reporte de práctica hplc
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Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías
Departamento de Química
Instrumentación Analítica
Práctica No. 7
Separación de ácido acetilsalicílico y cafeína (cafiaspirina) en analgésicos por
Cromatografía de Líquidos de Alta Precisión
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DATOS PREVIOS
En la cromatografía de líquidos, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria.
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales
lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible
para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama
de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta
presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades
y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o
físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención
de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a
ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad
identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.
La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los
compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la
resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el
acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido
trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.
Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de
la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en
una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de
forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la
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hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la
fase estacionaria.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias
químicas y farmacéuticas así como en la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía
preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1µg de
muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de
una mezcla de 100 g.
Aplicaciones:
Campos de Aplicación de HPLC
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos.
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos.
Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes.
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB.
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos.
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
Separación y purificación de metabolitos.
Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina.
Purificación y separación de enantiómeros.
Purificación de compuestos naturales.
Purificación y caracterización de enzimas y proteínas.
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Mecanismos de separación en cromatografía El principio para que se separe una muestra en sus componentes puede ser debido a 5 principales fenómenos físicos:
1. Adsorción. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, con un área
superficial muy grande (por ejemplo, carbón activado o sílica gel). El soluto se adsorbe en la
superficie de la fase estacionaria. La causa de que se mantenga adsorbido el soluto se debe a
la separación de este a lo largo de la superficie de la fase estacionaria.
La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de
líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante
de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina,
siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con
masas moleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y
reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
2. Reparto. La fase estacionaria es una película delgada fija sobre un soporte sólido
previamente preparado. El soluto se separa por el equilibrio que se establece por la
solubilidad que tenga el soluto frente a este líquido estacionario y a la fase móvil gaseosa o
líquida.
3. Intercambio Iónico. Para que se efectúe la separación, la fase estacionaria se modifica
uniendo a su superficie especies electro activas (aniones o cationes) de forma covalente.
4. Exclusión molecular. Esta separación se debe al tamaño del componente de la muestra. Se asemeja a un “tamiz molecular”, en el cual la fase estacionaria es un gel poroso que
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atrapa a las partículas pequeñas del soluto, mientras que las grandes, no caben por los poros de este gel y pasan de largo sin ser retenidos. Es una técnica reproducible, escalable y rápida. La fase fija está formada por partículas
poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar
las moléculas de pequeño tamaño.
5. Afinidad. Es la técnica más reciente y más selectiva. Se inmovilizan moléculas (como
enzimas y anticuerpos) sobre la superficie de la fase estacionaria. Los componentes de la
muestra altamente afines a estas moléculas se retienen con gran eficacia mientras las que no
son afines, pasan de largo a través de la columna y salen en primera instancia.
Cromatografía de columna
El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo largo de una columna
cromatográfica se denomina elución. Como se observa en la figura 9, la fase móvil que entra a
la columna se llama eluente. Al salir de la columna se llama eluato o efluente.
Diferencia entre eluente y eluato
Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima,
los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la
mezcla separada.
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Parámetros que pueden identificarse en un cromatograma
Tiempo muerto ( ): Tiempo de retención para un soluto inerte, que no sea retenido en la
columna. Notar que tm es en realidad el tiempo necesario para que la fase móvil recorra la
longitud de la columna. En los cromatogramas reales, tm no siempre aparece. En
cromatografía de gases, cuando se usa un detector de ionización de flama, puede inyectarse
aire junto con la muestra para que aparezca el pico de aire correspondiente al tiempo muerto.
El volumen de la fase móvil necesario para desplazar un soluto no retenido desde el inyector
al detector se conoce como volumen muerto (Vm) o volumen de la fase móvil en la columna.
Tiempo de retención corregido ( ): Diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo
muerto.
