PRACTICA N1: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE, COLORACION GRAM Y LA GALERIA BIOQUIMICA OxNiGLUMoCISKADI. INTRODUCCIN.Existen un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del hombre y de los animales representados por bacilos Gram negativo no esporulado que se encuentran tambin en excretas, aguas, pastos, suelos, alimentos y vegetales al estado y en descomposicin. Nos estamos refiriendo a los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo conocimiento racional y orgnico permite establecer el diagnstico inmediato de las enfermedades entricas, dictar las medidas de orden epidemiolgico y establecer las causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman un extenso captulo de la patogenia infecciosa del pas.El conocimiento de estos seres vivos, es obligatoria en los estudios microbiolgicos, no slo porque algunos gneros y especies ocupan destacada posicin en la patogenia entrica de origen humano animal, sino porque tambin es una base fundamental en la sanidad pblica y en el diagnstico bacteriolgico en general. Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del que se encuentran tambin en la excretas, aguas, pastos, suelos, -alimentos y vegetales al estado.Caractersticas de las Enterobacteriaceae En la definicin clsica de unaEnterobacteriaceaese usan siete criterios bsicos, adicional a la aparicin de nuevos mtodostaxonmicospara incluir a ciertos gneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia: Son bacterias Gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos y otrospleomrficos. No son exigentes, son de fcilcultivo. Sonoxidasanegativo (exceptoPlesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzimacitocromo oxidasa. Son capaces de reducirnitratoennitrito. Sonanaerbicos facultativos. Sonfermentadoresdecarbohidratosen condicionesanaerbicascon o sin la produccin de gas (en especial glucosa ylactosa), yoxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aerbicas.

II. REVISION BIBLIOGRAFICAA las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo esporulados, mviles o inmviles, provistos de flagelos en pertrico, que adoptan la forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patolgicamente como huspedes en el intestino del hombre y de los animales, se les halla en los alimentos en descomposicin, excretas de origen humano y animal, en las aguas del albaal y emuntorios en general viven saprofticamente en las materias orgnicas en descomposicin. Gran nmero de especies que integran esta familia son patgenas pura el hombre y los animales; produciendo infecciones graves en forma individual, endmica y epidmica (Guia de microbiologa agroindustrial). CLASIFICACION DE LA ENTEROBACTERIAS Escherichia coli es un habitante intestinal. No es con mucho el ms abundante numricamente, sino que est por detrs de Bacteroides y Bifidobacteriurn. No obstante, E. coli se mantiene viable un cierto tiempo fuera del intestino y es fcilmente demostrable. Por ello es apropiado utilizarla como demostracin de contaminacin fecal en las aguas de bebida. Proteus vulgaris pertenece tambin a la flora intestinal normal pero asimismo est ampliamente distribuido en el suelo y en las aguas. Esta bacteria es conocida debido a su tendencia a la modificacin de forma (nombre), su intensa actividad y la tendencia a diseminarse sobre las superficies de agar y cubrir toda la superficie. Enterobacter aerogenes es en cierto modo el hermano gemelo de E. coli; ambos se designan como "Coliformes". Es muy abundante en los suelos. Tal como indica su nombre, esta bacteria forma mucho gas. Se diferencia de E. coli tan s610 par unas pocas caractersticas bioqumicas. Serratia marcescens (anteriormente Bacterium prodigiosum u "hongo de las hostias") puede ser considerada como una variante pigmentada de Enterobacter. Al gnero Erwinia pertenecen algunas especies pat6genas de vegetales, que afectan a los vstagos, las hojas y las races y que desencadenan enfermedades debido a la excreci6n de pectinasas. Klebsiella pneumoniae se diferencia de Enterobacter exclusivamente para la formaci6n de una capsula gruesa y por su falta de motilidad. Se presenta en algunas formas muy peligrosas de inflamaci6n de los pulmones. Salmonella typhimurium es la bacteria ms extendida de entre aqueas que provocan una gastroenteritis, la Hamada "intoxicacin por productos alimentarios". Esta intoxicaci6n se debe a la liberaci6n de lipopolisacaridos que desencadena una irritaci6n de las mucosas; no se da ninguna invasi6n del sistema sanguneo. S. typhi es el causante del tifus epidmico.

