reporte 5 lab.genetica

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO División de ciencias naturales y exactas

Laboratorio de genética

Reporte 5: Reproducción meiotica en levaduras convencionales y

análisis genético de la segregación meiotica

EQUIPO #4: Guzmán Barrón Michelle Montserrat

Velázquez Villafaña Marion

12 de abril del 2014

Introducción: Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado

industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas que esta especie presenta. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa. Las levaduras, además de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno —como podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos— como fuentes de fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la

Biotina, también llamada Vitamina H. El apareamiento sexual sólo puede ocurrir entre células haploides de distinto sexo, las células a y las células alfa. En el caso de las levaduras, la determinación sexual no se debe a un cromosoma distinto entre sexos sino más bien a una diferencia en un único locus. Dicho locus se conoce con el nombre de MAT. Las células haploides de cualquiera de los sexos responden a la feromona producida por el sexo contrario. Las células de sexo opuesto podrán fusionarse, formando una célula diploide. Las células haploides nunca podrán realizar la meiosis en condiciones normales. Por el contrario, las células diploides no producen ni responden a ninguno de los dos tipos de feromonas, pero sí pueden realizar meiosis bajo condiciones ambientales muy determinadas. Una levadura haploide es capaz de cambiar de sexo. Las levaduras poseen copias del locus MAT que están silenciadas y por tanto no interfieren en la determinación sexual. Cuando se produce un cambio en el sexo de las levaduras, se produce un reemplazamiento génico del locus MAT por una de las copias adicionales. Las cepas de levaduras utilizadas en los laboratorios no suelen realizar este cambio de sexo debido a que están alteradas en el gen HO, que es determinante para el cambio de sexo. El genoma de esta levadura contiene aproximadamente 12.156.677 pares de bases, Está organizado en un conjunto de dieciséis cromosomas completamente caracterizados. Se estima que comparte aproximadamente el 23% del genoma con el ser humano.

Objetivos: Identificar las distintas fases de del ciclo sexual en S. cerevisiae.

Identificar a la progenie recombinante y en base a la segregación de los diferentes

caracteres genéticos corroborar su ubicación en un cromosoma específico

Metodología: PARTE 1 1. Realiza un parche de las 2 cepas Y1 y Y7 de aproximadamente 1cm2 2. Incuba 4 días y transfiere a medio de pre-esporulación incubando 5 días. 3. Transfiere finalmente a medio de esporulación e incuba 1 semana. 4. Identifica al microscopio las ascas formadas, producto de la meiosis. Guarda a 4 °C las ascosporas para realizar análisis de segregación meiótica mediante análisis en masa. PARTE 2: Tomar una porción de las células esporulantes que provienen del cruce Y1 X Y7 con un palillo estéril y suspenderlas en 0.2 ml de glusulasa diluida 1:40. Incubar 1 h a 30 C.

1. Añadir 0.1 m l aproximadamente de perlas de vidrio e incubar 1 h mas. Añadir

1 ml de agua estéril y agitar en el vortex 1 min y añadir 4 ml de de agua estéril.

Mezclar

2. Preparar diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar 100 L de las diluciones 10-2 y

10-3 en medio YPD.

3. Incubar hasta el viernes por la tarde y rescatar las colonias ROSAS

sembrándolas con el palillo en los medios

Resultados:

Imagen 1. Observacion de las tetradas

En la imagen de las que se observaron en las placan solo en la tercer caja, se observaron mas,por lo que de esa caja,se tomo la muestra para hacerlas diluciones 10-1,10-2 y 10-3.

