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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

“REPORTE DE DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO EN EL SITIO ALTERADO PRESA BLANCA: COMPUERTA 1 DE ACUERDO A LA

PROY-NMX-AA-042/1-SCFI-2008 NMX-AA-SCFI-1987”

PRESENTAN

GRIMALDO MÉNDEZ JESÚS ADIR

MARTÍN DEL CAMPO ORTIZ ISRAEL

PÉREZ RAMÍREZ MIRIAM ALEJANDRA

PEDROZA ÁLVAREZ JESÚS OMAR

RAMÍREZ RAMÍREZ MIGUEL ANGEL

QU-301

ASESORA

Dra. ROSA RICO MATA

GENERACIÓN: 2014-2016 LEÓN, GUANAJUATO. 24 DE JUNIO DE 2015

Universidad Tecnológica de León.

S e r, S a b e r, H a c e r.

EL PREMIO NACIONAL

DE CALIDAD2 0 0 0

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ANTECEDENTES DEL SITIO

En el estado de Guanajuato se encuentra el municipio de León uno de los 46

que conforman el estado.

En dicho municipio se

encuentra la Presa Blanca,

con una localización

geográfica 21°05’01.71” N

101°42’39.60 O; en la

Figura 1 Presa Blanca vista

aérea se puede apreciar

dicha presa vista desde el

aire a una altura de 3.93 km,

se observa un color verdoso

de agua así como a sus

alrededores se encuentran

parcelas para sembradíos.

Es una presa de aguas negras y residuales donde desembocan todo tipo de

desechos industriales y domésticos, el agua de dicha presa se conduce a través de

un canal a cielo abierto, hacia las comunidades de Santa Rosa, Plan de Ayala y San

Pedro del Monte y su destino final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas

están fuertemente contaminadas química y bacteriológicamente, al no sufrir ningún

tratamiento de remediación. El municipio de León posee parcialmente dos cuencas

hidrológicas: la del sistema Lerma-Chapala-Santiago, y al de los ríos Pánuco-

Tamesí.1

Actualmente en Presa blanca existen ciertos tipos de servicios como los que

se observan en la Tabla 1. Actividades económicas, se encuentra referenciado a un

área de influencia de 2 km.

Tabla 1 Actividades Económicas 2

SEVICIO EXISTENTES

Agricultura, cría y explotación de animales 2

Minería 2

Generación, transmisión y distribución de energía eléctrica

2

Construcción 10

industrias manufactureras 1200

1 Información por municipios. Acceso y disponibilidad en:

http://proteccioncivil.guanajuato.gob.mx/atlas/sanitario/leon.php 2 Actividades económicas municipio de León de los Aldama, Guanajuato. Acceso y disponibilidad en:

http://inegi.com/leon/actividades/economía

Figura 1 Presa Blanca vista aérea

3

Comercio al por mayor 575

Comercio al por menor 2475

Transportes, correos y almacenamiento 49

Información en medios masivos

Servicios financieros y de seguros

58

Servicios inmobiliarios y de alquiler de bienes muebles e instancias

80

Servicios profesionales, científicos y técnicos 58

Servicios de apoyo a los negocios y manejo de residuos y desechos

138

Servicios educativos

121

Servicios de salud y de asistencia social 126

Servicios de esparcimiento culturales y deportivos, y otros

84

Servicios de alojamiento temporal y de preparación de alimento

751

Otros servicios excepto actividades gubernamentales

972

Actividades legislativas, gubernamentales, de impartición de justicia.

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Fidel García Granados, titular de la Dirección de Medio Ambiente de León,

Guanajuato, menciona que se tiene un problema de contaminación, Presa Blanca

se ha convertido en un tiradero de desechos industriales, desde lodos de tenerías,

hasta llantas y maderas. Ha presentado denuncias dirigidas a la Comisión Nacional

del Agua y la Procuraduría federal del Medio Ambiente, pues la zona es de

competencia federal. 3

3 Transforman presa en tiradero. Acceso y disponibilidad en: http://am.com.mx/leon/local/transforman-la-

presa-en-tiradero-5559.html

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RELATORIA DEL MUESTREO

El día miércoles 10 de junio de 2015 se efectuó el muestreo microbiológico en Presa Blanca León, Guanajuato por parte de los alumnos de grupo QU-301 de la carrera Química área Tecnología Ambiental de la Universidad Tecnológica de León.