Si todos los componentes de la mezcla interaccionan con la fase estacionaria, ninguno de
ellos eluirá al volumen de retención. Puede darse el caso de que el pico correspondiente al
tiempo muerto no aparezca tampoco en el caso de que el detector no sea sensible a ese
compuesto.
Tiempo de retención ( ): Tiempo necesario después de la inyección de la mezcla para que
la muestra alcance el detector. Manteniendo las mismas condiciones experimentales, cada
substancia tendrá su propio tiempo de retención, único y característico de ella. El tiempo de
retención se mide desde el inicio de la inyección hasta la parte más alta del pico
cromatográfico.
Factor de retención (k): También llamado factor de capacidad, se define como la relación
entre el tiempo de retención corregido y el tiempo muerto.
Retención relativa (α ) Para caracterizar las distancias entre los máximos de dos picos
cromatográficos consecutivos, se utiliza el factor de selectividad o de retención relativa,
definido como la razón entre el tiempo de retención neto de los dos componentes, que puede
calcularse directamente del cromatograma.
Resolución (Rs) El objetivo principal de la cromatografía es separar una mezcla en sus
componentes en un periodo de tiempo razonable. La Resolución es la separación entre los
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picos de un cromatograma, lo que implica que se pueda observar mejor la concentración de
cada componente.
PARÁMETROS INSTRUMENTALES
Columna Lichrocart 250-4 C 18 1508390001
Fase móvil Metanol-agua HPLC 50-50%
Flujo 8ml/min, presión 3000 psi
Detector
Diámetro interno
El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad
de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las
columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificación
de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno
menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el
aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas
columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a
un detector UV-VIS.
Medida de las partículas
La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de
partículas esféricas de sílice. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de
5 µm de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y
una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima
aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto
significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la
columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.
Tamaño de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros
pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida
proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande;
por ejemplo, una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros
puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.
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Presión del sistema
La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se
mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr
valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC
incorporan mejoras para poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar
partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2 micrómetros).
DATOS OBTENIDOS
Cromatogramas de estándares puros
Ácido acetil salicílico Cafeína
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Cromatograma de muestra problema.
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CÁLCULOS
Cálculos para preparación de la muestra
Cada comprimido contiene:
Aspirina: 500 mg
Cafeína: 40 mg
Cada comprimido de cafiaspirina pesó 640.5 mg, se tomó (1/10) del comprimido (64.05 mg) y
se aforo en un matraz a 25 ml (solución madre), la solución madre se diluyó 1/10 y de nuevo
se diluyó 5/100 para llegar a una concentración de AAS cercana a 10 ppm.
(
) (
)
Se aforaron en un matraz de 25 ml:
(
) (
)
Cálculos para obtener resultado final
, ,
.
Cálculo de Retención relativa α
El profesor nos proporcionó el tiempo de muerto.
Tiempo de retención corregido del AAS , tiempo de retención corregido de la cafeína .
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Cálculo de Factor de retención K
;
Cálculo de los números de platos teóricos N
( )
(
)
(
)
Cálculo de la altura equivalente a un plato teórico (AEPT)
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Resolución entre los dos compuestos
( )
( )
F.A. y F.C.
Cálculos para encontrar el porcentaje % del compuesto presente en el producto
comercial
AAS
⁄
( )( )
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(
)( )
(
) (
)
( )
(
)
En el comprimido se obtuvo 432.7 mg de ácido acetil salicílico, 86.54 % de 500 mg que dice
tener presente el comprimido de cafiaspirina de Bayer.
Cafeína
⁄
( )( )
(
)( )
(
) (
)
( )
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(
)
En el comprimido se obtuvo 35.62 mg de cafeína, 89.05 % de 40 mg que dice tener presente
el comprimido de cafiaspirina de Bayer.
