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Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
NUEVAS METODOLOGÍAS ELECTROANALÍTICAS
BASADAS EN NANOMATERIALES PARA LA DETECCIÓN
Y CONTROL DE COMPUESTOS DE INTERÉS
AGROALIMENTARIO
ANA MARÍA BUENO SANZ
Tesis Doctoral
Ciudad Real, 2013
Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
NUEVAS METODOLOGÍAS ELECTROANALÍTICAS
BASADAS EN NANOMATERIALES PARA LA DETECCIÓN
Y CONTROL DE COMPUESTOS DE INTERÉS
AGROALIMENTARIO
Por
Ana María Bueno Sanz
Visado en Ciudad Real a 19 de Diciembre de dos mil trece
Fdo.: Ángel Ríos Castro Catedrático del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la UCLM. Trabajo presentado para optar
al Grado de Doctor en Química
Fdo.: Ana María Contento Salcedo Profesora Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la UCLM.
Fdo.: Ana María Bueno Sanz
Licenciada en Química
Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
Dª. Juana Rodríguez Flores, Catedrática de Universidad y Secretaría del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la
Universidad de Castilla-La Mancha.
CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “Nuevas
metodologías electroanalíticas basadas en nanomateriales para la
detección y control de compuestos de interés agroalimentario” constituye la Tesis Doctoral que presenta Dª. Ana María Bueno Sanz, para aspirar al Grado de Doctor en Química, y que ha sido realizada en el Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos, cumpliendo todos los requisitos necesarios, bajo la dirección del Dr. D. Ángel Ríos Castro y la Dra. D ª. Ana María Contento Salcedo. Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a 19 de diciembre de dos mil trece.
VºBº
Fdo.: Ana Isabel Briones Pérez Fdo.: Juana Rodríguez Flores Directora del Departamento Secretaria del Departamento
Llegado este momento crucial en el que finalizo la presente
Tesis doctoral, montones de palabras se agolpan en mi mente fruto de
la increíble experiencia que he vivido durante estos años. Pienso que
la realización del doctorado es algo muy importante en la vida de una
persona, tanto por la valiosa formación que se adquiere como por el
grado de madurez personal que se consigue. En mi caso particular,
embarcarme en estos estudios ha supuesto un punto de inflexión en
mi vida, ya que ésta ha dado un giro de 360 grados, siendo en la
actualidad una persona completamente diferente a la que con tanta
ilusión empezó estos estudios. A consecuencia de las diferentes
situaciones que he vivido durante este tiempo, mi forma de pensar y
sentir ha evolucionado gradualmente hasta culminar en lo que hoy
represento, con unos valores fuertemente construidos y una voluntad
firmemente establecida. En la vida siempre he creído en el lado
positivo de las cosas, y en el carácter regenerador de la desgracia, por
lo que hoy en día puedo afirmar que me siento plena y orgullosa tanto
de mi persona y de los logros conseguidos, como de las maravillosas
personas que forman parte de mí vida.
No puedo comenzar estos agradecimientos sin nombrar a D.
Ángel Ríos, mi director de Tesis, al cual conocí afortunadamente
cuando yo tenía todas mis fuerzas puestas en poder realizar estos
estudios, y me brindó la valiosa oportunidad de cumplir mis sueños.
Muchas trabas nos hemos encontrado durante este camino pero
gracias a su férrea personalidad, su extensa experiencia y su
incalculable grado de conocimientos hemos conseguido juntos
culminar este proyecto. Siento muchísima admiración hacia su
persona y hacia su inagotable capacidad de trabajo, y le agradezco
enormemente la confianza que ha depositado en mí hasta el último
momento.
AGRADECIMIENTOS
Para Dª. Ana Mª Contento, mi co-directora de Tesis, solo tengo
palabras de agradecimiento. En una situación crucial durante el
desarrollo de mis estudios creyó en mí y accedió a ayudarme y, gracias
a su profesionalidad y a su buen hacer, la culminación de esta Tesis ha
sido posible. Muchos han sido los momentos de comprensión y apoyo
que guardo en mi memoria, no pudiendo olvidar que me ha hecho
sentir valorada y querida en todo momento.
Muy importantes en esta etapa de mi vida han sido Dª.
Carmen Cámara y Dª. Enriqueta Arias, por su valioso apoyo y
acertados consejos. Son dos grandes profesionales y excelentes
personas. Sin su ayuda hubiera sido mucho más difícil este camino.
Nunca tendré suficientes palabras de agradecimiento para ellas.
He conocido a muchas personas que como yo estaban
realizando el doctorado y que por tanto hemos compartidos muchos
momentos, tanto en el día a día como en congresos, actividades y
otros eventos. Les quiero recordar con estas palabras, y en especial a
Miguel, mi “becario” de la última parte experimental y amigo, por su
agradable compañía y buen trabajo. Le agradezco los buenos
momentos que hemos pasado juntos “luchando” en el laboratorio, y
como él ya sabe, parte de esta Tesis doctoral también es suya.
También quiero agradecer a todo el personal del
departamento de Química Analítica tanto de la Universidad de Castilla
La Mancha como de Alcalá de Henares su colaboración al desarrollo de
esta Tesis Doctoral, sin olvidar al personal externo al departamento
que me ha hecho tan agradable los días y a los que voy a echar mucho
de menos. Es el caso de Teresa y María, que han sido como mis
madres y amigas manchegas.
De mi familia poco puedo decir sin que me broten las lágrimas.
Lágrimas de alegría por tener la gran suerte de tenerlas a mi lado,
siempre y de forma incondicional. Nunca han dudado de mí y de mis
capacidades, y han sabido en todo momento actuar y decirme las
palabras adecuadas para motivarme en este duro proyecto. Sin lugar a
dudas ellas, con su apoyo moral, han hecho posible esta Tesis, porque
me han levantado cada vez que me he derrumbado. Son los pilares de
mi vida y me siento plenamente orgullosa de ellas, de mi madre
Marisa y de mi hermana Irene. Os quiero, incalculable es el amor que
me habéis dado en los difíciles momentos. Lo sabéis, ésta Tesis es de
las tres.
Por último quiero recordar a mis amigos, aquellos que se han
mantenido en el tiempo y siempre han estado cuando los he
necesitado. A Pedro, Pila, Henar y Eva, por los buenos momentos
vividos y los que vendrán. Y no menos importantes aquellos que han
aparecido en mi vida durante estos años completándola. Lina, que
siendo tan diferente a mí me complementa y alegra los días. Y Javi,
que con sus palabras siempre me siento admirada y querida. Gracias
por estar ahí.
Índice
ÍNDICE
12
ÍNDICE
13
PRESENTACIÓN 15
OBJETO 19
ACRÓNIMOS 23
INTRODUCCIÓN 27
CAPITULO I. PARTE EXPERIMENTAL 141
I.1. Reactivos y disoluciones
I.2. Materiales y equipamiento
I.3. Métodos
CAPÍTULO II. METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS
DE SCREENING 155
II.1. Técnicas de screening en Química Analítica
II.2. Rapid voltammetric screening test for dietary
antioxidant compounds using screen-printed
multiwalled-carbon nanotubes electrodes
II.3. Validation of a screening method for rapid control of
sulfonamide residues based on electrochemical
detection using multiwall carbon nanotubes-glassy
carbon electrodes
ÍNDICE
14
CAPÍTULO III. METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS
CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN 225
III.1. Cromatografía Líquida acoplada a detección
electroquímica
III.2. Determination of sulfonamides in milk samples by
high pressure liquid chromatography with
amperometrics detection using a multiwall carbon
nanotubes-glassy carbon electrode
III.3. Determination of mutagenic amines in water and
food samples by high pressure liquid chromatography
with amperometrics detection using a multiwall carbon
nanotubes-glassy carbon electrode
CONCLUSIONES 295
CURRICULUM VITAE 299
Presentación
PRESENTACIÓN
16
PRESENTACIÓN
17
La presente Memoria recoge los resultados, discusiones
y conclusiones que se han obtenido durante los trabajos de
investigación llevados a cabo en esta Tesis Doctoral. Se trata de
nuevas metodologías electroanalíticas basadas en
nanomateriales para la detección y control de compuestos de
interés agroalimentario. Los trabajos se han desarrollado de
forma mayoritaria en el Departamento de Química Analítica y
Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Castilla La
Mancha, habiéndose realizado una estancia pre-doctoral en el
Departamento de Química Analítica e Ingeniería Química de la
Universidad de Alcalá.
La Memoria está estructurada en una Introducción
donde se presentan los nanomateriales dentro del contexto de
la Nanociencia y la Nanotecnologías analíticas, centrándose en
las estructuras de los nanotubos de carbono, ya que son los
nanomateriales empleados en los trabajos experimentales
desarrollados. Del mismo modo se tratan las técnicas
electroquímicas existentes y aplicadas en las metodologías
propuestas, orientadas al control de productos
agroalimentarios. La introducción incluye un review que
contiene información sobre todos estos aspectos, haciendo un
análisis crítico sobre los mismos, y una descripción detallada de
los compuestos estudiados. Adicionalmente, en cada capítulo,
se han llevado a cabo introducciones más específicas y
detalladas.
En el Primer Capítulo se detallan los reactivos y
materiales empleados, así como la instrumentación manejada
para el desarrollo de todos los trabajos experimentales. Los dos
siguientes capítulos proporcionan el núcleo central de
resultados de esta Memoria, compilados en estilo de
publicación (en revistas científicas).
PRESENTACIÓN
18
El Segundo Capítulo, titulado “Metodologías analíticas
basadas en técnicas de screening”, comienza con una
introducción relativa a los métodos cualitativos de análisis
(métodos de screening) y está integrado por los resultados
obtenidos en dos trabajos experimentales:
a. Rapid voltammetric screening test for dietary
antioxidant compounds using screen-printed
multiwalled-carbon nanotubes electrodes.
b. Validation of a screening method for rapid control of
sulfonamide residues based on electrochemical
detection using multiwall carbon nanotubes-glassy
carbon electrodes.
En el Tercer Capítulo, cuyo título es “Metodologías
analíticas basadas en técnicas confirmativas por cromatografía
líquida de alta resolución”, se realiza una breve introducción
sobre el acoplamiento HPLC –ED basado en las técnicas que
comportan los dos trabajos experimentales incluidos en este
capítulo:
a. Determination of sulfonamides in milk samples by
HPLC with amperometric detection using a multiwall
carbon nanotubes-glassy carbon electrode.
b. Determination of mutagenic amines in water and food
samples by HPLC with amperometric detection using a
multiwall carbon nanotubes-glassy carbon electrode.
Tras estos capítulos experimentales se presenta un
último apartado, Conclusiones, donde se reflejan los hitos más
relevantes derivados del conjunto de investigaciones que
forman parte de esta Memoria.
Objeto
OBJETO
20
OBJETO
21
Esta Tesis Doctoral tiene por objeto el desarrollo de nuevos
métodos analíticos basados en técnicas electroanalíticas para el
control y detección de compuestos de interés agroalimentario. Los
compuestos estudiados abarcan un amplio espectro, comprendiendo
compuestos polifenólicos o antioxidantes naturales, agentes
antibacterianos como las sulfonamidas y compuestos mutagénicos
como las aminas aromáticas heterocíclicas.
Una parte de las nuevas metodologías de análisis que se han
desarrollado encajan en la modalidad de métodos de “screening”, ya
sea por generar directamente una respuesta binaria de tipo cualitativo
(clasificación de muestras), o porque proporcionan una información
rápida y aproximada de determinados componentes de la muestra.
