prÁctico de bioquÍmica
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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA
2019
Purifique su propia proteína
Modalidad:
Presentación grupal de 15 min
Preparar PowerPoint
Todos los integrantes del grupo deben
participar
Purifique su propia proteína
Buscar protocolos ya existentes en Google o Scholar Google con palabras clave
En español e inglés
Purifique su propia proteína
También pueden idear de cero su protocolo
Para eso:
¿Qué peso molecular tiene?
¿Qué estructura cuaternaria tiene?
¿Qué punto isoeléctrico tiene?
¿Cómo puede detectarse? ¿Ensayos de actividad?
¿Qué tan compleja es la fuente de origen?
https://www.rcsb.org/
https://web.expasy.org/protparam/
Purifique su propia proteína
Poco texto
Imágenes clave
Explicar contexto: la proteína, su estructura y
función, el sistema en el que se encuentra,
dificultades
Detallar protocolo de purificación propuesto
Detallar cómo harían para evaluar la
purificación (resultados esperados)
Purifique su propia proteína
Métodos para lisis y homogeneización: ej. Sonicación
Métodos basados en centrifugación: ej. centrifugación zonal
Métodos basados en precipitación: ej. salting-out
Métodos para concentrar, para cambio de buffer: ej. diálisis, liofilización
Métodos cromatográficos distintos: ej. cromatografía de afinidad
PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN
Muestra de origen
Obtención del Extracto
Métodos separativos
Análisis de la
purificación
Métodos basados en
precipitación
MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Métodos basados en filtración,
centrifugación
Ensayos de actividad / detección específica
con anticuerpos
SDS-PAGE
Tabla de purificación
PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO
Lisis y homogeneización: método dependiente del material de partida en un buffer adecuado
Lisis osmótica / lisis enzimática
Licuación / molienda
Homogeneizadores / Prensa de French
Agitación con perlas de vidrio
Sonicación
El homogeneizado se centrifuga para remover los restos celulares, obteniéndose así el
EXTRACTO
Sonicador
MÉTODOS SEPARATIVOS
SALTING-OUT
Las proteínas precipitan a altas concentraciones de sulfato de amonio: (NH4)2SO4
Las sales remueven la capa de solvatación, se exponen parches hidrofóbicos en la superficie de las
proteínas, estas se agregan por interacciones hidrofóbicas y precipitan
SALTING-OUT
La cantidad de parches hidrofóbicos y la
concentración en la que se encuentre una
proteína determina la cantidad de (NH4)2SO4
necesaria para que precipite
Se elije una concentración de sal que permita
recuperar la mayor cantidad posible de la
proteína de interés y la menor cantidad de
otras proteínas no deseadas
Suele usarse al inicio de un protocolo de
purificación: permite concentrar y remover
contaminantes
Propiedad de la proteína Método
Reconocimiento específico de un ligando Cromatografía de afinidad (AC)
Unión a un ion metálico Cromatografía de afinidad por un ion metálico inmovilizado (IMAC)
Carga Cromatografía de Intercambio Iónico (IEX)
Tamaño Gel Filtración (GF)
HidrofobicidadCromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Cromatografía de Fase Reversa (RPC)
Cromatografía
• Método más común de purificación de proteínas
• Separación de acuerdo a la diferencia entre las propiedades de la proteína de interés y
las propiedades de otras sustancias en la muestra
• Las propiedades utilizadas en los tipos más comunes de cromatografía son:
Cromatografía de Afinidad
Proteína de interés unida
Impurezas no unidas
Separación de proteínas en base a la
unión reversible de la proteína de interés
y un ligando específico inmovilizado en la
matriz cromatográfica
Condiciones que favorecen la
unión al ligando
Condiciones que favorecen la elución de
la proteína unida
Lavado del material no unido
Matriz inerte
Brazo espaciador
Ligando específico
Fase estacionaria
Cromatografía de Afinidad: Elución de la proteína de interés
Cambio de la composición de la fase móvil: pH, fuerza
iónica, polaridad
1. Condiciones suaves
2. Cambios extremos de pH o altas concentraciones de
Urea o cloruro de guanidinio (agentes caotrópicos)
Fase móvil selectiva: sustancia que compite por la
unión
3. Sustancia que compite por el ligando
4. Sustancia que compite por la proteína de interés
Cromatografía de Afinidad: Ejemplos
Blue Sepharose
Fase estacionaria Ligando Proteína blanco
Cibacron Blue F 36-A (colorante)
Albúmina
Enzimas que usan NAD+ como cofactor
Lectinas como Concanavalina A (Con A)Lectina de lenteja
Glicoproteínas
Heparina
• Proteínas de unión al ADN: endonucleasas, ligasa, polimerasas, etc.