A las 8:20 de la mañana se realizó un Check-list con la finalidad de revisar y confirmar la existencia y correcto funcionamiento de equipo y materiales necesarios para efectuar el muestreo así como preservadores que mantuvieran en condiciones óptimas las muestras. A las 9:20 de la mañana se abandonamos la Universidad con destino a Presa Blanca, tomando el Boulevard Aeropuerto hasta llegar al Boulevard Timoteo Lozano por último la avenida María Auxiliadora, recorriendo un total de 25 km en un tiempo aproximado de 35 minutos.

Siendo las 10:15 se tuvo un reconocimiento de la zona como se aprecia en la Figura 2. Panorámica Presa Blanca. Así como el arribo a la zona de muestreo que se puede observar en Figura 3. Zona de muestreo: Compuerta 1.

Gracias al sitio web Meterored se constató que a las 12:00 de la tarde el clima era soleado – nuboso con una temperatura de 23°C con un viento de 11 km/h sin presencia de lluvias un porcentaje de humedad de 69% y una presión

de 1017hPa. 4

Se dio inicio con la recolección de 5 muestras puntuales de suelo aledaño al cauce de la compuerta 1 para posteriormente crear una muestra compuesta de 1.5 kg. Como se puede observar en Figura 4: Muestreo de suelo

Se midió el caudal de descarga del agua proveniente de Presa blanca para

4 Clima en León. Acceso y disponibilidad en: http://www.meteored.mx/clima_Leon-America+Norte-Mexico-

Guanajuato--nxw-22384.html.

Figura 2 Panorámica Presa Blanca

Figura 3 Zona de Muestreo: Compuerta 1

Figura 4 Muestreo de suelo

5

después recolectar 8 muestras puntuales de 500 mL cada una como se puede observar en Figura 5: Muestreo de agua.

Observando las figuras cabe destacar la

coloración verdosa y espumosa que presentaba el agua, se cree que contiene contaminantes provenientes de descargas ilegales por parte de la industria leonesa y descargas de aguas residuales, así como el suelo tenía una consistencia limo-arcillosa, comprobándose al ser moldeado de diferentes maneras.

El muestreo bacteriológico fue el último en realizarse debido a que las muestras tenían un tiempo limitado, por lo que se realizó una siembra de muestras in situ en agar rojo bilis violeta previamente preparado y contenido en cajas Petri.

Dicho muestreo se efectuó a las 12:30 del día tomando una muestra simple de agua, con ayuda de una jeringa estéril se depositó 1 mL de muestra en el agar previamente mencionado, la caja Petri que contenía el medio y la muestra rápidamente fue colocada en una hielera para mantener en buen estado la muestra. Observar Figura 6 Siembra in situ agua.

A las 12:40 del día se efectuó el muestreo bacteriológico en suelo, excavando aproximadamente 3 cm a partir de la superficie con ayuda de un hisopo previamente esterilizado se colocó la muestra de suelo por estriado en el agar y rápidamente se guardó la caja Petri en la hielera. Observar Figura 7 Siembra insitu suelo.

El muestreo finalizó a las 13:00 del día sin reporte de incidencias, el equipo se retiró al punto de reunión previamente acordado.

El arribo a la Universidad Tecnológica de León fue a las 15:20 del día, la Dra. Rosa Rico Mata recibió 2 muestras debidamente etiquetadas: 1 de agua y 1 de suelo junto con las 2 cajas Petri que contienen las muestras sembradas, se almacenaron en la incubadora a una temperatura de 35°C – 37°C por 24 horas para su posterior análisis y detección de coliformes totales y fecales.

Figura 5 Muestreo de agua

Figura 6 Siembra in situ agua Figura 7 Siembra in situ suelo

6

PROCEDIMIENTO: CULTIVO IN SITU

Material:

2 cajas Petri previamente esterilizadas que contengan medio de agar rojo

bilis violeta.

Un hisopo de algodón estéril.

Pipeta o jeringa estéril

Muestreador de agua

Procedimiento de toma de muestra de suelo y agua:

1. En el sitio de muestreo se acondiciona la zona seleccionada para la toma de

muestra para la siembra en cada una de las matrices en este caso agua y

suelo.

2. Para suelo se escarban 3 cm ya que se requiere muestra superficial y con

una espátula depositar la cantidad suficiente en el recipiente.

