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EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO IN
VITRO DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE 5 PLANTAS
SOBRE Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis (Cmm).
Presenta: Armendáriz Barragán José Eduardo
Asesores:
Soto Peña Gerson Alonso
Rosales Colunga Luis Manuel
NOVIEMBRE 2018.
1
CONTENIDO
1. Introducción2. Pregunta de Investigación
3. Justificación4. Objetivo
Gral.
5. Objetivos Específicos
6. Hipótesis7. Metodología8. Resultados
9. Conclusión 10. Bibliografías
2
El cultivo de jitomate (Solanum lycopersicum
sculentum.) es un producto agrícola de alta importancia económica a nivel mundial.
En México la producción de jitomate está altamente concentrada en cinco entidades; se produjo el 56.3% del total nacional en 2016.
San Luis Potosí como segundo lugar en producción de tomate rojo, con una producción aproximada de 200 mil toneladas anuales.
JITOMATE
El 54.5% de la superficie
destinada al cultivo de jitomate en 2014 se concentró en 4 países: China (19.8%), India(18.8%), Nigeria (10.8%) y
Turquía (6.40).
-Sinaloa (27.6 %), -San Luis Potosí (9.2%)-Michoacán (7 %),
-Baja California (6.7%)-Zacatecas (5.7%)
(FIRA 2017)(SAGARPA, 2015)
(FAO, 2014)
3
México ocupa la décima posición mundial con el 1.9% de la superficie cosechada de esta hortaliza.
Dada la importancia económica del cultivo de jitomate, se hace más
patente el esfuerzo tecnológico en cuanto a identificación y tratamiento de
plagas y enfermedades.
PRINCIPALES PLAGAS QUE AFECTAN AL TOMATE
INSECTOS ACAROS NEMÁTODOS
CHUPADORES • Afilados/Pulgone
s
• Mosca blanca
• Paratrioza
• Acaro
blanco
• Araña roja
MASTICADORES • Orugas
• Gusanos
MINADORES • Minador de la
hoja
• Nemátodo
de la raíz 4
TABLA 1.
El manejo integrado de plagas
(MIP) permite al productor elacceso a mercados de
exportación que exigen la
calidad fitosanitaria. Dicho
manejo incluye distintas
estrategias de control biológico,
químico, cultural y mecánico.
TABLA 2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL
TOMATE
BACTERIANAS FUNGOSAS
• Cáncer bacteriano (Cmm) • Antracnosis
• Mancha bacteriana • Cáncer del tallo/Alternariosis
• Mancha negra del tomate • Cenicilla
• Marchitez Bacteriana • Fusarium
• Tizón temprano
• Verticillum
5
Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis es la bacteriacausante de la enfermedad delcáncer del jitomate.
La enfermedad fue descubiertaen 1909 en Grand Rapids,Michigan, EUA.
Esta bacteria es un bacilo Grampositivo, no móvil, aérobico,temperatura óptima decrecimiento in vitro es de 25 a28°C. (Schaad et al., 2000; Jones et al., 2001.).
6https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Clavibacter_michiganensis
Esta enfermedad puede causar
pérdidas hasta del 100% de la
producción. En México se encuentra
distribuido básicamente en todos los
Estados productores de jitomate.
Los principales hospederossusceptibles al ataque de la bacteria
son:
Jitomate rojo.
Tomate de cascara.
Chile.7
Marchitamiento de la planta iniciando con las hojas más viejas
Necrosamiento marginal e intervenal de hojas.
Decoloración de los tejidos vasculares de tallos, iniciando de color amarillo para luego tornarse café claro y finalmente café obscuro.
Se presenta como manchas pequeñas color café claro.
Se manifiestan cuándo la bacteria es depositada mediante salpicadura.
Disease Guide BCT Spanish (1).pdf8
Semilla infectada.
De suelos infestados a suelos libres, con la maquinaria o herramientas de trabajo.
Agua de riego.
Contaminación por insectos.
Contacto entre raíces infectadas y raíces sanas.
Utensilios de trabajo relacionados con las labores de manejo.
Manejo de las plantas infectadas por el hombre. 9
El cáncer bacteriano es difícil de controlar y para ello se han utilizado
bactericidas a base de cobre (Oyoque, 2008), sin embargo, los resultados
demostraron que incrementan el costo de producción y causan daño al
hombre, animales y al ambiente por lo que su empleo no es satisfactorio.
Cu(OH)2CuSO4 Cu2(OH)3Cl
Una alternativa que se plantea para el tratamiento de esta enfermedad
es el uso de plantas medicinales, que se a observado que pueden inhibir
el crecimiento de bacterias del género Gram Positivo. 10
EpazoteChenopodium ambrosioides
EstafiateArtemisa mexicana
GobernadoraLarrea tridentata.
