objetivo: presentar los principales conceptos vinculados a
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Objetivo: Presentar los principales conceptos vinculados a la espectroscopía infrarroja, con particular énfasis en las biomoléculas
Carga horaria: 46 hs Teórico/Práctico: 12 hs T / 34 hs P (5 créditos)
Aprobación del curso: Con la asistencia obligatoria a todos los prácticos, y la entrega del informe correspondiente al trabajo especial. Posteriormente, deberán rendir un examen escrito sobre los temas teóricos y prácticos dictados en el curso. La nota final de aprobación tendrá en cuenta la nota obtenida en el informe del trabajo especial (50 %) y del examen escrito (50 %).
Trabajo Especial: Consta de parte experimental a la cual se asigna una carga horaria de 18hs y un informe escrito con una breve introducción de la temática elegida, discusión de los resultados y conclusiones.
Bibliografía Recomendada
Barbara Stuard, Infrared Spectroscopy Fundamental and Applications (2004)
Da-Wen Sun, Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control (2009)
Jerry Workman; Jr. Lois Weyer Practical, Guide to Interpretative Near-infrared Spectroscopy (2007)
J. Kauppinen;J. Partanen, Fourier transforms in Spectroscopy (2001)
Clays and Clay Minerals, 1973, Vol. 21, pp. 363-368
Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 30(2):95-120 (1995)
Talk Letter Shimadzu
IR cercano
IR lejano
• 12800-4000 cm-1
• 4000-400 cm-1
• 400-10 cm-1
La absorción de luz se produce por alteraciones en la vibración de las moléculas
REPASO DE UNIDADES
IR medio
ν = 1/λ Siendo v el número de onda y λ la longitud de onda
Cuanto más fuertes o rígidos son los enlaces químicos mayores son las frecuencias observadas.
Las masas atómicas menores tienden a originar frecuencias mayores.
Predicciones del modelo clásico
H2O vs. D2O
Ejemplo:
m1 y m2 representan la masa de los átomos y la constante k se relaciona a la rigidez del enlace
Regla de selección
Regla de selección: Para que la molécula sea visible en el infrarrojo el momento dipolar de la misma debe cambiar durante la vibración.
N
N
N2 H2O
NO VISIBLE VISIBLE
Las vibraciones simétricas son más débiles que las asimétricas. Ejemplo C-C o N-N cuyas bandas son débiles. Como regla general cuanto mayor sea el cambio del momento dipolar, mayor es la intensidad de la banda infrarroja asociada a la vibración.
Los modos normales de vibración, son los tipos de vibraciones fundamentales que se pueden presentar en las moléculas.
El número de modos independientes de vibración en una molécula de N átomos se calcula asumiendo que el movimiento de cada átomo se puede describir en términos de desplazamientos a lo largo de tres direcciones espaciales, de modo que tendremos 3N desplazamientos a considerar.
Dependiendo de si el modo vibra en fase o no se dice que son simétricos o asimétricos.
El principio de la técnica se basa en la absorción de radicación IR.
FUENTE RADIACIÓN INCIDENTE
MUESTRA RADIACIÓN TRANSMITIDA
DETECTOR
Una parte de la radiación es absorbida por la muestra y la luz transmitida es medida por el detector
T= It Io
A= -log (T)
Interferómetro de Michelson
Interferencia destructiva
Interferogramas obtenidos para una radiación monocromática (a) y policromática (b)
Solución Finita
Transformada de Fourier
Apodización
Box-Car
Triangular
Happ-Genzel
Transmisión
Pastilla de KBr y mull Sólidos
Líquidos
Gases
Ventanas, celdas de volumen fijo y método “sandwich”
Celdas de gases
Sólidos
9-10 Ton y 2 Ave María (2 min)
Método de la pastilla de KBr
Sólidos Pastilla de KBr
Es el método más utilizado para la caracterización de sólidos. Tradicional. Actualmente el aceptado en el análisis farmacéutico Es sencillo. Produce buenos espectros en general, aunque depende de la calidad de la pastilla. La reproducibilidad de los anchos de las bandas y la línea de base puede variar dependiendo del nivel de rugosidad de la pastilla y el ancho de la misma.
