microbiología de los alimentos para consumo humano y...

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Vencimiento consulta pública: 2008.06.27 PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

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Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Guía para la preparación y producción de medios de cultivo - Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio Preámbulo El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos. Este proyecto de norma se estudió a través del Comité Técnico Microbiología de los alimentos, para proporcionar la terminología general relativa al aseguramiento de la calidad

para la preparación de los medios de cultivo, y especificar los requisitos mínimos de

aplicación en los análisis microbiológicos de productos destinados al consumo humano o animal. Este proyecto de norma es una traducción modificada de la versión en inglés de la Especificación Técnica Internacional ISO/TS 11133-1:2000 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. Para los propósitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales que se indican y justifican en Anexo E. La Nota Explicativa incluida en un recuadro en cláusula 2 Referencias normativas y en Anexo Bibliografía, es un cambio editorial que se incluye con el propósito de informar la correspondencia con norma chilena de la norma internacional citada en este proyecto de norma.

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En este proyecto de norma se han realizado modificaciones con respecto a la especificación técnica internacional debido a la necesidad de armonizar este proyecto de norma con otra norma chilena sobre el tema. Estas desviaciones técnicas se han incorporado al texto del proyecto de norma, y están marcadas con una barra simple en los márgenes (I). En Anexo E se incluye una lista completa de las desviaciones técnicas, junto con su justificación. Este proyecto de norma NCh3162 ha sido preparado por la División de Normas del Instituto Nacional de Normalización. Los Anexos A, B, C, D y E no forman parte del proyecto de norma, se insertan sólo a título informativo.

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Contenido

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Preámbulo I

0 Introducción 1

1 Alcance y campo de aplicación 2

2 Referencias normativas 2

3 Términos y definiciones 3

3.1 Generalidades 3

3.2 Terminología de aseguramiento de la calidad 3

3.3 Terminología de los medios de cultivo 3

3.4 Terminología de los organismos de control 6

4 Prácticas para el control de la calidad de los medios de cultivo 7

4.1 Documentación 7

4.2 Almacenamiento 7

4.3 Preparación de los medios en el laboratorio 9

4.4 Preparación para el uso 12

4.5 Eliminación de los medios 13

5 Control de la calidad de los productos finalizados 13

5.1 Control de la calidad físico 13

5.2 Control de la calidad microbiológica 14

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Contenido

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Anexos

Anexo A (informativo) Denominación de los componentes de los medios de cultivo en las normas de análisis microbiológico de los alimentos para consumo humano y animal

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A.1 Generalidades 16

A.2 Peptonas 16

A.3 Extractos 16

A.4 Agar 17

A.5 Otros 17

Anexo B (informativo) Guía para la conservación y mantenimiento de cepas de control

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B.1 Generalidades 18

B.2 Cepas de referencia de origen comercial 18

B.3 Reserva de cepas de referencia preparadas en el laboratorio 18

B.4 Cultivos de trabajo 18

Anexo C (informativo) Aseguramiento de la calidad de los medios de cultivo - Tabla de anomalías

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Anexo D (informativo) Bibliografía 21

Anexo E (informativo) Justificación de las desviaciones técnicas y cambios editoriales

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Contenido

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Figuras

Figura B.1

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Tablas

Tabla E.1 Desviaciones técnicas

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Tabla E.2 Cambios editoriales 22

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Vencimiento consulta pública: 2008.06.27 PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

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Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Guía para la preparación y producción de medios de cultivo - Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio 0 Introducción En el laboratorio de microbiología muchos análisis y procedimientos dependen de que el medio de cultivo sea constante y proporcione resultados reproducibles. Los medios de cultivo se emplean en todas las técnicas de cultivo tradicionales y también en muchas técnicas alternativas. Numerosas fórmulas de medios de cultivo deshidratados están disponibles comercialmente y muchas más, destinadas a crecimientos específicos, se encuentran descritas en la literatura. Adicionalmente, en los laboratorios que realizan exámenes microbiológicos de productos alimenticios, los principales objetivos son el mantenimiento, revivificación, crecimiento, detección y/o recuento de una amplia variedad de microorganismos. Los requisitos que han de reunir los medios son específicos tanto para la muestra como para los organismos que se van a detectar. Los medios de cultivo han de cumplir unos criterios mínimos de rendimiento que constituyen por ello una condición previa a todo análisis microbiológico fiable. Conviene realizar un número de análisis suficiente para demostrar: i) la aceptabilidad de cada lote de medio; ii) que el medio es adecuado al objetivo; y iii) que el medio puede dar resultados constantes. Estos tres criterios son una parte esencial de los procedimientos de control interno de calidad y, con la documentación adecuada, permitirán una supervisión eficaz de los medios de cultivo y contribuirán a la obtención de los datos precisos y fiables.

