producción de hidrocarburos en la cepa arthrobacter jbh1
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Producción de hidrocarburos en la cepa Arthrobacter
JBH1
Ana Lucía Quijano Hoyos
Resumen: Se investigó la producción de hidrocarburos en la bacteria Arthrobacter JBH1 para establecer su potencial en
la formación de biocombustibles de segunda generación. Se investigaron genes implicados en el proceso y se diseñaron
primers para amplificarlos mediante una PCR. Para caracterizar los hidrocarburos formados por la bacteria se realizó una
cromatografía de gases y una espectrometría de masas. En el estudio se identificó la presencia de genes oleABCD, y se
diseñó una pareja de primers para amplificar el gen oleA por su papel inicial en la biosíntesis de hidrocarburos, sin embargo
no se logró estandarizar la PCR. Por otra parte se observó producción de alcanos lineales y ramificados de 7, 8, 9 y 10
carbonos, sin presencia de alquenos, que podrían ser usados en maquinaria que actualmente funciona con diésel o gasolina.
En conclusión, Arthrobacter JBH1 posee un gran potencial para la producción de hidrocarburos alifáticos y debe seguirse
estudiando.
[Palabras clave: Arthrobacter JBH1, gen oleA, alcanos]
INTRODUCCIÓN
La disminución de las reservas de combustibles fósiles
y el continuo desarrollo de la economía altamente
dependiente de la energía y de compuestos derivados de
los hidrocarburos, ha generado un interés por el
desarrollo de nuevos combustibles. Es decir, de
biocombustibles generados a partir de recursos
renovables que puedan suplir la creciente demanda
energética, y que además tengan una menor repercusión
sobre el medio ambiente [1].
Estos biocombustibles se han clasificado en primera,
segunda y tercera generación, en relación a sus
mecanismos de producción y a la materia prima
empleada. Los de primera y segunda generación son
producidos por microorganismos heterótrofos durante
la fermentación de biomasa a partir de cultivos
alimentarios y no alimentarios respectivamente.
Mientras que los biocombustibles de tercera generación
son generados por microorganismos fotosintéticos que
convierten directamente el CO2 a hidrocarburos o
precursores [2].
El bioetanol, quien pertenece a los biocombustibles de
primera generación, ha sido utilizado a nivel mundial
en remplazo de los combustibles fósiles para suplir la
demanda energética principalmente en el sector de
transporte [3]. Sin embargo, su baja densidad
energética [1], el constante conflicto por el uso de la
tierra con cultivos alimentarios [2], y su alta
corrosividad en los sistemas de almacenamiento y
distribución, ha dirigido la visión hacia la producción
de otros biocombustibles. Entre estos, se encuentran los
hidrocarburos alifáticos quienes son componentes
predominantes de la gasolina y el diésel, y por
consiguiente son más compatibles con las máquinas
actuales y los sistemas de distribución existentes [4].
No obstante, el desarrollo de hidrocarburos alifáticos a
gran escala a partir de cultivos microbianos aun
presenta limitaciones en cuanto a la comprensión de los
diferentes mecanismos de síntesis y en la identificación
de los genes y proteínas implicadas; además de la
selección de microorganismos que puedan producir en
mayor cantidad estos compuestos [1]. Esto genera la
necesidad del estudio de nuevos microorganismos que
ayuden a dilucidar un poco el panorama.
Actualmente, se ha identificado producción de
hidrocarburos alifáticos en algunos microorganismos,
Xanthomonas campestris [5], Micrococcus sp.,
Arthrobacter sp., Stenotrophomonas sp. [6] y
Pseudomonas aeruginosa RM [7]; mientras que en
otros como Vibrio furnassii M1 aún sigue en duda [8].
En el caso de Arthrobacter sp. se ha encontrado que la
producción intracelular de hidrocarburos alcanza hasta
un 0.93% de la biomasa seca, con reportes de
compuestos alifáticos con longitud variable entre 15 y
34 carbonos [9], y particularmente en el caso de
alcanos, cadenas de longitud variable entre 7 a 18
carbonos [7]. Igualmente se ha identificado que no
todas las especies de Arthrobacter sp. son productoras,
pues en el estudio de Frías y colaboradores (2009) sólo
4 de 8 especies evaluadas, A. chlorophenolicus TC1, A.
auresences A6, A. crystallopoietes, y A. oxydans,
formaron alquenos.
Por otra parte, además de investigar los
microorganismos productores de hidrocarburos, se han
realizado estudios para determinar los genes implicados
en estos procesos. Beller y colaboradores (2010)
identificaron la importancia del gen oleA en la
producción de alquenos a partir de estudios de
expresión heteróloga de los genes oleABCD en una E.
coli. Observaron que al expresarse únicamente el gen
Mlut_13230 (oleA) se producían cetonas precursoras de
los alquenos; cuando se expresaban los genes
Mlut_13240 (oleC) y Mlut_13250 (oleB) no se producía
nada; y cuando se expresaba el conjunto de genes
Mlut_13230-13240-13250 se generaban alquenos. De
esta forma, establecieron la importancia del gen oleA en
los primeros pasos de la biosíntesis de alquenos y la
necesidad de su estudio.
En ese contexto, el presente estudio buscó caracterizar
la producción de hidrocarburos en la cepa Arthrobacter
JHB1. Se identificaron los posibles genes oleA, se
diseñó una pareja de primers y se realizaron ensayos de
cromatografía de gases y espectrometría de masas para
corroborar la producción de hidrocarburos e identificar
compuestos de interés.
IDENTIFICACIÓN DE LOS GENES
Para identificar los genes relacionados con la
producción de hidrocarburos se anotó el genoma
mediante el servidor en línea RAST
(http://rast.nmpdr.org/) y se comparó con secuencias de
genes oleABCD reportadas en literatura. A partir de las
secuencias de aminoácidos de las proteínas OleA
reportadas en los estudios de Beller y colaboradores
(2010) y Friedman (2008), se realizó un blastp para
identificar proteínas homólogas y establecer
características como multidominio y superfamilia
(Tabla 1). Se encontró que estas secuencias
correspondían a la proteína 3-oxoacil ACP sintasa;
quien a su vez, estaba presente en tres regiones del
genoma de Arthrobacter JBH1, aquí llamadas
JBH1_10, JBH1_20, JBH1_30.