Colonia MM MMCom-pleto

MM-ade MM-his MM-leu MM-Ura

1 - - - - -

2 - - - 3 - - - 4 - - 5 - - - - 6 - - - - -

7 - - - - -

8 9 - - - 10 - -

11 12 - + - - + -

13 - + - - - -

14 - + - - - -

15 - + - - - -

16 - + - - + +

17 - + - - + -

18 - + - + - -

19 - + - + - -

20 - + - + - -

21 - + - - - -

22 - + - + - +

23 - + - - - +

24 - + - - + -

25 - + - + + +

26 + + - + + +

27 - + - - + +

28 - + - + + +

29 + + - - - -

30 - + + + - -

31 - + - + + +

32 - + - - - -

33 - + - - - -

34 - + - - - -

35 - + - + - -

36 - + - - - -

37 - + - - - +

38 - + - - - -

39 - + - - - +

40 + + - - - +

41 - + + - + +

42 - + + - + +

43 + + - - + -

44 + + - - - +

45 - + - - - +

46 + + + + + +

47 - - + + - -

48 + + + + + +

49 + + + - + +

50 + + + + + +

51 - + + - + +

52 - - - + - -

53 - - + + - +

54 + + + - + +

55 - - + + - +

Nota: crecimiento –sin crecimiento

Tabla 1. Crecimiento de las colonias en los diferentes medios de cultivo

Colonia Fenotipo Genotipo Parental o Recombinante

1 A: leucina, adenina, uracilo

e histidina

-leu - ade - ura - his Recombinante

2 A: leucina, adenina

P:uracilo, histidina

-leu –ade ura his Recombinante

3 A: leucina, adenina

P:uracilo, histidina

-leu –ade ura his Recombinante

4 A: leucina P: adenina,

uracilo e histidina

-leu ade ura his Recombinante


P:histidina

-leu - ade - ura his Recombinante


e histidina



e histidina


8 P: leucina, adenina, uracilo

e histidina

leu ade ura his Recombinante

9 A: leucina, uracilo

P:adenina, histidina

-leu ade - ura his Recombinante

10 A:uracilo P:leucina, adenina e histidina

leu ade - ura his Recombinante

11 P: leucina, adenina, uracilo

e histidina

leu ade ura his Recombinante

12 A:adenina, histidina

P:leucina,uracilo

+leu –ade +ura -his Recombinante

13 A: leucina, adenina, uracilo,

histidina

-leu -ade -ura -his Recombinante

14 A:leucina, Adenina, uracilo,

histidina

-leu –ade –ura -his Recombinante

15 A:leucina, adenina,

uracilo,histidina

-leu –ade –ura –his Recombinante


P:leucina,uracilo

+leu –ade +ura- his Recombinante

17 A:adenina, histidina, uracilo

P:leucina

+leu –ade -ura -his Recombinante

18 A:adenina, leucina, uracilo

P:histidina

-leu –ade –ura +his Recombinante


P:histidina



P:histidina


21 A:adenina, histidina,

leucina, uracilo


22 A:adenina, leucina

P:histidina, uracilo

-leu –ade +ura+his Recombinante

23 A:adenina, histidina, leucina

P:uracilo

-leu –ade +ura -his Recombinante


P:leucina

+leu –ade –ura-his Recombinante

25 A:adenina, uracilo

P:leucina, histidina

+leu –ade –ura +his Recombinante

26 A:adenina P:leucina,

histidina ,uracilo

+leu –ade +ura +his Recombinante


P:leucina, uracilo

+leu –ade +ura –his Recombinante

28 A:adenina P:leucina,

histidina, uracilo



leucina, uracilo


30 A:leucina, uracilo P:adenina, histidina

-leu +ade –ura +his Recombinante

31 A:adenina P:histidina,

leucina, uracilo



leucina, uracilo



leucina, uracilo



leucina, uracilo



P:histidina



leucina, uracilo

-leu –ade -ura -his Recombinante


P:uracilo

-leu –ade +ura –his Recombinante


leucina, uracilo


39 A:adenina, leucina, histidina

P:uracilo

-leu –ade +ura – his Recombinante

40 A:adenina, leucina, histidina

P:uracilo


41 A:histidina P:adenina,

leucina, uracilo

+leu +ade +ura –his Recombinante


leucina, uracilo



P:leucina

+leu –ade –ura –his Recombinante


P:uracilo



P:uracilo


46 P:adenina, histidina, leucina, uracilo

+leu +ade +ura +his Recombinante

47 A:leucina, uracilo P:adenina, histidina

-leu +ade –ura +his Recombinante

48 P:adenina, histidina,

leucina, uracilo



leucina, uracilo


50 P:adenina, histidina,

leucina, uracilo



leucina, uracilo



P:histidina


53 A:leucina P:adenina,

histidina, uracilo

-leu +ade +ura +his Recombinante


leucina, uracilo


55 A:leucina P:adenina,

histidina, uracilo

-leu +ade +ura +his Recombinante

Nota: A = Auxotrofo P = Prototrofo

Tabla 2. Determinación de Fenotipo y Genotipo e identificación de recombinantes

Tipo Genotipo Número de

individuos

con este

genotipo

I -leu - ade - ura – his 13

II -leu –ade ura his 3

III -leu ade ura his 3

IV -leu - ade - ura his 1

V leu ade ura his 5

VI -leu ade - ura his 5

VII leu ade - ura his 2

VIII -leu –ade +ura -his 5

IX +leu-ade +ura -his 4