Para el desarrollo de éstas técnicas se ha recurrido a sistemas de flujo
y a dispositivos miniaturizados. La otra parte de las nuevas
metodologías que comprenden esta Memoria pertenece a la
modalidad de técnicas confirmativas, las cuales aportan información
precisa y sensible para la identificación y cuantificación de los
compuestos de estudio. Dentro de esta modalidad se ha recurrido a la
cromatografía de alta resolución como técnica analítica de separación.
Los nuevos métodos analíticos establecidos se basan en el
empleo de nanomateriales (en particular nanotubos de carbono) con
el propósito de mejorar la sensibilidad y los límites de detección y
cuantificación de las técnicas empleadas, de manera que se puedan
satisfacer los requerimientos legislativos existentes relativos a los
compuestos de estudio. Desde este punto de vista, las nuevas
metodologías desarrolladas se engloban dentro del campo de la
Nanotecnología y pertenecen, por tanto, a una de las importantes
tendencias actuales dentro del ámbito científico de la Química
Analítica.
OBJETO
22
23
Las abreviaturas utilizadas en esta Memoria son las siguientes,
utilizando las iniciales en inglés:
ACN: Acetonitrilo
AdSV: Voltametría de redisolución adsortiva
Amp: Amperometría
ASV: Voltametría de redisolución anódica
AαC: 2-amino-9H-pirido[2,3-b]indol
BDD: Electrodo de diamante dopado con boro
CE: Electroforesis capilar
C.E.: Contraelectrodo
CS: Citosan
CFME: Microelectrodo de fibra de carbono
CNTs: Nanotubos de carbono
CPE: Electrodo de pasta de carbono
CSPE: Electrodo serigrafiados de tinta de carbono
CV: Voltametría cíclica
DMF: Dimetilformamida
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPV: Voltametría diferencial de impulsos
DWCNT: Nanotubos de carbono de pared doble
ED: Detección electroquímica
ENMs: Nanomateriales de ingeniería
FD: Detección fluorescente
FET: Transistor de efecto campo
FIA: Análisis por inyección en flujo
GC: Cromatografía de gases
GCE: Electrodo de carbono vitrificado
Acrónimos
24
GCE-CNTs: Electrodo de carbono vitrificado modificado con nanotubos
de carbono
H: 1-metil-9H-pirido[3,4-b]indol
HAAs: Aminas heterocíclicas aromáticas
HAP: Hidroxiapatita nanoestructurada
HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución
IARC: Agencia internacional para la investigación del cáncer
ISE: Electrodo de ión selectivo
LC: Cromatografía líquida
LOD: Límite de detección
LOQ: Límite de cuantificación
LSRP: Resonancia de plasmón superficial localizado
LSV: Voltametría de barrido lineal
MBs: Nanopartículas magnéticas
MeAαC: 2-amino-3-metil-9H-pirido[2,3-b]indol
MECK: Cromatografía electrocinética micelar
MFNP: Nanopartículas multifuncionales de campo magnético
MIP: Polímero de impronta molecular
MS: Espectrometría de masas
MWCNT: Nanotubos de carbono de pared múltiple
MWCSPE: Electrodo serigrafía de tinta de carbono con nanotubos de
pared múltiple
NCs: Nanocanales
NH: 9H-pirido[3,4-b]indol
NIR: Infrarrojo cercano
Nf: Nafión
NMs: Nanomateriales
NMNs: Nanomateriales de metales nobles
NP: Nanopartícula
NS: Sílice nanoporoso
NWs: Nanohilos
25
QDs: quantum dots
R.E.: Electrodo de referencia
ROS: Especies reactivas de oxígeno
RSD: Desviación estándar relativa
SAA: Sulfanilamida
SAAs: Sulfonamidas
SD: Desviación estándar
SDZ: Sulfadiazina
SGZ: Sulfaguanidina
SMZ: Sulfamerazina
SPE: Extracción en fase sólida
SPR: Resonancia de plasmón superficial
STZ: Sulfatiazol
SXZ: Sulfisoxazol
SWCNT: Nanotubos de carbono de pared simple
SWCSPE: Electrodo serigrafiado de tinta de carbono con nanotubos de
pared simple
SWV: Voltametría de onda cuadrada
Trp-P-1: Acetato 3-amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indol
Trp-P-2: 3-amino-1-metil-5H-pirido[4,3-b]indol
UV: Detector ultravioleta visible
W.E.: Electrodo de trabajo
26
Introducción
INTRODUCCIÓN
28
INTRODUCCIÓN
29
1. NANOCIENCIA Y NANOTECNOLOGÍA
1.1. GENERALIDADES
La Nanociencia y la Nanotecnología están siendo ampliamente
estudiadas en la actualidad debido al gran potencial que tienen al
brindar una gran cantidad de beneficios a muchas áreas de
investigación. La Nanociencia se puede definir como la manipulación y
el estudio de materiales a escala atómica, molecular y
macromolecular, donde las propiedades difieren significativamente de
las análogas a escala mayor. Por otra parte, la Nanotecnología
comprende el diseño, caracterización, producción, y aplicación de
estructuras, dispositivos y sistemas mediante el control del tamaño y
la forma a escala nanométrica. Los científicos están interesados en la
nanoescala (comprendida entre 1 y 100 nm), debido a que es en esta
escala donde las propiedades son muy diferentes a las presentes a
escala macro. En algunos sentidos, la Nanociencia y la Nanotecnología
no son nuevas, ya que, por ejemplo, en los últimos 20 años se han
estado creando características miniaturizadas en los chips de los
computadores. Sin embargo, los avances realizados en las
herramientas que ahora permiten que los átomos y moléculas sean
examinados y probados con gran precisión, han permitido la
expansión y el desarrollo de la Nanociencia y las Nanotecnologías [1].
Un aspecto sustancial de la Nanociencia y la Nanotecnología es
su carácter multidisciplinar. Físicos, químicos e ingenieros son los
científicos y profesionales más directamente relacionados. Pero debe
constatarse también su convergencia con otras áreas tales como las
Tecnologías de la Información y Comunicación (TICs), Biotecnología y
Ciencia de los Materiales, Medicina, Farmacia, Agroalimentación y
diversos tipos de industrias como la Textil y la Energética, lo que
amplía considerablemente el número y tipo de profesionales
INTRODUCCIÓN
30
potencialmente implicados. De hecho, puede afirmarse que lo más
extraordinario de la nanotecnología es que no es una tecnología
aislada, sino que su carácter transversal la convierte en un campo de la
ciencia del que se pueden extraer soluciones a un amplio rango de la
actividad humana, desde la alimentación a la energía, pasando por la
medicina, aeronáutica, moda, industria militar, construcción, etc [2].
Actualmente, los científicos debaten las implicaciones futuras
de la nanotecnología. Como toda tecnología emergente, el impacto
socio-económico de la Nanotecnología será elevado, pero un aspecto
más básico es el tratado en la obra “Nanoethics” [3]. Por ejemplo, la
privacidad de las personas puede verse afectada por el uso masivo de
nanosensores indetectables. Al igual que la Automatización y la
Informática cambiaron sustancialmente la vida de las personas, es de
prever un cambio de profundidad muy superior con la Nanotecnología.
Es obvio que los agentes sociales estén preocupados por las
repercusiones de la nueva tecnología, no sólo en la Biomedicina [4],
donde las expectativas de mejora de enfermedades son elevadas, sino
también en las posibles connotaciones negativas centradas en la
contaminación medioambiental y la posible toxicidad derivadas de la
fabricación y uso de los nanomateriales. La preocupación de los
gobiernos por este tema es elevada [5], al igual que la de diferentes
organizaciones científico-técnicas prestigiosas [6]. Es una temática en
la que, pese a los intensos esfuerzos de los últimos años, no se ha
logrado establecer un marco genérico fiable. No cabe duda de que se
trata de una asignatura pendiente de la Nanotecnología, que es clave
para su consolidación futura.
INTRODUCCIÓN
31
1.2. EVOLUCIÓN HISTÓRICA
Los conceptos que promovieron la nanotecnología se
discutieron por primera vez en 1959 por el famoso físico Richard
Feynman, en su charla “Hay mucho sitio al fondo”, en la que se
describe la posibilidad de síntesis a través de la manipulación directa
de los átomos. Inspirado en conceptos de Feynman, K. Eric Drexler en
1986 utilizó independientemente el término " Nanotecnología " en sus
Motores de la Creación : la próxima era de la nanotecnología ,
proponiendo la idea de un " ensamblador " nanoescala, que sería
capaz de construir una copia de sí mismo y de otros elementos de
complejidad arbitraria con el control atómico. También en 1986,
Drexler co-fundó el Instituto Foresight para ayudar a aumentar la
conciencia pública y la comprensión de los conceptos de la
nanotecnología y sus implicaciones. Por lo tanto, la aparición de la
nanotecnología como campo, se produjo en la década de 1980 a
través de la convergencia de la obra teórica y pública de Drexler (que
desarrolló y popularizó un marco conceptual para la nanotecnología),
y los avances experimentales de alta visibilidad que llamó la atención a
gran escala sobre las perspectivas del control atómico de la materia.
Por ejemplo, la invención del microscopio de efecto túnel en 1981
proporcionó la visualización sin precedentes de los átomos y enlaces
individuales, y se utilizó con éxito para manipular átomos individuales
en 1989. Los desarrolladores del microscopio, Gerd Binnig y Heinrich
Rohrer en el Laboratorio de Investigación de IBM de Zurich, recibieron
el Premio Nobel de Física en 1986 [7]. Binnig , Quate y Gerber también
inventaron el microscopio de fuerza atómica análoga ese año.
Otro hito importante en la evolución histórica de la
nanotecnología fue el descubrimiento de los fullerenos en 1985 por
Harry Kroto , Richard Smalley y Robert Curl, quienes juntos ganaron el
Premio Nobel de Química de 1996 [8, 9]. En los inicios de los 2000s, el
INTRODUCCIÓN
32
campo obtuvo mayor atención científica, política y comercial,
llevándolo tanto a la controversia como al progreso. Las controversias
surgieron con respecto a las definiciones y las posibles repercusiones
de las nanotecnologías, ejemplificados por el informe de la Royal
Society sobre nanotecnología [1]. Mientras tanto, la comercialización
de productos basados en los avances en las tecnologías de nanoescala
comenzó a emerger. Estos productos se limitan a aplicaciones al por
mayor de los nanomateriales y no implican el control atómico de la
materia. Algunos ejemplos incluyen el uso de las nanopartículas de
plata como agentes antibacterianos, protectores solares transparentes
basados en nanopartículas y nanotubos de carbono resistentes a las
manchas para los textiles [10]. Los gobiernos se trasladaron a
promover y financiar la investigación en nanotecnología, comenzando
en EE.UU. con la Iniciativa Nacional de Nanotecnología , que formalizó
una definición de la nanotecnología basada en el tamaño, y la
financiación para la investigación a escala nanométrica. Los proyectos
surgieron para producir hojas de ruta de la nanotecnología [11], que
se centraron en la manipulación de la precisión atómica de la materia
y en analizar las capacidades, metas y aplicaciones existentes y
previstas.
1.3. NANOCIENCIA Y NANOTECNOLOGÍA ANALÍTICAS
El avance actual de la Química Analítica pasa, en gran medida,
por incorporar la Nanociencia y la Nanotecnología. En un pasado
reciente, la Química Analítica ha incorporado plenamente otros
avances científico-técnicos tales como la informática, la
automatización, la miniaturización y la simplificación. El carácter
transversal de la Nanociencia y la Nanotecnología puede favorecer
también la consolidación de estos avances, además de abrir nuevas
rutas insospechadas que implican la explotación de las excepcionales
INTRODUCCIÓN
33
propiedades de la nanomateria. Así se muestra gráficamente en la
Figura 1.1 [2], en la que se visualiza el papel múltiple que tiene la
Nanociencia y la Nanotecnología en la Ciencia Analítica. Por una parte,
hay que considerar el impacto directo (Figura 1.1.A), es decir, la
aportación de desarrollos innovadores basados en la explotación de
las propiedades excepcionales de la nanomateria y en la reducción del
tamaño. En muchos casos el impacto es indirecto (Figura 1.1.B), es
decir, a través de aportaciones directas a otros avances científico-
técnicos que repercuten indirectamente en la Química Analítica.