Al analizar estas secuencias con un blastx se determinó
que las tres pertenecían a la superfamilia de proteínas:
enzimas de condensación, pero que estaban agrupadas
en dos multidominios diferentes, fabF (JBH1_10 y
JBH1_30) y PRK 09325 (JBH1_20). Como en el
estudio de Beller y colaboradores (2010) se estableció
que las proteínas pertenecientes al multidominio fabF
no estaban implicadas en el primer paso de
condensación de los ácidos grasos, paso esencial para
el desarrollo de los hidrocarburos [10], sólo se
seleccionó la proteína JBH1_20 para realizar los
estudios posteriores.
Al visualizar la proteína JBH1_20 en el programa
RAST se observó que estaba sucedida por dos proteínas
implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos, una
proteína transportadora de acilo (JBH1_21) y otra
proteína tipo 3-oxoacil ACP sintasa del multidominio
fabF (JBH1_22), ver Tabla 2. Como estos tres genes
eran consecutivos y todos están implicados en la
biosíntesis de ácidos grasos, bien sea en el primer paso
de condensación o en pasos posteriores de elongación,
se decidió amplificar toda esta región. Las secuencias
de estos 3 fragmentos se presentan en el Anexo1,
Anexo2 y Anexo3; y en la Ilustración 1 se observa un
recuadro rojo que se resalta está región, donde la flecha
roja representa la proteína JBH1_20.
Ilustración 1. Posicionamiento genes KASIII, acyl carrier protein, KASII según anotación de RAST.
Aunque el presente estudio se enfocó solamente en la
proteína tipo OleA, se buscó a grandes rasgos la
presencia de las proteínas OleBC(BC)D puesto que de
estar presentes las cuatro proteínas, o tres si existiese
una fusión de los genes oleB y oleC, existe una mayor
probabilidad que Arthrobacter JBH1 produzca
hidrocarburos alifáticos [11]. Se siguió el mismo
procedimiento efectuado para el gen oleA, donde se
buscaron proteínas homólogas para las proteínas OleB,
OleC, OleBC y OleD reportadas para Arthrobacter
aurescens TC1 y Arthrobacter chlorophenolicus A6, en
la patente WO 2008/147781 A2 (Tabla 3).
Después de realizar un primer análisis se identificaron
dos posibles genes tipo oleB, dos tipo oleC y dos tipo
oleD, cuyas secuencias se presentan en la sección de
anexos. No se halló ningún resultado concluyente
respecto a proteínas tipo OleBC porque la secuencia de
referencia reportada por Friedman (2008), que codifica
para la proteína hidrolasa, daba múltiples coincidencias
en el genoma de Arthrobacter JBH1, haciendo
necesario un análisis más complejo de homología entre
proteínas que salía del alcance de estudio. Por tanto, la
posible presencia de genes oleABCD establece a
Arthrobacter JBH1 como un potencial candidato para
la producción de hidrocarburos alifáticos, sin embargo,
es importante aclarar que se necesita realizar estudios
más profundos para determinar si estos 6 genes oleBCD
identificados codifican para proteínas funcionales
OleBCD, y si en efecto Arthrobacter JBH1 carece de la
fusión del gen oleBC.
Tabla 1. Resultado Blastp y Blastx para genes oleA.
ID Multidominio Superfamilia Hit específico Proteína Microorganismo Referencia
TC1_10 PRK 09258 Cond_enzymes KAS_III 3-oxoacil
ACP sintasa
Arthrobacter
aurescens TC1 [4] [11]
Mlut_13230 PRK 09258 Cond_enzymes - 3-oxoacil
ACP sintasa
Micrococcus
luteus [4]
JBH1_10 fabF Cond_enzymes - 3-oxoacil
ACP sintasa
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_20 PRK 09325 Cond_enzymes KAS_III 3-oxoacil
ACP sintasa
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_30 fabF Cond_enzymes KASI_II 3-oxoacil
ACP sintasa
Arthrobacter
JBH1 Actual
Tabla 2.Características proteínas seleccionadas para amplificar.
ID Multidominio Superfamilia Hit específico Proteína Microorganismo Referencia
JBH1_20 PRK 09325 Cond_enzymes KAS_III 3-oxoacyl-
ACP synthase
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_21 - PP-binding AcpP Acyl carrier
protein
Arthrobacter
JBH1 Actual
JBH1_22 fabF Cond_enzymes KASI_II 3-oxoacyl-
ACP synthase
Arthrobacter
JBH1 Actual
Tabla 3. Resultado blastp y blastx para genes oleBC(BC)D.
Proteína de
referencia Microorganismo Multidominio Superfamilia Proteína homologa Referencia
OleB A. chlorophenolicus A6 PRK 00870 Esterase_lipase Alpha/beta hidrolase [11]
OleC A. chlorophenolicus A6 PRK 09274 AFD_Class_I Acyl-CoA synthetase [11]
OleBC A. aurescens A6 PRK 09274 AFD_Class_I Hydrolase [11]
OleD A. chlorophenolicus A6 WcaG SDR Nucleoside-diphosphate
sugar epimerase [11]
Tabla 4. Características de los primers.
Primer Longitud MW %GC Tm Purificación
FP 24 7342.9 41.7 61.2 Salt-free
RP 24 7445.0 41.7 61.2 Salt-free
AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES
A partir de la región de interés comprendida por las
secuencias JBH1_20, JBH1_21 y JBH1_22; de 3128pb
de longitud y contenido GC de 65.21%, se diseñó una
pareja de primers mediante el programa CLC Main
Workbench versión 7.5.1, cuyas secuencias fueron: FP
– (5’-GAATTCTATTCCGCTAAAGGTTGC- 3') para
el primer forward y RP – (5'-
AGATCTTTTTAGTGTGCGGTGATG-3') para el
primer reverse. Se comprobó la eficiencia de los
cebadores con el servidor web PrimerBlast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y
finalmente estos fueron sintetizados en la compañía
Integrated DNA Technologies (IDT) ®. En la Tabla 4
se detallan las características de los mismos.
Mediante esta pareja de primers se realizó la
estandarización de la PCR a partir del ADN extraído de
la cepa de Arthrobacter JBH1 con el kit Ultraclean
Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO). Como control
positivo de la PCR se amplificó la región de 16S con
los primers 27F- Forward (5'-GAGTTT
GATCTGGCTCAG-3) y 1492R- Reverse (5'-
GGTTACCTT GTTACGACTT-3’). La mezcla de la
reacción de la PCR para 16S consistió en 5µl de buffer,
4 µl de dNTPS, 0.12 µl de cada uno de los primers,
0.25µl de la polimerasa Takara Ex taq HS (Clontech) y
1 µl de ADN, en un volumen total de 50 µl. El perfil de
temperatura del termociclador consistió en un primer
paso de denaturación a 94°C por 30seg, seguido de 30
ciclos de denaturación a 98°C por 10seg, anillaje a 55°C
por 30seg y elongación 72°C por 3min y 20 seg; con un
último paso a 72°C por 7min para la elongación final.
