un control de

solución salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno

formalizado. Incuba las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observa a intervalos de 15 min

por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla

de prueba pero no en el control.

Página de

Página 56 de 122

Debes interpretar como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre

aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.

Pruebas bioquímicas complementarias

• Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no

concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:

• Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de

Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de

la especie S. arizonae.

Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

Agar citrato Simmons

• Inocula por estría el tubo.

• Incuba durante 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

• Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

• Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Medio SIM

• Inocula por punción.

• Incuba durante 24 h a 35 ± 2ºC.

Movilidad.

• Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

• Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

• Producción de ácido sulfhídrico.

• Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a

todo el medio.

• Prueba negativa: ausencia de color negro.

• Producción de Indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3

mL de reactivo de Kovac.

Página de

Página 57 de 122

Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

Caldo RM-VP

• Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h

para la prueba RM.

• Prueba de Voges-Proskauer (VP)

• Transfiere a un tubo un mL del cultivo de 48 h.

• Adiciona 0,6 mL de solución de alfa naftol.

• Adiciona 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%.

• Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional).

• Interpreta los resultados después de incubar durante 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura

ambiente.

• Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.

• Prueba negativa: sin cambio de color.

• Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.

Prueba de rojo de metilo (RM)

• Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de

metilo. Interpreta los resultados inmediatamente.

• Prueba positiva: desarrollo de color rojo.

• Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

Caldo malonato

• Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

• Prueba positiva: desarrollo de color azul.


Caldo manitol


• Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.


Página de

Página 58 de 122

•

Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las

pruebas bioquímicas convencionales.

9. Etiqueta y rotula los tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos

10. Verifica la temperatura de incubación

11. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos

Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra.

12. Compara tus resultados con los estándares permitidos

13. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado

Página de

Página 59 de 122

Nombre Determinación de Staphylococcus aureus No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 60 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes





análisis a realizar.

6. Prepara la cantidad de los diferentes medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del fabricante

(Baird-Parker, solución de telurito, Emulsión de yema de huevo, Solución salina isotónica, caldo de

infusión cerebrocorazón, ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera, cloruro de calcio

anhidro, solución de azul de toluidina, solución amortiguadora Tris pH 9, plasma de conejo).



8. Realiza el procedimiento aplicando la técnica adecuada

• Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie

de las placas de agar Baird-Parker.

• Distribuye el inoculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto,

utilizando una para cada dilución.

• Debes mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.

• Voltea las placas y colócalas en incubación durante 45 a 48 h a 35ºC.

• Selecciona las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus; si

no es posible, selecciona las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de

150 colonias.

• Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al

informe debes agregar la nota de "valor estimado".

• Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2

mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

Página de

Página 61 de 122

•

• Selecciona las colonias de acuerdo con el cuadro del anexo 15 para realizar las pruebas de

coagulasa y termonucleasa:

• Seleccionar el número de colonias y siembralas cada una en tubos con 0.5 mL de caldo de

infusión cerebro-corazón.

• Incúbalas a 35ºC durante 24 h.

• Inocula en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus

epidermidis como testigos positivo y negativo.

• Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0.3 mL de cada cultivo a

otro tubo de 10 mm x 75 mm y consérvalo para la prueba de termonucleasa. El resto del

cultivo usalo para la prueba de coagulasa.

Prueba de coagulasa

• Agrega a los 0.2 mL del cultivo anterior, 0.2 mL de plasma de conejo diluido volumen a

volumen con solución salina estéril.

• Incubalo en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay

formación de coágulo, observa a las 24 h. Considera positiva la prueba si hay formación de

coágulo.

• Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo añade una gota de cloruro de calcio al

5% a 0.5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg.

Prueba de termonucleasa

• Calienta durante 15 minutos 0.3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebrocorazón en baño de

agua hirviendo.

• Pasa una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, incluye

testigo.

• Incuba a 35ºC en cámara húmeda durante 4 a 24 h. La aparición de un halo color rosa

extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva.

Página de

Página 62 de 122

9. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y

dilución con los datos correctos.

10. Realiza la incubación de la muestra a analizar.





Página de

Página 63 de 122

Nombre Determinación de Listerya monocitogenes No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 64 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes

2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar.





Reactivos Acido acético 5 N, Acido clorhídrico 1 M, Acido sulfanílico (cristales), Alfanaftilamina,

Alfa-naftol 5% en etanol absoluto, Etanol absoluto, Granalla de zinc, Hidróxido de sodio 1 M,

Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina), Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2,

Sangre de carnero fisiológica 0,85% estéril, Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp,

Sulfato de cadmio al 20%, Zinc pulverizado, Reactivos para Tinción de Gram, Alcohol-acetona, Cristal

violeta, Oxalato de amonio, Solución de Yodo, Solución de Safranina.

Reactivos para la determinación de nitritos Reactivo A: Alfa-naftilamina 0,5 g, Acido acético 5N 100,0 mL

Reactivo B: Acido sulfanílico 1,0 g, Acido acético 5N 125,0 mL

Reactivo C: Alfa-naftol 1,0 g, Acido acético 5N 200,0 mL

Solución de sulfato de cadmio al 20%

Medios de cultivo Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)

Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3

Agregar en condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo

antes de su uso.

Para la preparación de un litro del medio CSTEL se deben agregar las siguientes soluciones:

acriflavina, ácido nalidíxico y solución de cicloheximida.

Página de

Página 65 de 122

Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben

emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos inmediatamente después de usarla!

Medio de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)

Medio Oxford

Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)

Agar sangre de carnero

Caldo nitratos

Medios para la prueba de movilidad: Medio de SIM, Medio MTM.

Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos




9. Realiza el vertido en placa de cultivo de acuerdo a la técnica descrita

10. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos

correctos.






Recuerda incluir en el reporte

de la práctica los estándares permitidos

para comparar tus resultados

Página de

Página 66 de 122











Página de

Página 67 de 122

Importancia de diluir

Cómo diluir

Aislamiento en placa y transferencia de cultivos

Realiza análisis microbiológicos a derivados de la leche, de acuerdo a las

normas vigentes en la materia

2

Página de

Página 68 de 122

Conteo de hongos y levaduras

Conteo de coliformes totales y fecales

Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias

Determinación de Salmonella

Determinación de Staphylococcus aureus

Determinación de Listeria monocytogenes

Página de

Página 69 de 122

Los microorganismos, o microbios como se conocen comúnmente, son de interés sobresaliente en la

industria de la transformación de alimentos, ya que son causantes de enfermedades en los humanos,

al contaminar los alimentos y descomponerlos. En éste submódulo obtendrás conocimientos sobre

los patógenos que pueden contaminar la leche y los productos lácteos; aprenderás también sobre las

diferentes técnicas para la identificación de tales patógenos; vas a adquirir conocimientos de

toxicología, análisis de alimentos, microbiología de alimentos y procesos de calidad. Para que logres

los conocimientos que te acabo de mencionar, voy a guiarte a través de actividades prácticas que

incluyen desde tomar muestras, hasta realizar los análisis respectivos, todo para que logres

interpretar tus resultados y puedas realizar el reporte correspondiente. Se dice fácil, ¡pues sí, lo es!