Figura 1.1. Papel múltiple de la Nanotecnología en la Ciencia Analítica: A)
Impacto directo; y B) Impacto indirecto a través de su papel en soporte de
otros avances científico-técnicos [2].
En cualquier caso, se mejoran las propiedades analíticas tanto
supremas (exactitud, representatividad) como básicas (precisión,
sensibilidad y selectividad) y productivas (rapidez, costes y factores
personales) y sus relaciones entre sí [12], no sólo para la mejora de
procesos analíticos ya descritos, sino también para desarrollar
INTRODUCCIÓN
34
metodologías analíticas innovadoras que traten de resolver problemas
analíticos inabordables sin la aproximación nanotecnológica.
Las posibilidades que surgen al introducir la Nanociencia y la
Nanotecnología en el ámbito químico-analítico son variadas y
múltiples [13]. Para evitar confusiones deben delimitarse los campos
de acción que surgen. Para ello, se ha optado por usar una
clasificación múltiple basada en cuatro criterios complementarios, que
se muestran esquemáticamente en la Figura 1.2 [2].
El primer criterio (Figura 1.2.1) tiene en cuenta el tipo de
materia analizada, que puede ser convencional (de tamaño macro y
micro), o bien nanomateria. El segundo criterio (Figura 1.2.2) tiene en
cuenta la consideración analítica de las nanopartículas y del material
nanoestructurado que pueden ser objetos, es decir, analitos (por
ejemplo nanopartículas magnéticas, nanopartículas semiconductoras,
nanotubos de carbono, nanodiamantes, etc.) [14], o bien para el
desarrollo de herramientas del proceso analítico (por ejemplo
desarrollo de sensores ópticos, desarrollo de fases estacionarias en
cromatografía y pseudoestacionarias en electroforesis capilar,
sensores electroquímicos, sensores mecánicos, etc.) [15]. Esta
clasificación está muy relacionada con la primera, tal como se muestra
en la Figura 1.2. Los criterios 3 (Figura 1.2.3) y 4 (Figura 1.2.4) se basan
en la explotación en el ámbito analítico, o bien de las excepcionales
propiedades de la nanomateria, en la explotación del nanotamaño, o
en ambas, lo que da lugar a la definición de tres tipos de sistemas
analíticos relacionados con la Nanociencia y la Nanotecnología:
INTRODUCCIÓN
35
Figura 1.2. Clasificaciones inherentes a la Nanociencia y Nanotecnología
Analítica teniendo en cuenta cuatro criterios: 1) Tipo de análisis; 2) Según
la consideración de la nanomateria; 3) Según se exploten o no las
propiedades de la nanomateria; y 4) Según la explotación o no del
nanotamaño [2].
a. Sistemas analíticos nanotecnológicos, que se basan en las
propiedades excepcionales de la nanomateria, aunque estén
en micro/macrosistemas analíticos; tal es el caso de un
microscopio de fuerzas atómicas, cuya punta de barrido se ha
realizado con un nanotubo de carbono con el fin de mejorar la
resolución del sistema. Otro ejemplo podría ser un
nanoelectrodo, donde el propio nanotubo de carbono es el
electrodo [16]. En estos sistemas sólo el elemento de
reconocimiento presenta tamaño nanométrico.
b. Sistemas analíticos nanométricos, que son aquellos que
explotan la dimensión en la nanoescala para la mejora del
proceso analítico en alguna de sus facetas; tal es el caso de un
INTRODUCCIÓN
36
sistema de nano-chip-LC, que explota las ventajas de trabajar
con nanoflujos [17].
c. Nanosistemas analíticos, que corresponden a una situación
ideal: nanotamaño y explotación de las propiedades del
nanomundo. En realidad, se trata de una combinación de los
dos anteriores; en este ámbito básicamente se encuentran
nanosensores (nanopartículas y complejos supramoleculares)
que dan respuesta en la propia matriz de la muestra; tal es el
caso de sistemas supramoleculares que reconocen de forma
selectiva un analito, lo que se traduce en una respuesta
química o física [18].
Así pues, son dos los objetivos en la relación entre la Química
Analítica y la Nanotecnología: alcanzar el tamaño nanométrico
(tendencia en el contexto de la miniaturización) y explotar las
excepcionales propiedades de la nanomateria.
1.4. NANOMATERIALES
Los nanomateriales, por tanto, pueden describirse como
aquellos materiales cuyo tamaño está comprendido entre 1 y 100 nm
en al menos una de sus dimensiones. Los nanomateriales pueden ser
producidos a tamaño nanoescala en una dimensión (por ejemplo,
superficies muy finas), en dos dimensiones (por ejemplo, nanohilos y
nanotubos) o en las tres dimensiones (por ejemplo, nanopartículas).
Existen dos razones fundamentales que explican la diferencia
observada en las propiedades en la nanoescala. En primer lugar, los
nanomateriales presentan mayor área superficial comparada con el
mismo material a escala mayor. Esto puede provocar que los
materiales sean más reactivos químicamente (en algunos casos
materiales inertes en la escala macro son reactivos cuando son
INTRODUCCIÓN
37
producidos en el tamaño de la nanoescala) y afecta a su resistencia
mecánica y propiedades eléctricas. En segundo lugar, el
comportamiento de la materia comprendida en la nanoescala es
dominado por los conocidos efectos quantum, que afectan al
comportamiento óptico, eléctrico y magnético de los materiales.
Los nanomateriales pueden tener un origen natural, es decir,
existir en la naturaleza como tales, por ejemplo coloides orgánicos
(ácidos fúlvicos y húmicos), magnetita, aerosoles (sal de mar), óxidos
de hierro, etc. Pero la revolución nanotecnológica se basa en la
fabricación y elaboración de productos. Las dos aproximaciones para
alcanzar el nanotamaño de objetos o materiales nanoestructurados
son [19, 20]:
a) Estrategia “arriba-abajo” basada en metodologías en las
que se consigue el nanotamaño a partir de un macromaterial, que es
la que más empleada actualmente.
b) Estrategia “abajo-arriba”, que se basa en crear
nanoestructuras complejas a partir de elementos funcionales atómicos
o moleculares de un modo similar a la creación de la vida en nuestro
planeta. Esta opción tiene todavía un grado de desarrollo escaso, pero
constituye sin duda el futuro más prometedor, que requerirá una
etapa intensa de investigación básica.
1.4.1. Clasificación
El rápido crecimiento de la Nanociencia y la Nanotecnología ha
dado lugar a una amplia variedad de nanoestructuras que han sido
clasificadas de modos muy diversos, atendiendo a la homogeneidad, la
naturaleza o composición química, o teniendo en cuenta criterios de
dimensionalidad. Esta última clasificación es la más habitual y se divide
en dos clasificaciones, que tienen en cuenta tanto las dimensiones
estrictas de las nanoestructuras que originan estas propiedades
INTRODUCCIÓN
38
excepcionales como las dimensiones del material donde están las
nanoestructuras. Según el número de dimensiones que se encuentran
en la nanoescala (inferiores a 100 nm), la Royal Society of Chemistry y
la Royal Academy of Engineering [21] distinguieron en 2004 tres tipos
de nanoestructuras:
a. Nanoescala en una dimensión. Se trata de superficies de
espesor nanométrico, como las películas delgadas formadas
por una o varias capas atómicas (por ejemplo láminas de
grafeno).
b. Nanoescala en dos dimensiones, es decir, que la materia
nanoestructurada está desarrollada en dos de las tres
dimensiones espaciales. Tal es el caso de los nanotubos de
carbono, nanotubos inorgánicos, nanoalambres (nanowires),
biopolímeros, etc.
c. Nanoescala en tres dimensiones cuando ésta se desarrolla en
las tres dimensiones espaciales (x, y, z). En este apartado se
encuentran, por ejemplo, las nanopartículas de metales o sus
óxidos y los puntos cuánticos, en el ámbito inorgánico; así
como los fullerenos, y los dendrímeros en el ámbito orgánico,
a la que se puede agregar la de nanoescala a cero
“dimensiones” (por ejemplo material compuesto con
nanopartículas dispersas).
Otros autores [22, 23] han optado por considerar cuatro tipos de
nanoestructuras, de acuerdo con el número de dimensiones de la
materia en la que se encuentra la nanoestructura que sean superiores
a 100 nm, es decir, por encima de la nanoescala:
a. Nanoestructuras 0D. Se trata de un material que está
complementamente nanoestructurado y cuyas dimensiones
globales están también comprendidas en la escala
nanométrica. Así, las nanopartículas metálicas y sus óxidos, los
INTRODUCCIÓN
39
“puntos cuánticos” y los “nanovarillas” pueden considerarse
en este apartado.
b. Nanoestructuras 1D. Una de las dimensiones del material
nanoestructurado es de tamaño micro/macrométrico. Tal es el
caso de los nanotubos de carbono, cuya longitud oscila entre 5
y 15 μm, los nanoalambres y las nanovarillas (nanorods).
c. Nanoestructuras 2D. Una de las dimensiones del material
nanométrico es de tamaño micro/macrométrico, mientras que
las otras dos están comprendidas en la nanoescala. Tal es el
caso de los nanorrecubrimientos superficiales y las películas
delgadas de nanocapas moleculares [24].
d. Nanoestructuras 3D. Las tres dimensiones del material son
superiores a 100 nm, pero está formado por un conjunto de
nanoestructuras de los grupos anteriores. Es decir, se trata de
nanopartículas ensambladas formando bloques de tamaño
micro/macrométrico. Se consideran también en este apartado
los polvos y las estructuras fractales.
En la Figura 1.3. se muestran de forma esquemática las
nanopartículas más ampliamente usadas en Química Analítica, así
como la extensión relativa en que las propiedades químicas, ópticas,
eléctricas, térmicas y magnéticas son explotadas en cada caso [2].