Shigella dysenteriae y cepas relacionadas son los causantes de la disentera y las diarreas. Vibrio cholerae es el causante del colera, una enfermedad epidmica. Este agente causal no pertenece al grupo de las Enterobacteriaceae, pero desde el punto de vista metabolico y fisiol6gico es muy pr6ximo. V. cholerae se reproduce en el intestino. Se fija sobre el epitelio intestinal, pero no penetra en las clulas. La enterotoxina del co1era es una protena, que se fija a las clulas del epitelio intestinal (unos receptores especficos) y que determina la salida de iones sodio, bicarbonato y cloruro, as! como de agua a la luz intestinal. Yersinia pestis es el causante de la peste. Yersinia no pertenece al grupo taxonmico de las Enterobacteriaceae, pero es muy pr6ximo desde el punto de vista de su modo de vida facultativamente anaer6bico y de su tipo de fermentaci6n. EI reservorio natural del causante de la peste son los roedores salvajes, sobre todo ratas. Las bacterias son transmitidas par pulgas infectadas 0 por otros ectoparsitos hasta el hombre y conducen a la peste bub6nica o a la peste pulmonar. Mediante una multiplicaci6n rpida y la producci6n de una fuerte toxina conducen rpidamente a la muerte. (Microbiologa General Hans. Scheler nueva edicin).

III. OBJETIVO-Hacer que el alumno recuerde las tcnicas y procedimientos bsicos de microbiologa general, para poderlos aplicar posteriormente en el control microbiolgico de los alimentos.IV. MATERIALES Y METODOSA) Coloracin Gram a partir de una cepa marcada- Desengrasar un porta-objeto con alcohol-acetona y algodn.- Descolgar una gota de agua estril, suspender en ella una pequea cantidad de cepa problema y homogenizar.- Dejar secar y flamear suavemente la extensin para fijarla.- Cubrir con una solucin del colorante primario. Cristal violeta u otro similar y dejar en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de cao.- Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar.- Decolorar con la solucin de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.- Cubrir con solucin de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto por 30 segundos. Lavar.- Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio. Anotar los resultados.B) Galera Bioqumica de OxNiGLUMoCISKAD para EnterobacteriaceaesA partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioqumicas:- Reaccin de la Oxidasa (Ox)- Reduccin de los Nitratos (Ni)- Fermentacin de la Glucosa (G) - Fermentacin de la Lactosa (L) - Hidrlisis de la Urea (U)- Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)- Asimilacin del Citrato (C)- Formacin del Indol (I)- Formacin del cido Sulfhdrico (S)- Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K) - Transformacin de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirvico APP (A).C) Fundamento v procedimiento de las pruebas bioqumicas para la familia EnterobacteriaceaeConstituida por grmenes de bastn Gram negativo mviles (flagelos en peritrico) e inmviles, Oxidasa negativos. Nitratos son reducidos a nitritos. Todas fermentan la glucosa con o sin produccin de gas, la diferencia de estas bacterias se basan en el comportamiento bioqumico, tratamiento recomendado por MOSSEL-QUEVEDO y llamado: Ox Ni G L U Mo C I S K A DOxidasa (Ox)Llamada tambin Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que la: poseen, oxidan al tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).Prueba: En una placa petri colocar un papel de nitro, humedecer este con el reactivo de Kovacs (solucin de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se oxida con el aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estra de cultivo joven (18 a 24 horas de incubacin) de ms o menos 5 mm de longitud considerar la prueba como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las enterobacterias no deben dar esta reaccin.Reduccin de Nitratos (Ni)Las bacterias que poseen las enzimas nitrato-reductasa, tienen la propiedad de reducir los nitratos a nitritos.Prueba: Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga adems 1/1000 de Nitrato de Potasio. Despus de incubar a 37/24 horas, aadir gotas de solucin A y de solucin B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo slido formado por cido sulfanlico, cido tartrico, y alfa-naftil -amina.La prueba es positiva s aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha coloracin agregar sobre el cultivo que contiene e! reactivo, Zn o Mg en polvo; observar despus de 10 minutos si la coloracin es rojiza, considerarla como negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen el que se ha reducido en nitratos.Fermentacin de Glucosa, Lactosa y Produccin de H S(GLS)El H;S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desanimacin de aminocidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos), En el medio, el H2S formado, reacciona con la sal de Fe contenido en l y da sulfuro de fierro (FeS) de color negro. La prueba en condiciones aerobias, es reversible.Prueba y lectura: Se puede realizar en un slo medio: Kligler (Hierro dos azcares), en el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estra en la superficie. Incubar a 37C, por 18 a 24 Horas.Parte inferior amarilla: Fermentacin de Glucosa. Parte superior amarilla: Fermentacin de Lactosa. Ruptura del medio: Produccin gas (Glucosa) Ennegrecimiento en la puntura de inoculacin: H2S positivo, indicador del medio: Rojo de fenolHidrlisis de Ia.Urea (U)Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea, alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva). Medio de cultivo: Caldo rea