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1 Alcance y campo de aplicación Esta norma proporciona la terminología general relativa al aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo, y especifica los requisitos mínimos de aplicación en los análisis microbiológicos de productos destinados al consumo humano o animal. Estos requisitos son aplicables a tres categorías de medios de cultivo empleados en los laboratorios que preparan y/o utilizan medios de cultivo para realizar sus análisis microbiológicos: - medios comerciales listos para su empleo; - medios preparados a partir de fórmulas deshidratadas comerciales (sean completos,

por ejemplo, agar para recuento en placa, o sean medios base a los que se les añaden suplementos, por ejemplo agar de Baird-Parker);

- medios preparados a partir de sus componentes individuales. 2 Referencias normativas Los documentos referenciados siguientes son indispensables para la aplicación de esta norma. Para referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha se aplica la última edición del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda). NCh9000.Of2001 ISO 9000:2000

Sistemas de gestión de la calidad - Fundamentos y vocabulario.

EN 1659:1996 In vitro diagnostic systems - Culture media for microbiology - Terms and definitions.

EN 12322:1999 In vitro diagnostic medical devices - Culture media for microbiology - Performance criteria for culture media.

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de la norma internacional señalada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 9000:2000 NCh9000.Of.2001 Idéntica

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3 Términos y definiciones Para los propósitos de esta norma, se aplican los términos y definiciones siguientes: 3.1 Generalidades Esta cláusula establece las definiciones generales referentes al aseguramiento de la calidad y proporciona diferentes tipos de terminología relacionada con los medios de cultivo y los cultivos de control. Las normas citadas entre corchetes indican que el texto dado es idéntico a la fuente citada. 3.2 Terminología de aseguramiento de la calidad 3.2.1 aseguramiento de la calidad: parte de la gestión de la calidad orientada a proporcionar confianza en que se cumplirán los requisitos de la calidad [NCh-ISO 9000] 3.2.2 control de la calidad: parte de la gestión de la calidad orientada al cumplimiento de los requisitos de la calidad [NCh-ISO 9000] 3.2.3 control de calidad interno: programa de control continuo de las actividades de un laboratorio preparado por o para él, y basado en los análisis de control y de seguimiento y sobre las acciones correctivas si fueran necesarias 3.2.4 lote de los medios de cultivo: unidad que permite una trazabilidad completa referida a una cantidad definida de producto a granel, producto semiterminado o producto final, que es coherente en tipo y calidad, y ha cumplido los requisitos de los ensayos de producción (control durante el proceso) y de garantía de la calidad, y que ha sido producido durante un período de producción definido al que se le ha asignado el mismo número de lote [EN 12322] 3.2.5 rendimiento del medio de cultivo: respuesta de un medio de cultivo sometido a cepas de control bajo condiciones definidas 3.3 Terminología de los medios de cultivo 3.3.1 medio de cultivo: formulación de sustancias en forma líquida, semisólida o sólida, que contienen constituyentes naturales y/o sintéticos destinados a facilitar la multiplicación o a mantener la viabilidad de los microorganismos NOTA - Cuando se utiliza formando parte de palabras compuetas, este término se abrevia a menudo con la palabra medio (por ejemplo, medio de enriquecimiento). [EN 1659]

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3.3.2 Medios de cultivo clasificados según su composición 3.3.2.1 medio de cultivo de composición química definida: medio de cultivo formado únicamente por constituyentes químicamente definidos (es decir, de estructura molecular y el grado de pureza conocidos) [EN 1659] 3.3.2.2 medio de cultivo de composición química incompleta: medio de cultivo formado total o parcialmente por materias primas naturales, procesado o de otra manera, cuya composición química no está definida de forma completa NOTA - Para los diversos componentes no definidos químicamente empleados en los medios de cultivo, el ISO/TC 34/SC 9 ha establecido una lista armonizada de denominaciones, ver Anexo A. 3.3.3 Medios de cultivo clasificados por su consistencia 3.3.3.1 medio de cultivo íquido: medio de cultivo que consiste en una solución acuosa de uno o más constituyentes (por ejemplo, agua de peptona, caldo nutritivo) NOTAS 1) En algunos casos se añaden partículas sólidas al medio de cultivo líquido. 2) Los medios líquidos en tubos, matraces o frascos se denominan comúnmente caldos. [EN 1659] 3.3.3.2 medio de cultivo sólido y medio de cultivo semisólido: medio de cultivo líquido que contiene materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar, gelatina, etc.) en diferentes concentraciones NOTAS 1) Debido a la utilización mundialmente extendida de los medios de cultivo solidificados con agar-agar, se

utiliza el término abreviado agar de forma sinónima para medios de cultivo sólidos y por lo tanto formando parte de otros términos (por ejemplo, agar para recuento en placa).

2) Los medios de cultivo sólidos vertidos en placas de Petri se llaman comúnmente placas. Los medios de

cultivo sólidos vertidos en tubos que se mantienen en posiciones inclinadas mientras se solidifican se denominan a menudo agares inclinados.