3. En agua directamente con un frasco muestreador se sumerge 10 cm debajo

de la superficie inclinándolo en dirección opuesta al flujo se introduce hasta

llenado y se vuelve a verter esto con la finalidad de homogenizar la muestra,

se repite la operación 2 veces más y la final se toma como muestra.

Procedimiento de siembra: Para la siembra que se realizara en situ es necesario llevar acabo las

siguientes actividades:

1. Para la siembra de suelo se homogeniza la muestra y con el hisopo tomamos

muestra y se estría de manera simple por la placa de modo que este quede

esparcido.

2. En la siembra de agua, directamente del frasco muestreador con una jeringa

o pipeta estéril tomar 1ml de muestra y se esparce por toda la placa por medio

de movimiento oscilatorio

3. Una vez sembrada la muestra se procede a refrigerar para evitar que el agar

sembrado se derrita y se transporta al laboratorio para incubar a una

temperatura de 35°C-37°C durante 24 horas y se observa si hay crecimiento

7

PROCEDIMIENTO PRUEBA PRESUNTIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES Fundamento

El método se basa en la inoculación de alícuotas de muestra, en una serie

de tubos que contengan un medio de cultivo líquido conteniendo lactosa (caldo

lactosado).

tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación para verificar la turbidez en los tubos y la producción de gas. Estos cambios se producen debido a que los organismos coliformes fecales (termotolerantes), que son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, Gram negativos, no esporulados que se caracterizan por poseer la enzima beta-glactosidasa la cual actúa cuando estos se desarrollan a 44.0 ±1 °C, lo cual fermenta la lactosa y el manitol produciendo ácido láctico y gas como CO2 e H2. Esta producción de ácido se ve reflejada en el cambio de color si es que hay indicador de pH y la producción de gas se ve en el aire contenido dentro de la campana Durham, también se puede observar una turbidez en el contenido del tubo la cual es producida por el crecimiento de las bacterias.

El Indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano (presente en el medio) con producción de Indol. Materiales, reactivos y equipo

Preparación del medio de cultivo caldo lactosado

18 Campanas de fermentación Durham 18 Tubos de ensaye de cristal refractario de 15mm x 150 mm con tapón de baquelita, aluminio o algodón. 2 Espátula 2 Piceta 3 Charola de pesado 2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 2 Agitador de vidrio Balanza analítica Autoclave Caldo lactosado Agua destilada 1 Gradilla

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Preparación de muestras e inoculación del medio

1 Espátula

1 Piceta

2 Pipetas 10 mL

2 Perillas

2 Probetas de 100 mL

2 Asas bacteriológicas

1 Mechero

Incubadora

PRUEBA PRESUNTIVA

Procedimiento

Para la confirmación de presencia de coliformes en agua y suelo es necesario

primero sembrar muestras de agua y suelo en cajas Petri con agar rojo bilis violeta

de manera que el suelo se siembre con un isopo estéril y el agua con una jeringa 1

mL, ambos en el sitio de muestreo que se preservaran a 4 °C.

Medios de aislamiento presuntivo TABLA 1. CONTENIDO Y MÉTODO DE PREPARACIÓN PARA EL CALDO LACTOSADO.

Medio utilizado

Marca y contenido de

producto Contenido Método de preparación

Caldo lactosado

BD BIOXON CONT. 450 g

Fórmula preparada para 1000 mL de agua purificada. -Peptona de gelatina 5.0 g -Extracto de carne 3.0 g -Lactosa 5.0 g -pH final 6.9 ± 0.2.

Suspender 13 g del polvo en un litro de agua purificada. Disolver y distribuir en tubos con campana Durham. Esterilizar a 121°C de 12 a 15 minutos.

Conociendo que se prepararían 9 tubos para la muestra de suelo y 9 para la muestra de agua.

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Procedimiento de análisis

1. Preparación del medio

1.1. Verificar la preparación que viene establecida en el frasco del medio.

1.2. El volumen que se preparara de caldo se determina de acuerdo a las

proporciones de ensayo que se desean analizar.

TABLA 2. PROPORCIONES DE ENSAYO PARA LA DISTRIBUCIÓN DE MUESTRA EN

LOS TUBOS.