• Inhibidores de serin proteasas, como antitrombina III
• Receptores de hormonas esteroideas
• Lipoproteinas
Heparin Sepharose
Con A Sepharose 4B
Cromatografía de Afinidad: Proteínas con etiqueta de afinidad
Fase estacionaria Ligando Proteína blanco
IMAC
Grupo quelante inmovilizado en la matriz coordinado con Ni2+
Proteínas recombinantes con etiqueta de cola de His
Grupo quelante inmovilizado en la matriz coordinado con Co2+
Proteínas recombinantes con etiqueta de cola de HisMayor selectividad para proteínas con etiqueta de cola de His
Glutatión inmovilizado en la matriz
Proteínas recombinantes con etiqueta de glutatión S-transferasa(GST)
Cromatografía de Afinidad: Reacción antígeno-anticuerpo
Purificación de anticuerpos IgG
Purificación de antígenos
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Cromatografía de fase reversa (RPC)
Elución
Aumento de la hidrofobicidad de la fase móvil
Adsorción
Fase móvil hidrofílica
Mismo tipo de interacción que HIC
pero:
• Ligando más hidrofóbicos
• Interacción hidrofóbica más fuerte
• Mayor resolución (separación de
componentes con diferencias
menores de hidrofobicidad)
ACONDICIONAMIENTODE LA MUESTRA
¿CÓMO CONCENTRAR?
Remoción de agua:
Ultrafiltración: membranas semipermeables no
dejan pasar proteínas pero sí el solvente y
moléculas de bajo PM (ej. centricones)
Liofilización: se congela la muestra y se sublima
el agua en vacío (se concentran sales también)
Precipitación y redisolución en menor volumen
Precipitación salina: “salting-out”
Precipitación con solventes orgánicos (ej.
acetona)
Centricón
Liofilizador
¿CÓMO CAMBIAR DE BUFFER O DESALAR?
Cromatografía de exclusión molecular: Sephadex G-25 (límite de exclusión: 5 kDa)
Diálisis: la muestra va dentro de una membrana semipermeable cerrada (Cut-off: 15 a 20 kDa) y
se deposita en gran cantidad del nuevo buffer
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
Los métodos separativos se usan de forma secuencial:
Método separativo 1
(ej. precipitación salina)
Método separativo 2
(ej. intercambio iónico)
Método separativo 3
(ej. exclusión molecular)
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
El orden escogido no es al azar:
Método separativo 1
(ej. precipitación salina)
Método separativo 2
(ej. intercambio iónico)
Método separativo 3
(ej. exclusión molecular)
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
Luego de cada paso de purificación se deben realizar los controles:
Método separativo 1
(ej. precipitación salina)
Método separativo 2
(ej. intercambio iónico)
Método separativo 3
(ej. exclusión molecular)
Actividad específica
Rendimiento
Actividad específica
Rendimiento
Actividad específica
Rendimiento
SDS-PAGE
ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN
Recordar que entre los distintos pasos puede ser necesario acondicionar la
muestra:
Método separativo 1
(ej. precipitación salina)
Método separativo 2
(ej. intercambio iónico)
Método separativo 3
(ej. exclusión molecular)
Desalado
Concentrar,
cambio de pH