[EN 1659] 3.3.4 Medios de cultivo clasificados por el uso al que se destinan 3.3.4.1 medio de transporte: medio de cultivo diseñado para conservar y mantener la viabilidad de los microorganismos durante el período de tiempo entre el momento del muestreo y el procesamiento de la muestra en el laboratorio NOTA - Los medios de transporte contienen normalmente sustancias que no permiten la multiplicación de los microorganismos pero que aseguran su conservación (por ejemplo, medio de transporte de Stuart o de Amies). [EN 1659]

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3.3.4.2 medio de conservación: medio de cultivo diseñado para conservar y mantener la viabilidad de los microorganismos durante un período de tiempo prolongado, para protegerlos contra las influencias adversas que pueden ocurrir durante su almacenamiento a largo plazo y para permitir su recuperación después de este período (por ejemplo, medio de huevo de Dorset) [EN 1659] 3.3.4.3 medio de revivificación: medio de cultivo que permite a los microorganismos lesionados y dañados, reparar y recuperar su capacidad de crecimiento normal, sin promover necesariamente su multiplicación [EN 1659] 3.3.4.4 medio de enriquecimiento: medio de cultivo generalmente líquido, que debido a su composición, proporciona unas condiciones particularmente favorables para la multiplicación de los microorganismos [EN 1659] 3.3.4.4.1 medio de enriquecimiento selectivo: medio de enriquecimiento que favorece la multiplicación de microorganismos específicos mientras que inhibe parcial o totalmente el crecimiento de otros microorganismos (por ejemplo, medio de Rappaport-Vassiliadis) 3.3.4.4.2 medio de enriquecimiento no selectivo: medio de enriquecimiento que favorece el crecimiento de la mayoría de los microorganismos (por ejemplo, caldo nutritivo) 3.3.4.5 medio de aislamiento: medio de cultivo sólido o semisólido que favorece el crecimiento de microorganismos 3.3.4.5.1 medio de aislamiento selectivo: medio de aislamiento que favorece el crecimiento de microorganismos específicos, a la vez que inhibe otros microorganismos (por ejemplo, agar PALCAM, agar MacConkey) [EN 1659] 3.3.4.5.2 medio de aislamiento no selectivo: medio de aislamiento que no está diseñado para la inhibición selectiva de microorganismo (por ejemplo, agar nutritivo) [EN 1659] 3.3.4.6 medio diferencial: medio de cultivo que permite el estudio de una o más características fisiológicas/bioquímicas de los microorganismo para su identificación (por ejemplo, medio de urea, agar de Kligler) NOTA - Los medios diferenciales que se pueden utilizar como medios de aislamiento se denominan medios de aislamiento/diferencial [por ejemplo, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)]. [EN 1659]

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3.3.4.7 medio de identificación: medio de cultivo diseñado para producir una reacción de identificación específica que no precisa ningún análisis posterior de confirmación NOTA - Los medios de identificación que se pueden emplear como medio de aislamiento se denominan medios de aislamiento/identificación. [EN 1659] 3.3.4.8 medios para usos múltiples: ciertos medios de cultivo se pueden asignar a varias categorías, por ejemplo, el agar-sangre es un medio de revivificación según 3.3.4.3, un medio de aislamiento según 3.3.4.5, y un medio diferencial según 3.3.4.6, utilizado para la detección de hemólisis 3.3.5 Medios de cultivo clasificados según el método de preparación 3.3.5.1 medio listo para su empleo: medio de cultivo que se suministra en recipientes bajo la forma de producto listo para su empleo (por ejemplo, placas de Petri, tubos u otros recipientes) 3.3.5.2 medio de cultivo preparado a partir de fórmulas comerciales deshidratadas: medio de cultivo desecado que no está listo para su uso inmediato (por ejemplo, productos en polvo, granulados o liofilizados). La rehidratación producirá uno de los dos tipos de medios siguientes: - un medio completo listo para su empleo; - un medio incompleto al cual se añaden componentes lábiles justo antes de su uso. 3.3.5.3 Medio de cultivo preparado en el laboratorio a partir de sus componentes individuales 3.4 Terminología de los organismos de control 3.4.1 Generalidades Se trata de microorganismos utilizados generalmente para el control de la calidad y de los análisis del rendimiento de los medios de cultivo. Se definen según su origen de la forma siguiente: 3.4.2 cepa de referencia: microorganismo definido al menos a nivel de género y especie, catalogado y descrito según sus características y preferiblemente indicando su origen [EN 12322] 3.4.3 cepa de reserva de referencia: lote de cultivos obtenido en el laboratorio por una sola propagación a partir de una cepa de referencia, ya sea en el laboratorio o desde un proveedor [EN 12322] 3.4.4 cultivo de trabajo: subcultivo primario de una cepa de reserva de referencia (ver 3.4.3)

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4 Prácticas para el control de la calidad de los medios de cultivo 4.1 Documentación 4.1.1 Documentación requerida desde el fabricante El fabricante debería suministrar la información siguiente: - nombre del medio, constituyentes individuales y cualquier suplementos, y sus códigos

de productos; - número de lote; - pH del medio antes de su uso; - condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad; - cualquier evaluación de su rendimiento y organismo de control utilizado; - ficha técnica; - certificado de control de la calidad; - ficha de datos de seguridad y/o peligrosidad, cuando sea necesaria. 4.1.2 Verificación realizada por el laboratorio Cuando se recibe el medio, el laboratorio comprueba los datos siguientes: - nombre del medio y número de lote; - fecha de recepción; - fecha de caducidad; - condiciones e integridad del embalaje. 4.2 Almacenamiento 4.2.1 Generalidades En todos los casos se seguirán las instrucciones del fabricante, cuando existan, en lo referente a condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso.