Ya que para eso estoy contigo, para facilitar tu aprendizaje de manera amena y divertida.

Para que tu aprendizaje sea completo, será importante que sigas las indicaciones con orden, limpieza

y responsabilidad. Todo lo que aprendas te permitirá desarrollar los atributos de cada una de las

competencias profesionales planteadas, necesarias para que puedas laborar en el campo del control

de calidad microbiológica de la leche y los productos lácteos.

Página de

Página 70 de 122

El facilitador realiza la presentación de la competencia a desarrollar la cual abarca la siguiente información:

Aplicación de una evaluación diagnóstica

Resultado de aprendizaje.

Atributos profesionales que componen a la competencia.

Evidencias de desempeño y evidencias de producto a evaluar.

Prácticas programadas y Prácticas integradoras.

Normas oficiales vigentes a seguir.

Criterios e instrumentos de evaluación.

Sobre las actitudes y valores que el estudiante debe de mostrar.

ATRIBUTOS DE LA

COMPETENCIA


RESULTADO DE APRENDIZAJE

Efectua análisis microbiológicos a leche y derivados lácteos, de acuerdo a las normas vigentes en la materia y a los requerimientos del sector productivo lechero, siguiendo instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.

Página de

Página 71 de 122

GENERALIDADES Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se

encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún

modo su sobrevivencia o desarrollo.

Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”,

según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha

flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los

microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo

microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos.

Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su

manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los

microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera

sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la

aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).

Nombre Importancia de diluir No. 6


Lee con atención tu guía y con la exposición de tu facilitador te darás cuenta de la importancia de realizar diluciones para el análisis microbiano.

Saberes a adquirir

Saber la importancia de la realización de diluciones para investigar el contenido microbiano de una muestra.

Manera Didáctica

de Lograrlos

Pon atención a la explicación de tu facilitador y con ayuda de tu guía sabrás la importancia de las diluciones en los análisis microbianos.

Página de

Página 72 de 122

Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van

desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa

requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras

decimales para facilitar los cálculos. Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir

de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos

diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana

esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el número de diluciones

necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e incluso a partir de los

datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra. El buen

resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en lo posible, por lo que

es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO Posteriormente a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya

finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto

cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más

uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este

fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para

ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el

pH favorables para iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así como

para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.

Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que

después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar

tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado

puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de resultados proporcionales al tamaño

de la población, en el caso de tubos o matraces.

La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el

número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la

observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de

placas.

Página de

Página 73 de 122

NOTAS • La técnica de dilución es la primera etapa en el análisis de la mayoría de las prácticas en las que se

determina cuantitativamente algún microorganismo o grupo microbiano; por lo tanto, continúa con la

determinación específica.

• Cuando se trabaja con alimentos líquidos, fácilmente homogenizables, que pueden distribuirse con

pipetas de 1 mL, y con bajo contenido microbiano, puede omitirse la preparación de diluciones, pero

este caso es una excepción, no la regla.

• Los diluyentes más utilizados son la solución amortiguadora de fosfatos, el agua peptonada y la

solución salina isotónica, pero pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones de

dispersar y homogenizar la carga microbiana y de facilitar la recuperación de los microorganismos en

estudio, mediante condiciones de osmolaridad, pH, etc., adecuadas para ellos; por ejemplo, para la

determinación de Vibrio cholerae, que es alcalófilo, se utiliza agua peptonada a pH 8.5.

• El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que

finalmente se inoculan las diluciones en los medios de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

Página de

Página 74 de 122

Preparación de reactivos. Solución de hidróxido de sodio 1,0 N: Disuelve 4.0 g de hidróxido de sodio y afóralo a 100 mL con

agua destilada.

Soluciones diluyentes. Solución reguladora de fosfatos concentrada: Diluye 34.0 g de fosfato de sodio monobásico en 1.0

litro de agua destilada.

Preparación: Disuelve el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de

sodio 1,0 N y aforar a un litro con agua. Esterilízalo durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.

Consérvalo en refrigeración, recuerda que es una solución concentrada.

Nombre Cómo diluir No. 2


Consulta en las fuentes de información de tu escuela sobre la importancia que tiene diluir las muestras durante la realización de análisis microbiológicos a leche procesada.

Actitudes a formar

Orden

Limpieza

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas

Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.


5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de métodos establecidos.

A) Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo.

E) Sintetiza evidencias obtenidas mediante la experimentación para producir conclusiones y formular nuevas preguntas.


Lograrlas

Siguiendo procedimientos de manera reflexiva, que a través de la experimentación obtiene evidencias

Página de

Página 75 de 122

Toma 1,25 mL de la solución concentrada y llévala a un litro con agua. Esta es tu solución de trabajo.

Distribúyela en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.

Esterilízala a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.

Preparación de agua peptonada Disuelve en 500 mL de agua destilada los siguientes ingredientes: peptona 1.0 g y cloruro de sodio 8

.5 g. Después de mezclarlos afora la solución a un litro también con agua destilada y Ajusta el pH a 7

± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.

Distribuye en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera

y esterilízalas a 121 ± 1.0°C durante 15 minutos. Si este diluyente no lo usas inmediatamente,

almacénalo en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en

condiciones tales que no se alteren su volumen o composición.

Necesitarás pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con

tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su

volumen total. También serán requeridos frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca, tubos de 16

x 150 mm con tapón de rosca, utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos,

pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc. Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las

muestras a analizar deberán esterilizarse mediante autoclave, durante 15 minutos como mínimo a

121 ± 1.0°C.

Preparación de la dilución primaria a partir de muestras líquidas: Esta técnica la puedes utilizar para muestras de leche en las cuales la distribución de

microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación,

etcétera); también para muestras congeladas de un alimento a base de leche originalmente líquido o

licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y

homogeneizar agitando vigorosamente.

Agita la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados

en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe

encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

Siempre que la cantidad de muestra lo permita, toma alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de

10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente.

Página de

Página 76 de 122

Preparación de la dilución primaria a partir de muestras sólidas: Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC

durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. Pesa una cantidad de 10 u

11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.

