previo a la obtención del título de:

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA LA DETECCIÓN DE MEZCLAS MICROSATÉLITES PARA LA DETECCIÓN DE MEZCLAS DE ALMENDRAS DE CACAO (DE ALMENDRAS DE CACAO (THEOBROMA CACAO THEOBROMA CACAO L.) L.)

TIPO NACIONAL CON LA VARIEDAD CCN-51TIPO NACIONAL CON LA VARIEDAD CCN-51

• Es la mas conocida especie del género Theobroma.

• Theo = Dios y broma = alimento.

• Es una especie diploide (2n = 20).

• Originada en alto Amazonas (Centros de diversidad).

• Sin embargo, es en Centro América donde se domesticó hace aproximadamente 3000 años.

• Es uno de los géneros más antiguos y con mayor potencial económico a nivel local, regional y mundial.

• Y en esta especie la variedad de cacao tipo Nacional es una de las mas destacables.

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

El cacao (El cacao (Theobroma cacaoTheobroma cacao L.) L.)


El cacao NacionalEl cacao Nacional

• El cacao se lo considera el producto símbolo del país.

• Se estima que estuvo presente desde el tiempo de los Incas (siglo XII) y proviene de la Amazonía.

• Francisco Pizarro relata su presencia entre 1526 y 1527.

• A principios del siglo XVIII comienza el auge de su comercialización en los bordes del río Guayas.

• En 1904 el Ecuador fue el mayor productor y exportador mundial de cacao.

• La variedad Nacional se mantuvo exclusiva hasta 1890.

Estructura de la variedad NacionalEstructura de la variedad Nacional


• Descendencia híbrida complejo Nacional

• Introducción de material foráneo

• Se producen 4 millones de TM. de cacao en el mundo.

• El 95% es cacao ordinario.

• El restante 5 % es cacao fino.

• El cacao fino o de aroma proviene de 17 países Suramérica, América Central, Islas del Caribe y Sudeste asiático.

• Las características de aroma y sabor determinan un premio en los mercados internacionales

La comercialización del cacaoLa comercialización del cacao


INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN• Ecuador lidera la producción mundial de cacao fino (61%).

• USD 535’000.000 en exportaciones de grano y elaborados (2011).

• Los buenos precios en los últimos años, la creciente demanda y el declive del café superficie cultivada (500.000 ha).

Comunidad Europea

• El CCN-51 se registra desde el año 1960.

• Agr. Homero Castro Zurita “Colección Castro Naranjal”.

• Originado de un doble cruzamiento (IMC 67 x ICS 95) x Canelo.

• Medianamente resistente a la Escoba de Bruja y la Monilla.

• Su rendimiento supera a las variedades clásicas cuando se cultiva con mediana y alta tecnología.

• Buen índice de semilla, proporción elevada de grasa, peso y tamaño del grano y muy poca cáscara.


El cacao CCN-51El cacao CCN-51

• En el 2003 no registró cantidades exportadas de CCN51.

• En el 2011 se registró un 29,03% del total nacional exportado.

• El problema de las mezclas es la subsecuente degradación del sabor del cacao del tipo Nacional.

• La mezcla de cacao tipo Nacional con CCN-51 ha tomado fuerza (agresiva).

• La ICCO amenaza con una nueva reducción grandes perdidas a la cadena.


Nacional

CCN-51

• Análisis químicos.• La radiación ultravioleta.• La radiación visible en cuerpos

opacos.• NIRS (Near Infrared Reflectance

Spectrometry).

CCN-51

CCN-51

Técnicas en estudioTécnicas en estudio


Encontrar estrategias que posibiliten la detección de mezclas de cacao tipo Nacional con CCN-51.

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares


Desarrollar mediante el uso de marcadores moleculares microsatélites una metodología que permita detectar la existencia de mezcla entre almendras de cacao del tipo Nacional con la variedad CCN-51.

•Seleccionar un protocolo de extracción a nivel de semilla que permita obtener un ADN de calidad y cantidad necesaria para amplificación por PCR.

•Seleccionar marcadores moleculares SSRs para detectar la presencia de almendras de cacao CCN-51 en muestras de cacao del tipo Nacional.

•Identificar alelos microsatélites específicos que permitan discriminar entre la variedad CCN-51 y el tipo Nacional.


Objetivo GeneralObjetivo General

Objetivos específicosObjetivos específicos


• Ho = Los marcadores moleculares utilizados no amplifican específicamente para la variedad clonal CCN– 51.