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4.2.2 Gestión y control de la calidad de medios deshidratados y suplementos Los medios se adquieren generalmente de fabricantes comerciales. Se suministran en forma de polvo deshidratado o en gránulos en recipientes sellados, y los suplementos de las diferentes sustancias selectivas o de diagnóstico se suministran bajo forma liofilizada o líquida. Sin embargo, es conveniente planificar la recepción para asegurar una rotación regular de los productos almacenados (es decir, primero que entra primero que sale). Para mantener un inventario eficaz se deberían efectuar verificaciones suplementarias que comprenden: - una nueva verificación del sellado; - fecha de la primera vez que se abre; - evaluación visual del contenido de los recipientes abiertos. La calidad del medio puede depender del ambiente del almacenamiento, especialmente después de abrir un nuevo recipiente. La pérdida de la calidad de los medios deshidratados se manifiesta por un cambio en las características de flujo del polvo, homogeneidad, apelmazamiento, cambios de color, etc. Se debería desechar todo medio deshidratado que haya absorbido humedad o muestre signos manifiestos de cambio en la apariencia física. 4.2.3 Medios comerciales listos para su empleo Seguir las instrucciones del fabricante en lo referente a las condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso. 4.2.4 Medios preparados a partir de fórmulas deshidratadas disponibles comercialmente y a partir de componentes individuales básicos El tiempo de conservación de estos tipos de medios es variable. Por ello es difícil establecer límites de tiempo generales para el almacenamiento de los medios preparados. Las normas internacionales o nacionales específicas pueden estipular las condiciones específicas y el tiempo de conservación. Los medios de cultivo esterilizados dispensados en placas, tubos o frascos y los reactivos que no vayan a ser utilizados inmediatamente deben ser protegidos de la luz y de la desecación. A menos que se haya establecido una fecha de caducidad validada o esté especificado en la norma en cuestión, los medios parcialmente completos estériles, es decir los medios a los cuales los componentes finales se añaden inmediatamente antes de su uso, se deben mantener en refrigerador como máximo tres meses y un mes como máximo a temperatura ambiente, en condiciones que eviten toda modificación de su composición. Sin embargo, se recomienda que los medios a los que se les ha añadido suplementos selectivos lábiles sean usados en el mismo día de su preparación. No es conveniente que los medios sólidos que contengan reactivos químicos y/o sustancias lábiles se almacenen en masa para refundirlos posteriormente.

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Hay que observar cualquier cambio de color, signo de evaporación/deshidratación o crecimiento microbiano. Los lotes de medios que presenten tales cambios, no deberían ser usados. Se recomienda que antes de usar o antes de un calentamiento adicional, la temperatura de los medios de cultivo se equilibre con la temperatura ambiente. 4.3 Preparación de los medios en el laboratorio 4.3.1 Generalidades La preparación precisa de los medios de cultivo es una de las etapas fundamentales en el examen microbiológico y se le debe dedicar un cuidado especial. Se han de respetar las buenas prácticas de laboratorio y las instrucciones del fabricante respecto a la manipulación de los medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que contengan materiales peligrosos, es decir sales biliares u otros agentes selectivos. Cuando los medios se preparan a partir de fórmulas deshidratadas comerciales, se seguirán fielmente las instrucciones del fabricante. Hay que documentar todos los datos importantes, es decir peso/volumen, pH, fecha de preparación, condiciones de esterilización, técnico. Para los medios preparados a partir de componentes individuales, se seguirá fielmente la receta y se registrarán todos los detalles (ver 4.1.2), así como la identificación completa (es decir código y número de lote) de todos los constituyentes utilizados. 4.3.2 Agua El agua utilizada debe ser destilada o agua de calidad equivalente, es decir libre de sustancias que puedan inhibir o influir en el crecimiento de los microorganismos en las condiciones de análisis. Si el agua destilada se prepara a partir de agua clorada, neutralizar el cloro antes de la destilación. El agua destilada debe ser almacenada en recipientes fabricados preferiblemente de materiales inertes (por ejemplo, vidrio neutro, polietileno, etc.) que deben estar libres de toda sustancia inhibidora antes de ser usados por primera vez. NOTA - En algunos casos puede ser necesario usar agua recién preparada, libre de dióxido de carbono disuelto. Para que el agua destilada se pueda considerar de buena calidad, debe tener una resistividad de al menos 300 000 Ωcm. ADVERTENCIA: El agua procesada a través de un intercambiador de iones (desionizada) puede tener un alto contenido en microorganismos; es por ello recomendable no utilizar este tipo de agua sin haber verificado antes que el contenido de microorganismos en el agua es bajo. Es conveniente consultar al fabricante sobre la mejor manera de minimizar la contaminación microbiana. El agua desionizada muy contaminada que haya sido esterilizada por filtración, puede todavía contener sustancias inhibidoras para el crecimiento de algunos microorganismos.