Por otra parte, las condiciones de la reacción de la PCR
y de los perfiles térmicos del termociclador para
amplificar la región de estudio con la pareja de primers
diseñados se hizo en base a las recomendaciones de
Takara Bio INC [12]. La mezcla de la PCR consistió en
5µl de 10XEx taq buffer, 4 µl de dNTPS, 1.5 µl de cada
uno de los primers, 0.25µl de la polimerasa Takara Ex
taq HS (Clontech) y 1 µl de ADN, en un volumen total
de 50 µl. El perfil de temperatura del termociclador
consistió en un primer paso de denaturación a 94°C por
30seg, seguido de 30 ciclos de denaturación a 98°C por
10seg, anillaje a 55°C por 30seg y elongación 72°C por
3min y 20 seg; con un último paso a 72°C por 7min para
la elongación final.
Sin embargo, al correr el gel de electroforesis con los
productos de la PCR no se obtuvo ningún resultado, así
que se hicieron una serie de modificaciones en el
protocolo original para lograr estandarizar la PCR. A
continuación se indican los diferentes ensayos
realizados:
1. Gradiente de temperatura para la temperatura de
anillaje. Se probaron 8 temperaturas
intermedias (67°C, 66.1°C, 64.6°C, 62.3°C,
59.4°C, 57.3°C, 55.8°C y 55°C).
2. Gradiente de DMSO. Se probó una
concentración final de DMSO de 2.5%, 5%,
7.5% y 10%.
3. Gradiente de temperatura y dos concentraciones
de DMSO. Se programó el termociclador con 8
temperaturas de anillaje: 70°C, 68.1°C, 65°C,
60.3°C, 54.3°C, 49.9°C, 46.8°C y 45°C; y se
probaron dos concentraciones de DMSO (5% y
10%) para cada una de las temperaturas.
4. Gradiente de MgCl2. Se cambió el buffer del kit
Takara Ex taq hot start polymerase, por un
buffer sin concentración de MgCl2, y se varió la
concentración final de MgCl2 en 1mM, 2mM,
3mM, 4mM y 6mM. Todos los ensayos tenían
DMSO al 5%.
5. Se cambiaron las condiciones originales de la
reacción de PCR por las condiciones usadas
para amplificar 16S. Es decir, se añadió un
volumen de 0.12 µl de cada uno de los primers.
6. Gradiente de concentración de dNTP’s. En el
protocolo original se probaron 3 volúmenes
diferentes de dNTP’s: 2 µl, 4µl y 6 µl.
No obstante, al revelar los geles para cada uno de estos
ensayos no se obtuvo ningún resultado. Por ello se
evaluó la integridad y pureza del ADN para descartar
que el problema estuviese allí. En el primer caso se
reveló un gel de electroforesis (Ilustración 2) donde se
observaron dos bandas perfectamente delimitadas
correspondientes a las dos extracciones diferentes de
ADN realizadas, que indican ADN en buen estado. En
el segundo casó se calculó la relación OD260/OD280 en
ambas extracciones, obteniendo valores de 1.92 y 1.90
respectivamente, valores que se encuentran dentro del
rango aceptable. Igualmente se amplificó el gen 16S en
Arthrobacter JBH1 tomando como control positivo a
Ralstonia eutropha; en la Ilustración 3 se observa el gel
con las bandas correspondientes a estos
microorganismos.
Como se observa, el ADN de Arthrobacter JBH1 está
en buenas condiciones y puede ser amplificado para la
región de 16S. Sin embargo, aún no se ha conseguido
estandarizar la PCR para los primers diseñados durante
el estudio. Es posible identificar varias causas para ello;
que haya sustancias inhibidoras de PCR, que el
fragmento sea muy largo afectando la procesividad de
la polimerasa, o que las características de Arthrobacter
sp., como una bacteria Gram positiva con un alto
contenido de GC, dificulten la amplificación de este
fragmento
ANÁLISIS DE LOS HIDROCARBUROS
Los hidrocarburos se extrajeron a partir de un cultivo
celular de 5 días de JBH1 mediante el protocolo de
Bligh y Dyer [13]. El producto se inyectó en una
columna de 0.85g de gel de sílice, se eluyó con 30ml de
hexano y se concentró en un rotavapor hasta llegar a
1.5ml, de ser necesario, el volumen faltante se completó
con hexano. Luego la muestra se reconcentró con
nitrógeno gaseoso hasta llegar a 1ml. Se realizó un
análisis de cromatografía de gases (CG) y
espectrometría de masas (MSD) para la solución
obtenida, con el equipo de cromatografía HP6860
acoplado a un espectrómetro de masas HP5975B. Las
condiciones de la CG fueron gas de helio, 1ml/min;
columna HP-5MS (30m por 250µm por 0.50µm);
rampa de temperatura a 40°C por 5min, luego 3°C/min
hasta 200°C y 10°C/min hasta 250°C, manteniendo por
5 minutos. La MSD se ejecutó en modo de impacto de
electrones a 70eV y a 35µA.
Ilustración 2. Comprobación integridad del ADN.
Pozo1: escalera, Pozo 2: Extracción 1 de ADN; Pozo 3: Extracción 2 de
ADN.
Ilustración 3 Amplificación del gen 16S.
Pozo 1: escalera; Pozo 2: control positivo, Ralstonia eutropha; Pozo3:
Arthrobacter JBH1; Pozo 4: Control negativo.
En los cuatro ensayos de cromatografía realizados, bajo
las condiciones anteriores, para caracterizar la
producción de hidrocarburos de la cepa Arthrobacter
JBH1, se observaron compuestos alifáticos de cadenas
lineales y ramificadas, principalmente conformados por
alcanos de cadena corta que llegaban hasta los 14
átomos de carbono en la cadena principal de la
molécula. También se observaron alcoholes, cetonas y
ácidos, que no se tuvieron en cuenta para el análisis
porque no eran el objeto de este trabajo. Igualmente se
presentaron varios compuestos derivados del hexano
que tampoco se consideraron pues provenían del
disolvente usado para eluir la columna. En la se
presentan los resultados más relevantes para las cuatro
cromatografías realizadas, donde se seleccionaron los
compuestos que estuvieron presentes en por lo menos
dos de los ensayos realizados. Se puede observar que
los compuestos más comunes están formados por
cadenas principales de 7, 8, 9 y 10 carbonos.