Adiciónale un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la

muestra.

Licua durante 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea. Permite que las

partículas grandes se sedimenten, y transfiere la cantidad deseada tomando de las capas superiores

de la suspensión. Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, puedes adicionar más

diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de

resultados.

Prepara las diluciones decimales adicionales de la siguiente manera: Transfiere 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro

recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada,

evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Mezcla cuidadosamente cada botella de diluyente

siempre de la misma manera que se describe en el punto 2. Las diluciones que trabajarás serán de la

1 a la 6.

Utiliza pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan

seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la

pipeta. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total,

escurre aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido. Mientras

se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debes apoyarla en el interior del cuello del frasco y

mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es: Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el

microorganismo en 10 mL de la dilución más alta. Para la técnica de cuenta en placa, considerar

aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en

el método de cuenta de bacterias aerobias en placa.

En el caso de otros grupos microbianos, considera el número especificado de colonias en la Norma

Oficial Mexicana correspondiente. En general, las diluciones de la muestra debes prepararlas

inmediatamente antes del análisis y usarlas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos

posteriores a su preparación.

Página de

Página 77 de 122

El empleo de microorganismos en biotecnología se fundamenta en la obtención de cultivos puros, que

están constituidos por una única especie microbiana; y en el mantenimiento de esa pureza en las

manipulaciones subsiguientes. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleva el uso de

cultivos puros.

La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución. El

método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se extiende o se

raya sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales quedan

separadas una de otra. Cada célula aislada crece para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o

clon) puro, puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una única célula

original.

Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo.

Nombre Aislamiento en placa y transferencia de cultivos. No. 1


Lee detenidamente los consejos que te ayudarán para que realices las técnicas de siembra, separación y aislamiento, y que con ayuda de tu facilitador te guiará paso a paso.

Actitudes a formar


Manera Didáctica

de Lograrlas

Búsqueda bibliográfica y en internet.


• Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones.

• Estructura ideas y argumentos de manera clara, coherente y sintética.


Lograrlas

Tener el conocimiento completo de la técnica aséptica para efectuar el cultivo de microorganismos.

Página de

Página 78 de 122

1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en

placa inicial debería dar lugar al repetir la operación colonias todas del mismo tipo, y cuya

morfología concuerda con la de aislamiento inicial.

2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia debería mostrar un

único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción, como por ejemplo la tinción Gram, son

útiles para establecer que la colonia no contiene una mezcla de tipos microbianos diferentes.

Existen varios métodos para obtener un buen aislamiento en placa y cada método requiere un poco

de práctica. Es importante recordar que cuantas más células se cogen con el asa de siembra, mas

habrá de rayas (diluir) sobre la placa para obtener células aisladas. No es necesario comenzar con

una gran cantidad de inoculo en el asa de siembra. Para esta práctica, emplearemos dos protocolos

distintitos de aislamiento en placa.

Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la

esterilidad de los medios y soluciones (ver el Anexo 2, Manipulación Segura de los Microorganismos).

Trabajando asépticamente, se toman prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la

contaminación de los cultivos o de las soluciones con microorganismos no deseados. La mayoría de

las placas de Petri y las botellas de cultivo de tejidos que se emplean para crecer cultivos puros de

microorganismos están fabricadas en plástico y ya vienen esterilizadas de fábrica; pero se necesita

emplear una técnica aséptica para llenar estos recipientes con un medio estéril. Una adecuada

asepsia en la técnica de transferencia protege a quien está manipulando, de la contaminación con el

cultivo, que siempre debería tratarse como un patógeno potencial. La técnica aséptica significa evitar

cualquier contacto entre el cultivo puro, el medio estéril, y las superficies estériles del recipiente de

cultivo, con microorganismos contaminantes. Para conseguir este objetivo, (1) el área de trabajo se

limpia previamente con un agente antiséptico para reducir el número de contaminantes potenciales;

(2) los instrumentos con los que se realiza la transferencia están esterilizados; por ejemplo, el asa de

siembra se esteriliza con calor en el mechero Bunsen antes y después de cada inoculación; y (3) el

trabajo se realiza rápida y eficientemente para minimizar el tiempo de exposición durante el que

podría ocurrir la contaminación del cultivo o del trabajador.

Los pasos típicos en la transferencia de un cultivo de un recipiente a otro son los siguientes: (1)

flamear el asa de siembra; (2) abrir y flamear las bocas de los tubos de cultivo; (3) recoger un poco de

cultivo crecido y transferirlo al medio fresco; (4) flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes

de cerrarlos; y (5) volver a flamear el asa de siembra. Esencialmente se emplea la misma técnica

para inocular placas de Petri (salvo quela placa no se flamea), y también para transferir

microorganismos desde un cultivo a un porta de observación microscópica.

Página de

Página 79 de 122

Es un prerrequisito esencial el conseguir una comprensión y un conocimiento completo de la técnica

aséptica antes de ponernos a trabajar con cultivos de microorganismos. Te ahorraras una gran

cantidad de tiempo y energía, y evitaras resultados erróneos si observas unas pocas reglas sencillas

y de sentido común cuando trabajas con microorganismos:

1. Esteriliza siempre el asa de siembra por calor antes de meterla en cualquier cultivo.

2. Flamea siempre la boca del tubo de cultivo antes de meter el asa de siembra estéril. Esto

destruye cualquier célula contaminante que pueda haberse depositado inadvertidamente

cerca de la abertura del tubo durante inóculo anterior o por cualquier otro motivo.

3. Mantén todos los cultivos con sus tapas y tapones respectivos mientras no los empleas. No

depositas los tapones o las tapas de las placas de Petri sobre la mesa, ya que expones los

cultivos a una potencial contaminación. Cuando transfieres colonias desde placas de Petri,

utiliza la tapa como un escudo abriéndola solo lo suficiente para meter el asa de siembra de

manera que el medio continúe estando protegido de los contaminantes que pudieran caer

sobre la placa.

4. No permitas que los tapones de los recipientes ni las tapas de las placas de Petri toquen otra

cosa que sus recipientes de cultivo respectivos. Ello impedirá la contaminación de los cierres y

por tanto de los cultivos.

5. Utiliza los procedimientos adecuados de manipulación en la apertura y en el cierre de los

recipientes.

Con la guía de tu maestro, pon en práctica las técnicas siguientes:

Fig. 1. Tipos de aislamiento en placa.

Aislamiento por rayado por cuadrantes

1 2

4 3

Aislamiento por rayado continúo

Página de

Página 80 de 122

Fig. 2. Manejo de muestras y toma del inóculo

Página de

Página 81 de 122

Fig.32. Aislamiento por agotamiento por estrías en 3 fases

Fig. 4. Prepación de un frotis bacteriano.