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4.3.3 Pesada y rehidratación Se pesa cuidadosamente la cantidad apropiada de medio deshidratado (teniendo cuidado de no inhalar polvo, especialmente con medios que contengan sustancias tóxicas) y se añade progresivamente la cantidad necesaria de agua evitando que se formen grumos. 4.3.4 Disolución y dispersión Los medios deshidratados necesitan para su disolución una dispersión rápida mediante una agitación inmediata y repetida, seguida por calentamiento si es necesario. Para la disolución de los medios que contengan agar, es conveniente dejarlos a remojo durante varios minutos antes de calentarlos con agitación para disolverlos. Para los medios preparados a partir de sus componentes individuales, cada componente se debería añadir separadamente y dejarlo disolver antes de completar el volumen final. 4.3.5 Medida y ajuste de pH Se mide el pH utilizando un pHmetro y se ajusta si es necesario, es decir para los medios preparados a partir de sus componentes individuales en el laboratorio se ajusta de tal forma que después de la esterilización y enfriamiento a 25ºC el medio esté al pH requerido ± 0,2 unidades de pH, salvo que se indique otra cosa. El ajuste se realiza normalmente empleando una disolución de hidróxido sódico (NaOH) de aproximadamente 40 g/L (alrededor de 1 mol/L) o de ácido clorhídrico (HCl) de aproximadamente 36,5 g/L (alrededor de 1 mol/L). NOTA - Los medios de cultivo comerciales pueden mostrar cambios significativos de pH antes y después de ser sometidos al autoclave. Sin embargo, siempre que se use agua destilada o desionizada de buena calidad, el ajuste del pH antes de introducir en el autoclave no debería ser necesario. 4.3.6 Dispensación Se dispensa el medio en recipientes adecuados que tengan un volumen de 1, 2 a 3 veces el del medio. 4.3.7 Esterilización 4.3.7.1 Generalidades La esterilización de los medios de cultivo y de los reactivos se puede realizar empleando esterilización mediante calor húmedo (ver 4.3.7.2) o esterilización mediante filtración (ver 4.3.7.3). Ciertos medios no necesitan esterilización por autoclave sino que se pueden utilizar después de haber sido llevados a ebullición. Por ejemplo, medios para Enterobacteriaceae que contienen verde brillante son particularmente sensibles al calor y a la luz y deberían ser enfriados rápidamente después de la ebullición y protegidos de la luz intensa. Igualmente algunos reactivos se pueden usar sin esterilización (referirse a la norma apropiada o a las instrucciones del fabricante).

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4.3.7.2 Esterilización mediante calor húmedo La esterilización mediante calor húmedo se realiza en autoclave o en un aparato preparador de medios. Generalmente la esterilización por autoclave se efectúa durante 15 min a 121ºC. Para volúmenes mayores que 1 000 ml, es necesario adaptar el ciclo de esterilización. En todos los casos, se seguirán las instrucciones dadas en las normas o las instrucciones de los fabricantes. Es conveniente controlar el funcionamiento del autoclave mediante perfiles de temperatura empleando termopares y papel reactivo bajo condiciones de cargas típicas para asegurar que las temperaturas deseadas se puedan alcanzar. NOTA - Se puede producir un sobrecalentamiento cuando se someten al autoclave grandes cantidades de medio (> 1 000 ml). El control de la eficacia de la esterilización es esencial. Después del calentamiento del medio, es esencial enfriarlo de manera que se evite que se desborde. Esto es particularmente importante en los medios sensibles como por ejemplo, para las Enterobacteriaceae y para los medios en grandes volúmenes. 4.3.7.3 Esterilización por filtración La esterilización por filtración se puede realizar por vacío o por presión. Se usan membranas o filtros con un diámetro de poro de 0,22 µm. Deben haber sido esterilizados en el autoclave. Para el empleo de filtros o membranas que se hayan adquirido estériles, referirse a las instrucciones del fabricante. Los diferentes elementos de los aparatos de filtración, montados o no, deben ser esterilizados en el autoclave durante 15 min a 121ºC. Si es necesario, el montaje aséptico se puede realizar en una cámara de flujo laminar después de ser sometidos al autoclave. NOTA - Algunos filtros de membrana pueden retener proteínas (como los antibióticos). A fin de obtener la concentración adecuada, el usuario debería humedecer previamente el filtro. 4.3.7.4 Monitoreo Después de la esterilización por autoclave, ebullición o filtración, todos los medios se deberían monitorear, en particular en lo referente al pH, color, esterilidad y consistencia. 4.3.8 Preparación de los suplementos Los suplementos comerciales que contengan agentes tóxicos, particularmente antibióticos, deben ser manipulados con cuidado, evitando la dispersión del polvo que podría dar lugar a alergias o a otras reacciones en el personal del laboratorio. Se tomarán las precauciones necesarias y se seguirán las instrucciones del fabricante durante la preparación de las disoluciones. No se sobrepasará la fecha límite de conservación, que es generalmente el mismo día para las disoluciones de trabajo de antibióticos. Bajo ciertas circunstancias, las disoluciones de antibióticos pueden ser almacenadas congeladas en alícuotas apropiadas, pero no se deberían volver a congelar después de ser descongeladas. La pérdida potencial de actividad debido a la congelación se debería discutir con el fabricante o ser determinada por el usuario.