A continuación se expone el papel que juegan las
nanopartículas en diferentes etapas del proceso analítico [2],
atendiendo a los trabajos de investigación existentes:
a. Purificación y preconcentración de analitos
Las propiedades químicas superficiales de las nanopartículas y
su empleo como sorbentes reversibles se han revelado como una de
las aplicaciones más notables. No obstante, existen varios problemas
relacionados con la pureza y homogeneidad de las nanopartículas (lo
INTRODUCCIÓN
40
Figura 1.3. Nanopartículas más utilizadas en Química Analítica en la
actualidad y la proporción relativa en que están involucradas las
propiedades excepcionales de la nanomateria [2].
que da lugar a irreproducibilidades en los porcentajes de retención), la
tendencia a aglomerarse formando agregados (disminuyéndose
drásticamente la superficie específica y, por tanto, su capacidad de
retención), y la reversibilidad completa del doble proceso de
retención/elución de analitos en la superficie de la nanopartícula, ya
que con frecuencia se producen retenciones quasiirreversibles. No
obstante, las ventajas que comportan las nanopartículas como
sorbentes sobrepasan a la de los sorbentes tradicionales. Hasta la
fecha, se han utilizado nanotubos de carbono [25, 26] y MIPs
INTRODUCCIÓN
41
(polímeros de impronta molecular) [27] en la extracción en fase sólida,
y las membranas poliméricas han sido modificadas con nanopartículas,
o bien nanopartículas autoensambladas [28], para potenciar la
retención y/o filtración selectiva de los analitos.
b. Mejora de las separaciones cromatográficas y
electroforéticas
El empleo de nanopartículas para mejorar la resolución
(selectividad) de las separaciones cromatográficas y por electroforesis
capilar es un área prometedora de la Nanotecnología Analítica, ya que
los resultados alcanzados, especialmente cuando están implicados los
nanotubos de carbono o MIPs, son claramente de mayor calidad que
los obtenidos por los sorbentes tradicionales. Generalmente, las
nanopartículas actúan como fases estacionarias o pseudo
estacionarias [29, 30].
c. Mejora de la detección
El empleo de nanopartículas para mejorar la detección
electroquímica y óptica es un área de intensa investigación y
desarrollo en la actualidad en Química Analítica. Entre ellas, las más
usadas son de tipo metálico: nanopartículas de oro y nanocristales
metálicos semiconductores, denominados puntos cuánticos, aunque
también se emplean otros, como los nanotubos. Las nanopartículas
metálicas y los nanotubos de carbono se usan de forma creciente
como parte de los composites en la fabricación de
macro/microelectrodos, donde actúan como mediadores. Los
“nuevos” electrodos presentan ventajas sustanciales, tales como una
gran superficie específica, una baja resistencia a la transmisión
electrónica y una gran capacidad de adsorber o enlazar químicamente
a numerosas biomoléculas y compuestos químicos, que los hacen muy
INTRODUCCIÓN
42
atractivos para mejorar con nitidez las determinaciones analíticas
electroquímicas clásicas [31]. Las nanopartículas minimizan el
deterioro de la superficie del electrodo, incrementan la actividad
electrocatalítica y simplifican el proceso de inmovilización de
biomoléculas en la superficie del electrodo [32]. Recientemente se han
combinado nanotubos de carbono y nanopartículas de oro en la
fabricación de electrodos, encontrándose que así se incrementan
algunas propiedades electrocatalíticas de los mismos [33]. Por otro
lado, la espectroscopia analítica también está tomando un notable
impulso con la implicación de nanopartículas en el proceso de
detección debido a sus excepcionales propiedades ópticas. Dentro de
este campo cabe destacar el ámbito de la fluorescencia donde las
nanopartículas han tenido mayor impacto gracias a los denominados
puntos cuánticos, que ofrecen una elevada fluorescencia nativa con
bandas de emisión muy estrechas, lo que los hace especialmente
adecuados para el desarrollo de sensores ópticos [34, 35].
En la presente Memoria, dentro de todos los tipos de
nanomateriales existentes, se han utilizado los nanotubos de carbono
para la mejora en el proceso de detección electroquímica para la
determinación de diversos analitos de interés dentro del campo
alimentario, por lo que estas nanoestructuras van a ser descritas de
forma detallada en el siguiente apartado.
2. NANOESTRUCTURAS DE CARBONO: NANOTUBOS
Ha habido una gran evolución conceptual desde la química
clásica del carbono a sus formas nanoestructuradas, que suponen
cambios físicos, químicos y físico-químicos espectaculares, que se
reflejan en sus propiedades y aplicaciones. Es la base de la
Nanociencia y Nanotecnología relacionada con el carbono y sus
derivados.
INTRODUCCIÓN
43
2.1. Clasificación nanoestructuras de carbono
No existe una única clasificación consensuada sobre las
nanoestructuras de carbono. Una de las clasificaciones más relevantes
se basa en la dimensión de las estructuras, distinguiéndose cuatro
tipos de nanoestructuras de carbono:
a. Estructuras de cero dimensiones (0D), como los
fullerenos;
b. Estructuras de una dimensión (1D), como los nanotubos
de carbono;
c. Estructuras de dos dimensiones (2D), como el grafeno;
d. Estructuras de tres dimensiones (3D), como los
diamantes.
En la Tabla 2.1. [2] se muestran las dimensiones características
de las nanopartículas de carbono más relevantes. Como se puede
observar, las propiedades excepcionales de la nanoquímica del
carbono no exigen un tamaño nanométrico global, como en el caso de
los fullerenos, ya que los nanotubos de carbono (de pared simple
SWCNTs y de pared múltiple MWCNTs) tienen una de las dimensiones
típicas (la longitud) en la escala micrométrica mientras que el
diámetro es típicamente nanométrico.
Los nanotubos de carbono (CNTs), descubiertos por Iijima
[36], han abierto uno de los campos de aplicación más variados y
prometedores de las nanoestructuras de carbono por sus propiedades
físicas y químicas excepcionales. De hecho, en las dos últimas décadas
han sido objeto de numerosas publicaciones generales incluidas en
artículos de revisión genéricos sobre nanoestructuras de carbono [37-
40], o bien exclusivamente dedicados a su reactividad [41], su síntesis
[42], sus propiedades mecánicas [43], eléctricas [44], biológicas [45],
sus aplicaciones en general [46] y específicas en Química Analítica
INTRODUCCIÓN
44
Tabla 2.1. Tamaño de las nanoestructuras de carbono más
relevantes [adaptada referencia 2].
Nanoestructura de carbono Dimensiones características
Fullerenos Distinto tamaño de C20 a C70 (C60 es el más abundante). C60: diámetro 0.7 – 1 nm.
Nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs)
Diámetro típico: 1 – 10 nm.
Nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs)
Longitud típica: 50 nm – 1 μm.
Diámetro interno: 1 – 10 nm Diámetro externo: 2.5 – 30 nm.
Lámina de grafeno 10 – 15 nm
Nanodiamantes Tamaño medio: 4.5 nm.
[47]. La literatura sobre nanotubos de carbono es sorprendentemente
abundante y crece exponencialmente desde 2001, lo que demuestra el
extraordinario interés que ha despertado entre científicos y
tecnólogos.
Los nanotubos de carbono están compuestos por átomos de
carbono. Su estructura es cilíndrica con dimensiones nanométricas en
su diámetro (1 – 30 nm, según tipo) y nano/micrométricas en su
longitud (10 nm – varios μm). Estructuralmente proceden del
enrollamiento de láminas de grafeno: cuando se trata de una sola
lámina se producen los “nanotubos de carbono de pared simple”
(SWCNTs) y si son varias láminas se obtienen los “nanotubos de
carbono de pared múltiple” (MWCNTs). Se trata de nanoestructuras
de dos dimensiones (2D) con hibridación intermedia entre sp2
INTRODUCCIÓN
45
(diamante) y sp3 (grafito). Estas estructuras se muestran en la Figura
2.1.
(A) (B)
Figura 2.1. Nanotubos de carbono: (A) de pared simple (SWCNTs), (B) de
pared múltiple (MWCNTs).
Existen muchos tipos de nanotubos de carbono, clasificándose de forma principal en base a dos criterios [2]:
a. Según el número de paredes del nanotubo, se distinguen los
de pared simple (SWCNTs), de pared doble (DWNTs) y de
pared múltiple (MWCNTs).
b. Según la forma de enrollamiento de la lámina de grafeno,
que determina el diámetro y la quiralidad del nanomaterial, se
distinguen dos tipos generales de nanotubos de carbono
(quirales y aquirales):
b.1. Nanotubos aquirales, denominados también
“metálicos”.
b.2. Nanotubos quirales o semiconductores.
INTRODUCCIÓN
46
El diámetro y la quiralidad de los nanotubos de carbono
determinan críticamente sus propiedades físicas, químicas y
físico-químicas.
Las propiedades excepcionales de los nanotubos son las
responsables de su importancia en el ámbito científico. Estas
propiedades, que dependen significativamente del tipo de nanotubo,
su longitud, quiralidad, etc., son:
· Propiedades eléctricas: Tienen una elevada conductividad
debido a su configuración electrónica basada en la hibridación
sp2. Dicha configuración condiciona tanto el transporte
electrónico de corriente como su reactividad química.
· Propiedades magnéticas: Son compuestos diamagnéticos con
una elevada conductividad eléctrica, que depende del campo
magnético al que estén sometidos.
· Superficie específica: Presentan un valor elevado de la
relación superficie/volumen lo que les permite una amplia
variedad de aplicaciones.
· Propiedades mecánicas: Tienen una gran resistencia a la
presión y una elevada flexibilidad, lo que les hace ideales para
la fabricación de compuestos más ligeros y resistentes.
· Reactividad química: Son compuestos básicamente estables,
por lo que generalmente son biocompatibles, lo que potencia
su empleo para el desarrollo de nuevos fármacos.
Como ya se ha comentado anteriormente las nanoestructuras
se usan en las diferentes etapas del proceso analítico aprovechando
las excepcionales propiedades que poseen, y esto es aplicable por
completo a los nanotubos de carbono. El siguiente apartado se centra
en las aplicaciones de los nanotubos de carbono en los sistemas de
INTRODUCCIÓN
47
detección, particularmente en la detección electroquímica, ya que es
donde se encuadra la temática de esta Memoria.
3. NANOSENSORES Y NANOELECTRODOS ELECTROQUÍMICOS
Un nanosensor se define como un dispositivo de dimensiones
menores de 1 μm que es capaz de monitorizar continuamente un
parámetro químico o biológico, mediante la transformación de la señal
primaria (óptica, eléctrica, másica) en información analítica fiable y útil
[48, 49]. Las características que deben cumplir los nanosensores son
[2]:
1. Reversibilidad. Un sensor debe ser totalmente reversible, es
decir, que sea capaz de volver a su estado inicial de forma
espontánea.
2. Tamaño. El tamaño suele variar desde varios nanómetros
hasta una micra, que teóricamente no entraría en este
contexto. Pero si se usan nanopartículas sí se podrían
considerar incluidos como nanosensores.
3. Formato. En general, se atribuye al sensor un formato de
sonda, como los electrodos. Pero, en realidad, son muchos los
que tienen configuración plana. También se han planteado de
flujo continuo [109] y se denomina sistemas nanosensores a
suspensiones estables de nanopartículas.
4. Tipo de nanomaterial. La mayor parte de los nanosensores se
basan en nanopartículas metálicas (oro, plata, óxido metálico,
quantum dots, etc.) y nanoestructuras de carbono. De éstos,
los más empleados son los nanotubos de carbono, dadas sus
excepcionales propiedades superficiales, que los hacen
especialmente aptos para la construcción de nanosensores.
5. Tratamiento previo de la muestra. Un nanosensor ideal debe
tener la selectividad suficiente como para responder
INTRODUCCIÓN
48
exclusivamente al(los) analito(s) diana y, por tanto, ser
insensible a la matriz de la muestra. Por ello, la muestra no
debería teóricamente ser sometida a tratamiento. Es lo que se
denomina “análisis directo”.
6. Robustez, sensibilidad, precisión y reusabilidad. Un
nanosensor debe cumplir condiciones de repetibilidad y
reproducibilidad adecuadas, además de proporcionar la
sensibilidad requerida de la señal medida. Debe ser capaz de
reutilizarse, es decir, poder ser usado en mas de una medida.
En particular, los nanosensores electroquímicos suponen la
temática de mayor actividad de la Nanociencia y la Nanotecnología
analíticas. Las nanopartículas más empleadas para mejorar las
prestaciones de la electroquímica convencional son
fundamentalmente de tres tipos:
a. Nanopartículas metálicas, de las que sobresalen las de oro
y plata.
b. Nanopartículas de carbono, predominando con claridad
los nanotubos de carbono.
c. Hibridación nanoparticular, tanto entre sí (por ejemplo
nanopartículas de oro y de carbono) como con otros
materiales (por ejemplo nanotubos de carbono con
polímero).