Página de

Página 82 de 122

Fig. 5. Tinción simple.

Preguntas

1. ¿Cómo puedes asegurar que tienes un cultivo puro de cada microorganismo en cada placa?

2. ¿Cómo emplearías la temperatura para favorecer o inhibir el crecimiento de bacterias o

levaduras?

3. ¿Por qué es una ventaja mantener el tubo de cultivo inclinado cuando se inserta el asa de

siembra?

4. ¿Para qué se flamea la boca del tubo?

Página de

Página 83 de 122

Nombre Conteo de hongos y levaduras No. 1


2.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A DERIVADOS DE LA LECHE, DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.





Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 84 de 122

Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar

formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos

sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización

en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor,

alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y

levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas

sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos

desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas.

Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer

la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias

inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia

prima inadecuada

Colonias, agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.

Se entiende por:

Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un

núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La

reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.

Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se

caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se

conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se

alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares

pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25

°C.

Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de

colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.

Reactivos y materiales

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique

agua debe entenderse como agua destilada.

Medios de cultivo.

Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.

Preparación del medio de cultivo.

Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C,

acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido

tartárico por 100 mL de medio).

Página de

Página 85 de 122

Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una

porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.

A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido

tartárico.

Soluciones.

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

FORMULA


Fosfato de potasio monobásico 34,0 g

Agua 1,0 l

Preparación:

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.

Llevar a 1,0 l de agua.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).

Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.

Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.

Solución estéril de ácido tartárico al 10%

FORMULA


Acido tartárico 10,0 g

Agua destilada 100,0 mL

Preparación:

Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de

membrana de 0,45 µm.

Materiales.

Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de

algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen

total.

Cajas Petri.

Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.

Página de

Página 86 de 122

Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.

Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas,

etc.

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben

esterilizarse mediante:

Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a

121 ± 1,0°C.

Aparatos e instrumentos

Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro calibrado.

Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.

Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado

con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente

amplificador.

Registrador mecánico o electrónico.

Microscopio óptico.

Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Procedimiento

Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,

utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una

pipeta estéril diferente para cada dilución.

Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño

de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es

vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de

las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie

lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie

horizontal fría.

Página de

Página 87 de 122

Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.

Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.

Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días,

seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja

muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los

conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de

3 o 4 días en los resultados del análisis.

Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para

distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.

Expresión de resultados

Cálculo del Método

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.

Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA1-

1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados.

Informe de la prueba

Informar:

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa -


Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa-


Te sugiero leer el anexo 3

previo a la elaboración del reporte

de la práctica.

Página de

Página 88 de 122

Nombre Conteo de coliformes totales y fecales No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 89 de 122



• bata

• cubre boca

• cubre pelo

• guantes




5. Prepara y esteriliza los siguientes medios de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad

requeridos y el análisis a realizar

CALDO LACTOSADO (medio de enriquecimiento)

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA (selectivo)

CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (medio de confirmación)

PREPARACIÓN

• Disuelve los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario, el medio completo

deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.

• Ajusta el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6.9 +/- 0.2 a

25°C

• Distribuye en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm en medio de

concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm en el medio de concentración de

1.5, cada tubo debe tener campana de fermentación.

• Esteriliza en autoclave por 15 min a 121 +/- 1.0°C

• Enfría rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es

claro y de color beige.

• Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán

10 mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.

• Realiza la toma de muestras aplicando la técnica adecuada.

• Realiza el vertido en placa y/o tubos de cultivo de acuerdo a la técnica descrita.

• Realiza la inoculación de la muestra aplicando la técnica adecuada.

• Toma tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración.

Página de

Página 90 de 122

• Utiliza una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida, o 10

mL de la dilución primaria inicial en el caso de otros productos.

• Toma tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento, usa una

pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida, o 1

mL de la dilución primaria en el caso de otros productos.

• Mezcla suavemente el inoculo con el medio.

• Etiqueta y rotula los tubos de ensaye de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos.

• Realiza la incubación de la muestra a analizar a 35 +/- 0.5 °C por 24 +/- 2 hrs y observar si

hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación por 48 +/- 2 hrs.

• Verifica la temperatura de incubación.

• Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos.

• Cuando solo una dilución muestra tres tubos positivos, elige esta y las diluciones mayores

posteriores.

• Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elige

esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.

• Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y estos se encuentran en más de tres

diluciones, selecciona las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.

• En cada caso se obtiene un número de tres cifras, que indica el número de tubos positivos

donde debes buscar el índice de número más probable NMP. La técnica de NMP puede

admitir gran cantidad de variaciones, por ejemplo, para una muestra sólida donde un NMP de

70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95 % de los casos variarán de 10 a 230

coliformes por gramo y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de

confianza son de 3.6 a 130 coliformes por gramo.

• Compara tus resultados con los estándares permitidos.

• Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado.

Recuerda que esta práctica la aplicarás en mantequilla, crema,

fermentados, dulces de leche, quesos de todos tipo y helados.

Página de

Página 91 de 122











Página de

Página 92 de 122

Nombre Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 93 de 122

NORMA MEXICANA NMX-F-253-1977.CUENTA DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS

METHOD FOR AEROBIC MESOPHYLIC BACTERIA COUNT

0 INTRODUCCION

Cuando se pretende investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica

más comúnmente utilizada es el recuento en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de

microorganismos y su fundamento consiste en contar las colonias que desarrollan en el medio de

elección después de cierto tiempo y temperatura de incubación presuponiendo que cada colonia

proviene de un microorganismo en la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de

variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.

En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La

variedad de especies y tipos diferenciales por sus distintas necesidades nutricionales, temperatura

requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas

constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, la ejecución de la técnica

cuando se siguen fielmente las condiciones que se señalan para su desarrollo puede llegar a

proporcionar resultados lo bastante reproducibles para darle significado a la prueba.

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN.

Esta Norma establece un método para estimar la cantidad de bacterias mesofílicas aerobias en un

alimento.

2 REFERENCIAS

Para la correcta aplicación de esta norma, se deben consultar las siguientes Normas Mexicanas en

vigor:

• NMX-F-285 Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis y

• NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.

3 MATERIAL Y EQUIPO

a) Horno para esterilizar.

b) Autoclave con termómetro, o manómetro probado con termómetro de máximas.

c) Baño maría con termostato y termómetro.

d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato con vasos esterilizables.

e) Vasos esterilizables para licuadora.

f) Balanza granataria con sensibilidad de 0.1 g.