X +leu –ade –ura -his 2

XI +leu –ade +ura +his 3

XII +leu +ade +ura -his 2

XIII -leu +ade –ura +his 3

XIV +leu +ade +ura -his 3

XV +leu +ade +ura -his 1

Tabla 3. Tipos de recombinantes y su frecuencia Discusión de resultados: Después de realizar la cruza se obtuvieron los diploides, algo que hay que tomar en cuenta al momento de visualizarlos en el microscopio es tu tridimensionalidad, la limitación del microscopio para mostrarnos únicamente dos dimensiones podría confundir en algún momento al observador en el momento de analizar las ascas. Una vez que se obtuvieron eso se analizaron cepas cuya coloración era rosa ya que eso garantizaba la auxotrofia a adenina (debido a que la coloración es producida por un metabolito de la síntesis de adenina que al no poder seguir con su ruta se estanca y produce la coloración) y posteriormente vimos toda la segregación identificando el genotipo de cada una de las colonias que logramos aislar, con esto queda demostrado como afecta la segregación meiotica a la variabilidad de un organismo además de cómo se pueden llegar a complementar ciertas auxotrofias. También tomamos en cuenta 10 cepas de las colonias blancas que se resembraron, para obtener las combinaciones posibles y estas están marcadas de color rojo en la tabla de resultados.

Conclusión: Se determinaron las características de Saccharomyces cerevisiae , se compararon las diferencias anatómicas entre ambas cepas originales, se identificaron cepas recombinantes con una auxofrofia a adenina, mediante las originales con características similares otorgadas por la maestra dentro del laboratorio. Se logró diferenciar las cepas recombinantes y sus auxofrofia y

Prototrofia con éxito para cada una de las cepas obtenidas. Por lo que se podría concluir de forma general que un microorganismo es auxótrofo cuando sólo es capaz de proliferar en un medio de cultivo si a éste se ha añadido alguna sustancia específica, que el tipo silvestre, llamado protótrofo, no requiere, porque es capaz de sintetizarla.

También que Típicamente, la genética subyacente a una auxotrofia es la carencia de una ruta metabólica funcional que genere la sustancia de la que depende el auxótrofo y que esta carencia suele deberse a una mutación que genera un alelo nulo carente de capacidad biológica.

Cuestionario: 1. Que harías para demostrar si cada una de ellas heredó una tercera o cuarta mutación ura-

leu- y/o his- . Por ejemplo, ¿como saber que las cepas ade- y ura- solo llevan esta dos

mutaciones o también son leu- y/o his-?

R= se sembraron en todos los medios ya mencionados lo cual nos permitió identificar todas

las auxotrofias presentes ya sea que concordaras con las que ya tenían como consecuencia

de los parentales o debido a la segregación al formarse los recombinantes

2. ¿Cual de las combinaciones de la tabla es la más abundante? ¿y que explicación genética le

dan?

R= el primer tipo de recombinante mencionado es el más abundante, esto se atribuye a la

distancia de los genes en cuestión que se estudiaron, las siguientes imágenes muestran la

localización de los genes ura3 leu2 his1 en el caso de la auxotrofia en adenina no sabemos

cuál gen requerido para la síntesis de adenina está dañado.

Ura 3

Leu2

His 1

Conclusión: Se identificaron las distintas fases del ciclo sexual en S. cerevisiae al ver paso a paso la manera en que dicho proceso se lleva a cabo, además se identifico la progenie recombinante observando el

crecimiento en distintos medios identificando así las auxotrofias y posteriormente el genotipo el cual después de compararlo con el genotipo parental nos indico cuales eran recombinantes , una vez hecho eso se estudio cómo afecta la ubicación y la distancia entre los genes involucrados a la formación de recombinantes.

Aplicación Saccharomyces cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Las aplicaciones industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación. Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas).

Bibliografía: http://es-urug.finanzalarm.com/details/Saccharomyces_cerevisiae.html http://www.yeastgenome.org

http://es-urug.finanzalarm.com/details/Saccharomyces_cerevisiae.html

http://www.yeastgenome.org/

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