En general, entre las características que aportan las
nanopartículas a los sistemas electroanalíticos cabe destacar la baja
resistencia a la transmisión electrónica, la elevada superficie
específica, y la elevada capacidad para adsorber o enlazar
biomoléculas. Todas ellas han potenciado que una de las tendencias
de la Electroquímica actual sea la participación de las nanopartículas
en la zona electroquímica sensible. Mejoran la sensibilidad, la
INTRODUCCIÓN
49
selectividad, la miniaturización y la robustez, especialmente en los
biosensores.
Los nanotubos de carbono son los nanomateriales más
ampliamente utilizados en electroquímica. En la Figura 3.1. [2] se
muestra una panorámica general del empleo de los nanotubos de
carbono en electroanálisis, a través de cuatro clasificaciones
complementarias:
1) Según la zona electroactiva donde se encuentran los
nanotubos de carbono, pueden estar ellos solos, como
modificadores de la superficie del electrodo, como
componentes de pastas o materiales compuestos y
combinados en enzimas.
2) Según la configuración del electrodo, éste puede ser
plano o tubular y de diferente tamaño con tendencia a
la miniaturización.
3) Según la técnica electroanalítica aplicada, los
electrodos con nanotubos de carbono se han usado en
potenciometría, redisolución anódica, voltametría,
conductimetría e impedancia, entre otras.
4) El campo de aplicación es muy variado y los
correspondientes nanoelectrodos se pueden usar en
técnicas directas de determinación, como detectores
continuos en técnicas analíticas de separación y como
detectores en microchips (lab-on-chip), entre otras
aproximaciones.
Se ha demostrado que los nanotubos de carbono tienen la
habilidad para favorecer las transferencias electrónicas para un amplio
rango de especies electroactivas (efecto electrocatalítico), además de
reducir los sobrepotenciales redox, lo que disminuye las posibles
interferencias. Además, estas nanoestructuras permiten la resolución
INTRODUCCIÓN
50
Figura 3.1. Panorámica general empleo de nanotubos de carbono en
electroanálisis [2].
de picos solapados de muchos analitos (mejora de la selectividad) y
aumentan la reversibilidad de las reacciones, teniendo una elevada
resistencia al ensuciamiento (disminución de la pasivación de los
electrodos). Todas estas ventajas implican una mejora en las
características analíticas obtenidas con estos sistemas [50] y un
amplionúmero de aplicaciones dentro de la química electroanalítica,
incluyendo los sensores electroquímicos [51]. En la Tabla 3.1. se
recogen las aplicaciones analíticas basadas en la modificación de
diferentes electrodos con nanotubos de carbono. Únicamente se
muestran las aplicaciones que usan exclusivamente CNTs, sin tener en
INTRODUCCIÓN
51
cuenta aquellas que utilizan además mediadores o composites
híbridos que incluyen CNTs, debido a la relación directa que tienen
dichas aplicaciones con los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral.
Como puede observarse en la tabla, la mayoría de las
aplicaciones utilizan electrodos modificados mediante la incorporación
de un pequeño volumen de dispersión de CNTs sobre la superficie de
electrodos de carbono vitrificado (GCE). Otras modificaciones han sido
realizadas sobre microelectrodos de fibra de carbono (CFME),
electrodos serigrafiados (SPE), electrodos de grafito y electrodos de
pasta de carbono (CPE). Cabe destacar los diferentes métodos
empleados para la preparación de dispersiones homogéneas de CNTs,
que incluyen el pretratamiento con ácidos concentrados y la
utilización de dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO),
citosan (CS) y Nafion (Nf) como disolventes dispersantes. Los
compuestos determinados tienen un origen muy diverso, pudiéndose
destacar la determinación de neurotransmisores, metales pesados y
compuestos fenólicos. En relación a las muestras analizadas, la
mayoría son fármacos en formato de tableta y fluídos biológicos como
el suero y la orina humana. Los métodos electroanalíticos empleados
para llevar a cabo las medidas incluyen la voltametría cíclica (CV),
voltametría diferencial de impulsos (DPV), voltametría de barrido
lineal (LSV), voltametría de redisolución adsortiva (AdSV), voltametría
de onda cuadrada (SWV) y amperometría.
Como complemento de esta introducción, al final del presente
capítulo se adjunta un artículo de revisión bibliográfica elaborado por
los autores de esta Tesis Doctoral, donde se realiza una revisión crítica
del empleo de nanomateriales en la fabricación de nanoelectrodos y
nanosensores con fines analíticos.
INTRODUCCIÓN
52
Tabla 3.1. Electrodos modificados con nanotubos de carbono (*)
Electrodo Disolvente dispersante
Analito/Muestra Método analítico
Referencia
MWCNTs-GCE
DMF Tiocolina CV (FIA) 52
MWCNTs-GCE
DMF L-Tiroxina DPV 53
SWCNTs-GCE
DMSO Metronidazol, ranitidina/fármaco, suero
CV, DPV, Amp
54
SWCNTs-GCE
DMF Bisoprolol fumarato/orina, fármaco
DPV 55
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido (DMF)
Hidroquinona, catecol/agua
CV, DPV 56
SWCNTs-GCE
DMF o-,m-,p-Dihidroxibenceno
CV 57
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido (DMF)
Brucina CV, SWV 58
MWCNTs-GCE
- Morfina Amp 59
MWCNTs-GCE
- Tiocitosina, L-cisteína, glutation
Amp 60
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido (DMF)
Etamsilato CV, DPV 61
MWCNTs-CPE
DMF Hidroquinona, dopamina, NADH, epinefrina, H2O2
CV (FIA) 62
(*)Amp = Amperometría
INTRODUCCIÓN
53
Tabla 3.1. . Electrodos modificados con nanotubos de carbono (Continuación 1) (*)
Electrodo Disolvente dispersante
Analito/Muestra Método analítico
Referencia
MWCNTs-CFME
DMF Ácido ascórbico DPV 63
MWCNTs-GCE
CS Insulina Amp 64
SWCNTs-GCE
DMF, CS, Nf H2O2 CV 65
MWCNTs-GCE
CS NADH Amp 66
MWCNTs-CFME
Nf Radical óxido nítrico/higado pescado
Amp 67
MWCNTs-CPE
Tratamiento ácido (DMF)
Bergenina CV, DPV 68
MWCNTs-GCE
Nf Pb (II), Cd (II) SWV 69
MWCNTs-GCE
Nf Eu (III) DPV 70
SWCNTs-GCE
Nf Cd (II) LSV, DPV 71
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido (DMSO)
As (III), Bi (III)/agua
DPV 72
MWCNTs-GCE
CS Bromuro LSV 73
(*)Amp = Amperometría
INTRODUCCIÓN
54
Tabla 3.1. . Electrodos modificados con nanotubos de carbono (Continuación 2) (*)
Electrodo Disolvente dispersante
Analito/Muestra Método analítico
Referencia
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido
Teofilina/fármaco LSV 74
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido
Procaina/injecciones LSV 75
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido
Fenilefrina CV 76
MWCNTs-CPE
Tratamiento ácido
Quercetina/suero, orina
CV, DPV 77
SWCNTs-GCE
DMF Rutina/fármaco CV-AdSV 78
MWCNTs-GCE
Nf L-Dopa LSV 79
SWCNTs-GCE
DMSO Ranitidina, metrodinazol/suero
Amp 80
SWCNTs-GCE
- Bisoprolol/orina DPV 81
MWCNTs-CPE
- Mo (VI)/agua DPV 82
MWCNTs-CPE
- Hidroquinona CV 83
MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido
Isoflavonas Amp 84
(*)Amp = Amperometría
INTRODUCCIÓN
55
Tabla 3.1. . Electrodos modificados con nanotubos de carbono (Continuación 3) (*)
Electrodo Disolvente dispersante
Analito/Muestra Método analítico
Referencia
SWCNTs, MWCNTs-GCE
Tratamiento ácido
Antioxidantes, vitaminas, isoflavonas
Amp 85
MWCNTs-Electrodo de grafito
- Capsaicin/Salsas AdSV 86
MWCNTs-SPE
- Arylsulfatasa/Aceite SWV 87
MWCNTs-CPE
- Ácido ascórbico, acetaminofen/fármacos, plasma
CV, DPV 88
MWCNT - Hidroquinona, catecol. Resorcinol/aguas residuales
Amp 89
MWCNTs-GCE
Nf Fenoles, nitrofenoles Amp 90
MWCNTs-GCE
- Pb (II), Cu (II) /agua AdSV 91
MWCNTs-GCE
- Zn (II) AdSV 92
MWCNTs-CPE
- Acido ascórbico, acetaminofen/fármacos
DPV 93
MWCNT - Levofloxacin/orina DPV 94
MWCNTs-GCE
- Idarubicin/fármacos AdSV 95
(*)Amp = Amperometría
INTRODUCCIÓN
56
Tabla 3.1. . Electrodos modificados con nanotubos de carbono (Continuación 4) (*)
Electrodo Disolvente dispersante
Analito/Muestra Método analítico
Referencia
MWCNTs-GCE
- Nifedipina AdSV 96
MWCNTs-GCE
- Microorganismos SWV 97
(*)Amp = Amperometría
4. CONTROL DE PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS
La investigación objeto de esta Memoria está orientada al
control de productos agroalimentarios, debido a la importancia que
tiene como una de las principales aplicaciones de la Química Analítica
en la actualidad. La Directiva 89/397/CEE [98], relativa al control oficial
de productos alimenticios, constituye un marco general en relación a
los métodos de análisis empleados para llevar a cabo el control oficial
de los alimentos y la fiabilidad de los laboratorios que realicen dichos
análisis. Dicho control tiene por objeto los productos alimenticios, los
aditivos y los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con
éstos. Su finalidad es prevenir los riesgos para la salud pública y
proteger los intereses de los consumidores, incluyendo su derecho a
una información adecuada. El control se basa en inspecciones que
pueden tener lugar en cualquier eslabón de la cadena que va desde la
producción a la venta final al consumidor. Además de las inspecciones,
el control puede comportar la toma de muestras y análisis efectuados
INTRODUCCIÓN
57
por laboratorios oficialmente reconocidos, la verificación del
cumplimiento de las normas de higiene por parte del personal de la
empresa, y el examen del material escrito y documental de todo tipo.
Están sometidos a inspección: el estado y el uso que se haga
de terrenos, locales, oficinas, instalaciones, medios de transporte,
equipos, materiales, etc.; las materias primas, ingredientes, auxiliares
tecnológicos, etc.; los productos semi-acabados; los productos
acabados; los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con
los productos alimenticios; los plaguicidas; los productos y
procedimientos de limpieza y mantenimiento; los procedimientos de
fabricación y tratamiento de los productos alimenticios; los medios de
conservación y el etiquetado, y la presentación de los productos
alimenticios.
Los métodos de análisis oficiales para el control de productos
alimentarios deben proporcionar especificidad, exactitud, precisión,
repetitividad, reproducibilidad, sensibilidad y tener carácter práctico.
La Directiva 85/591/CEE [99] establece los sistemas de toma de
muestras y métodos de análisis comunitarios para los productos
alimenticios destinados a la alimentación humana. En relación a la
legislación alimentaria, el Reglamento 178/2002 [100] establece los
principios y los requisitos generales de la legislación alimentaria, crea
la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y fija los
procedimientos relativos a la seguridad alimentaria. Además de esta
legislación genérica, existe una normativa específica para cada tipo de
producto agroalimentario (por ejemplo, productos cárnicos, leche y
derivados lácteos, etc.) que ha sido consultada y aplicada para el
desarrollo de los trabajos experimentales que se detallan en los
capítulos posteriores. Así, cabe destacar la legislación vigente relativa
al establecimiento de los límites de residuos máximos permitidos de
productos medicinales veterinarios en alimentos de origen animal
INTRODUCCIÓN
58
[101], que ha supuesto la base del desarrollo del método de screening
que forma el apartado 3 del capítulo II de la presente Memoria.