Página de

Página 94 de 122

g) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±0.5°

h) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas.

i) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 y 1 mL graduadas en 0.1 y 0.01 mL respectivamente.

j) Frascos de dilución de vidrio para contener 99 ó 90 mL, ó tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca

para contener 9 mL de solución reguladora diluyente, en ambos casos ± 1% del volumen señalado

después de la esterilización cerrados herméticamente.

4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

a) Solución reguladora diluyente

Solución concentrada

KH2 PO4 34 gramos

Agua destilada 500 mililitros

Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con Hidróxido de Sodio IN.

Llevar a un litro con agua destilada. Esterilizar durante 20 minutos a 121°. Conservar en refrigeración.

Tomar 1.25 mL de solución concentrada y llevar a un litro con agua destilada, ésta es la solución de

trabajo. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° durante 20

minutos. El pH final debe ser 7.2.

b) Agar – Triptona - Extracto de Levadura (agar cuenta estándar)

Extracto de levadura 2.5 gramos

Triptona 5 gramos

Dextrosa (d - glucosa) 1 gramos

Agar 15 gramos

Agua destilada 1,000 mililitros

NMX-F-253-1977

Suspender 24 gramos del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.

Distribuir en volúmenes de 100 y 200 mL. Esterilizar a 1.1 kg/cm2 (121°) durante 15 minutos. El pH

final del medio debe ser 7.0 ± 0.1.

El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado para algunos alimentos en particular y

requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese

alimento.

Página de

Página 95 de 122

5 PROCEDIMIENTO

5.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que su inoculación, la adición de los

medios de cultivo y su rotación se pueda realizar cómoda y libremente.

Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación.

5.2 Para la preparación y dilución de la muestra seguir las indicaciones señaladas en la Norma

Mexicana NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.

5.3 Practicar las diluciones decimales que se estimen convenientes.

5.4 Transferir 1 mL ó 0.1 mL de la muestra y de cada una de las diluciones a cajas Petri estériles

evitando todo tipo de contaminación durante la maniobra y aplicando la punta de la pipeta al fondo de

la caja mientras escurre el líquido.

5.5 Agregar 12 a 15 mL. del medio de cultivo fundido y mantenido a una temperatura de 45° - 48° en

un baño de agua. Mezclarlo con la muestra (6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de

las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a delante) sobre una superficie lisa y

horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculó en el medio, cuidar que el medio no

moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

5.6 El tiempo transcurrido desde el momento que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que

finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

5.7 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y a la temperatura

que se requiera, según el tipo de alimento de que se trate.

5.8 Seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 30 a 300 colonias, pues es en ellas donde

será menor el error en el recuento.

5.9 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de hongos),

incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no

se pueden distinguir las colonias de pequeñas partículas de alimento.

6 INTERPRETACION DE RESULTADOS

6.1 Con el auxilio de la lente de aumento y de la cuadrícula del contador, contar todas las colonias de

las placas seleccionadas. Si el número se estima mayor de 300, y no se dispone de placas

preparadas con las diluciones subsecuentes, contar en la mitad o en un cuarto representativo de ella,

multiplicando por 2 o por 4 el número obtenido. El fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro

contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.

Página de

Página 96 de 122

6.2 Multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de colonias por mililitro o gramo de

la muestra.

6.3 Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, utilizar la placa cuyo recuento se aproxime

más a esta cifra. Si la placa correspondiente a la primera dilución es la única que presenta colonias y

éstas son menos de 10, informar el número de colonias seguidas de la frase "en la dilución 1:10".

6.4 Debe apreciarse una razonable proporcionalidad en el número de colonias que aparezcan en las

placas de acuerdo con las diluciones utilizadas. En tanto no exista esta relación el personal del

laboratorio debe adquirir la destreza necesaria hasta conseguirlo antes de efectuar estudios que sean

válidos.

Al iniciarse en el trabajo de laboratorio es recomendable inocular las cajas correspondientes de cada

dilución por duplicado y computar las medias aritméticas.

6.5 Si todas las placas:1) no muestran colonias, 2) muestran excesiva difusión de las mismas, 3)

están contaminadas o no son satisfactorias por cualquier motivo, anotar respectivamente: 1) sin

colonias, 2) colonias difusas, 3) incluyendo por accidente de laboratorio.

6.6 Redondear la cifra obtenida en el recuento de manera que sólo aparezcan 2 dígitos significativos

al inicio de esa cifra: 128 se informa como 130; 2,417 como 2,400; 49 como 49, etc.

6.7 Informar: Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias en placas de Agar Triptona

Extracto de levadura incubadas X * horas a X*

* anotar las que correspondan a cada caso particular.

Recuerda elaborar el reporte de la práctica.

Página de

Página 97 de 122

Nombre Determinación de Salmonella No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 98 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes





análisis a realizar. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir

las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.

Medios de preenriquecimiento Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenito-cistina,

Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solución A, Solución B, Solución C, Caldo de soya

tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de

potasio

Medios de aislamiento Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para

Salmonella y Shigella (SS), Agar entérico Hektoen.

Medios para pruebas bioquímicas Agar de tres azúcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para

Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer),

Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rápido, Caldo infusión cerebro corazón

Soluciones Solución verde brillante al 0,1% (1:1000), Solución de yodo-yoduro, Solución salina al 0,85%,

Solución salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solución de alfa-naftol al 5%, Solución de rojo de

metilo, Solución de hidróxido de potasio al 40%, Solución de gelatinasa al 5%

Página de

Página 99 de 122

Antisueros Antisuero polivalente somático (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi



Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de

1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.

Se recomienda una muestra de 25 g o más.

Procedimiento general para la preparación de muestras

• Pesa asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para

trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher).

• Adiciona 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a

menos que se indique otro) y licúalo si es necesario durante un minuto.

• Transfiere asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con

tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.

Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potenciómetro. Ajusta, si es necesario, a

un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezcla y cubre el

recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 ± 2 h a 35ºC.

Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada

• Sigue el procedimiento general para el pesado de la muestra y adiciónala lentamente a un

matraz Erlenmeyer con 225 mL de solución verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo

quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60

minutos e incúbala durante 24 horas +/-2 horas a 35°C


Aislamiento de Salmonella

• Cierra firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y

agita suavemente, transfiere respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10

mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en

sustitución del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport.

Página de

Página 100 de 122

•

• Incuba de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo

periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios

selectivos.

• Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estríalo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),

agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos

adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo

procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

• Examina las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo

con las siguientes características:

a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En

algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las

bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

c) Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos

las colonias pueden aparecer completamente negras.

d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras;

con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose

posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.

Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

e) Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las

colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

Identificación bioquímica

• Selecciona al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien

aisladas.

• Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azúcar

hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por

punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.

• Almacena en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario

retomar más colonias.

Página de

Página 101 de 122

• Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las

colonias que den las siguientes reacciones:

f) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa;

en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no

fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra

a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.

h) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación

de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo

en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en

este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

• Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en

los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuación:

• Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA

típicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio

LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o

sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos

medios.

• Continúa el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta

reacciones atípicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se

obtuvo el cultivo atípico anterior y siembra las pruebas bioquímicas nuevamente.

• Continúa la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI.

Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias

procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

Prueba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente

positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para

comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar

24 ± 2 h a 35ºC.

Página de

Página 102 de 122

Prueba de ureasa (rápida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de

cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rápida). Incuba 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de

agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Deberás retener los cultivos que den la

prueba negativa (sin cambio de color del medio).

Identificación serológica Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

• Coloca con asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos

secciones de una placa para aglutinación. Suspende en cada una de las gotas, una porción

del cultivo desarrollado en TSI.

• Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mézclalas con el

canto del asa o empleando aplicadores de madera.

• Agita inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un minuto.

• Observa bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

• Considera cualquier grado de aglutinación como positiva.

• La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el

antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.

• Si observas aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con

las pruebas bioquímicas complementarias.

• Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo

empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los

más frecuentes).

• Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay

aglutinación con Vi calienta el cultivo a ebullición y repite la aglutinación con el antisuero

polivalente O.

• Si se requiere, practica el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero

polivalente H).

Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a

35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya

tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adiciona 2,5 mL de solución

salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

Página de

Página 103 de 122

• Coloca 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x

100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Prepara un control de

solución salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno

formalizado. Incuba las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observa a intervalos de 15 min

por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla

de prueba pero no en el control. Debes interpretar como negativa una prueba en la que

ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se

considera la prueba inespecífica.

Pruebas bioquímicas complementarias

• Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no

concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:

• Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de

Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de

la especie S. arizonae.

Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: Agar citrato Simmons

• Inocula por estría el tubo.

• Incuba durante 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

• Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

• Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Medio SIM

• Inocula por punción.

• Incuba durante 24 h a 35 ± 2ºC.

Movilidad.

• Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

• Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

• Producción de ácido sulfhídrico.

Página de

Página 104 de 122

• Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a

todo el medio.

• Prueba negativa: ausencia de color negro.

• Producción de Indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3

mL de reactivo de Kovac.

Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

Caldo RM-VP

• Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h

para la prueba RM.

• Prueba de Voges-Proskauer (VP)

• Transfiere a un tubo un mL del cultivo de 48 h.

• Adiciona 0,6 mL de solución de alfa naftol.

• Adiciona 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%.

• Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional).

• Interpreta los resultados después de incubar durante 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura

ambiente.

• Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.


• Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.

Prueba de rojo de metilo (RM)

• Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de

metilo. Interpreta los resultados inmediatamente.

• Prueba positiva: desarrollo de color rojo.

• Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

Caldo malonato


• Prueba positiva: desarrollo de color azul.


Página de

Página 105 de 122

Caldo manitol


• Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.


Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las

pruebas bioquímicas convencionales.

9. Etiqueta y rotula los tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos

10. Verifica la temperatura de incubación


Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ mL de muestra.



Página de

Página 106 de 122

Nombre Determinación de Staphylococcus aureus No. 1


2.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A DERIVADOS DE LA LECHE, DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA





Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 107 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes




5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad

requeridos y el análisis a realizar.

6. Prepara la cantidad de los diferentes medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del

fabricante (Baird-Parker, solución de telurito, Emulsión de yema de huevo, Solución salina

isotónica, caldo de infusión cerebrocorazón, ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de

ternera, cloruro de calcio anhidro, solución de azul de toluidina, solución amortiguadora Tris

pH 9, plasma de conejo).



8. Realiza el procedimiento aplicando la técnica adecuada

• Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la

superficie de las placas de agar Baird-Parker.

• Distribuye el inoculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en

ángulo recto, utilizando una para cada dilución.

• Debes mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.

• Voltea las placas y colócalas en incubación durante 45 a 48 h a 35ºC.

• Selecciona las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus

aureus; si no es posible, selecciona las placas de las diluciones más altas no obstante

tengan más de 150 colonias.

• Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas

y al informe debes agregar la nota de "valor estimado".

Página de

Página 108 de 122

• Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de

1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

• Selecciona las colonias de acuerdo con el cuadro del anexo 15 para realizar las

pruebas de coagulasa y termonucleasa:

• Seleccionar el número de colonias y siembralas cada una en tubos con 0.5 mL de

caldo de infusión cerebro-corazón.

• Incúbalas a 35ºC durante 24 h.

• Inocula en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y

Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.

• Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0.3 mL de cada

cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y consérvalo para la prueba de termonucleasa.

El resto del cultivo usalo para la prueba de coagulasa.

Prueba de coagulasa

• Agrega a los 0.2 mL del cultivo anterior, 0.2 mL de plasma de conejo diluido volumen a

volumen con solución salina estéril.

• Incubalo en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si

no hay formación de coágulo, observa a las 24 h. Considera positiva la prueba si hay

formación de coágulo.

• Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo añade una gota de cloruro de

calcio al 5% a 0.5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en

10-15 seg.

Prueba de termonucleasa

• Calienta durante 15 minutos 0.3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebrocorazón en

baño de agua hirviendo.

• Pasa una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio,

incluye testigo.

• Incuba a 35ºC en cámara húmeda durante 4 a 24 h. La aparición de un halo color rosa

extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva.

Página de

Página 109 de 122

9. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y

dilución con los datos correctos.






Página de

Página 110 de 122

Nombre Determinación de Listerya monocitogenes No. 1







Docente




Actitudes a formar

Limpieza

Orden

Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas





Lograrlas


Página de

Página 111 de 122



• Bata

• Cubre pelo

• Guantes

2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar.





Reactivos Acido acético 5 N, Acido clorhídrico 1 M, Acido sulfanílico (cristales), Alfanaftilamina,

Alfa-naftol 5% en etanol absoluto, Etanol absoluto, Granalla de zinc, Hidróxido de sodio 1 M,

Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina), Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2,

Sangre de carnero fisiológica 0,85% estéril, Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp,

Sulfato de cadmio al 20%, Zinc pulverizado, Reactivos para Tinción de Gram, Alcohol-acetona, Cristal

violeta, Oxalato de amonio, Solución de Yodo, Solución de Safranina.