HipótesisHipótesis

MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS

ExtracciónM1: Doyle & Doyle (1987)

M2 : Bayer Crop-Science (2008)

M3 : Colombo et al. (1998)

G1: Nacional

G2 : CCN-51

Cantidad

Pureza

Material vegetal

Extracción Cuantificación

Genotipado

MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS

Análisis de datos• Amplificación (PCR)• Electroforesis (poliacrilamida)• Revelado

− Tinción (nitrato de plata)− Fluoresencia (Li-cor 4300S )

• Frecuencia alélica.• Análisis de agrupamiento.• Análisis multivariado (ACoP).• Análisis de asignación genética.

RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3

200 ng120 ng80 ng40 ng

Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3

200 ng120 ng80 ng40 ng

Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3

200 ng120 ng80 ng40 ng20 ng

a)

b)

c)

Figura 1 Geles de agarosa al 1 % con los aislados de ADN de cacao Nacional y CCN-51. a) Doyle & Doyle 1987 b) Bayer Crop-Science, 2008 y c) Colombo et al., 1998. M: marcador Low Mass Ladder. R: repeticiones por grupo.

Doyle & Doyle, 1987

Bandas definidas de ADNConcentración 60ng a 200ng

Bayer Crop-Science, 2008

Bandas definidas de ADNConcentración 60ng a 120ng

Colombo et al., 1998

Bandas poco definidasConcentración 20ng a 50ng

Extracción de ADNExtracción de ADN

Cantidad de ADN

Métodos de Extracción

Medias (ng) Rangos

M1 30.03 aM2 20.38 bM3 5.02 c

Grupos Medias (ng) Rangos

G2 20.66 a

G1 16.30 b

RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 2 Concentraciones promedio de ADN influenciados por el método de extracción y el grupo de estudio.

Tabla 2 Cantidades promedio de ADN obtenidas en los diferentes protocolos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%).

Tabla 3 Cantidades promedio de ADN obtenidas en los diferentes grupos genéticos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%).

La semilla es un tejido de reserva

• Lípidos Ácidos Grasos (50%)• Carbohidratos• Proteínas• Metabolitos secundarios

• Taninos• Alcaloides• Fenoles• Terpenos

Órgano latente

Viabilidad de la semilla de cacao

< cantidad de núcleos x peso

recalcitrante

Pureza de ADN


Fuente de Variación G L ProbabilidadCuadrados

Medios

Métodos de extracción (M) 2 < 0.0001 1.56 **Grupo genético (G) 1 0.1744 0.08 ns

Método x Genotipo (MxG) 2 0.3445 0.05 ns

Error Experimental 10 0.04Total 17

Tabla 4 Análisis de varianza (ADEVA) para el índice de pureza de ADN.

Métodos de Extracción

Medias Rangos

M1 2.17 aM2 2.87 bM3 3.16 b

Tabla 5 Índices de pureza promedio de ADN obtenidas en los diferentes protocolos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%).

Figura 3 Índices de pureza de ADN (Abs260/Abs280) promedios influenciados por el efecto del método de extracción.

• El CTAB usado en el primer protocolo es un detergente catiónico a diferencia del SDS• El agente PVP (polyvinil pirrolidona) precipita los desechos • β-mercaptoetanol proteger el ADN contra la actividad enzimática • Purificación con alta concentración de NaCl• Un componente importante en este proceso fue el nitrógeno líquido

Figura 2 Productos de amplificación en gel de agarosa al 2 % de las muestras de ADN obtenidas con tres métodos de extracción y probadas con el mTcCIR 58.

Método 1 Método 2 Método 3 M Nacional CCN-51 Nacional CCN-51 Nacional CCN-51 aaaaaaR1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3


Amplificación del ADN aislado

M1: Doyle & Doyle (1987)



M1: Doyle & Doyle (1987)



Aunque los aislados presentaron contaminación y degradación, se pudo amplificar probablemente se deba a la capacidad de la PCR y de los microsatélites.

mTcCIR 12 – 222 pb





**** *









Figura 4 Marcador mTcCIR 12 en que se observan 5 alelos y la presencia de sombras y arrastre.

*Datos perdidos

Figura 3 Amplificación del marcador mTcCIR 37 en que se observan 7 alelos.

Genotipado

222pb

212pb210pb

204pb

199pb

187pb

Fincas de cacao tipo Nacional Fincas de cacao CCN-51

Figura 5 Amplificación obtenida con el marcador mTcCIR 12 revelada en el sistema

LI-COR 4300 en muestras del tipo Nacional y CCN-51.

