FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICADEPARTAMENTO ACADMICO DE BIOQUMICA

INTRODUCCIN

Los principales alimentos que sostiene la vida del organismo se clasifican, con excepcin de las pequeas cantidades de ciertas sustancias como las vitaminas y los minerales, en hidratos de carbono, grasas y protenas. En general, la mucosa gastrointestinal no puede absorber ninguno de ellos en su forma natural, por lo que, sin un proceso de digestin preliminar, no servirn como elementos nutritivos, para que ello suceda, interviene unas enzimas catalticas que ayudan hidrolizar a los hidratos de carbono en nutrientes elementales para la vida del organismo.1Los carbohidratos aportan 4Kcal/g al organismo. Los podemos encontrar en una innumerable cantidad y variedad de alimentos y cumplen un rol importante en el metabolismo. Por eso deben tener una muy importante presencia de nuestra alimentacin diaria. Los carbohidratos estn formados unidades de azucares los cuales se pueden clasificar en monosacridos, oligosacridos y polisacridos; cada uno de estos azucares tienen enzimas especficas que los degradan, por ejemplo el almidn es degradado por la ptialina.2 La absorcin de los nutrientes se realiza en las vellosidades intestinales, pero la accin de las enzimas empieza desde la masticacin, donde la saliva humana contiene enzimas como la amilasa salival que es una alfa-amilasa, que hidroliza los enlaces alfa-1-4 del almidn como resultado se obtiene una serie de intermediarios de la reaccin que pueden ser dextrinas maltosa y glucosa.3La hidrolisis de los carbohidratos es muy importante para la obtencin de nutrientes elementales para el ser vivo, por tales motivos, en esta prctica se plante los siguientes objetivos: demostrar la actividad de hidrolisis enzimtica de amilasa salival; establecer los factores ptimos de la amilasa salival y pancreatina; establecer diferencia entre la amilasa salival.

MARCO TERICOHIDROLISIS DE CARBOHIFRATOS.Casi todos los carbohidratos de los alimentos son grandes polisacridos o disacridos formados, a su vez, por combinaciones de monosacridos unidos entre s por condensacin. La condensacin significa que se han eliminado un in hidrgeno (H+) de uno de los monosacridos y un ion hidroxilo (-OH) del monosacrido siguiente. De esta manera, los dos monosacridos se combinan en los lugares donde se produce la eliminacin, a la vez que los iones hidrgeno e hidroxilo se unen para formar una molcula de agua.Una vez digeridos, el proceso anterior se invierte y los hidratos de carbono se convierten de nuevo en monosacridos. Algunas enzimas especficas de los jugos digestivos devuelven los iones hidrgeno e hidroxilo del agua a los polisacridos, separando as unos monosacridos de otros. Este proceso, llamado hidrlisis, es el siguiente (R-R representa un disacrido).R- R + H2OROH + RH

DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS EN LA BOCA Y EN EL ESTOMGO.Cuando se mastican, los alimentos se mezclan con la saliva, que contiene la enzima ptialina (una alfa- amilasa), secretadas fundamentalmente por la glndula partida. Esta enzima hidroliza el almidn, al que convierte en un disacrido, la maltosa y en otros pequeos polmeros de glucosa formados por tres a nueve molculas de la misma. Sin embargo, los alimentos permanecen en la boca poco tiempo y es probable que, en el momento de su deglucin, no ms del 5% de todos los almidones ingeridos se encuentren ya hidrolizados. La digestin del almidn continua, no obstante, en el fondo y el cuerpo gstricos hasta una hora antes de que los alimentos se mezclen con las secreciones gstricas. En ese momento, la actividad de la amilasa salival queda bloqueada por el cido de las secreciones gstricas, pues su actividad enzimtica desaparece por completo cuando el pH desciende por debajo de 4, aproximadamente. En cualquier caso, antes de que los alimentos y la saliva asociada se mezclen por completo con las secreciones gstricas, entre el 30% y 40% del almidn se encuentra ya hidrolizado, sobre todo l maltosa.4

ALMIDN: El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos.5AMILASA SALIVAL.La amilasa, denominada tambin sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilasa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivales (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia).

