PCRFundamentos y aplicaciones

Virología Médica

Víctor Hugo Jiménez Mendoza

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1985 - Mullis & Falloona

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA

(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades

La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’

Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde

Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)

La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-dependiente.

Cadena líder (Leading Strand)

Primer (riboNTPs)

Fragmento de Okasaki

Cadena rezagada (Lagging Strand)

Basta un primer

LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.

Eventos en la Replicación del DNA:

• Apertura de las cadenas (orígen de replicación)

• Colocación de los iniciadores (primers de RNA) ( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)

• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)

• Eliminación de los iniciadores de RNA.

• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)

ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

Hebra Templado

· Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de nucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.

dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados

DNA Polimerasa

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

5’3’

3’5’DNA de cadena doble

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’

CalorDNA de cadena simple

PCRMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

3’5’

5’3’5’

5’

Melting94 oC

Hibridaciónde primers

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30 ciclos

3’5’

5’3’

Calor

Calor

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

Calor

Calor

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragmentos de tamaño definido

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

tura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.

0# ciclos

Numero de copias1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TECNICAS

ALTA SENSIBILIDAD

ALTA ESPECIFICIDAD

RAPIDEZ

DESVENTAJA:

PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)

Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en pacientes asintomáticos)

Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)

Evaluación de terapia - pronostico de recaída

Detección de cepas resistentes a antibióticos

Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en pacientes con trasplante de órganos (por inmunosupresión y mayor riesgo a infecciones latentes)

MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR

•Sangre - Bacterias

•Mucosa - Hongos

•Tejido - Parásitos

•Orina - Virus

•Heces - Mutaciones en Genes

•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de genes

Bibliografía Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis

KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491

Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Genética. McGraw-Hill Interamericana.

Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006). Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. Humana Press

Butler, JM (2005). Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84

Gracias