Se seleccionaron 8 SSR mTcCIR 7, 11, 12, 15, 24, 33, 37 y 58


Genotipado en geles de poliacrilamida presentaron perfiles poco concisos

El LI-COR 4300S mayor claridad y nitidez

256pb

264pb258pb

Fincas de cacao tipo Nacional Fincas de cacao CCN-51

248pb

236pb

206pb

Figura 6 Amplificación obtenida con el marcador mTcCIR 58 revelada en el sistema LI-COR 4300 en muestras del tipo Nacional y CCN-51.

Observar la presencia de alelos cercanos (258pb y 256pb)

• Se contabilizaron en total 44 bandas para las 66 muestras rango (139 y 346 pb).• Dos o más bandas por locus tipo Nacional • En CCN-51 dos alelos por locus en varios materiales• El loci con > variabilidad fue el mTcCIR 37 (7 alelos) y el < fue el mTcCIR 7 (4 alelos).• Se logró obtener un 100% de amplificación en los mTcCIR 7, 11, 12, 15, 33 y 58.


Figura 7 Número de alelos de CCN-51, IMC-67, ICS-95 y de tipo Nacional presentes en las fincas cacaoteras de la zona central de la costa Ecuatoriana.

BandasFincas Controles

Tipo Nacional CCN-51 IMC-67 ICS-95 CCN-51

No. Bandas 44 30 15 14 14

No. Bandas específicas 11 0 0 0 0


Tabla 6 Número de bandas totales y privados para las poblaciones: tipo Nacional, CCN-51 y controles.

• Se hallaron 11 alelos específicos para el tipo Nacional.• 33 alelos del tipo Nacional compartidos con las finca de CCN-51

y los controles.• 7 alelos compartidos solo entre las fincas Nacionales y CCN-51• No se encontraron alelos específicos para CCN-51

Frecuencia

Marcador CCN-51 Nacional

mTcCIR 58 - 258 pb 1 0.182

mTcCIR 12 - 199 pb 1 0.114

mTcCIR 12 - 199 pb 1 0.477

Tabla 7 Alelos de CCN-51 registrados con sus frecuencias para cada grupo de cacao


GRUPO A

GRUPO B

GRUPO B1

690

Figura 8 Dendograma UPGMA de las 66 muestras de Theobroma cacao L., analizadas con ocho SSRs.

Análisis de agrupamiento

7.17%

Figura 9 Distribución de las 66 muestras de cacao del tipo Nacional en análisis ACoP.


Análisis de Coordenadas Principales

GRUPO A

GRUPO B

GRUPO B1


Fincas Nacionales

Tipo Nacional CCN-51

Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4 Pop 5 Pop 6

12 - - 0.103 - 0.880 -13 - 0.056 - - 0.877 -14 0.150 0.799 - - - -

20* 0.093 0.135 0.052 0.059 0.643 -21 - - 0.968 - - -73 - - - - 0.944 -

78* - - 0.576 - 0.400 -87 - - 0.270 - 0.710 -88 - - - - 0.965 -138 - - 0.196 - 0.788 -

141* - 0.055 0.078 - 0.176 0.659146 - - - - 0.964 -151 - - - - 0.971 -

180 - - 0.968 - - - 199 - - - - 0.963 - 232 - 0.056 0.892 - - - 234 - - - - 0.973 - 248 - - 0.064 - 0.827 -

Tabla 8 Análisis de asignación genética cuando K=6 para muestras de semillas de fincas cacaoteras del tipo Nacional. Valores de asignación (q) ≤ a 0.05 no son mostrados, software Structure.

Análisis de estructura

GRUPO A

GRUPO B

GRUPO B1

Figura 9 Distribución de las 66 muestras de cacao del tipo Nacional en análisis ACoP.

Fincas CCN-51

Tipo Nacional CCN-51

Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4 Pop 5 Pop 6

2 - - - - - 0.9928 - - - - - 0.992

15 - - - - - 0.992153 - - - - - 0.992

164* - 0.178 - - 0.069 0.633178 - - - - - 0.981189 - - - - - 0.991272 - - - - 0.917280 - - - - 0.097 0.804283 - - - - - 0.992290 - - - - - 0.989294 - - - - - 0.975

IMC67 0.354 - - 0.347 - 0.235ICS95 0.208 0.072 - 0.332 - 0.377CCN51 - - - - - 0.992

Tabla 9 Análisis de asignación genética cuando K=6 para muestras de semillas de fincas cacaoteras CCN-51 y controles. Valores de asignación (q) ≤ a 0.05 no son mostrados, software Structure.


GRUPO A

GRUPO B

GRUPO B1

• El protocolo de aislamiento de ADN que proporcionó el resultado más favorable en términos de cantidad y pureza de ADN, fue el desarrollado por Doyle y Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002).