MECANISMOS DE SECRECION.Los acinos producen una secrecin primaria semejante a un ultrafiltrado del plasma, producto de transporte activo y con variables concentraciones de alfaamilasa y mucina. Los conductos salivares modifican la secrecin primaria por secrecin o absorcin de electrolitos. En las porciones proximales de los conductos se agrega activamente HCO3 por un proceso en que juega importante papel la carbnicoanhidrasa, contra reabsorcin pasiva de Cl. Ms distalmente en los conductos se absorbe Na y se agrega K. Los ndices de secrecin determinan la composicin de la saliva. En reposo la concentracin de Na y Cl estn por debajo de las plasmticas mientras que las HCO3 y K son superiores; cuando hay abundante secrecin salivar la composicin se asemeja a la de la secrecin primaria. Los intercambios entre la sangre capilar y el contenido de los conductos se favorecen por el hecho de la circulacin es contra-corriente, es decir, la sangre llega a los conductos antes que a los acinos.

COMPOSICION DE LA SALIVAEl volumen diario secretado oscila entre 1 y 1.5 litros. El pH salivar es en promedio de 7.0 (6.0 a 7.4). Se ha calculado que la participacin relativa de las glndulas salivales principales en el flujo salival total en adultos en reposo aportan: Las glndulas submaxilares al 69% del flujo salival, las partidas el 26%, las sublinguales el 5% y las glndulas salivales menores el 8%. En general, la saliva tiene mayores concentraciones de K, HCO3 y menores concentraciones de Na y Cl que el plasma. Contiene adems dos tipos principales de protenas:1. AMILASA SALIVAR (Alfa-amilasa o ptialina) Principal producto de la secrecin serosa inicia en boca la digestin de los almidones. Dichos procesos continan un poco en el estmago hasta que la progresa del pH a ese nivel inactiva esta enzima.2. MUCINA Principal componente proteico es una glicoprotena lubricante.6

Resultados1. DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA HIDRLISIS DE ALMIDN.

COMPONENTES123456

SOL. ALMIDN 1%1.01.01.01.01.01.0

BUFFER FOSFATO pH 6.65.05.05.05.05.05.0

SOL. SALINA (NacL1%)2.22.22.22.22.22.2

AGUA DESTILADA0.60.40.2-2.2-

TUBOS A BAO DE AGUA A 37C POR 5 MIN.CONTROL

ENZIMA0.20.40.60.80.80.8

BAO DE AGUA A 37C POR 8 MIN.CONTROL

1.1. CONTROL POR LA REACCIN DE LUGOL

T. 6T. 5T. 4T. 3T. 2T. 1

1.2. CONTROL POR LA REACCIN DE BENEDICT

T. 1T. 2T. 3T. 4T. 5T. 6

2. Efecto de la concentracin de sustrato y del tiempo de imcubacin sobre la actividad de la amilasa salival.

Reaccin de LugolTubos Reaccin

1+++++

2++++

3+++

4++

5+

T. 5T. 4T. 3T. 2T. 1

Reaccin de BenedictTubos Reaccin

1++++

2+++

3++

4+

5-

T. 5T. 4T. 3T. 2T. 1

Ensayo N3: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salivalTUBO 1TUBO 2TUBO 3

COMPONENTES5 mL de Sol. Almidn 1%5 mL de Sol. Almidn 1%5 mL de Sol. Almidn 1%

2 mL de Sol. Salina (NaCl 1%)2 mL de Sol. Salina (NaCl 1%)2 mL de Sol. Salina (NaCl 1%)

2 mL de Buffer pH 4.02 mL de Buffer pH 6.62 mL de Buffer pH 10.0

PRUEBAS DE LUGOL

REACCIN DE LUGOLRESULTADO

TUBO 1-(ver figura 1)

TUBO 2++(ver figura 2)

TUBO 3+ (ver figura 3)

NOTA: Bastante trabajo de la enzima (++), Poco trabajo de la enzima (+), nada de trabajo de la enzima (-)

Figura 3Figura 2Figura 1

Para diferenciar la figura 1 y la figura 3 procedimos a diluirlo para diferenciar as donde existi un poco de trabajo de la enzima (aunque en la foto no se diferencie bien los colores)

En el tubo 1 con pH 4 se observa un color negruzco eso quiere decir que la enzima no trabaja es decir no hidroliza al almidn, en el tubo 2 con pH 6.6 sucede todo lo contrario ya que se observa un color rojo indicndonos que la enzima hidroliza al almidn y evidenciando as el trabajo de la enzima y en el tubo 3 se aprecia una decoloracin ligera del color negruzco indicndonos un trabajo mnimo de la enzima.

PRUEBAS DE BENEDICT

REACCIN DE BENEDICTRESULTADO

TUBO 1- (ver figura 1.1)

TUBO 2++(ver figura 2.2)

TUBO 3+ (ver figura 3.3)

NOTA: Bastante trabajo de la enzima (++), Poco trabajo de la enzima (+), nada de trabajo de la enzima (-)

Los resultados de este experimento fueron muy similares a los que se obtuvieron con la prueba de Lugol, ya que la prueba de Benedict determina azcar reductores un precipitado rojo ladrillo significa que el almidn se hidrolizo y precipito y si se mantiene el color celeste significa que no hubo ningn trabajo.