Prueba: Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-slido (agar nitratado que lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura, introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, slo en una de las ramas.LecturaDespus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un enturbiamientoSe ertienJe desde la rama cultivada a la otra.KNO3: Fuente de Oxgeno, necesaria para la movilidad de! germen aerobio.Asimilacin del Citrato (C)Las enterobitcterias que utilizan el Citrato de Sodio como nica fuente de Carbono, alculinizun el medio agar Citrato de Simona, haciendo virar el indicador azul de bromo timol, del verde al azul intenso. Para esta prueba hay que tener las siguientes precauciones:-Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir all los posibles restos de materia orgnica que pudiera contener.- Realizar siempre la siembra a partir de un medio slido porque con medio lquido se arrastrara restos de materia orgnica.- Realizar la siembra en pequea cantidad y trazando slo una lnea a lo largo de la superficie de inclinacin.Produccin de Indol(I)Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminocido triptofano. Uno de los productos finales de esta degradacin es el Indol.Prueba: Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptona do, adicionar el reactivo de Kovacs pura Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la superficie.

Tolerancia al Cianuro de Potasio (K)Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente al OTK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le ha colocado previamente 0.1 mi. De un solucin al 0.5%. Se usan tubos de 8 x 160 mm-, y se siembran tres usadas de ms o menos 6 mm. De dimetro, a partir de un cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37C por 18 a 24 horas como mximo.Lectura:Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie completamenteTransparente, o ausencia total de desarrollo.Prueba de cido Phenil Pir vico (A)La fenilalanina, es un aminocido que determinadas enterobacterias pueden transformar en cido phenil pirvico.Prueba: Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estras) aminocido en estudio. Despus de la incubacin a 37C por 24 horas, investigar en el medio la presencia de cido fenil pirvico, adicionando unas gotas de sal frrica (Cl2 Fe). Prueba positiva: Aparicin inmediata de color verde.Descarboxilacion de la lisina (D)

Ciertas enterobacterias pueden transformar por desearboxilacin la lisina en Cadaverina, que por desanimacin libera grupos amino (NH3), bajo la forma de NH, alcalinizando e! medio de cultivo.

Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y prpura de bromocresol como indicador del medio.

Lectura. Despus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba como positiva si el Violeta vara al color prpura.Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentacin de la glucosa.PruebaMedio de cultivoTemperatura e incubacinReactivo a aadirsePrueba positivaPrueba negativa

Ox-------Tetrametil parafenil endiaminaSin coloracinColor azul

NiCaldo nitrato31C x 24 HReactivo gricesColor rojizoDespus de agregar Zn sigue rojizo

GAgar glucosa31C x 24 HColor amarilloSin coloracin

LAgar lactosa31C x 24 HColor amarilloSin coloracin

UCaldo urea31C x 24HGrosella intensoRojo de fenol

MoAgar movilidad31C x 24 HTurbidezSin color

CAgar citrato de Simmons31C x 24 HColor azulColor verde

ICaldo peptonado31C x 24HReactivo de kovacsAnillo grosellaSin presencia de anillo