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4.4 Preparación para el uso 4.4.1 Fusión de los medios de cultivo con agar Se funde un medio de cultivo situándolo en un baño de agua hirviendo o por cualquier otro procedimiento que dé resultados idénticos (por ejemplo, en autoclave a vapor fluente). Los medios que han sido previamente esterilizados en autoclave deberían ser recalentados durante un tiempo mínimo para mantener la calidad de los medios. Hay que evitar un calentamiento excesivo y retirarlo cuando esté fundido. Se enfría el medio fundido a 47ºC ± 2ºC en un baño de agua controlado termostáticamente hasta el momento de su empleo. El tiempo necesario para alcanzar los 47ºC depende del tipo de medio, del volumen y del número de recipientes que haya en el baño de agua. Los medios de cultivo refundidos se deberían usar lo más pronto posible, y se recomienda no conservarlos más de 4 h. 4.4.2 Desgasificación de los medios de cultivo Si es necesario, justo antes de su uso, calentar el medio de cultivo en agua hirviendo o bajo vapor fluente durante 15 min, con tapones flojos; después del calentamiento, se aprietan los tapones y se enfría rápidamente hasta la temperatura de utilización. 4.4.3 Adición de suplementos Los suplementos termolábiles se deberían añadir al medio después de que éste haya sido enfriado a 47ºC ± 2ºC. Los suplementos estériles se deben estabilizar a temperatura ambiente antes de añadirlos al medio de agar. Los líquidos fríos pueden hacer que el agar se solidifique o que se formen copos transparentes. Se mezclan con precaución y completamente todos los suplementos con el medio y después se transfiere a los recipientes finales lo más rápidamente posible. 4.4.4 Preparación y almacenamiento de los medios en placas de Petri Se vierte el medio de cultivo de agar fundido en placas de Petri de manera que se obtenga un espesor de al menos 2 mm (por ejemplo, para placas de 90 mm de diámetro, se necesitan normalmente 15 ml de agar). Se deja el agar solidificar y enfriar situando las placas de Petri, con las tapas en su lugar, en una superficie fresca y horizontal. NOTA - Durante la incubación se produce una pérdida de humedad del medio de agar. Una pérdida mayor que 15% del contenido en agua puede en algunas circunstancias afectar adversamente al crecimiento de microorganismos. Los factores que influyen en la pérdida de agua son la composición del medio, la cantidad de medio en las placas, el tipo de estufa de incubación (es decir, con ventilación o de otro tipo), humedad de la atmósfera en la estufa de incubación, la posición y el número de placas en la estufa de incubación y la temperatura de incubación.

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El medio solidificado se emplea inmediatamente o se conserva en condiciones que eviten toda modificación de su composición, es decir en oscuridad y/o en refrigerador entre 4ºC y 12ºC en bolsas selladas, durante un tiempo máximo de una semana o lo indicado por el fabricante o la norma específica. Se etiquetan las placas en la base con la fecha de preparación y/o la fecha de caducidad y la identificación del medio. Alternativamente se pueden utilizar sistemas de códigos que reúnan estos requisitos. El tiempo de conservación de las placas se incrementará si se almacenan en bolsas de plástico selladas. Para evitar que se produzca condensación, las placas se deberán enfriar antes de introducirse en las bolsas. No se deben secar las superficies de las placas de agar antes de almacenarlas en el refrigerador. En general, para la siembra en superficie de un medio de cultivo sólido, se secan las placas, preferiblemente con las tapas retiradas y con la superficie del agar mirando hacia abajo, en una estufa regulada entre 25ºC y 50ºC o en una cabina de flujo laminar, hasta la desaparición de las gotas de la superficie del medio. No se deben secar demasiado. Las placas comerciales listas para su empleo se deberían almacenar y utilizar según las instrucciones del fabricante. 4.4.5 Incubación Apilar las placas en número no mayor a seis unidades y dejar espacio para que circule el aire, de tal forma que el medio de cultivo se equilibre con la temperatura de incubación lo más rápidamente posible. En el caso de medios líquidos, el tiempo para alcanzar la temperatura de incubación depende de varios factores, por ejemplo, el volumen, la carga, el recipiente, el tipo de estufa. Si se utilizan jarras de anaerobios puede ser necesario apilar más de seis placas. 4.5 Eliminación de los medios Tanto los medios contaminados como los no utilizados deben ser eliminados de una manera que sea segura y que cumpla las reglamentaciones locales o nacionales. 5 Control de la calidad de los productos finalizados 5.1 Control de la calidad físico Los controles de laboratorio deberían incluir como mínimo: - valor del pH medido entre 20ºC y 25ºC; y mediante observación: - cantidad repartida y/o espesor de la capa; - color;