5. COMPUESTOS ESTUDIADOS
Se describen a continuación los compuestos determinados en
los trabajos que forman esta Memoria.
5.1. ANTIOXIDANTES NATURALES: COMPUESTOS POLIFENÓLICOS
5.1.1. Definición, clasificación y estructuras químicas
Los compuestos polifenólicos constituyen un vasto y
heterogéneo conjunto de metabolitos secundarios de las plantas que
se encuentran distribuidos en el reino vegetal y por lo tanto,
constituyen parte integral de nuestra dieta mediante el consumo de
alimentos como cereales, legumbres, frutas y verduras. Así mismo,
bebidas como zumos de frutas, té, café, cacao, cerveza y vino son otra
fuente habitual de polifenoles de nuestra ingesta diaria.
Los compuestos polifenólicos o polifenoles contienen al menos
un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo, pudiendo
presentar, además, otros grupos funcionales como sustituyentes. En la
actualidad se conocen más de 6500 estructuras de este tipo de
compuestos. Una sencilla clasificación de los compuestos polifenólicos
establece que las clases estructurales principales son los ácidos
fenólicos y los flavonoides.
Los ácidos fenólicos se pueden clasificar en dos subgrupos:
ácidos hidroxibenzoicos (p-hidroxibenzoico, protocatéquico,
vainillínico, siríngico y gálico) y ácidos hidroxicinámicos (p-cumárico,
cafeico, ferúlico, sinápico y clorogénico). Están presentes en una gran
variedad de estructuras conjugadas (estructura libre unida a otra(s)
sustancia(s) de naturaleza no polifenólica), siendo los ésteres y las
INTRODUCCIÓN
59
amidas las mayoritarias, mientras que los glicósidos aparecen
raramente. En la Figura 5.1.1. se muestran las estructuras
correspondientes a los ácidos fenólicos.
Los flavonoides son compuestos que en su estructura
presentan el esqueleto difenilpropano (C6-C3-C6) (Figura 5.1.2), siendo
los compuestos polifenólicos más abundantes en la dieta humana.
Están presentes en los alimentos principalmente como glicósidos
(estructuras químicas enlazadas a un azúcar), aunque en algunas
ocasiones también se encuentran como agliconas (estructuras
químicas libres de azúcar). Habitualmente el número de azúcares
unidos es uno, pero podría ser también dos o tres, existiendo varias
posiciones para la unión dependiendo de dónde pueden presentar
sustituciones los flavonoides. A su vez los azúcares también pueden
presentar sustituciones. Las glicosilaciones influyen en las propiedades
químicas, físicas y biológicas de los flavonoides [102].
Los flavonoides se clasifican en diferentes familias,
diferenciándose dentro de éstas en el número y posición de los grupos
hidroxilo así como en las alquilaciones y/o glicosilaciones de los
mismos. En la Figura 5.1.3. se muestran las estructuras
correspondientes a las familias predominantes de flavonoides. Como
se observa en esta figura, los flavonoides se pueden clasificar en
flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanoles, antocianidinas,
isoflavonas y chalconas. Las flavonas son el grupo de polifenoles
menos presente en alimentos, siendo las agliconas más ampliamente
distribuidas apigenina y luteolina. Respecto a los flavonoles, están
ampliamente distribuidos en el reino vegetal siendo representados
fundamentalmente por miricetina, isorhamnetina, quercetina y
kaempferol. El flavonol más importante es la quercetina ya que es el
principal flavonol existente en nuestra dieta, estando presente en
muchas frutas, verduras y bebidas, siendo particularmente abundante
en cebollas y té. Los flavonoles están presentes principalmente como
INTRODUCCIÓN
60
Figura 5.1.1. Estructuras de los ácidos fenólicos
Figura 5.1.2. Estructura básica de flavonoides
COOH
Acido p-hidroxibenzoico 4-OH
Acido protocatéquico 3,4-OH
Acido gálico 3,4,5-OH
Acido vainillínico 4-OH, 3-OCH3
Acido siringico 4-OH, 3,5-OCH3
Acidos hidoxibenzoicos
COOH
Acido p-cumárico 4-OH
Acido cafeico 3,4-OH
Acido gálico 3,4,5-OH
Acido ferúlico 4-OH, 3-OCH3
Acido sinápico 4-OH, 3,5-OCH3
Acidos hidoxicinámicos
INTRODUCCIÓN
61
Figura 5.1.3. Estructuras de las distintas familias de flavonoides
INTRODUCCIÓN
62
estructuras glicosiladas, presentando el enlace O-glicosídico
normalmente a través del grupo hidroxilo situado en la posición 3. El
subgrupo de las flavanonas está representado principalmente por
taxifolina, naringenina y hesperidina. La principal fuente de flavanonas
son los cítricos, donde se encuentran como agliconas, estando
presentes en otras plantas como estructuras glicosiladas
principalmente. La glicosilación tiene lugar en la posición 7 y los
azúcares involucrados son monosacáridos y disacáridos. Los flavanoles
constituyen una de las familias más ampliamente distribuidas
encontrándose principalmente como agliconas. Los flavanoles más
importantes son los flavan-3-ols también conocidos con la extensión
del plural del nombre de uno de ellos: “catequinas”, las cuales se
encuentran en gran cantidad en té, vino tinto y chocolate. No sólo se
presentan como unidades monoméricas, sino que también aparecen
como estructuras oligoméricas conocidas como procianidinas. Las
procianidinas están constituidas por dos o más monómeros unidos
químicamente, siendo (+)-catequina y (-)-epicatequina sus
monómeros constituyentes. Dentro de este tipo de compuestos, las
estructuras más importantes son las diméricas de (+)-catequina y (-)-
epicatequina, conocidas como procianidinas B1, B2, B3 y B4 (Figura
5.1.4.). Además los monómeros anteriores condensan fácilmente
dando lugar a compuestos poliméricos conocidos como taninos
condensados. (+)-Catequina y (-)-epicatequina pueden también
combinarse para formar esteres dando lugar a catequina y/o
epicatequina galatos; y enlazarse a azúcares y proteínas. En relación a
las antocianidinas, es necesario indicar que son el grupo más
importante de pigmentos solubles en agua presentes en plantas. Han
sido utilizados como aditivos en la industria alimentaria, aprovechando
su poder de pigmentación tanto en zumos como en mermeladas. Las
estructuras más ampliamente distribuidas son cianidina, delfinina,
INTRODUCCIÓN
63
peonidina, pelargonidina, petunidina y malvidina, siendo las
responsables de la pigmentación en las frutas. Rara vez aparecen
como agliconas, estando presentes en la mayoría de los casos como
estructuras glicosiladas, formando 3-glicósidos y 3,5-diglicósidos.
Glucosa, galactosa, ramnosa y arabinosa son los azúcares que se
encuentran habitualmente enlazados a sus estructuras. Por otra parte,
las antocianidinas acetiladas (enlazadas químicamente a un ácido) se
encuentran también ampliamente distribuidas en las frutas,
especialmente en las uvas. Las isoflavonas constituyen una de las
familias minoritarias dentro de los alimentos. Se encuentran en las
leguminosas, principalmente en la soja. Las más importantes son
genisteina y daidzeina, sus glicósidos (genistina y daidzina) y sus
derivados metoxilados (biocanina-A y formononetina). Dentro de las
chalconas más importantes encontradas en alimentos, cabe destacar
la floretina y su glicósido (floridzina) y la chalconaringenina. Floretina y
floridzina abundan en las manzanas y chalconaringenina en los
tomates tomates.
1.1.1. Propiedades generales
Los compuestos polifenólicos constituyen un grupo de
sustancias de elevado interés debido al conjunto de propiedades
físico-químicas y fisiológicas que poseen. Debido a la amplia
distribución estructural que presentan estos compuestos en la
naturaleza se emplean como marcadores en estudios taxonómicos y
juegan un papel importante en propiedades relacionadas con la
calidad de los alimentos, existiendo numerosas monografías y
revisiones bibliográficas en las cuales todas estas propiedades son
objeto de estudio indicando por otra parte el interés de estos
compuestos en la escena científica [103-112].
INTRODUCCIÓN
64
Figura 5.1.4. Estructura de la procianidinas diméricas
Tienen importancia biológica como metabolitos secundarios de las
plantas, siendo los responsables del crecimiento de las mismas.
Poseen efectos fisiológicos ya que mediante los grupos hidroxilo
interaccionan con proteínas y carbohidratos disminuyendo así la
disponibilidad de los macronutrientes. Además juegan un papel
INTRODUCCIÓN
65
importante en propiedades relacionadas con la calidad de los
alimentos ya que determinan las propiedades organolépticas de los
mismos [113-116]. Los polifenoles se consideran los compuestos más
importantes que determinan el sabor, así como las diferencias de color
en vinos blancos, rosados y tintos. Son los ingredientes naturales del
vino que reaccionan con el oxígeno, siendo cruciales en la
conservación, maduración y envejecimiento del mismo.
Sin embargo, una de las propiedades más importantes de los
compuestos polifenólicos, por la que son objeto de una intensa
investigación científica, es su actividad antioxidante. Se comportan
como atrapadores de los radicales libres con importantes
consecuencias en la prevención del cáncer. Por este motivo, los
compuestos polifenólicos se denominan antioxidantes naturales.
El término antioxidante es muy heterogéneo y depende del
ámbito en el cual se establezca. Una descripción sencilla y rigurosa del
mismo es la dada por Halliwell [117]: “Antioxidantes son aquellas
moléculas que estando presentes en concentración menor a las
biomoléculas de interés, evitan o reducen la extensión de la
destrucción oxidativa de dichas biomoléculas”.
Los polifenoles actúan como antioxidantes mediante distintos
mecanismos de acción. Su acción como antioxidante está relacionada
no sólo con su estructura química sino también con su localización en
la partícula. Son potentes atrapadores de radicales libres, que son
aquellas especies inestables que provocan la peroxidación lipídica
produciendo la destrucción de las membranas celulares y mutaciones
del ADN de las células, jugando un papel importante en distintas
enfermedades como, las enfermedades cardiacas, artritis, cáncer,
cataratas, arterosclerosis, diabetes, osteoporosis y enfermedades
degenerativas como el Alzheimer. También actúan como agentes
quelatantes de metales de transición, uniéndose a estos iones y
reduciendo su capacidad de generar radicales libres. Poseen la
INTRODUCCIÓN
66
capacidad de inhibir, activar o regenerar enzimas específicas en el
organismo. Por otra parte, los flavonoides disminuyen la presión
arterial y regulan adecuadamente el ritmo cardiaco. En definitiva, los
polifenoles son potentes antioxidantes, denominados también
antioxidantes naturales y/o dietéticos, presentando propiedades
relacionadas con la prevención de la oxidación, tales como
antiinflamatorias, antialérgicas y anticancerígenas [118-121].
La actividad antioxidante se define como la capacidad de un
compuesto para atrapar especies reactivas de oxígeno (ROS) y de
nitrógeno (radicales libres). La actividad antioxidante de los polifenoles
está asociada con varios mecanismos, pero por la elevada reactividad
que presentan los polifenoles hacia los radicales libres se considera
éste el mecanismo más aceptado para explicar su actividad
antioxidante. La tendencia de un polifenol de inhibir procesos en los
que están involucrados radicales libres está gobernada por su
estructura química. En la capacidad de atrapamiento de radicales
libres y en su actividad quelatante influye el número, la posición y el
tipo de sustituyentes del compuesto polifenólico.
Los criterios estructurales que determinan la capacidad de
atrapamiento de radicales libres y por lo tanto la actividad/capacidad
antioxidante de los flavonoides son las siguientes [122]:
a) La estructura o-dihidroxi en el anillo B (grupo catecol), en el
cual confiere una mayor estabilidad al radical y participa en la
deslocalización de electrones (resaltado en color amarillo).