Proporciones de ensayo

1° volumen de muestra

2° volumen de muestra

3° volumen de muestra

A1 3 tubos con 10 mL 3 tubos con 1 mL 3 tubos con 0.1 mL

A2 5 tubos con 10 mL 5 tubos con 1 mL 5 tubos con 0.1 mL

A3 1 matraz con 10 mL 5 tubos con 1 mL

A4 5 matraz con 100 mL 1 tubo con 10 mL 1 tubo con 1 mL

A5 1 matraz con 10 mL 5 tubos con 1 mL 5 tubos con 0.1 mL

1.3. Posteriormente preparar el medio a doble concentración y colocar la cantidad

correspondiente de acuerdo a las proporciones de ensayo, en este caso se

prepararán 9 tubos para la muestra de suelo y 9 tubos para la muestra de agua,

utilizando material previamente estéril. El medio a doble concentración se

agrega solo a los 6 tubos (3 para análisis en agua y 3 de suelo) que llevan 10

mL de muestra y 10 mL de medio, y el resto de los tubos llevan el medio en

concentración normal.

1.4. Colocar una campana Durham a cada uno de los tubos sin excepción de manera

que estas se encuentren invertidas y al fondo de su tubo.

1.5. Poner un tapón de algodón con capucha de aluminio a cada tubo para

introducirlos en la autoclave durante 15 minutos a 15 lb de presión y 121°C o a

la olla de presión durante 15 minutos, contando el tiempo después de que

alcanza una temperatura alrededor de 120°C.

1.6. Una vez fuera de la autoclave u olla de presión dejar enfriar a temperatura

ambiente.

2. Inoculación e incubación de tubos

2.1 Homogeneizar las muestras de agua y suelo agitándolas cuidadosamente. Realizar diluciones de las muestras si es necesario.

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2.2 Tomar con pipetas diferentes las cantidades de muestra de agua y suelo requeridas para cada tubo de caldo lactosado y completar un volumen de 20 mL. 2.3 Tapar los tubos con sus respectivas capuchas y poner en la incubadora a una temperatura de entre 35-37 °C durante 18-48 horas.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA DETERMINAR COLIFORMES TOTALES

Fundamento: Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo bilis

verde brillante el cual es un medio selectivo que solo permite el desarrollo de

aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde

brillante.

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del

Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo

microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a

37°C durante 48 hr.

METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS

Caldo verde bilis brillante TABLA 2. CONTENIID Y MÈTODO DE PREPARACIÓN PARA EL CALDO VERDE BILIS BRILLANTE

Medio utilizado

Marca y contenido de

producto Contenido Método de preparación

Caldo verde bilis

brillante

BD BIOXON

CONT. 450 g

Fórmula preparada para 1000 mL de agua purificada. -Bilis de Buey 20.0 g -Lactosa 10.0 g -peptona de Gelatina 10.0 g -Verde Brillante 13.3 g

Disolver 40 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Agitando frecuentemente para disolver el producto, dispense en tubos con campanas Durham. Esterilizar a 121ªc durante 15 minutos.

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NOTA: En base a la cantidad de tubos presuntivos que resultaron positivos en los tubos que contenían caldo lactosado, preparar la cantidad necesaria de caldo verde bilis brillante para realizar las pruebas confirmativas, adicionando 10 mL de caldo a cada tubo con su respectiva campana Durham invertida, una vez preparado los tubos necesarios de caldo verde bilis brillante se procede a realizar la siembra de estos. Desarrollo de la prueba

Una vez sembrados los tubos presuntivos en caldo lactosado con muestras

de agua y suelo se procede a detectar la producción de gas de CO2 e H2 dentro de las campanas Durham.

1. Si hay producción de gas dentro de la campana Durham se tendrá que

resembrar de cada tubo con caldo lactosado positivo a otro tubo con caldo verde

bilis brillante previamente esterilizado, (si no hay producción de gas dentro de la

campan Durham no es necesario realizar los siguientes pasos ya que la prueba

presuntiva es negativa).

2. Antes de realizar la siembra primero esterilizaremos nuestra área de trabajó

con alcohol etílico al 70%, dejaremos que se seque por completo.

NOTA: Durante la siembra todos los integrantes deben de utilizar su EPP

necesario para resguardar su salud ya que se desea confirmar la presencia de

organismos coliformes totales y termotolerantes.

3. Realizaremos nuestra siembra de la siguiente manera:

Primero encenderemos nuestro mechero bunsen, esterilizaremos nuestra asa de

nicromo en el mechero, una vez esterilizada el asa se introducirá a un tubo con

caldo lactosado que resulto positivo, se agitara en todas direcciones por el tubo

y se retirara, cerraremos rápidamente el tubo, después introduciremos el asa de

nicromo a un tubo que contenga caldo verde bilis brillante y de igual manera la

agitaremos dentro del CVBB, cerraremos nuestro tubo y lo llevaremos a incubar.