La presencia de alcanos de cadena corta concuerda con
el estudio de Stroeva y colaboradores (2013), donde se
reportó producción de alcanos de 7, 9 11, 13 y 15
carbonos para Arthrobacter sp. RV. Allí se menciona
que el nonano es el alcano presente en mayor
proporción, mientras que en el actual estudio el nonano
aparece en baja cantidad y sólo en dos de las
cromatografías realizadas. Adicionalmente, en el
presente estudio se observó que el decano es el alcano
que más aparece en los ensayos, bien sea como cadena
lineal o ramificada. En todas las cromatografías aparece
algún compuesto de tipo n, n-dimetil-decano, mientras
que el n_decano aparece en sólo tres de los cuatro
ensayos (ver Tabla 5).
Por otra parte, los resultados encontrados contrarrestan
los observados por Frias y colaboradores (2009), donde
se detectó en cuatro de ocho especies de Arthrobacter
evaluadas la formación de alquenos y cetonas de 27 y
29 carbonos. En el presente estudio no se observó
ningún alqueno, un resultado inesperado dado que la
presencia de los genes oleABCD, explicados
previamente, son un indicio de la formación de
alquenos, lo cual da a pensar que hay otros genes en
Arthrobacter JHB1, diferentes al complejo oleABCD,
que podrían estar implicados en la formación de
hidrocarburos alifáticos.
En términos generales los resultados de las cuatro
cromatografías no fueron consistentes entre sí, puesto
que el perfil de compuestos varió de ensayo a ensayo,
con tan sólo unas pocas coincidencias que se observan
en la Tabla 5. Esta inconsistencia entre los ensayos
radica, en parte, por la baja concentración a la que se
encuentran los productos generados por Arthrobacter
JBH1 lo cual afecta la sensibilidad de los equipos de
CG-MSD; y a su vez por la ausencia de un patrón de
hidrocarburos que se pueda correr antes de las muestras
y que permita identificar con mayor certeza los
compuestos presentes. Igualmente dado que en los
ensayos aparecen muchos compuestos conformados
por átomos de sílice (resultados no incluidos), formados
por la reacción entre la muestra y la columna de
cromatografía, es importante evaluar si el equipo de
CG-MSD está funcionando adecuadamente y brinda
resultados confiables.
Por último, en la Tabla 5 se observa que la tercera y
cuarta cromatografía tienen un problema relacionado
con los blancos, porque en la mayoría de los
compuestos el área reportada para el blanco supera el
área de la muestra. Ello conllevaría a que se descartarán
los resultados obtenidos para ambos ensayos debido a
mayor presencia del compuesto en el blanco que en la
muestra, sin embargo, al analizar cada caso
específicamente se encuentra que en la tercera
cromatografía el cromatograma del blanco tiene un
perfil casi idéntico al de la muestra, y que en la cuarta
cromatografía el blanco posee mayor número de
compuestos que la muestra en sí (resultados no
presentados). De esta forma, puede ser que el problema
esté en la contaminación cruzada de los blancos con la
muestra, o en un error en la cromatografía por la lectura
por duplicado de la muestra, es decir no leer el blanco,
o que el equipo esté funcionando mal. En este sentido,
los resultados aquí presentados son sólo un indicio y
deben ser comprobados con nuevos experimentos, que
corroboren tanto el adecuado funcionamiento de los
equipos como la pureza de los blancos.
Tabla 5. Resultados cromatografía.
Primera Cromatografía: 13/02/2015 Segunda Cromatografía: 16/04/2015
RT Área
Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob
RT
Área
Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob
10.33 4.54 3.24 2,4 dimetil heptano 94% 18.24 15.13 6.78 1 metil ciclopentanol 43%
12.56 3.51 2.43 4 metil octano 91% 19.98 2.38 NA decano 53%
Tercera Cromatografía: 23/04/2015 Cuarta Cromatografía: 29/05/2015
RT Área
Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob
RT
Área
Muestra
Área
Blanco Compuesto Prob
10.27 2.09 2.48 2,4 dimetil heptano 64% 10.26 0.93 4.24 4,4 dimetil heptano 47%
12.49 1.88 2.38 4 metil octano 83% 14.45 1.22 1.34 nonano 76%
14.46 1.27 1.20 nonano 76% 19.97 3.35 2.2 decano 93%
18.24 15.72 8.85 1 metil ciclopentanol 49% 23.08 1.48 4.51 2,4,6 trimetil decano 53%
19.98 2.71 2.49 decano 93% 23.08 1.48 4.51 2,4 dimetil decano 53%
23.09 1.81 2.07 2,4,6 trimetil decano 53%
23.09 1.81 2.07 2,4 dimetil decano 50%
CONCLUSIONES
Arthrobacter JBH1 parece ser una bacteria interesante
para el estudio de la biosíntesis de hidrocarburos y para
la creación de biocombustibles de segunda generación,
debido a que posee algunos de los genes implicados en
este proceso, genes oleABCD, y a que se evidenció
formación de hidrocarburos alifáticos en los estudios
realizados.
Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por
responder en futuros estudios. En primer lugar, es
importante establecer realmente cuales son los genes
implicados en la formación de los hidrocarburos
alifáticos identificados en este trabajo, dado que la
presencia de genes oleABCD está relacionada es con la
formación de alquenos, compuestos no detectados en el
estudio. En ese sentido, debe comprobarse si los genes
oleABCD identificados son funcionales, y de serlo,
establecer por qué no se están produciendo alquenos.
Igualmente, se debe identificar cuáles son los genes que
están implicados en la formación de los alcanos
hallados, y realizar más ensayos para estandarizar la
reacción de PCR.
Por último, dada la longitud de los hidrocarburos
hallados (C7-10) se establece que podrían usarse como
materia prima en combustibles como el diésel y la
gasolina, quienes se caracterizan por tener
hidrocarburos de 8-14 carbonos y de 5-10 carbonos
respectivamente, y que están conformados
aproximadamente en un 70% por compuestos saturados
[14] [15].