INTRODUCCIÓN
67
b) El doble enlace en posición 2,3 en conjugación con el enlace
4-oxo en el anillo C (resaltado en color verde) es responsable de la
deslocalización electrónica en el anillo B estando la capacidad
antioxidante relacionada con la estructura en términos de
deslocalización electrónica del núcleo aromático. Cuando estos
compuestos reaccionan con radicales libres, los radicales fenoxil
producidos son estabilizados por efectos de resonancia del núcleo
aromático.
c) Los grupos 3- y 5-OH (anillo A) con el grupo 4-oxo (anillo C)
son necesarios para tener el máximo potencial de atrapadores de
radicales libres (resaltado en color rojo).
La quercetina satisface todos estos criterios siendo
potencialmente un antioxidante ideal. La Figura 5.1.5. muestra la
estructura de la quercetina sobre la que se indican las zonas
estructurales relacionadas con la capacidad antioxidante con el código
de colores indicado anteriormente.
Figura 5.1.5. Estructura de la quercetina
INTRODUCCIÓN
68
Es necesario indicar que las agliconas son antioxidantes más
potentes que sus correspondientes glicósidos, influyendo en la
disminución de la actividad antioxidante tanto los azúcares como la
posición de las glicosidaciones [123, 124].
Con respecto a los ácidos fenólicos, la actividad antioxidante
de éstos y de sus ésteres depende del número y posición de grupos
hidroxilo en la molécula, siendo ésta reforzada cuando existen
impedimentos estéricos [125]. En términos generales, la actividad
antioxidante aumenta al aumentar el número de grupos hidroxilo; y a
igualdad de éstos la actividad antioxidante depende de la posición de
los mismos y de las sustituciones que éstos presentan. Las
propiedades captadoras de electrones del grupo carboxilato en los
ácidos hidroxibenzoicos influyen negativamente en la capacidad
donadora de protones de estos, presentando los ácidos
hidroxicinámicos mayor actividad antioxidante que sus homólogos
hidroxibenzoicos.
Se han estudiado los mecanismos de oxidación de distintos
flavonoides utilizando distintas técnicas electroquímicas como son
voltamperometría cíclica (CV), voltamperometría de onda cuadrada
(SWV) y voltamperometría diferencial de impulsos (DPV). La oxidación
electroquímica de los compuestos polifenólicos es un proceso
complejo que tiene lugar a través de mecanismos de cascada, estando
fuertemente relacionada con su estructura, teniendo lugar a través de
sus grupos hidroxilo. En la Figura 5.1.6. se muestra el mecanismo de
oxidación de la (+)-catequina como ejemplo representativo [126].
Debido a que los protones intervienen en el proceso de
oxidación, dichos procesos son dependientes del pH. Un incremento
del pH produce una disminución del potencial de oxidación ya que el
analito se oxida más fácilmente como consecuencia de que la pérdida
de electrones es posterior a la de protones y por siguiente dicha
INTRODUCCIÓN
69
Figura 5.1.6. Mecanismo de oxidación de (+)-catequina [126]
pérdida queda favorecida. Por otra parte, la reversibilidad de los
procesos de oxidación depende de la estabilidad del producto de
oxidación formado. Así, compuestos que tienen el grupo catecol en su
estructura son químicamente reversibles, ya que la quinona que se
produce es estable; la cual puede ser reducida generando una
corriente catódica. Sin embargo, compuestos polifenólicos con grupos
mono o trihidroxi sustituidos son irreversibles, ya que el compuesto
formado no es estable [127].
5.2. AGENTES ANTIBACTERIANOS: SULFONAMIDAS
5.2.1. Descubrimiento y definición
Las sulfonamidas o sulfamidas fueron los primeros agentes
antibacterianos eficaces empleados en el tratamiento de las
infecciones en el hombre. Su origen data en 1908, cuando Gelmo,
investigando las propiedades colorantes de ciertos agentes, obtuvo el
agente quimioterapeútico sulfanilamida (Figura 5.2.1.). Sin embargo,
sus propiedades antimicrobianas no fueron utilizadas hasta 25 años
después. En 1932, Gerhard Domagk estudió las actividades
INTRODUCCIÓN
70
antimicrobianas del Prontosil, colorante que contienen el grupo
sulfonamídico, demostrando que los ratones afectados por infecciones
estreptocócicas eran curados por éste fármaco. Domagk recibió el
premio Nobel de Medicina en 1938, por sus trabajos sobre el valor
quimioterapeútico del Prontosil. A partir de éstos resultados se puso
en movimiento la búsqueda de otros compuestos químicos
(relacionados con la sulfanilamida) que pudieran tener mejores
efectos quimioterapeúticos. Se modificó así la estructura de la
sulfanilamida obteniéndose los diferentes fármacos: sulfadiazina,
sulfamerazina, sulfatiazol, etc. Por lo tanto, son antimicrobianos
sintéticos, bacteriostáticos, de amplio espectro, e inicialmente con
actividad frente a una gran variedad de microorganismos
grampositivos y gramnegativos. Con el transcurso de los años y su
amplia utilización a nivel mundial (usadas en clínica por al menos 50
años), apareció el problema de resistencia bacteriana. En la actualidad,
el uso de sulfamidas solas es excepcional debido a su relativa actividad
comparada con otros antimicrobianos, el problema de la resistencia
adquirida y su perfil de toxicidad. Las sulfamidas de uso sistémico
comercializadas en España son la sulfadiazina, la sulfanilamida y la
combinación de sulfametoxazol con trimetoprima [128].
Figura 5.2.1. Estructura de la sulfanilamida.
INTRODUCCIÓN
71
5.2.2. Estructura química y propiedades
Todas las sulfamidas son compuestos sintéticos derivados de la
sulfanilamida (para-aminobenceno sulfonamida) que fue la primera en
descubrírsele actividad microbiana. La estructura química general de
las sulfonamidas se muestra en la Figura 5.2.2.
Figura 5.2.2. Estructura química sulfonamidas.
Poseen dos átomos de Nitrógeno, el N4 o amínico y el N1 o
amídico, y las distintas sulfamidas se diferencian entre sí en el radical
(R) unido al grupo amido N1 y a veces en el sustituyente del grupo
amino N4. Casi todas las sulfamidas actuales derivan de sustituciones
en el N1 ya que las realizadas en el N4 tienen menor actividad
antibacteriana [129]. En la Tabla 5.2.1. se muestran las propiedades
de las sulfamidas estudiadas. Las sustituciones en el grupo amido (que
dan lugar a las distintas sulfamidas) originan efectos variables en la
actividad antibacteriana de la molécula. Si bien las diversas
sustituciones originan sulfamidas con características físicas, químicas y
farmacocinéticas particulares, en general las propiedades
antibacterianas son similares para todos los compuestos del grupo.
Químicamente, son cristales blancos relativamente insolubles
en agua, teniendo un amplio rango de valores de pKa. El hidrógeno
unido al nitrógeno del grupo amido tiene carácter ácido por efecto del
grupo sulfonilo (-SO2-), que es muy fuerte atrayendo electrones. Por lo
tanto en medio básico se forma la sal correspondiente (Figura 5.2.3.).
INTRODUCCIÓN
72
Tabla 5.2.1. Sulfamidas estudiadas
Sulfamida R Pm (g/mol) pKa
Sulfisoxazole
267,31 4,9
Sulfadiazina
250,28 6,4
Sulfamerazina
264,3 6,9
Sulfatiazole
255,32 7,2
Sulfanilamida H 172,2 10,4
Sulfaguanidina
214,24 11,3
Figura 5.2.3. Carácter ácido del hidrógeno del grupo sulfanilamida N-
sustituida.
INTRODUCCIÓN
73
Por lo tanto las sulfonamidas se comportan como ácidos
débiles. Son compuestos polares con propiedades anfóteras [130,
131], donde el nitrógeno amino N4 se encuentra protonado a pH=2-3,
mientras que el nitrógeno amido N1 está desprotonado en el intervalo
de pH=4.5-11.5, que corresponde al intervalo de pKa de los
compuestos (ver Tabla 5.2.1.).
Las propiedades electroquímicas de las sulfonamidas fueron
estudiadas en 1984 por A. Momberg et al. [132], llegando a la
conclusión de que todas las sulfonamidas p-amino-sustituidas exhiben
una oxidación irreversible sobre la superficie de un electrodo de
carbono vitrificado donde están implicados 2 electrones. El potencial
al que se produce la oxidación es dependiente del pH y el producto de
oxidación principal de estos compuestos es una iminobenzoquinona.
En la Figura 5.2.4. se muestra el mecanismo del proceso global
electroquímico de las sulfonamidas.
Figura 5.2.4. Mecanismo global de oxidación sulfonamidas [132].
5.2.3. Toxicidad
Los antibióticos son un grupo de productos farmacéuticos con
efectos sobre el medio ambiente que pueden ser particularmente
nocivos para la salud humana. Las sulfonamidas se han empleado
durante mucho tiempo como antibióticos sintéticos dentro de la
medicina veterinaria, en particular dentro de las actividades
ganaderas. El uso prolongado de estos medicamentos tiene efectos y
INTRODUCCIÓN
74
consecuencias sobre la salud humana y el medio ambiente (Figura
5.2.5). Esta influencia se ha extendido en las últimas décadas debido al
proceso de globalización [133]. Por estos motivos, se han llevado a
cabo muchos estudios sobre el consumo de estos medicamentos y la
determinación de sus residuos en distintos tipos de muestras
medioambientales y de alimentos. El límite de concentración máximo
permitido de sulfonamidas en alimentos fue establecido en
regulaciones administrativas. La Unión Europea adoptó como
concentración máxima 100 g/Kg como la suma de todas las
sulfonamidas presentes en alimentos de origen animal [134].
Figura 5.2.5. Posibles destinos de los residuos de sulfonamidas [133].
INTRODUCCIÓN
75
5.3. COMPUESTOS MUTAGÉNICOS: AMINAS HETEROCÍCLICAS
AROMÁTICAS
Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto
que existe una estrecha relación entre el tipo de vida y la incidencia
del cáncer en los seres humanos [135, 136]. La dieta es el factor que
contribuye en una mayor proporción al desarrollo de tumores y de
hecho, entre un 35% y un 45% de los cánceres se asocian a este factor.
El efecto de la dieta varía en función del tipo de alimento, del modo de
cocción, de su valor nutricional y de su composición. Los mutágenos
presentes en los alimentos pueden provenir de distintas fuentes:
a) Pueden ser de origen natural como por ejemplo, las
micotoxinas, las hidracinas y algunos alcaloides y
flavonoides.
b) Pueden encontrarse en los alimentos como resultado de
una contaminación de los mismos como es el caso de los
pesticidas, herbicidas o disolventes.
c) Pueden ser compuestos genotóxicos como las nitrosaminas,
las nitrosoamidas, los hidrocarburos aromáticos policíclicos
y las aminas heterocíclicas, que son productos que se
generan durante el procesado y cocción de los alimentos.
Los compuestos pertenecientes a esta tercera categoría
presentan una característica especial que los diferencia de otros
contaminantes alimentarios y que hay que tener en cuenta en la
evaluación de la seguridad de los alimentos. Esta característica se
refiere a que para minimizar el riesgo de ingesta de los mismos puede
ser necesario modificar algunos de los hábitos culinarios de la
población o bien los procedimientos de preparación industrial de
algunos alimentos.