NOTA: Todo el procedimiento se debe de realizar en un perímetro no mayor a 30

cm del mechero Bunsen.

4. Una vez sembrados los tubos con aproximadamente 0.1 mL de muestra

recolectada del tubo con caldo lactosado que resulto positivo, incubaremos los

tubos durante 48 horas a una temperatura de 37ºc, pasadas las 48 horas

deberemos de observar si nuevamente hay producción de gases dentro de la

campana Durham e interpretaremos los resultados de la siguiente manera:

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Interpretación de resultados:

Si se observa turbidez y producción de CO2 e H2: La prueba se considera

POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: estos se consideran NEGATIVOS.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES

TERMOTORELANTES Y E. COLI. PRESUNTIVA

Fundamento:

En la fase confirmativa se detecta a un grupo de coliformes fecales, el cual

está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con

producción de gas a las 48 hr de incubación a 44 °C. Este grupo no incluye una

especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli.

Desarrollo de la prueba:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba

presuntiva en los tubos con caldo lactosado, inocular con una asada otro tubo

con caldo verde bilis brillante.

2. incubar durante 24 horas a 44 °C. y después de este período, observar

presencia de turbidez y gas (CO2). Posteriormente se reportaran los resultados.

Interpretación de resultados:

Si se observa turbidez y producción de CO2 e H2: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: estos se consideran NEGATIVOS

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PUEBA DEL INDOL

METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS Y REACTIVOS

Agua peptona

1. Pesar 0.4 gramos de peptona y 0.1 gramos de cloruro de sodio (NaCl)

transferirlos a un matraz Erlenmeyer de 250 mL y adicionar 20 mL de agua

destilada.

2. Distribuir 10 mL a cada tubo con una pipeta de 10 mL.

3. Tapar los 2 tubos y llevar a esterilizar en la autoclave a 121 ºc durante 15 min

a 15 libras de presión.

Reactivo de Kovacs:

Disolver 5.0 gr de dimetilaminobenzaldehído (C6H4 [H (CH3)2] CHO) en 75

mL de Alcohol amílico (CH3 (CH2) 4CH) libre de bases orgánicas. Añadir 85

mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl) con cuidado, proteger de la luz y

almacenar a (4°C).

Desarrollo de la prueba

1. Si nuevamente hay producción de gas dentro de las campanas Durham

contenidas en los tubos con el agar verde bilis brillante incubados se procede

a realizar de nuevo otra siembra en un tubo con agua peptonada pero solo

se elegirá un tubo de cada matriz.

2. A el tubo que resulto positivo las pruebas confirmativas tanto de la matriz

de agua y suelo y se eligió para realizarle la prueba del Indol se le

introducirá un asa de nicromo previamente esterilizada con el mechero, se

resembrara en otro tubo con agua peptonada y se incubara a 44ºc durante

24 horas.

3. Pasadas las 24 horas retiraremos el tubo de la incubadora y le añadiremos

de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs.

4. posteriormente se observara el desarrollo de un anillo de color rojo en la

superficie, agitaremos suavemente y notaremos la presencia de Indol en

caso de ser positiva. Si no se nota la presencia del anillo de color rojizo en

la superficie la prueba es negativa.

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PRUEBA DE LA OXIDASA

Fundamento

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La

reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que

activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que

produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno

actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de

electrones.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de

Neisseria (+). Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las

enterobacterias. También se usa en algunos casos para diferenciar género y

especie de otras bacterias

METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Disolver 0.1 gr de Clorihidrato de tetrametil-p-fenilendiamina en 1000 mL de agua

destilada

Desarrollo de la prueba

1. Llevar a cabo la prueba con subcultivos puros de los organismos

fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue:

2. Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.

3. Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado en

un papel filtro en una caja de Petri.

4. Con una barra de vidrio o un asa de alambre de platino (no de nicromel),

colocar parte del cultivo en el papel filtro preparado.

5. Esperar 5-10 segundos y observar la coloración.

Interpretación de resultados: La prueba se considera POSITIVA si la coloración se produce a los 5-10 segundos. De lo contrario la prueba se considera como NEGATIVA.