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Johana Husserl por su asesoría y consejos
a lo largo del trabajo, a Ana María Lopez por su ayuda
en el laboratorio, a Adriana Jaimes y a Mariela Quintero
por su ayuda en la realización de los ensayos de
GC/MSD, y a Wolfram Baumann, director del
departamento de química por proveer amablemente el
reactivo DMSO.
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Anexos
ANEXO 1: Secuencia gen JBH1_20
TGGGACCTCTGCATGGATACCATGGTGCAGCGGGGCGTCACCGGCGTCATCGAACTGGCACCCGCCGGCAC
ACTTGCAGGGCTCGCAAAGCGCGGCATGCCAGGAGTCAAGACGGTTGCCGTCAAGACGCCGGACGACCTCT
CAGCCGCACTGGCACTCTTCGCAGAATTGGAGGGTAACGCATGAGCGTTCCCACGCTGAAACAGGCCCCCA
TCCAGGAGAACACCCGCATCCTGGGAATTGGCGCTTACCGTCCGGACATCATCGTCACCAACGACGACGTC
TGCCAGTGGATTGATTCCTCGGACGAATGGATCCGTCAGCGCACCGGCATCGTGACGCGCCACCGAGCACC
GGCTGACGTCAGCGTTATCGACATGGCCGAAGGAGCCGCACGGGAAGCTCTGGAAAAGGCTGGTATCGAG
GCCTCCGAGCTTGGCGCGGTCATCGTCTCCACGGTCACCCATCCCTACGCCACACCGTCGGCGGCTGCCAGC
CTGGCTGACCGGCTGGGAGCAACGCCTGCCCCGGCTTTTGACATCTCGGCCGCCTGCGCGGGCTACTGCTAC
GGCATCGCCCAGGGTGATGCCCTGGTCAGGTCCGGCGCGGCCAAGTATGTCCTGGTCGTGGGTGCGGAAAA
GCTCTCCGACGTCATCGACAACCATGAGCGGACCATTTCGTTCCTGCTCGGCGACGGCGCCGGCGCGGTAGT
GATCGGCCCTTCGGACACACCGGGCATCGGCCCGTCCGTCTGGGGCTCAGACGGCAGTAAGTGGGACGCCA
TCGGCATGACCCGGTCCATGCTCGACGTCCGTGCCCTGAGCCAGGCAGCGCGCCAGTCGGACGAGTCCGGG
GATTTCGCGCTGCTGGAAGAAGCCCAGGACCTGTGGCCGACGCTGCGCCAGGATGGCCAGACCGTGTTCCG
CTGGGCCGTCTGGGAAATGGCGAAGGTGGCCCAGCAGGCCCTTGAGGCTGCCGGAGTGCAGGCCGAGGAC
CTCGTGGCGTTCATCCCGCACCAGGCGAACATGCGGATCATCGACGAAATGGTGAAGAAGCTCAAGCTTCC
CGAAACCGTGACCGTGGCCCGCGACATCGCGGACGCCGGCAACACCTCAGCCGCTTCCATCCCCCTGGCCA
CACACCGCCTGCTGCAGGAGAATCCGGCGCTCAGCGGCGGTCTTGCGCTGCAGATCGGCTTCGGCGCCGGG
CTCGTCTTCGGTGCCCAGGTAATAGTCCTTCCCTAGGAACGCCCCACACAGGCAGCATCCGCTGCCTGAACC
GTTTCCGGCAGCCCCTGCCGGCAATAACAAGAAAAGGAGCCATCAATGGCTAGCAACGAAGAGATCCTGGC
CGGCTTGGCTGAAATCGTCAACGAAGAGACCGGCCTCGCCCCCGAGGCTGTGG
ANEXO 2: Secuencia gen JBH1_21
GCTGGACAAGTCCTTCACCGAGGACCTGGACATCGACTCCATCTCCATGATGACCATCGTCGTCAACGCCGA
AGAGAAGTTCGGCGTGCGCATCCCGGACGAAGAGGTCAAGAACCTCAAGACCGTTGGCGACGCCGTCAGCT
TCATCTCCGGCGCACAGGCCTAGCCAAGGCGCCAGCCGCTCACGGCTTGGCTGGACTGCCGGCCCGGGTAT
CC
ANEXO 3: Secuencia gen JBH1_22
CGGACCGGCAGTCCGGCCGCATTCAACCGGCAGCCACCTGCCCTACACCCCACACGCGGGACCCCGCCGGA
GAATACCGGAGCAGGGCTGCCCACCGACAGAGAGTGATCCCATGACACGCAAAGTAGTCATTACCGGTCTG
GGTGCCACAACGCCCATCGGCGGCGACGTACCCACTATGTGGAAGAACGCGCTTAAGGGGGTCTCCGGTGC
ACGCACCCTGGAGGACGACTGGGTTGCCAAGTATGAACTCCCCGTCCACTTCGCGGCGCGCTGCACCACCC
CGGCCCTCGACGTCCTGAGCCGCGTTGAAGCAAAGCGCATGGACCCCTCCACCCAGTTCGGCGTTATCGCCT
CCCGGGAAGCATGGGCCGACTCAGGGATCACCGAGATCGACCATGACCGCCTTGCAGTTGCCTTCGCAACA
GGCATCGGCGGCGTCTGGACCCTGCTGGACGCCTGGGACACCTTAAAGGAAAAAGGGCCCCGCCGTGTCCT
GCCGATGACGGTTCCCATGCTGATGCCCAACGGTGTCGCAGCGGCCGTCAGCCTTGACCTTGGTGCCCGCGC
GGGCGCCCACACCCCGGTATCCGCCTGCGCTTCCGGCACCGAAGCCCTCCACCTTGGCCTGGACCTGATCCG
CTCCGGAAAGGCCGATGTGGTCATGTGCGGCGGCGCCGAGGCCGCGATCCACCCCATGCCGCTCGCCGCGT
TCGCCTCCATGCAGGCGCTGTCCCGCCGGAACGACGACCCGCAGGGTGCATCCCGCCCGTATGACCTGGGC