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- claridad/presencia de defectos ópticos; - estabilidad del gel/consistencia/humedad. 5.2 Control de la calidad microbiológica 5.2.1 Contaminación Una cantidad apropiada de cada lote debería ser analizada para verificar la ausencia de contaminación. 5.2.2 Cepas de control Un lote de cepas de control debería contener sólo microorganismos con características estables, que sean representativos de sus especies y que se hayan mostrado fiables para la comprobación del comportamiento óptimo de un medio en particular preparado en el laboratorio. Las cepas de control deberían incluir principalmente cepas que estén disponibles fácilmente en colecciones de cultivos de referencia, pero también se pueden incluir cepas bien caracterizadas aisladas en el laboratorio. Se deberían examinar y registrar en el laboratorio las características principales de los cultivos de reserva y renovar las cepas si aparecen características atípicas. Se utilizarán preferentemente cepas de origen alimentario, aunque no todas las colecciones de cultivo suministran este tipo de información sobre su origen. Las cepas de control para cada medio pueden incluir: - cepas robustas positivas que muestren características típicas; - cepas positivas que crecen débilmente (es decir de una naturaleza más sensible); - cepas bioquímicamente no reactivas, por ejemplo, aquellas que muestren reacciones

diferentes de fermentación o de fluorescencia; - cepas completamente inhibidas. NOTA - El grupo de trabajo sobre medios de cultivo (WPCM) del International Committee for Food Microbiolgoy and Hygiene ha recomendado una colección validada de cepas de control para la evaluación de los medios (ver Anexo D, [1]). 5.2.3 Medios y reactivos listos para su uso Los fabricantes de medios comerciales listos para su uso, particularmente si están

certificados según ISO 9001 (ver Anexo D, [2]), tendrán un programa de calidad en

funcionamiento y pueden acompañar los medios que suministren con un certificado de calidad. Bajo estas condiciones el usuario puede no necesitar realizar pruebas extensas de dichos medios, pero se debería asegurar que las condiciones de conservación establecidas se mantengan.

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5.2.4 Medios preparados a partir de formulaciones deshidratadas disponibles comercialmente Para los propósitos de esta norma, las exigencias mínimas son unas pruebas cualitativas

para cada lote del medio preparado, pero cuando se van a realizar exámenes cuantitativos de muestras, las pruebas cuantitativas de cada lote darán una mayor seguridad de la calidad de los medios. Para aquellos medios que no contienen indicadores o agentes selectivos, es suficiente el uso de una sola cepa de control positiva. Para aquellos medios que contienen indicadores o agentes selectivos, se deben utilizar cepas que demuestren la función del (de los) indicador(es) y la selectividad. Para los medios complejos, es decir con suplementos adicionados, cada lote se debería verificar con cepas con las características indicadas en 5.2.2. Lo mismo se aplica al caso de los medios listos para su uso a los cuales se han adicionado suplementos preparados en el laboratorio. 5.2.5 Medios preparados a partir de componentes básicos individuales Se recomienda que además de las pruebas cualitativas descritas en 5.2.4 se realicen algunas pruebas cuantitativas utilizando técnicas como la de Miles & Misra modificada (ver Anexo D, [1]) o siembra en espiral, para evaluar así la calidad de los componentes de base, la productividad del medio y los procedimientos internos de elaboración en el laboratorio. NOTA - Estas son directrices mínimas, pero en la práctica los alimentos pueden contener microorganismos lesionados. Se debería tener en cuenta la capacidad del medio respecto a la recuperación de las células lesionadas. Para información sobre las técnicas de conservación, mantenimiento y sobre las colecciones de cultivos de referencia, ver Anexo B.

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Anexo A (Informativo)

Denominación de los componentes de los medios de cultivo en las normas de análisis microbiológico de los alimentos para consumo humano y animal

A.1 Generalidades Con el fin de armonizar la descripción de los diferentes componentes en la composición de los medios de cultivo en los métodos microbiológicos normalizados, el ISO/TC 34/SC 9 Productos agrícolas y alimenticios - Microbiología decidió las denominaciones para las categorías de los componentes designados en cláusulas A.2 a A.5. A.2 Peptonas - digerido enzimático de caseína1); - digerido enzimático de harina de soja; - digerido enzimático de tejidos animales2); - digerido enzimático de corazón; - digerido enzimático de gelatina; - digerido enzimático de tejidos de animales y plantas. A.3 Extractos - extracto de carne; - extracto de cerebro-corazón; - extracto de levadura; - bilis de buey para uso bacteriológico; - sales biliares; - sales biliares N° 3.

1) Incluye digerido péptico de caseína, digerido tríptico de caseína y triptona. 2) Incluye peptona de carne, digerido péptico de carne, digerido pancreático de carne.

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A.4 Agar - agar bacteriológico. A.5 Otros - emulsión de yema de huevo; - leche descremada en polvo; - hidrolizado ácido de caseína.