El efecto de Christiansen es el incremento en la transmitancia de un polvo cristalino en las longitudes de onda donde los índices de refracción de la matriz iguala a la de la muestra.
Christiansen effect
Algunos problemas
Christiansen effect
Afecta la intensidad relativa de las bandas de absorción.
Puede minimizarse utilizando espesores pequeños de pastillas.
Sólidos
Mull
Nujol o parafina líquida
Fluorolube
Mull
Líquidos
El agua es uno de los principales inconvenientes para trabajar en líquidos
H2O
D2O
Líquidos
Método “Sandwich”
Útil para el análisis rápido de líquidos Consiste en depositar una gota de la muestra entre dos ventanas Cualitativo
Ventana de espacio controlado
Puede presentar problemas durante el armado del dispositivo de medida Es necesario medir el paso óptico Cuantitativo
Ventana de espacio controlado
Ventana de espacio controlado
Gases
A menor densidad de los gases se necesita un mayor camino óptico. Típicamente puede estar entre 5 y 10 cm.
ATR: Reflexión total atenuada
Muestra
dp
n1
n2
n2 > n1
n1 y n2 corresponden a los índices de la muestra y el cristal
Profundidad de penetración del rayo
ATR
Índice de refracción
de la muestra
Profundidad del haz
Ángulo de incidencia
Cambia el ángulo límite
ATR
La absorbancia medida depende de la penetración de la muestra y del número de reflexiones de la muestra, que a su vez se relacionan con número de onda, el ángulo de incidencia del haz de luz y la relación de los índices de refracción
Número de onda
Profundidad del haz
Absorbancia
El efecto puede ser compensado por software
ATR
Ángulo de incidencia
Número de reflexiones
Absorbancia
Profundidad del haz
Absorbancia
ATR
Contacto de la muestra con el cristal
Ventajas
Rápida: no se necesita preparar la muestra Útil para todo tipo de muestras: opacas, cristales, polvos hormigón Mejora la reproducibilidad, minimiza variaciones de espectros por parte del usuario. Espectros de alta calidad.
Desventajas
La muestra puede formar una película sobre el cristal Necesidad de medir toda la muestra y no solo las primeras dos micras Demostrar que el cristal está limpio el cristal se puede romper la alineación puede cambiar La sensibilidad es menor a los métodos de transmisión
Reflexión especular y difusa
Reflexión especular
Ideal para la caracterización de superficies pulidas. Comúnmente usadas en films y muestras liquidas bañando una superficie de teflón como soporte. Útil para medidas de capas finas o mono capas.
Ventajas
Desventajas
Los espectros dependen del índice de refracción Las superficies deben ser como espejos
Reflexión difusa
La muestra debe generalmente diluirse con KBr. Los espectros son buenos si la muestras son homogéneas. La preparación de la muestra puede ser trabajosa y los espectros pueden verse distorsionados.
Reflexión difusa
R:= Reflectancia absoluta c:=Concentración de la muestra k:=Coeficiente de absorción molar
La luz recibida por el detector es una combinación de la luz reflejada y la luz trasmitida por la partícula
Utilizada para el análisis de fibras, polvos, granos, polímeros, jabones, etc.
Desventaja: Los espectros pueden aparecer muy distorsionados
Intensidades de la señal
• En una primera aproximación son función de
la vibración y el grupo funcional.
• La intensidad exacta es función de la
molécula y la matriz.
• No hay reglas directas de cuantificación, ya
sea para moléculas o grupos funcionales.
¿Qué esperamos de un espectro infrarrojo?
El espectro debe ser preciso, reproducible
Fuentes de imprecisión
Ruido
Distorsiones
Deriva (cambios del instrumento con el tiempo de uso).
Usuario
Infrarrojo en el análisis
Análisis cuantitativo
Determinación de concentraciones u otras
propiedades
Análisis cualitativo
Determinación de la estructura
Seguimiento de reacciones
Identificación de muestras desconocidas
Confirmación de identidad
Análisis cualitativo
No es el objetivo del análisis asignar cada banda.
Es útil saber que grupo funcional corresponde a
cada banda de forma general.