CGCGACGGTTTTGTCATGGGTGAAGGAGCCGGCGCGCTGGTCCTCGAAGCCGAGGAGCACGCACTGGCACG
CGGTGCACGCATCTATGGCGAGCTTGCCGGCACGTCAGTCACCGCGGACGCATACCACATCACTGCCCCCG
ACCCCGAGGGCCTGGGCGCCACCCGTGCTTTGAAGGCAGCCATGTTCGACGGCCGTATCCAGGCCGAGGAC
GTAGTGCACGTCAACGCACATGCCACATCGACGCCCGTCGGCGACAAGCCTGAGTACACGGCTCTCCGCGC
GGCTCTGGGCAACCACATCGACAATGTGGCAGTCTCGGCCACCAAGTCGCAGATGGGCCACCTCCTGGGTG
CTTCCGGCGCCGTGGAGGCAGTATTGACCGTGCTCGCCGTCTACGAGCGCAAGGCCCCGGTCACCATTAAC
CTGGAAAATCAGGATCCGGAAATCCCGCTCGACGTGGTCACGTCCGCACGTGACCTCCCGTCCGGGAACAT
CGTGGCCTTGAGCAACTCCTTCGGCTTCGGCGGCCACAACGCCGTCATCGCAGTACGCAGCGTCTAGCATCA
CCGCACACTAAAAAGCAGGGGCCCCGCCAGTTGGCGGG
ANEXO 4: Secuencias de posibles genes oleB de Arthrobacter JBH1
Opción 1: node 108, posición 1224-2030
TGGCCATAACGCATTCCCTCTGGACCGGCATGGTGCCGGTTGACGACACGGCCTTAGCCGTCACCGACACC
GGCGGTCCCGGTATCCCGCTGGTCTACCTCAACGGCCACTTCGCCACACAAGGCTACTGGCACCGGGTCATC
GCCGAGCTCGGCACCGGGTTCCGGCACATCACCTACGACGAACGGGCCCGCGGCCGGAAGTCGAAGACATC
GGCGGACTACTCCTTCGAGGCCGCCGTCCGCGACATCGACGCCGTCATGGCAGCCCGGGGCGTGGACCGGG
CGCTGGTAGTCGGCTGGTCCTACGGGGCATTCGTCGGAGCGCACTGGGCCAGCCGGAACCCGGACCGTGCC
CTGGGCGCCGTCCTGGTCGACGGCGCGCAACCGTACGACTGGCTCACCGACGCCATGGAGCAGGGGATGCC
CAAGATGTTCCGGCGGATGTACCCGTTGATGCTGCTGCTGCGCCCGACCGGCCTGACCCCGCGGATGACCG
CCGAACAGATGGCCGCCAGCAACATCGAGGTCGGCAAGATCGCCCGGGAGCGCAACCTAGGCCCTGTGCTC
GACAACATCACCGTCCCTGTGCGGTACGTGCTCGCCTCAGGGGTGTCTTTCGGCAGCAAGGGTGACGAGCA
GGAGACCATTCGTGCGGGCCTCGATCCGGTGTTCGAGCGAAGCTCGAACATCAAGCTCAGCGCAAAGGTCC
CCAGCAACCACGGTGCGATCCTGCGGAAGGACTTCCGCGCCGTAGCCGACGCCGTACGGGAGACAGTGGCC
GCCCACGAACAAGGGCCTGGCTGA
Opción 2: Node 1, posición (189120 – 188287)
TCAGCCGGCGAAGAAGTCGCTCAGCTCCGTGATCAGCTTGTCCGGTGCGCGGAGTACGCCGTCGTGGCCGG
AGCCCTGAAGGATGGTGTAGCTGGAGCCGGACAGGACGTCGTGGATCTGGCCGCAGGCCACACCGAAGTA
CGCGGGGCTCTTTTCGCCGACGACGATCAGGGTTTCCAGGGGCAGTTCCAGGAACGGCTCGGCCGGCATGT
CCGCGGCGATGATCGCCTTGATTTCCCGGACGCCAGTGCGCATCAGTTCGCGCATCTGCTTGCCCATATGCG
TTCCGGCGGTGAGCTTGTTGGCGATGGTGAGCATGGACAGCGGCATTCTCGAGAAAGCGCCGCCGGTTTCC
AGGCCCTTCGTGAGTACCGCCAGGGCGCGGTCGTAGTCCCCGGCAGCCGTGGCACGTTCGTATTCAGCGGT
CCAGTCCGCCTTGACGCTGTGGTTCACTGACACGGCGGGGTCGTAAACGGCCAGCCGTTCCACGGGAAGCG
TGCGGGCCGCGTGCAGGGCCACGGCGCCACCGAAGCTGTGCCCGAACACGTCGGTGCTGGACGTGTGCTTC
ATCACCGCGTCGAGGTCCCGGATGTCCGCGTCAAGGGTGTAATCCTCGGCCTGTGGCGACGACGAACCGCG
GCCGCGGCGGTTGAACGTGTGCACCGGACGGCCCAGGGCTGCGCTGAGTTTCTGCGCAAACTTCGTATAGT
CGGCCGCGGTGACCATGGAGGCCGGCACCACCACCACGCCGGAGCCTGCGGACGCCAGCTCGGCGCCCGTG
GAGAAGAGCTCGAGTGTGCCGCCGTCGGGGGTCTTGATGTTCTCGCGCGTCAT
ANEXO 5: Secuencias de posibles genes oleC de Arthrobacter JBH1
Opción 1: Node 13, posición (103420-105243)
ATGACGGCCGGAACCGCTCCCTCAACCCGCTGGCCTGCCATCCCTAAGGACATCCGGACCTTCGCCGTCCGC
CCCAACATGGTGGACTACGACGCCACCCGTGCGGCATTCTCCTGGGATGGGGCGAGGCACGAATTGTCCGG
GCTGCCCCACGGCGGCGTGAACATTGCCTACGAGGCTGTAGACCGCCACGCCTCGGGCGACCGGGCAGGCC
ACGAAGCCTTGCGTTTCATCCGTGCCGACGGTACCGCCCGTTCCTTGAGCTATGCGGAGTTGGCGGAACAGA
CCGGACGGTTTGCGGGCGTCCTGCACGGGTTGGGGATCGGCCGGGGGGAGCGCGTATTTTCGCTCCTGGGC
AGGTGCCCGGAGCTGTACATCGCGGTGTTGGGGACGCTCAAGAATGCCAGCGTGTTCTGTCCCCTGTTCTCC