Reactivos para la determinación de nitritos Reactivo A: Alfa-naftilamina 0,5 g, Acido acético 5N 100,0 mL

Reactivo B: Acido sulfanílico 1,0 g, Acido acético 5N 125,0 mL

Reactivo C: Alfa-naftol 1,0 g, Acido acético 5N 200,0 mL

Solución de sulfato de cadmio al 20%

Medios de cultivo Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)

Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3

Agregar en condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo

antes de su uso.

Para la preparación de un litro del medio CSTEL se deben agregar las siguientes soluciones:

acriflavina, ácido nalidíxico y solución de cicloheximida.

Página de

Página 112 de 122

Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben

emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos inmediatamente después de usarla!

Medio de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)

Medio Oxford

Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)

Agar sangre de carnero

Caldo nitratos

Medios para la prueba de movilidad: Medio de SIM, Medio MTM.

Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos




9. Realiza el vertido en placa de cultivo de acuerdo a la técnica descrita

10. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos

correctos.






Te sugiero que leas

el anexo 2.

Página de

Página 113 de 122











Página de

Página 114 de 122

Nombre Visita a una planta procesadora de lácteos No. 1


1.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A LA LECHE PROCESADA DE ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA





Realiza una visita a una planta procesadora de lácteos. Atendiendo las indicaciones de tu maestro, identifica los procedimientos que se realizan en el laboratorio de control de calidad. Entrega un reporte de la visita.


Docente Realizar el procedimiento administrativo para la realización de la visita.


apoyo Hojas para elaborar el reporte por equipo.

Actitudes a formar

Orden, Limpieza, Responsabilidad

Manera Didáctica

de Lograrlas

La realización de la práctica debe desarrollarse observando los equipos, la indumentaria y las pruebas que se realizan en el laboratorio de control de calidad.


Escucha, interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante la utilización de medios, códigos y herramientas apropiados.


Lograrlas

Aplica distintas estrategias comunicativas según quienes sean sus interlocutores, el contexto en el que se encuentra y los objetivos que persigue.

Página de

Página 115 de 122

La Revolución industrial originó un aumento masivo de las poblaciones, con el consiguiente aumento

de la demanda de recursos, esto conlleva que se tengan que extremar las precauciones, para evitar

microorganismos perjudiciales en el agua y alimentos y también es necesaria una mejora en la

conservación de los alimentos.

Desde antiguo se sabe que los alimentos son un excelente transmisor de enfermedades infecciosas.

Incluso hoy en día, a pesar de que existe mayor información acerca de los microorganismos y su

transmisión, aún así, la transmisión de microorganismos por alimentos representa un problema que

atender. El aumento de nuevos patógenos transmitidos por alimentos atrae a los medios de

comunicación sobre la seguridad de los alimentos, haciendo que los consumidores seamos más

conscientes de dichas transmisiones y así exigimos alimentos cada vez más seguros. Por otra parte,

el desarrollo microbiano destruye grandes cantidades de alimentos, causando problemas económicos

y una considerable pérdida de importantes nutrientes.

La pérdida de calidad de un producto, por tanto, puede ser debida a la presencia de microorganismos

patógenos o de microorganismos que alteran el producto de tal manera que lo hagan inadecuado

para el consumo. De ahí surge la necesidad de que todas las industrias conozcan la calidad

microbiológica de sus productos, a nivel de las materias primas que usan, que conozcan la calidad de

todos los procesos de elaboración y por supuesto la calidad del producto final.

Para alcanzar la calidad microbiológica es necesario aplicar pasos ordenados a través de la cadena

de producción. A lo largo de esta cadena pueden presentarse fallas que llevan a obtener un producto

con características distintas a las deseadas por el consumidor y la empresa. Por esta razón, la

garantía de esta calidad se basa en el control de la presencia y multiplicación de los microorganismos

en el nicho ecológico peculiar constituido por el sustrato que proporciona el producto y por el tipo de

ambiente en que se conserva o mantiene. Los problemas microbiológicos suelen presentarse cuando

no se alcanza el efecto deseado por el procesado o por los sistemas de conservación y esto suele ser

consecuencia de errores en la manipulación o procesado. La detección de dichos errores, su rápida

corrección y prevención en el futuro, son el principal objetivo de cualquier sistema de control

microbiológico.

Página de

Página 116 de 122

Muy bien, terminamos el submódulo 3, “Efectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos”.

Para esto, fue necesario que realizaras las actividades propuestas en la Guía de aprendizaje además

de la guía de tu maestro. Fue muy importante el interés que pusiste para investigar, realizar trabajo

en equipo, y seguir las indicaciones de las prácticas en el laboratorio.

Como te habrás dado cuenta, hay aspectos que no se deben pasar por alto: el uso de la indumentaria

adecuada, la manipulación segura de los microorganismos y la elaboración de los resultados. Por lo

que es indispensable que tomes en cuenta siempre las recomendaciones de los anexos 2 y 3, que te

serán de utilidad durante todos los módulos de la carrera, demostrando en todo momento una actitud

de respecto, orden y limpieza en tus actividades.

Has realizado diferentes actividades como ejemplos, ejercicios y prácticas en donde adquiriste

conocimientos, habilidades y destrezas con los que puedes demostrar que has desarrollado las

competencias de este submódulo.

Todo lo que acabas de adquirir te facilitará la entrada en el sector laboral y/o el autoempleo, así que

no dejes escapar las oportunidades que se te presenten.

Página de

Página 117 de 122

• Guía práctica. Departamento de Producción e Industria Animal. La Universidad del Zulia. Maracaibo, Noviembre 2003.

• Manual de Prácticas del Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa. María de los Ángeles Aquiahuatl Ramos. María de Lourdes Pérez Chabela. Edición 2004.

• Microbiología de los Alimentos. Manual de Laboratorio. Juan Antonio Pereda. Gonzalo D. Librería Norma, 2006.

• Guía Práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Editorial Acribia, Zaragoza.

• Higiene de los alimentos, microbiología y HACCP. S.J. Forsythe y PY Hayes. Segunda Edición.

• Migración de sustancias químicas. Desde el envase al alimentos. Volúmenes I y II. D.H. Watson, M.N. Meaj. Editorial Acribia, S.A.

• Principios de la Tecnología de lácteos. James N. Warner. AGT Editor, S.A.

• Biotecnología: Curso de prácticas de laboratorio. Jurek M. Becjer, Guy A. Caldwell. Editorial Acribia.

Normas Mexicanas y Normas Oficiales Mexicanas.

• NMX-F-255-1978-Método de conteo de hongos y levaduras en alimentos

• NMX-F-308-1992-Cuenta de organismos coliformes fecales

• NMX-F-253-1977-Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias.