Figura 1.1Figura 2.2Figura 3.3

Pruebas de BenedictPruebas de Lugol

Discusin de Resultados El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacridos, particularmente el almidn por la formacin de una coloracin azul violeta intensa y el glicgeno y las dextrinas por formacin de coloracin azu8. El color azul nos indica la presencia de amilosa, mientras que el color rojo nos indica que no hay almidn es decir que la enzima ha trabajado, la saliva contiene una enzima que es capaz de romper las cadenas de almidn esta enzima es la ptialina y cuando esta trabaja rompiendo las cadenas de almidn forma un color rojo en presencia de Lugol ya que se libera amilopectina en nuestro experimento los resultados fueron que en el tubo con pH 6.6 se present la coloracin roja indicndonos as que a ese pH la enzima trabaja de una manera eficaz pero a un pH 4.0 la enzima no trabaja ya que el color resultante es un negruzco igual al color del Lugol, es por eso que al no haber cambio de color nos indica que no hubo ningn trabajo de la enzima; pero ya en el tubo con pH 10.0 el color fue ms claro que el tubo con pH 4.0 tornndose ms rojo y a ese pH la enzima tena un trabajo mnimo.

El reactivo de Benedict permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, este contiene ion cprico en medio alcalino que se reduce hasta xido cuproso en presencia de azcares con el hidroxilo hemiacetlico libre9. El almidn contiene glucosa y este es azcar capaz de reducir al cobre del reactivo de Benedict, esto se detecta por un cambio de coloracin, entonces un resultado rojo ladrillo nos indicara que el almidn se hidrolizo y precipito y una coloracin igual al que tena antes del bao con agua hirviendo nos indicara que no hubo trabajo de la enzima. Nuestros resultados fueron muy similares a los obtenidos con la prueba de Lugol resultando en el tubo con pH 6.6 la mayor formacin de precipitado rojo ladrillo y en el tubo con pH 4.0 ningn cambio de color y en el ltimo tubo con pH 10.0 una pequea formacin de precipitado indicndonos as que a pH 6.6 la enzima realiza la mayor cantidad de trabajo

Segn Page, M. I., and Williams, A el pH en el que trabaja la ptialina es 7 teniendo ciertas variaciones encontradas entre 5.6 6.9 en algunos casos10, algo que se asemeja con nuestros resultados pues el pH en el que la enzima alcanza su mximo trabajo es el pH 6.6 siendo este muy cercano al pH que nos indica nuestra referencia bibliogrfica y donde existi un pequeo trabajo es al pH 10.0 encontrndose tambin este valor en medio bsico donde algunas veces trabaja la enzima y donde no ocurri ningn trabajo es a pH 4.0 ya que en medio cido esta enzima se inactiva nuestros resultados se encuentran dentro del rango.

Para identificar la presencia de glucosa en el almidn se utiliza el reactivo de Benedict que es una sustancia que identifica azucares reductores (aquellos que tienen un grupo carbonilo libre) como la lactosa, la glucosa, la maltosa y la celobiosa. La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azcar reductor.12, en el ensayo 1.2 con el reactivo Benedict se observ precipitado anaranjado en poca cantidad evidenciando la presencia de azcares reductores como la glucosa debido a la hidrlisis del almidn por la enzima amilasa salival.

En tubo 5 no se adicion NaCl al 1% por lo tanto enzima no est trabajando en un medio ptimo a deferencia de los dems tubos, ya que segn13, la alfa amilasa contiene en los restos aminoacidicos de su centro activo al Cl-, y por ello al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimtica es decir, el cloro acta como cofactor de la enzima amilasa salival.

Conclusiones Se demostr la actividad de hidrlisis enzimtica de amilasa salival. Se estableci los factores ptimos de la amilasa salival.

Bibliografa1. Arthur C. Guyton. Fisiologa Mdica. 12ma ed. Editorial ELSEVIER. 2010.2. Bioqumica 108 (2010). Recuperado el 29 de Agosto del 2010 de:http://bioquimicauabc108.blogspot.com/2010/02/viernes-26-de-febrero-del-2010.html3. Gua de Practicas. Bioqumica I. UNMSM. 20134. Arthur C. Guyton. Fisiologa Mdica. 12ma ed. Editorial ELSEVIER. 2010. Pag. 809.5. Mayoral Luis Guillermo, M.D. M.S.; Fisiologa Digestiva: Secrecin Salival;Universidad del Valle. 1996.6. Alvarado J, Otero W, Emilio Paulo, Gastroenterologa y Hepatologa:7. Secrecin salival; Asociacin Colombiana de Endoscopia Digestiva; 1996.