GCCTTCGGCCCGGAGCCCGTCCGTCAGCGGCTCCACCTCGGGGAGGGCCGGGCGCTGGTCACAACCCGGGC
GCTGTACCGGCGGAAGGTTGCCCAGATCCGCGGGCAGCTGCCGGGGCTGGAGCACATCCTGCTGATCGATG
CCGAGGGCCGCCCGGATCCGGGAACCCTGGATCTGGCTGAACTGATGCGCGGCGCGGAGCCAAGGGAAAC
CGCCCCGACCGGCGCCGAGGAAATGGCCCTGCTGCACTTCACCAGCGGGACAACGGGCACTCCCAAGGGG
GCCATCCACGTGCACGACGCCGTCACGGCGCACAGGGCAACCGGCTACTTCGCGCTGGACCTGCACCCGGA
CGACGTCTACTGGTGCACGGCCGACCCCGGCTGGGTTACCGGGACCTCGTACGGCGTGATCGCCCCCCTGA
CCCATGGCGTGACCACCATCGTGGATGAAGAGGAGATGGACCCGGACCGGTGGTACCGGATCCTGGCCGAG
CAGCGGGTCACCGTCTGGTACACCGCCCCCACCGCGCTCCGCATGCTGATGAAGGCAGGTGCCAGCCATGC
CGCGGAGCACGATCTGTCCGCCCTGCGGTTCGTTGCCAGTGTGGGCGAACCGCTGAACCCCGAAGCGGTGG
TGTGGGGCCAGGAGGCCTTCGGCCAGCCTGTCCATGACAACTGGTGGCAGACCGAAACCGGCGGCATCATG
ATTTCGAACTACCCCGCCATGGAGATCAGGCCCGGCTCCATGGGCCGGCCGTTGCCCGGCGTCGAGGCCGC
GATCATTGCCCGTGACCGGGACGGCAAACCGGTGATCCGGAACGGTGAGGCCGTTGTGGTGACTGACCCCG
GGATGGTGGGCGAACTTGCCCTCCGGCCGGGCTGGCCATCCATGTTCCGCGGCTACCTCAACGAGGACGAG
CGGTACCGGCGGTGCTTTGCCGGCGGCTGGTACCTCACGGGGGACCTGGCGAAGAAGGACACCGACGGGTA
CTTCTGGTTCGTCGGCAGGGGCGATGACGTCATCAAGTCCTCAGGCCATCTGATCGGCCCGTTCGAGGTGGA
GAGCTCTCTCATGGAGCACGAAGCCGTGGCTGAAGCAGGGGTGATCGGTGTCCCCGATCCCGTGGCAGGTG
AGCTGGTCAAGGCTTTCGTGGAACTGCGCACCGGGTGGGAGCCCTCGGAGGCACTGAAGCTGGACATCATC
GGCTTCGCCCGCAAACGCCTGGGGCCGGCAGTGGCCCCCCGGCTGCTGGACTTCACCGAGGCTTTGCCCAA
GACGCGGAGCGGCAAGATCCTCCGCCGGCTGCTGAAGGCGCGTGAGCTCGGCCTTCCTGAGGGCGACACCT
CGACGATCGAGTCCCCCGCAGGCCACTACCCCGGGACGCACACATGA
Opción 2: Node 98, Posición (3815-5827)
ATGTCCCAGGACACTCCCGGCTCCACCGCCACCGCTCCCGCAGCTACCGTGCAGGACGACCAGCAGGGCGA
CGCCTTCGAAAACCTGCTGCACGAGAACCGCAAGTTTGCGCCGACCCCCGAGTTCGCTGCCGACGCCGTCG
TCACCGCAGCCGACTACCAGGAGGCCGACGCCGACCGTCCCGCGTTCTGGGCCAGGCAGGCCCGTGAACTG
CTCACCTGGTCCAAGGACTTCGACCAGGCATTGGACTGGTCCAACCCGCCGTTCGCCAAATGGTTCGTGGGC
GGCGAGGTCAACGCCGCGTACAACGCCCTGGACCGGCACGTCGAGAACGGACTCGGGGACCGGGTGGCCA
TCTACTTCGAAGGCGAACCAGGCGACACCCGCACCTACACCTACGCCCAGCTCACCGAGGAAGTGAAGAAG
GCCGCGAACGCCTTCGAATCCCTCGGCGTTGCCAAGGGCGACCGGGTGGCCGTGTACCTGCCCATGATCCC
CGAAGCCGTGATTACGCTGCTGGCCTGCGCCCGCATCGGCGCGGTGCACTCTGTGGTGTTCGGCGGGTTCTC
CGCCGAGGCCCTGCGCTCCCGGATCGACGACGCCGAAGCCAAGCTCGTAGTCACCGCCGACGGCACCTACC
GCCGCGGCAAGCCCAGCTCCCTGAAGACCGCCGTCGACGACGCCCTGTCCCGCGAAGGCGGGCACACCGTC
CAGAACGTCGTGGTGGTCAAGCGCAACGGCCAGGACGTGGACTGGCACGAAGGCCGGGACCACTGGTGGG
ACGACACCGTCGGGGCGGCATCCACCCAGCACACCGCCGTCGGGCACGACTCCGAACACCCGCTGTTCATC
CTCTACACCTCCGGGACCACCGGCAAGCCCAAGGGCATCCTGCACACCACCGGCGGGTACCTCACCCAGGG
CGCCTACACCCACAAGGCCGTGTTCGACCTGCACCCGGAGACGGACGTCTACTGGTGCACCGCCGACGTCG
GCTGGGTCACCGGCCACTCCTACGTCGCCTACGCCCCGCTCATCAACGGCGCCACCCAGGTCATGTACGAA
GGCACCCCGGACTCCCCGCACCAGGGCCGCTGGTGGGAAATCATCGAAAAATACAAGGTCTCCATCCTGTA
CACCGCACCCACCGCGATCCGTACATTCATGAAGTGGGGCCGGGACATCCCGGACAAGTACGACCTCTCCT
CCCTCCGCGTGCTCGGTTCGGTGGGTGAGTCCATCAACCCCGAGGCCTGGATGTGGTACCGGGACGTCATCG
GCGGCAACAAGGCACCCATCGTGGACACCTGGTGGCAGACCGAGACCGGCGCCCAGATGATCGCCCCGCTG
CCCGGCGTCACCGCCACCAAGCCAGGCTCCGCCCAGGTGCCGCTGCCCGGCATCGCCGTGGACGTCGTGGA
CGAACTCGGCGAATCCGTGCCGAACGGCCACGGCGGTTTCCTGGTGATCCGCGAACCCTGGCCGGCCATGC