• NOM-115-SSA1-1994-Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

• NOM-143-SSA1-1995-Método de prueba microbiológico para alimentos.

• Determinación de Listeria monocytogenes.

• NMX-F-304-1977*-Método general de investigación de Salmonella en alimentos.

Página de

Página 118 de 122

Cepa: En microbiología, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo patrimonio

genético.

Colimetría. Técnica de análisis microbiológico.

FUNGI. Este reino incluye a los hongos (fungus, hongo), seres eucarióticos y heterótrofos

absorbedores. Para alimentarse, secretan enzimas digestivas a sus alrededores; posteriormente el

hongo absorbe los productos y los asimila.

GELIFICANTE. Se les llaman también gomas hidrosolubles o hidrocoloides, son básicamente

macromoléculas que se disuelven fácilmente en el agua y el resultado es un gran aumento de la

viscosidad, estos digamos “polvos”, son los encargados de facilitar la emulsión en determinados

alimentos.

INÓCULO. Cepa.

Página de

Página 119 de 122

ANEXO 1. EJEMPLO DE GUÍA DE OBSERVACIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑOS

Nombre del alumno: Campos de aplicación

Carrera: Técnico en Análisis y Tecnología de los Alimentos

Modulo II: Procesa alimentos a base de leche. Submódulo III: Efectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos. Evidencia por desempeño: Evidencia de actitud asociada:

Industria procesadora de leche.

Instrucciones para el alumno:

CUMPLIO CRITERIOS

SI NO

OBSERVACIONES

Observaciones generales

Evaluó (Nombre y Firma) Lugar y fecha de la aplicación

GUIA DE OBSERVACION: TAT-09/M2S3/ED1-1

Página de

Página 120 de 122

ANEXO 2. MANIPULACIÓN SEGURA DE MICROORGANISMOS

En muchas de las determinaciones biológicas conllevan el empleo de microorganismos vivos. Independientemente del lugar donde se empleen estos microorganismos, es esencial que los trabajadores de laboratorio se adhieran rígidamente a un código de prácticas microbiológico para reducir en lo posible las infecciones de origen laboratorial.

El modo seguro de aproximación al trabajo con microorganismos vivos es hacer las siguientes presunciones:

1. Todo microorganismo utilizado en el laboratorio es potencialmente peligroso.

2. Todo fluido del cultivo contiene organismos potencialmente patógenos.

3. Todo fluido del cultivo contiene sustancias potencialmente tóxicas.

El código de práctica del laboratorio microbiológico se basa en el deseo de que ningún microorganismo experimental o fluido procedente de su cultivo ha de entrar en contacto con la piel, la nariz, los ojos o la boca. hay que señalar que un porcentaje importante de las infecciones adquiridas en el laboratorio se deben a la inhalación de aerosoles infecciosos liberados durante el trabajo en el laboratorio. a continuación ofrecemos una lista de instrucciones que constituyen la base del código de prácticas de un laboratorio microbiológico.

1. En todo momento has de llevar una bata de laboratorio que te cubra desde el tronco hasta el cuello.

2. Está prohibido comer, beber o fumar en todo el laboratorio.

3. No deben existir etiquetas enmohecidas.

4. Debes evitar tocarte la cara o los ojos.

5. No debes mascar chiche ni morder lápices o bolígrafos.

6. El banco de trabajo has de mantenerlo limpio, ordenado, despejado y libre de objetos no esenciales como libros o bolsos.

7. No deberás sacar del laboratorio ningún material sin el permiso expreso del supervisor del laboratorio o del responsable de seguridad.

8. Todas las manipulaciones, como por ejemplo pipetear o utilizar el asa de siembra, deberías realizarlas de modo que evites la producción de aerosoles de material contaminado.

Página de

Página 121 de 122

9. Debes emplear pipetas automáticas o pipetas con filtro, no pipetear con la boca.

10. Todas las manipulaciones debes realizarlas de una manera aséptica, utilizando pipetas estériles con filtro, y las pipetas contaminadas deberías esterilizarlas inmediatamente sumergíendolas totalmente en un desinfectante adecuado.

11. Debes colocar el material de vidrio contaminado y las placas de petri descartadas en recipientes cerrados para su tratamiento.

12. Los portaobjetos usados debes colocarlos en recipientes que contengan desinfectante.

13. Debes saber que ciertos procedimientos o equipos (por ejemplo la agitación de fluidos en matraces) producen aerosoles de materiales contaminados. siempre que sea posible debes colocar tapas sobre los recipientes contaminados.

14. Debes comunicar cualquier accidente, incluido los cortes más mínimos, las rozaduras, los derrames de cultivos o reactivos, al supervisor del laboratorio o al responsable de seguridad.

15. Al acabar la jornada, limpia tu banco de trabajo con su desinfectante adecuado.

16. Siempre que dejes el laboratorio, lávate las manos con un jabón germicida y sécalas con una toalla de papel desechable. las batas de laboratorio deben guardarse o mandarse a lavar. bajo ninguna circunstancia entres en una oficina o una zxona de descanso llevando una bata de laboratorio potencialmente contaminada.

Página de

Página 122 de 122

ANEXO 3. REPORTE DE RESULTADOS.

LOS DIEZ MANDAMIENTOS DE LA CONSERVACION DE LOS RESULTADOS*

1. Cíñete a los hechos. No divagues ni editorialices. 2. Emplea un cuaderno de laboratorio de lomo pegado para impedir que se puedan arrancar o

poner hojas. 3. Haz dos copias de todos los apuntes, uno de ellos debería conservarse en un lugar separado

y seguro. 4. Incluye los datos e informaciones directamente en el cuaderno de laboratorio tan pronto como

sean generados. Puedes firmar y fechar cada página del cuaderno (la firma es un procedimiento requerido en cuadernos de investigación industrial). No confíes en la memoria ni escribas en hojas sueltas con la intención de pasarlas más tarde al cuaderno.

5. Utiliza tinta permanente, preferentemente negra, que se reproducirá satisfactoriamente en la fotocopiadora.

6. Identifica cualquier equivocación o error, y explícalos. 7. Pega los registros en el cuaderno o consérvalos, tras identificarlos y clasificarlos

correctamente, de modo que se puedan recuperar rápidamente. 8. Utiliza términos aceptados universalmente; si es posible evita las abreviaturas, los nombres

codificados o los códigos de números. 9. Mantén el cuaderno de laboratorio limpio; evita las manchas y los vertidos. 10. Elabora una tabla de contenidos y un índice del cuaderno de laboratorio tan pronto como esté

lleno. .

técnico en análisis y técnico en producción tecnología de...

Documents