SAgar kligler31C x 24Coloracin negraSin coloracin

V. RESULTADOSLos resultados estn basados en las caractersticas que presento cada caso en el tratamiento recomendado por Mossel Quevedo y son las siguientes:TratamientoResultado

Ox-

Ni+

G-

L+

U-

Mo-

C-

I-

S-

VI. DISCUCIONES-Los resultados que se obtuvieron fueron positivos debido a la coincidencia exacta de los datos en cuanto a respuesta del microorganismo, la shygela que es el microorganismo con los datos ms coincidentes a los resultados es una enterobacteria gram positiva y se pudo encontrar en la mayora de las muestras.-En la prueba de coloracin Gram los resultados son correctos ya que la familia de las Enterobacterias son gran negativos, nos esporulado y de forma bacilar.

VII. CONCLUSIONES- En la prctica se pudo comprobar, de acuerdo a los procedimientos realizados la presencia de shygela en las muestras debido a la coincidencia de los datos obtenidos con los de la tabla de diferenciacin que nos sirve para la comparacin de los resultados. VIII. BIBLIOGRAFIA-http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae-http://dianayjulian.galeon.com/enterobacte.htm-http://www.slideshare.net/miranda_col/eta-causadas-por-enterobacterias-EPIFANIO MARTINEZ MENA 2000. Manual de Practicas de Microbiologa Aplicada.Primera reimpresin Tarapoto-Per

IX. ANEXOSCuestionario1) Por qu las bacterias Gram negativas retienen el colorante de contraste, durante la coloracin Gram?La razn por la cual se da esta caracterstica es porque el yodo forma con el cristal una molcula soluble por lo que se da una fijacin a las bacterias gram negativas por la permeabilidad de la membrana celular y debido al punto isoelctrico menos acido por lo que se demuestra la poca afinidad con los colorantes bsicos.

2) Mencione diferencias entre bacterias Gram negativas y bacterias gram positivas.

Gram negativas:

- Retiene el colorante de contraste-Su coloracin es roja-Sus protenas tienen un punto isoelctrico menos acido-Complejo CVI se forma dentro de las bacterias y permanecen violetas-Presenta capa lipdicaGram positivas

-Complejo CVI se forman dentro de las bacterias y estas permanecen violetas-Sus protenas presentan un punto isoelctrico ms cido-No presentan capa lipdica

3) Describa a las bacterias entricas y nombre a los gneros ms representativos, dando caractersticas de cada uno de ellos.

Son parsitos de animales y de algunas plantas que son gram negativos y todas las especies atacan a los carbohidratos ya que en su mayora reducen nitrato o nitrito.Echerichia: Se encuentra en el tracto intestinal de los mamferos y utiliza como nica fuente de carbono el cido ctrico. Las especies de Escherichia coli oportunistas producen infecciones slo si abandonan el colon. Otros grupos producen hasta el 90% de las diarreas infantiles y la denominada diarrea del viajero. Se desarrollan entre 15C y 45C pero optima de 22C con un pH ptimo de 1, son gram negativos y suelen morir a 60C en 30 minutos

4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos gneros de la familia Enterobacteriaceae.

Salmonella: Gastro enteritis por salmonella ms conocida como salmonelosis.

Salmonella thipy: Produce la fiebre tifoidea.

Shigella: Produce disentera que es una enfermedad aguda o crnica del intestino grueso del humano.

Vibrio Cholerae: Produce clera.

Echerichia coli: Produce gastro enteritis.

AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN

FACULTAD: Ingeniera AgroindustrialESCUELA ACADMICA: Ingeniera AgroindustrialASIGNATURA: Microbiologa Agroindustrial PRCTICA N1: Familia enterobacteriaceae, coloracin gram y la galera bioqumica OxNiGLUMoCISKADDOCENTE: Ing. Nelson Garca GarayESTUDIANTE: Diego Ramrez FatamaCICLO: IVFECHA DE PRESENTACIN: 29/10/2013

MORALES 2013