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Anexo B

(Informativo)

Guía para la conservación y mantenimiento de cepas de control B.1 Generalidades Para la conservación y el mantenimiento eficaz de todos los microorganismos de interés en microbiología de los alimentos hay varios métodos disponibles, como la liofilización, conservación en bolitas a -70°C o empleando nitrógeno líquido. Un método puede no ser apropiado para todas las cepas. Estas directrices de conservación se presentan en Figura B.1. B.2 Cepas de referencia de origen comercial Si las cepas de referencia procedentes de colecciones de referencia o de proveedores

comerciales aprobados según ISO 9001 (ver Anexo D, [2]), se adquieren y mantienen en

sus recipientes originales, se deben seguir las instrucciones de los fabricantes para su cultivo y utilización. B.3 Reserva de cepas de referencia preparadas en el laboratorio Los cultivos de reserva de cepas de referencia (ver cláusula B.2) para el control de calidad y para ensayos de rendimiento, se deben mantener y manipular de manera que se reduzca al mínimo la posibilidad de contaminación cruzada, mutación o alteración de las características típicas. Las reservas de cepas de referencia se deberían almacenar en múltiples alícuotas ya sea ultracongeladas (-70°C) o liofilizadas. Se debería documentar exhaustivamente las características de crecimiento para cada uno de los medios sobre/en los que serán utilizadas como cepas de control. B.4 Cultivos de trabajo Los cultivos de trabajo se preparan a partir de las reservas de cepas de referencia liofilizadas o ultracongeladas (ver cláusula B.3). Las alícuotas deben ser manejadas de tal manera que se evite la posible contaminación cruzada de la cepa de reserva de referencia y/o su deterioro. Los cultivos de trabajo se deberían preparar resuspendiendo una alícuota de la cepa de reserva de referencia en un medio de crecimiento no selectivo e incubándolo hasta obtener una fase de cultivo estacionaria. En el caso de sistemas de conservación comerciales, las instrucciones del fabricante se deben seguir rigurosamente.

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NOTA - No se deberían realizar subcultivos a partir de cultivos de trabajo. Sin embargo, los cultivos de trabajo se puede utilizar más de una vez, siempre que sean manipulados y conservados adecuadamente, es decir evitando las contaminaciones cruzadas y/o su deterioro, y nunca durante más de una semana.

Cepa de referencia

Obtenida de una colección de cultivos de referencia, liofilizada y al vacío; o un organismo definido al menos al nivel de género y especie, altamente caracterizado y de origen conocido

Cepa de reserva de referencia

Una serie de alícuotas de cultivos idénticos obtenidos en el laboratorio de un subcultivo único de la cepa de referencia

Cultivo de trabajo

Un subcultivo primario a partir de una alícuota de la cepa de reserva de referencia

Figura B.1

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Anexo C

(Informativo)

Aseguramiento de la calidad de los medios de cultivo - Tabla de anomalías

Anomalías Razones posibles

No se solidifica el medio de agar Sobrecalentamiento del medio durante su preparación

pH bajo que produce una hidrólisis ácida

Pesada incorrecta del agar utilizado

Agar no disuelto totalmente

Mala mezcla de los ingredientes

pH incorrecto Sobrecalentamiento del medio durante su preparación

Mala calidad del agua

Contaminación química externa

Medición del pH a temperatura inadecuada

Calibración incorrecta del pHmetro

Mala calidad del medio deshidratado

Color anormal Sobrecalentamiento del medio durante su preparación



pH incorrecto

Contaminación externa

Formación de precipitados Sobrecalentamiento del medio durante su preparación



Control del pH inadecuado

Medio inhibidor/baja productividad Sobrecalentamiento del medio durante su preparación



Uso de una formulación incorrecta, por ejemplo, ingredientes que no se han pesado correctamente, suplementos adicionados a concentración errónea

Débil selectividad Sobrecalentamiento del medio durante su preparación


Uso de una formulación incorrecta

Suplementos mal adicionados, por ejemplo, cuando el medio está demasiado caliente o adicionados a concentración errónea

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Anexo D

(Informativo)

Bibliografía [1] Culture media for Food Microbiology - Progress in Industrial Microbiology, Vol. 34

(1995). Eds. Corry J.E.L., Curtis, G.D.W. and Baird, R.M. Elsevier, Amsterdam.

[2] NCh9001.Of2001 ISO 9001:2000

Sistemas de gestión de la calidad - Requisitos.

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de la norma internacional señalada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 9001:2000 NCh9001.Of.2001 Idéntica

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Anexo E

(Informativo)

Justificación de las desviaciones técnicas y cambios editoriales

Tabla E.1 Desviaciones técnicas

Cláusula/Subcláusula Desviaciones técnicas Justificación

3.2.1 Se reemplaza la definición por la contenida en NCh9000.Of2001 - ISO 9000:2000

Actualizar definición

3.2.2 Se reemplaza la definición por la contenida en NCh9000.Of2001 - ISO 9000:2000

Actualizar definición

5.2.3; B.2; Anexo D Se elimina la referencia a ISO 9002 Norma anulada

Tabla E.2 Cambios editoriales

Cláusula/Subcláusula Cambios editoriales Justificación

5.2.4 Se reemplaza “esta parte de la norma ENV ISO/TR 11133-1” por “esta norma”

La norma es de alcance nacional

microbiología de los alimentos para consumo humano y...

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