TCCGCGGCATCTGGGGCGACCCGGAACGGTTCAAGGACACCTACTGGTCCCGGTTCGAAACCATGTACTTC
GCCGGGGACGGCGCAAAGAAGGACGAGGACGGCGACATCTGGCTCCTGGGCCGGGTGGATGACGTCATGA
ACGTCTCCGGGCACCGGCTCTCCACCACGGAGATCGAATCCGCCCTGGTCTCCCACCCGGCCGTGGCCGAA
GCCGCCGTCGTGGGCGCCGCGGACGAGACCACCGGCCAGTCCGTCGTCGCGTTCGTCATCCTCCGCGGCGA
CGCCGTGGACACCGGCGACCAGATCATCCAGGACCTCCGCAACCACGTGGGCAAGGAGATCGGTCCGATCG
CCAAACCCAAAACCATCCTCGTGGTCCCGGAACTGCCCAAAACCCGCTCCGGCAAAATCATGCGCCGCCTC
CTCAAAGATGTCGCAGAAGGCCGCGACCCAGGCGACGCCACCACGCTGGCCGACAACACCGTCATGGCAC
AGATCGCGGCATCACTGCGGAAGTAG
ANEXO 6: Secuencias de posibles genes oleD de Arthrobacter JBH1
Opción 1: Node 45, posición (37438-38298)
ATGACCATCCTCATGGCCGGCTGCGGTGATCTGGGCACCGAAGCGGGCCTGCGCTTCGCCGCTGCAGGCCA
CCGGGTGGTGGGCTGGCGCCGCTCCCCGGAAAAGCTGCCTGCGGCGATCGAGGGCGTCGCCGCTGACCTGA
CCGCCGCCGGCCTTCCGGCTATCCCGGCGGACACCACCGCCGTCGTCGTTGCAGTGGCAGCCGATTCACCCA
CCGAGGCCGCCTACCGGGCCGCCTATGTGGACGGGCTGGCGCATGTCCTGGACGCCTTGGAACGCGACGGC
GTGACGCCGCGGCGTGTGCTGTTTGTGTCTTCCACCGCCGTCTACGGCGACGCGGGCGGCGGCTGGGTCGAT
GAAGGTACGACGCCGGCGCCTGGCGGCTTCTCCGGGCGCATCATCCGCGAGGCAGAGGACCTCCTGCTGTC
GCGGTTGCGCGGCACCGGATCCGCCCCGGTTGTTTTGCGGCTCGGGGGAATTTACGGCCCTGGGCGGACCC
GGCTCATCGACCAGGTCCGCAGCGGAGCGGCGGTTGTCCCGGACGAGCCGCGCTACACGAACCGGATCCAC
CGGGACGACGCAGCAGCGGCCATAGTCCATCTGGCTTCCATGGACTCCATGCCTGCTCCGGTATATGTCGGT
GTGGACAACGATCCCGCCGATCTCAGCGACGTCCTTCGTTTCCTGGCCGCCGAAATGGGCTGCCCGGAACC
GCGGACGGGCCCTGCGGGGGAAGCGAGGGGCGGGAACAAACGCTGCAGCAATGCCCTGCTCCGCAGCACG
GGATTCGACTTTGCCTACCCCTCCTTCCGAGAGGGCTACCGCGACATCCTGGCTGGTACCGGGGTGCGACAC
CCGTAG
Opción 2: Node 2, posición (136323 – 134791)
AGTAGAGCCTTCCGCTGAGGCCCTTCGGGAAGAAAATGGCCCGCTGCCGGTAGCGGCTGCCCGTGCCGTCG
GGCTCCACGGACAGTTCTAGCCAGGCGCGTCCGGGGGCGCGCATCTCAGCCCGCAGACGCAGCAGTCTTCC
GCGCTCGATCCGTTCCACGCGCCACCAGTCCACCACCTCGCCGGAGGCGAGGTTGCCGGGGTGCCGGCGTC
CCCGCAGGAGCCCCGCCCCGCCGGTGAGCTTGTCCAGCCAGCCCCGCACCTGCCACGCGAGGGGCAGCGAA
TACCAGCCGTTCCGGCCGCCGATGCCCTCAATGATGGTCCACACATGGGCAGGATCGACGTCCCCATGGAA
GGTCCGCTCGTCCACGAAGACCGTGTGGCCGGCCCAGTCCGGATCGCTGGGCAGGGGATCGGCGTCGGCCC
CGGCACTGGCCCAGGTGGTCTCCACCTGGCCGTCCCGCTCCTTGCCCAGGGCCAAGGCCACCGCACGCCGG
TACGGAGTCAGGCCGCCCTCAGGCACGGGAATGAACGAATCGATGTCGTGTTCCCGGGAGACGGCATCGTG
CTGCAGTGACTGGACGAGCGGCAGCGACATGGACAGCGGGATGGGCGTGGTCAGGGCCACCCACATTCCG
GCGAGCTTGGGGGCGGGAATGGGCAGGGCGAGCACCAGGCGGTGCGGCAGGCCGGCTTCGGCGGCGTACT
CCTTCATCATCCCTGCGTAGCTGAGCACCTGCCGGCAGCCGATGTCGAACGTGCGGTTGATCTCCCCCAGCA
GGGACGCGGCACCCACGAGGTAATACAGCACGTCCCGGACGGCGATGGCTTCGATTTTGTTGCGGACCCAG
CTGGGCGCCGGCATCACGGGGAGGGCTTCTGACAGGTGCCGGATCATCTCGAACGAAGCGGATCCCGAACC
GATGACCACGCCGGCCTGGAAAACCACCGCGTCCACGGGGCTGTCCAGGAACACCTTGCCGACGGCCTCCC
GGGAGCGCATATGGGTGGACAGTTCCACGTTGGAGGGGTGCAGGCCGCCCAGGTAAACAATCCGGCTGACT
CCTGCCTTGGCCGCTGCCTGCGCGGCGGTCTCCGCCATGGCTTTTTCCTTGGTTTCAAAGCCAGCGCCGGCA
GCCATGGAATGGACGAGGTAGTACAGCACGTCGACCCCTGCCAGCGCTGCCTGCAGCGCGCCGCCGTCGTC
GAGGCTGCTCTGGACCACCTCGACCTCGTCCAGCCAGGGCACGCCGGCTATCTTGGCCGGTGTGCGGACCA
GGACCTTGACGGTGTGGCCTGCCTCCAGGAGCCGCGGCACCAGGCGGCCGCCGATGTAGCCGGTGGCGCCC
GTCACCAGCACGGTGCGCGCGCCGCGGGATGTGCCGGGGATGGGGGTGTCCCCCGGACTAGTGGTTTCGCT
CAT