8. Nelson, D. Cox, M. (2008). Principios de Bioqumica. Omega. Espaa: 248 -2559. Nelson, D. Cox, M. (2008). Principios de Bioqumica. Omega. Espaa: 248 -25510. Page, M. I., and Williams, A. (Eds.), 1987. Enzyme Mechanisms. Royal Society of Chemistry. ISBN 0-85186-947-511. ELITECH Diagnostics. 2006. Instrucciones del uso del reactivo de glucosa PAP.12. Nelson D. y Cox M. 2008, Lehninger principios de Bioqumica. W. H. Freeman and Company. NY. Quinta edicin.13. Agustn Garrido. Actividad enzimtica de la amilasa. 2009 Citado en http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf

Cuestionario

1. Cul es el fundamento de la reaccin del lugol?La reaccin positiva del lugol con el almidn provoca una coloracin azul-violeta intensa. Esto se debe a los iones yoduro del lugol, que se disponen en el interior de la hlice de la amilosa formando un complejo coloreado.El lugol es una disolucin acuosa de yodo y yoduro potsico que sirve para averiguar si, en una disolucin de azcares no reductores existe el polisacrido almidn (prueba del lugol positiva). El lugol funciona como un indicador de la presencia de almidn.Cuando no est en contacto con el almidn, el lugol es amarillo, y si hay poco, no se aprecia. Cuando el lugol entra en contacto con el almidn, se vuelve azul-violeta.Cuando el almidn se pone en contacto con unas gotas de lugol (reactivo que contiene yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico (la amilosa se colorea de azul oscuro a negro y la amilopectina se colorea entre naranja y amarillo).La coloracin producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. No es por tanto, una verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta.

2. Cul es el mecanismo por el cual influye el pH en la actividad de la amilasa salival?

Con respecto a la influencia del pH del medio en la actividad enzimtica de la -amilasa, podemos decir que a pH extremos (es decir, muy cidos o muy bsicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad. Esto podemos concluir a partir de los experimentos realizados por otros grupos, que, manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la actividad de la -amilasa en dos medios con pH extremos.Un pH salival de entre 6 y 7 es la referencia. Sin embargo, a un pH 2 (ms cido), no encontr cambios con pH 12 (ms bsico) no hubo efecto tampoco.Todas las enzimas tienen un pH ptimo, en donde tienen mayor actividad, y a medida que se alejan de ese pH (para ambos lados) disminuyen su actividad. Esto se debe a que algunos restos aminoacdicos de las enzimas (en el caso de que sean protenas) tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la protena como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de iones H+ u OH-) puede modificar las cargas de estos aminocidos y de este modo incluso desnaturalizar a la enzima.

3. Cul es la funcin de la solucin salina y d ela solucin de almidn utilizados en el ensayo?

La alfa amilasa contiene en los restos aminoacidicos de su centro activo al Cl-,y por ello al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimtica.Es decir, el cloro acta como cofactor de la enzima amilasa salival , es decir en la practica el NaCl acta como un activador enzimtico que da la condiciones ptimas para que se realice la actividad enzimtica.La solucin de lugol o de Ioduro de potasio reacciona con la amilosa, donde el Iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa en las regiones hidrofobicas formando un complejo de color azul. Cuando la alfa amilasa actua, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de solucin de lugol ya no dara coloracin azul como lo observado en la prctica realizada.

4. Cul es la clasificacin y nomenclatura de las amilasas empleadas en la prctica?La amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es una enzima hidrolasa que tiene una funcin de digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tienen pH 7.

CLASIFICACINE.C = 3.2.1.1

NOMENCLATURA1,4 - D glucano- glucan hidrolasa

Bibliografa1. Digestin de Carbohidratos por Amilasa Salival Bioqumica Lactancia y Nutricin Biolog. Elaborado por: Departamento de Ciencias Fisiolgicas. Actualizado por Dra. Awilda Pea, MD Agosto 2004 Santiago, Rep. Dominicana rea Ciencias Fisiolgicas. Departamento de Medicina. PUCMN. 2. Agustn Garrido. Actividad enzimtica de la alfa-amilasa. 2009 Citado en http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf3. http://payala.mayo.uson.mx/QOnline/Prueba_Fehling_y_Lugol.htm.4. http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/2_EstructuradeCompuestosBioquimicos/9-1_ReaccionesIdentificacion.pdf

2013-IGUA DE PRCTICA DE BIOQUMICA I