HuizacheAcacia farnesiana
LechuguillaAgave lechuguilla torr 11
PLANTA P.A
Gobernadora Glucosidos, Flavonoides, Lignanos, Ácido
nordihidroguayarético.
Lechuguilla Esmilagenina.
Epazote Terpenos, Alcanos, Flavonoides, Ac. Butirico.
Huizache Esteroles, Flavonoides, Glucosidos,
Componentes fenílicos.
Estafiate Terpenos, Flavoboides y Cumarinas.12
Biblioteca de la Medicina Tradicional Mexicana
TABLA 3. PRINCIPIOS ACTIVOS PRESENTES EN LAS PLANTAS
¿Los extractos etanólicos de las plantas a evaluar
tienen efecto antimicrobiano sobre Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis?
13
El cáncer bacteriano es una enfermedad que causa severas perdidas en todo elmundo. La ocurrencia de esta enfermedad es esporádica, pero puede serdevastadora. En todos los tipo de cultivares de tomate están propensos a seriasperdidas (Monsiváis, 2006).
En México se ha detectado esta enfermedad en Sinaloa, Jalisco, San Luis Potosí,Baja California, Guanajuato y Sonora. En 2009, en Sinaloa, esta enfermedadafectó 200 ha de jitomate cultivado bajo invernadero, causando pérdidasaproximadamente de 40 millones de dólares. En San Luis Potosí se reportanpérdidas económicas que varían de 60 a 100 % en los municipios de Villa deArista y Moctezuma (Luzz & García, 2011).
El control natural es una alternativa natural propuesta para resolver problemascausados por bacterias del género gram positivo, el cual consiste en utilizarextractos de planta, para inhibir y eliminar la bacteria sin causar daños gracias asus principios activos.
15
Los extractos elaborados de las plantas a evaluar presentan efecto
antimicrobiano in vitro sobre Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.
16
Evaluar el efecto antimicrobiano de los extractos
etanólicos de Chenopodium ambrosioides, Artemisa
mexicana, Larrea tridentata, Acacia farnesiana y Agave
lechuguilla torr en Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.
17
18
1.
• Realizar la recolección de las plantas con las que se trabajaran.
2.
• Elaborar extractos de las plantas recolectadas mediante maceración y cuantificar su rendimientos.
3.•Realizar una cinética de crecimiento de Cmm.
4.
• Observar la inhibición producida por los extractos etanólicos en medio líquido.
19
Gobernadora
Cerritos de Zavala, S.L.P
Lechuguilla
Libramiento Poniente, S.L.P
Epazote
Comercialmente
Huizache
Fraccionamiento los Álamos S.L.P
EstafiateComercialmente
Secado del material vegetal
Maceración
(15 días) Filtración
Evaporación del solvente
(Rotavapor R-3)Cálculo de rendimientos
20
21
EXTRACTO GRAMOS
OBTENIDO
RENDIMIENTO DOSIS USADA
1
DOSIS USADA
2
LECHUGUILLA 6 g 6 % 0.0447 g/ml -
GOBERNADORA 6 g 6 % 0.0517 g/ml 0.150 g/ml
EPAZOTE 3 g 3 % 0.0162 g/ml 0.048 g/ml
ESTAFIATE 7 g 7 %- 0.0351 g/ml 0.105 g/ml
HUIZACHE 5 g 5 % 0.0173 g/ml 0.052 g/ml
TABLA 4. RENDIMIENTOS
22
Pre inóculo
40 ml LB + Cmm
Agitación 150 rpm
T= 28°C
D.O= 0.204Preparación de
medio con extractos
Toma de D.O
Se realizara un diseño completamente al azar, con 3
repeticiones por tratamiento.
Se realizara un análisis inferencial a través de las pruebas
no paramétricas de U de Mann Whitney y Kruskal Wallis.
23
24
0.000
0.031
-0.100
-0.050
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
0.450
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
TESTIGOS
T1 T2 T3
25
0.148
0.235
0.283
-0.100
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
GOBERNADORA
G1 G2 G3
26
0.148
0.235
0.283
-0.100
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
EPAZOTE
E1 E2 E3
27
0.000
0.169
0.009
-0.100
-0.050
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
ESTAFIATE
Es1 Es2 Es3
28
0.942
0.330
0.498
-0.400
-0.200
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
HUIZACHE
H1 H2 H3
29
0.010
0.222
0.059
0.590
-0.200
-0.100
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.900
0 12 18 24 36 42 48 60 66 72 84
UD
A
TIEMPO (h)
CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Cmm
TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE
*p<0.05 Se presento diferencia estadísticamente significativa del T48 a T84
con respecto a los testigos.