Existen tablas que permiten correlacionar las
bandas de absorción de varios grupos funcionales
Límite de detección
Depende de la muestra
Para sólidos basta con 10mg de muestra en general.
En líquidos es capaz de detectar concentraciones del orden de las ppm
En gases es capaz de detectar concentraciones del orden de las ppb
Factores que complican la interpretación de un espectro infrarrojo
Sobretonos y superposición de bandas
Resonancia de fermi
Acoplamiento de vibraciones
Bandas de Vibración-rotación (solo en gases)
Absorción de H2O y CO2
Sobretonos y superposición de bandas
Resonancia de fermi
La frecuencia fundamental y la del sobretono deben ser cercanas. La frecuencia fundamental y la del sobretono deben tener la misma simetría. Las vibraciones tienen que estar acopladas espacialmente
H2O
CO2
H2O
H2O
CO2
Bandas de Vibración-rotación (solo en gases)
Señales de CO2
•Aparece en regiones del espectro donde no aparecen señales de
compuestos.
•En general no molesta.
Señales del H2O
•Posición de todas las señales conocida.
•En general pueden coincidir con las señales de los compuestos que
vamos a medir.
•Puede aparecer como ruido en el espectro.
•Se puede eliminar su contribución de varias maneras: Restándolas
del blanco, compensación por software, utilizando una purga previa
con nitrógeno o un gas noble.
Espectro con vapor de agua Espectro con aire seco
Parámetros de medida
•Resolución •Número de barridos •Apertura •Apodización
Resolución
Suficiente para obtener la información buscada. Considerar que cuanto mayor es la resolución , mayor es el ruido asociado. No tomar más datos de los necesarios.
Gases: 1-2 cm-1 Líquidos 2-4 cm-1
Sólidos: 2-4 cm-1
En general
Resolución
280528202835285028652880289529102925294029552970298530001/cm
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
3
3,25
Abs
290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
2,8
3
3,2
3,4
Abs
280528202835285028652880289529102925294029552970298530001/cm
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
Abs
290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm
1,65
1,8
1,95
2,1
2,25
2,4
2,55
2,7
2,85
Abs
290129042907291029132916291929222925292829312934293729401/cm
1,6
1,8
2
2,2
2,4
2,6
2,8
3
3,2
3,4
Abs
Cut 1Cut
Res 0.5cm-1 1scan
Res 0.5cm-1 10scan
652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm
0,075
0,15
0,225
0,3
0,375
0,45
0,525
0,6
0,675
Abs
652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
Abs
652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
Abs
4 cm-1
0.5 cm-1
2 cm-1
PARAFILM
1 scan
Resolución
PARAFILM
652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm
0,075
0,15
0,225
0,3
0,375
0,45
0,525
0,6
0,675
Abs
0.5 cm-1
652,5660667,5675682,5690697,5705712,5720727,5735742,57501/cm
0,075
0,15
0,225
0,3
0,375
0,45
0,525
0,6
0,675
Abs
0.5 cm-1
10 scans 1 scan
Resolución
•Debe ser la adecuada. •Preguntarme que tan relevante es para el análisis. •Compromiso señal ruido. •Tiempo de espera.
Número de barridos
•Suficiente para obtener una relación señal ruido aceptable. • El ruido decrece con la raíz cuadrada del número de barridos. •Incrementar los barridos en un factor de 4X. •El número de barridos en el blanco y la muestra debe ser el mismo
400600800100012001400160018002000240028003200360040001/cm
-0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
Abs
20100911as prepared60620100911as prepared61720100911as prepared61120100911as prepared60920100911as prepared608
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
4054204354504654804955105255405555705856006156306451/cm
-0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
Abs
1 scan 5 scans 10 scans
20 scans 40 scans 80 scans
160 scans
2 cm-1
Apertura
Diámetro impuesto en el haz de luz infrarroja. El valor de la apertura puede afectar la exactitud de la escala de frecuencia. El instrumento viene programado para seleccionar la apertura óptima de acuerdo al valor de resolución. Puede ser necesario modificarlo si el diámetro de la muestra elegida es menor que la apertura, para evitar la incidencia de “luz fantasma”.