RESULTADOS
ANEXOS
La columna
Debe estar construida en acero inoxidable para resistir la presión. La columna es un tubo de
acero de 10 a 30 cm de largo y 2 a 5 mm de diámetro interior, empacada con la fase
estacionaria. Algunos cromatógrafos tienen la columna en posición vertical, otros horizontal, y
generalmente se encuentra en el exterior del aparato, a temperatura ambiente.
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Tipos de columnas HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna
diseñada para separar y clasificar los componentes de una muestra sobre la base de sus
interacciones con una columna específica. HPLC es distinta, ya que utiliza un entorno más
presurizado para propulsar las muestras líquidas a través de la densa columna de manera
más eficiente. Tres tipos de columnas de HPLC están en uso común hoy en día, pero difieren
en la naturaleza de la capa de material que recubre la columna e interactúa con la muestra.
Columna de intercambio iónico
Los experimentadores utilizan cromatografía de intercambio iónico al separar muestras
ionizables, o muestras que se puede cargar. La fase estacionaria, que es el material sólido
que recubre la columna e interactúa con la muestra, posee una carga opuesta a la de la
muestra de interés, de manera que la muestra será atraída a las paredes de la columna. Esta
atracción ralentiza el tiempo de elución e la muestra, o el tiempo que se necesita para pasar
todo la columna en la fase móvil. Mientras más cargadas estén las partículas de la muestra,
más atraídas estarán por la fase estacionaria, lo que resulta en un tiempo de elución más
lento. El tiempo de elución representan la intensidad de la carga de las partículas, y por lo
tanto es el medio principal de clasificación de los distintos compuestos dentro de la muestra.
Columna de adsorción
Como su nombre lo indica, la cromatografía de adsorción funciona a través de una fase
estacionaria adsorbente. La adsorción, que no debe confundirse con la absorción, implica la
unión temporal de las partículas de la muestra a la fase estacionaria de la columna. El grado
en el que una partícula de la muestra puede adsorberse a la fase estacionaria está
determinada por la polaridad relativa, o carga, que la partícula puede poseer en un momento
dado. Esto varía de la cromatografía de intercambio iónico en que las partículas no se cargan
de manera explícita, sino que a veces son ligeramente positivas o negativas a medida que la
partícula gira y vibra. Mientras la partícula se mueve hacia abajo en la columna, se adsorbe y
de-adsorbe en diversos grados en función del nivel de polaridad que posee. Los tiempos de
elución proporcionan una medida del nivel de polaridad de las partículas de la muestra.
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Columna de exclusión por tamaño
La cromatografía de exclusión por tamaño utiliza una técnica de separación diferente a la de
intercambio iónico o de adsorción. Este tipo de columna es menos común que las otras dos,
pero es útil cuando se separan biomoléculas grandes como proteínas o hidratos de carbono.
La fase estacionaria se compone de partículas no cargadas, que son de tamaños controlados
y porosos. Cuando la muestra se dispara a través de la columna, las partículas de tamaño
más pequeño son absorbidos temporalmente en el recubrimiento de la columna, mientras que
las partículas más grandes pasan directamente a través de él y se eluyen primero. La fase
estacionaria está diseñada de manera que cuanto más pequeña sea la partícula, más
profundamente penetra en el recubrimiento de la columna, lo que significa que a las partículas
más pequeñas les tomará la mayor cantidad de tiempo para volver a la superficie y eluir. Las
muestras se pueden clasificar de acuerdo con el tiempo de elución, lo que se corresponde
directamente con tamaño de partícula.
Problemas más comunes encontrados en HPLC
Presión Alta
Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas.
Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del
detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presión
sigue alta reemplace la columna.
Solución a largo plazo: Asegúrese que todas las fases móviles se filtren apropiamente antes
que entren a la bomba de HPLC. También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
Pérdida de la Resolución
Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas.
Solución: vea la sección de Presión Alta
Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema
de HPLC.
Picos Hendidos
Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas.
Solución: Marcha atrás columna roja con presión baja está al lado de abre. Si es necesario
reemplace el fritado de la entrada o la columna.
Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema
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de HPLC.
Variación en los Tiempos de Retención
Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil.
Solución: Bomba primera y está fases seguras tan móviles es propiamente [degassed].
Solución a larga plazo: Asegúrese fase tan móvil está propiamente y adecuadamente
desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en línea asegura esa cadencia del flujo no
es demasiado alto para evita [degassing] completo.
Variaciones de la Línea Base
Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala
desgasificación de los solventes de la fase móvil.
Solución: Asegúrese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y
considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.
Línea Base con mucho Ruido
Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
Solución: Enjuague el sistema y purgue la bomba de HPLC. Use Solventes desgasificados
adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema.
Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)
Posible causa: Oxígeno Disuelto.
Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de
oxígeno disuelto.
Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente
chequear el nivel de oxígeno disuelto.
Baja ó Ninguna Presión
Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a
partículas en suspención en la fase móvil.
Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.
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TIPOS DE DETECTORES
Espectrometría de masas
El detector de espectrometría de masas junto con la HPLC se denomina HPLC-MS (por sus
siglas en inglés). Éste forma uno de los mejores conjuntos analíticos. El HPLC-MS es el
detector más potente. Tiene particularmente relevancia dentro del ámbito de la ciencia médica
y es ampliamente utilizado en laboratorios farmacéuticos y en la investigación y el desarrollo.
El principal beneficio del HPLC-MS es su capacidad de analizar y proporcionar la identidad
molecular de un amplio rango de componentes.
Detección del índice de refracción (IR)
El detector del índice de refracción (IR) utiliza un monocromador y es uno de los detectores
LC menos sensibles. Es extremadamente útil para detectar aquellos componentes que son no
iónicos. No absorbe la luz ultravioleta y no se torna fluorescente. Algunas muestras que se
examinan con este detector son el azúcar, el alcohol, los ácidos grasos y los polímeros.
Ultravioleta (UV)
Los detectores ultravioleta (UV) son económicos y populares y son ampliamente utilizados en
la industria. Este tipo de detector responde a sustancias que absorben luz. El detector de UV
es principalmente utilizado en las ciencias biomédica y farmacéutica para separar e identificar
los principales componentes activos de una mezcla. Los detectores de UV son los más
versátiles, ya que cuentan con la mayor sensibilidad y linealidad. Los detectores de UV no
pueden utilizarse para probar sustancias bajas en cromóforos (incoloros o prácticamente
incoloros) ya que no pueden absorber luz en rangos bajos.
Fluorescencia
La fluorescencia es el detector de HPLC más sensible. Se utiliza prácticamente de manera
exclusiva en la cromatografía líquida (LC). Se trata de un detector específico que detecta
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solamente aquellas sustancias que emiten luz. Este detector es popular en el análisis de
trazas dentro de la ciencia ambiental. Como es muy sensible, su respuesta es solamente
lineal sobre un rango de concentración relativamente limitado. Como no hay muchos
elementos que se tornan fluorescentes, los científicos necesitan sintetizar muestras para que
sean detectables.
Mediciones para cálculos.
CONCLUSIONES
La cromatografía HPLC es una técnica de separación que nos permite identificar de manera exacta y
precisa la composición de una muestra y la concentración de sus componentes. Es de gran utilidad
para muchas aéreas de estudio y de la industria.
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REFERENCIAS
1. Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost detection of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of Neuroscience Methods, 139:263-269.
3. McNAIR, Harold y ESQUIVEL, Benjamin. Cromatografía Líquida de Alta Presión. Nº 10. Serie
Química. Organización de los Estados Americanos. Washington. 1973.
4. Cromatografía, Apuntes de instrumentación analítica. Bernardo Gudiño. 5. http://www.ehowenespanol.com/tipos-detectores-hplc-lista_92703/
6. http://latina.chem.cinvestav.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm#Problemas
7. http://www.slideshare.net/ivvivarchavsky/hplc-15483718