• Los ADNs obtenidos mediante los protocolos uno (Doyle & Doyle, 1987 modificado por Faleiro et al., 2002) y dos (Bayer Crop-Science 2008) tuvieron un rendimiento bajo en cantidad y pureza, pero fueron suficientes para llevar a cabo el marcaje molecular por la técnica PCR con marcadores microsatélites.

• La baja resolución obtenida en ciertos microsatélites amplificados, en la matriz de poliacrilamida teñida con Nitrato de Plata, se observó mejor con el uso del equipo LI–COR 4300 ya que contribuyó a reducir el error de lectura que se produjo y además permitió la confirmación de bandas y asignación de pesos moleculares.

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• En los ocho marcadores microsatélites evaluados, no se encontró alelos específicos para CCN-51, que posibiliten una discriminación inequívoca dentro de los perfiles moleculares del tipo Nacional analizados.

• Se hallaron once alelos presentes en el tipo Nacional que no correspondieron a los genotipos control ni a las fincas de cacao CCN-51. En cambio se hallaron dos alelos pertenecientes a CCN-51 (mTcCIR 58 – 236 y mTcCIR 58 – 258) que tuvieron baja frecuencia en las fincas del tipo Nacional.

• El análisis molecular determinó que dentro de las 19 muestras de CCN-51 analizadas, son 11 las fincas que cultivan solo el genotipo CCN-51, en el resto a mas de CCN-51 se encuentran presentes otros genotipos.

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• En la extracción de ADN de semillas es necesario implementar ciertas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad del ADN, para ajustar el proceso y obtener resultados con un alto grado de confiabilidad.

• Se debería implementar métodos de purificación, debido a la abundancia de nutrientes de reserva y otras sustancias en las semillas de cacao, para así obtener un aislado de mejores características que garantice una óptima calidad en la amplificación de microsatélites.

• Ante los resultados del genotipado obtenido en geles de poliacrilamida, se sugiere el uso del equipo LI - COR 4300, para mejorarlo, ya que este último provee de una mejor resolución del bandaje en un pool de ADN.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

• Se recomienda realizar una nueva búsqueda de marcadores microsatélites con el fin de encontrar variantes alélicas propias de CCN-51 y que se encuentren en bajas frecuencias en el tipo Nacional o en el mejor de los casos alelos únicos.

• Se podría incrementar el número de loci de entre 2 y 4 por cromosoma e incrementar el número de muestras del tipo Nacional, para llevar a cabo un trabajo de validación de la técnica a gran escala, lo cual permitirá ampliar la información requerida para establecer los marcadores que permitirán desarrollar la herramienta que permitirá controlar y limitar la ocurrencia de mezcla entre los cacaos del tipo Nacional y CCN-51.


• Se sugiere tomar en cuenta los 11 alelos registrados en este estudio como propios del tipo Nacional, como una posible estrategia para la discriminación con CCN-51. Además se sugiere que los alelos mTcCIR 58 – 236, mTcCIR 58 – 258 y el mTcCIR 12 – 199, sean considerados en futuros análisis de para evaluar su capacidad de discriminación.

• Es recomendable confirmar la procedencia de las muestras que vayan a ser tomadas para futuros estudios encaminados a establecer diferencias genéticas para la discriminación entre CCN-51 y el tipo Nacional, para así limitar la mezcla de CCN-51 en la variedad Nacional durante la evaluación preliminar de la herramienta y evitar erróneas en los análisis.


CCN-51Nacional

Muchas Gracias

Instituto Nacional

Autónomo de Investigaciones Agropecuarias

Escuela Politécnica del Ejército

“ El chocolate Ecuatoriano tal vez no sea el mas reconocido pero estoy seguro que puede llegar a ser el

mejor del mundo”

CUANTIFICACIONCUANTIFICACIONProtocolo 1: Protocolo 1: DeDesarrollado por Doyle & Doyle (1987) y modificado

por Faleiro (2002) Muestras: 1-6Muestras: 1-6

Protocolo 2: Protocolo 2: DeDesarrollado por Bayer Crop-Science (2008)

Muestras: 7-13Muestras: 7-13

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Protocolo: Desarrollado por Doyle & Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002) Protocolo: Desarrollado por Doyle & Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002)

Sin modificaciones

Sin modificaciones

Con modificacionesCon modificaciones

VALIDACION DE PRIMERSVALIDACION DE PRIMERS

PRIMERS 51 °CPRIMERS 51 °C

PRIMERS 46 °CPRIMERS 46 °C

DUPLEXDUPLEX

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