TIEMPO TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE
T0 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000 0.009 ± 0.007 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000
T12 0.000 ± 0.000 0.012 ± 0.012 0.045 ± 0.011* 0.000 ± 0.000 0.000 ± 0.000
T18 0.005 ± 0.006 0.024 ± 0.007 0.080 ± 0.008 0.062 ± 0.107 0.091 ± 0.079
T24 0.059 ± 0.072 0.035 ± 0.004 0.104 ± 0.014 0.096 ± 0.166 0.439 ± 0.159*
T36 0.244 ± 0.043 0.240 ± 0.012 0.240 ± 0.012 0.105 ± 0.181 0.657 ± 0.039*
T42 0.298 ± 0.051 0.338± 0.040 0.338 ± 0.040 0.111 ± 0.191 0.657 ± 0.318
T48 0.283 ± 0.054 0.411 ± 0.050* 0.397 ± 0.046* 0.106 ± 0.183 0.703 ± 0.303*
T60 0.200 ± 0.045 0.386 ± 0.121* 0.337± 0.048* 0.092 ± 0.159 0.747 ± 0.333*
T66 0.132 ± 0.040 0.324 ± 0.103* 0.287 ± 0.060* 0.080 ± 0.139 0.758 ± 0.437*
T72 0.094 ± 0.008 0.278 ± 0.076* 0.244 ± 0.058* 0.077 ± 0.119 0.685 ± 0.396*
T84 0.010 ± 0.017 0.222 ± 0.068* 0222 ± 0.068* 0.059 ± 0.095 0.590 ± 0.316*30
TABLA 5. PROMEDIOS Y DESVIACIÓN ESTÁNDAR (DOSIS 2)
31
0.601
0.686
0.694
0.566
0.489
0.652
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.900
1.000
0 12 24 36 48 60
UD
A
TIEMPO (h)
CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Cmm
TESTIGOS GOBERNADORA LECHUGUILLA EPAZOTE ESTAFIATE HUIZACHE
TIEMPOS TESTIGOS GOBERNADORA EPAZOTE LECHUGUILLA HUIZACHE ESTAFIATE
T 0 0.187±0.208 0.004±0.0040 0.187±0.105 0.114±0.0839 0.163±0.1092 0.115±0.0228
T12 0.367±0.0262 0.198±0.0298* 0.305±0.00089* 0.028±0.0008* 0.110±0.0019* 0.035±0.0011*
T24 0.304±0.0253 0.420±0.1100 0.289±0.0379 0.285±0.5928 0.431±0.0392* 0.014±0.0248*
T36 0.633±0.0113 0.535±0.0212* 0.512±0.0537* 0.476±0.0944* 0.611±0.1230 0.157±0.0923*
T48 0.606±0.1417 0.526±0.0470 0.434±0.0853 0.490±0.0285 0.698±0.2241 0.369±0.0112
T60 0.734±0.0175 0.593±0.0213* 0.504±0.0477* 0.602±0.0265* 0.575±0.0922* 0.438±0.0119*
T72 0.601±0.1240 0.686±0.0192 0.566±0.0100 0.694±0.0001 0.652±0.00015 0.489±0.0581
*p<0.05De las 12 a 36 horas, en todos los extractos hubo diferencias significativas con respecto de los
testigos, de igual manera a las 60 horas
TABLA 6. PROMEDIOS Y DESVIACIÓN ESTÁNDAR (DOSIS 1)
En los tratamientos de estafiate se logró observar que obtuvo mayor inhibición
del crecimiento de la bacteria Cmm en comparación con los testigo,
teniéndose en la mayoría del tiempo(T48 a T84) evaluado control sobre la
bacteria eso en la dosis usada 2, en cambio en la dosis 1(T12 a T36).
En la dosis 1 el epazote obtuvo mayor inhibición con respecto a la dosis 2,
aunque el tratamiento de estafiate es el que tuvo más inhibición con respecto a
los testigos.
En la dosis 2 no se utilizo tratamiento de lechuguilla debido a que presentabasaponificación lo que impedía la toma de lecturas.
33
Los extractos etanólicos de Estafiate y gobernadora demostraron
un control al desarrollo del microorganismo a ciertos tiempos,
dichos extractos representan una alternativa como medio de
control natural, que tienen la posibilidad de sustituir a los
tratamientos químicos, ya que sus compuestos biológicamente
activos podrían producir resistencia a la planta, lo que produce
una reducción del desarrollo de la bacteria.
34
Se seguirá trabajando con otras dosis y otros métodos para evaluar la inhibición
del Cmm.
Se evaluara con otra metodología con la lechuguilla debido a que en estás
pruebas presentaba saponificación e impedía la lectura.
Se buscara probar in vivo en plantas infectadas para ver si estas platas
evaluadas ayudan a controlar el cáncer bacteriano.
Se pretende realizar un estudio de dosificación repetida para ver si la inhibición
presente una mejor inhibición sobre Cmm.
35
36
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