INTRODUCCIÓN
76
5.3.1. Aminas heterocíclicas: formación e importancia
A finales de los años 70, Sugimura y colaboradores [137]
descubrieron que en determinadas condiciones, el humo procedente
de la cocción de alimentos ricos en proteínas contenía cantidades
apreciables de sustancias mutágenas. Estudios posteriores pusieron
de manifiesto que las partes más tostadas de carnes y pescados
asados presentaban una actividad mutágena notable debida a la
presencia de unas substancias básicas. Actualmente se han
identificado 23 de estas substancias, todos ellas pertenecientes al
grupo genérico de las aminas heterocíclicas aromáticas (HAAs).
Dependiendo del mecanismo de generación y de los
precursores, las HAAs se pueden clasificar en dos grandes grupos, las
carbolinas y los aminoimidazoazarenos (AIA). Las carbolinas también
conocidas como aminas pirolíticas, se forman a temperaturas
superiores a los 300 oC por pirólisis de aminoácidos o proteínas vía
reacciones radicalarias. Estas aminas contienen en su estructura
grupos piridoindol (Trp-P-1, Trp-P-2, AαC, MeαAC, harman,
norharman) o piridoimidazol (Glu-P-1, Glu-P-2). El segundo gran
grupo, los AIA, recibe el nombre genérico de aminas térmicas ya que
se forman al cocinar alimentos ricos en proteínas, como la carne o el
pescado, a temperaturas inferiores a los 300 oC. Todas ellas contienen
en su estructura el grupo 2-aminoimidazo y una quinolina (IQ, MeIQ),
una quinoxalina (MeIQx, DiMeIQx) o un anillo de piridina (PhIP,
DMIP). En general, los AIA son compuestos algo más polares que las
carbolinas, característica que se utiliza para la agrupación de las
aminas heterocíclicas en dos familias. Desde el punto de vista de su
actividad mutagénica, y por tanto de su potencial cancerígeno, existen
datos que demuestran que estos compuestos son cancerígenos en
ratones, ratas y primates en los que se han detectado tumores en
INTRODUCCIÓN
77
diversos órganos como por ejemplo el hígado, los intestinos, el
estómago, el pulmón, la piel y las glándulas mamarias [138].
La formación de las aminas heterocíclicas durante el
procesado industrial y/o culinario de los alimentos cárnicos puede
estar influida por algunos factores composicionales como la creatina
presente en el tejido muscular, la grasa o el agua así como los
azúcares y los aminoácidos. Así, diversos estudios han puesto de
manifiesto que la creatina es necesaria para la formación de los
aminoimidazoazarenos y que existe una relación directa entre la
cantidad de aminoacidos o péptidos de cadena corta y la actividad
mutagénica resultante. En cuanto a los azúcares, se ha demostrado
que su presencia es necesaria para la formación de las aminas aunque
algunos autores han puesto de manifiesto que la adición de glucosa o
lactosa a la carne inhibe en parte la formación de aminas y en
consecuencia, disminuye la actividad mutagénica generada por la
cocción. El agua y los lípidos que contienen los alimentos parece que
también tienen importancia en la generación de compuestos
mutagénicos dado que durante el proceso de cocción los precursores
solubles en agua migran junto con ésta a la superficie de los alimentos
donde son expuestos a temperaturas relativamente altas que
favorecen la reacción de formación de dichos compuestos. Esto
explica que el nivel de actividad mutagénica de la superficie de la
carne frita sea superior a la de la zona central, donde la temperatura
es normalmente más baja. El papel desempeñado por los lípidos no
está tan claro dado que algunos estudios sugieren que las grasas
pueden hacer aumentar la formación de las aminas heterocíclicas al
favorecer la transmisión del calor mientras que otros indican que la
posible dilución de los precursores en las grasas puede hacer
disminuir la producción de estos compuestos. Los antioxidantes tanto
naturales como sintéticos, como por ejemplo el butilhidroxianisol,
parece que hacen disminuir la actividad mutagénica de la carne frita.
INTRODUCCIÓN
78
Además de los factores composicionales, la aparición de estos
contaminantes en el tratamiento térmico de los alimentos proteicos
está influida por otros factores como por ejemplo el material en el
que se lleva a cabo el tratamiento, el tiempo, la temperatura y el tipo
de cocción. Se ha observado que las aminas heterocíclicas se
empiezan a formar a los 100 oC y que la actividad mutagénica
aumenta con la temperatura hasta los 170 – 200 oC. Así en general, los
tipos de cocción que implican temperaturas alrededor de los 100 oC
como hervir en agua, hacer al vapor o estofar generan pocos agentes
mutagénicos. Sin embargo, los tratamientos térmicos que implican un
calentamiento mediante procesos conductivos como freír o asar
conducen a un aumento de la actividad mutagénica.
Las aminas heterocíclicas se han detectado en carnes de
distinto origen (bovino, ovino, porcino y aves de corral) y en pescados
fritos, a la plancha o a la parrilla y procedentes tanto de restaurantes
como de casas particulares así como en productos precocinados, en
extractos de carne, en aromatizantes comerciales y en los residuos
que quedan en las sartenes o las planchas después de la cocción.
También se ha descrito su presencia en muestras medioambientales y
en algunas bebidas alcohólicas como el vino o la cerveza aunque lo
más frecuente es encontrarlas en alimentos proteicos que han sido
sometidos a tratamientos térmicos a elevadas temperaturas. Los
intervalos de concentración de las aminas heterocíclicas que con más
frecuencia se encuentran en algunos tipos de alimentos, carnes y
pescado, sometidos a diferentes procedimientos de cocción [139,
140] son muy variados, oscilando entre los 0.1 y los 40 ng/g. En
general, las cantidades de aminas producidas aumentan con la
temperatura y el tiempo. También es interesante remarcar que las
temperaturas relativamente bajas y los tiempos de cocción
relativamente largos, favorecen la presencia de las aminas en los
residuos de la sartén lo que es explicable por el transporte de los
INTRODUCCIÓN
79
precursores de las aminas desde la carne a la sartén lo que produce
como consecuencia una disminución de estos compuestos en la
superficie de los alimentos y un aumento en los residuos. Algunos
estudios recientes indican que la concentración de estos compuestos
en la superficie de la carne puede disminuir si se cocina a temperatura
relativamente baja y girando con frecuencia la carne.
Es importante destacar que a pesar de la actividad cancerígena
que presentan estos compuestos, no existe legislación vigente que
límite su contenido en alimentos. En 1993, la Agencia Internacional
para la Investigación del Cáncer (IARC) [141] considera determinadas
HAAs como posible carcinógenos humanos y recomienda una
exposición reducida a estos compuestos. Cuatro de los compuestos
estudiados, Trp-P-1, Trp-P-2, AαC, MeαAC, están incluidos en esta
clasificación.
Las aminas heterocíclicas aromáticas HAAs contienen en sus
estructura entre dos y cinco (generalmente tres) ciclos aromáticos
condensados con uno o más átomos de nitrogéno en el sistema del
anillo, además de uno grupo amino exocíclico. En la Figura 5.3.1. se
muestra la estructura de los compuestos estudiados en esta Memoria.
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INTRODUCCIÓN
89
Review: Recent
applications of nanoelectrodes and
nanosensors based on nanomaterials with analytical purposes
INTRODUCCIÓN
90
INTRODUCCIÓN
91
RECENT APPLICATIONS OF NANOELECTRODES AND NANOSENSORS
BASED ON NANOMATERIALS WITH ANALYTICAL PURPOSES
Ana María Bueno, Ana María Contento and Ángel Ríos
Department of Analytical Chemistry and Food Technology, University
of Castilla–La Mancha, Campus de Ciudad Real, E-13004 Ciudad Real,
Spain.
Abstract
This overview introduces the main concepts behind the
development of nanoelectrodes and nanosensors and the most
relevant electroanalytical applications. We will review the main types
of nanomaterials used to develop these new nanodevices to date,
according to the last 5-6 years, and the electrochemical techniques
performed in order to achieve different applications in several fields of
analysis. The main types of nanostructures, i.e. nanoparticles,
nanotubes and nanowires, are described and explained the properties
and applications related to each nanostructure.
We then discuss the main advantages, drawbacks, weakness,
challenges and actual trends of these nanostructures in the context of
the analytical chemistry.
Keywords: Nanomaterials, nanotechnology, nanoelectrodes,
nanosensors, electrochemistry, analytical applications
INTRODUCCIÓN
92
1. Introduction
Nanomaterials are materials with morphological properties
smaller than 100 nm in at least one dimension. Despite the fact that
there is no consensus about the minimum or maximum size of a
nanomaterial, some authors restrict the size of 1 to 100 µm, a logical
definition would place the nanoscale from microscale (1 µm) to scale
atomic/molecular (about 0.2 nm). A unique aspect of nanotechnology
is the high surface to volume ratio present in many materials in
nanoscale causes the appearance of new quantum mechanical effects,
for example, “the size effect as” in which the electronic properties of
solid altered with a great reduction in the size of the particles. This
effect is not important to go from macro to micro dimensions.
However, becomes dominant when the nanoscale is reached.
Moreover, various physical properties change when compared to
macroscopic systems. The new properties of nanomaterials are the
subject of nanomechanic research. Novel catalytic activities reveal its
properties in the interaction with bionanomaterials. Nanotechnology
can be imagined as an extension of traditional disciplines toward the
explicit consideration of the aforementioned properties. In addition,
traditional disciplines can be reinterpreted as specific applications of
nanotechnology. This dynamic reciprocity of ideas and concepts
contributes to the modern understanding of the field. Broadly
speaking, nanotechnology is the synthesis and application of ideas
from science and engineering to the understanding and production of
novel materials and devices. Nanotechnology implies manipulating
individual atoms, molecules or nanosized objects with the aim to
develop materials with novel properties and behaviour that are not
displayed by the bulk matter with the same composition.
Materials reduced to the nanoscale can suddenly show
different properties to those displayed on a macroscale, enabling
INTRODUCCIÓN
93
unique applications. For instance, opaque substances become
transparent (copper), inert materials are transformed into catalysts
(platinum), become stable materials fuels (aluminium), solids become
liquid at room temperature (gold), become conductive insulators
(silicone)… Materials such as gold, which is chemically inert at normal
scales, can serve as catalysts at the nanoscale. Much of the fascination
with nanotechnology stems from these unique quantum and surface
phenomena that matter exhibits at the nanoscale.
Nanoelectrodes are lower electrodes whose dimensions are at
least one order of magnitude to the common electrode. The
dimensions of these electrodes are usually less than 20 µm and can be
up to 30 nm in diameter and 2 µm in length. The electrochemical
behaviour of these electrodes is significantly different from the
classical electrodes and, apparently, has advantages in certain
analytical applications. The main advantages over the classical
electrodes are: the steady state is reached very quickly (µs or ms)
which allow the study of intermediates in fast electrochemical
reactions; the measurements can be made with electrodes with
incredible small solution volumes, for example, the volume of a
biological cell; the tiny currents that generate voltammetric
measurements allow high resistance to solvents, non-aqueous, such as
those used in liquid chromatography on normal phase.
A nanosensor consists of two essential parts: a transducer and
an ion-sensitive receptor layer. Due to the miniaturized transducer,
nanosensor require ion-sensitive receptor layer that must fulfil special
requirements relates to architecture of a transducer, including a
replacement of aqueous layer ensuring its adhesion to a sensor´s
support and a long life-time of the sensor [1]. These miniaturized
sensors are commonly used as analytical devices in many fields of
applications. Biosensors are an alternative to tradition analytical
methods, and probably one of the most interesting ways to solve
INTRODUCCIÓN
94
problems relationated with multidetection techniques [2].
Electrochemical biosensors, especially the amperometrics which
provide high sensibility and better lineal range than potentiometric
ones, have been successfully commercialized due to they have a lot of
advantages compared with optic devices, such as low cost,
miniaturized size, simple operation, they are disposable and
incorporate multiple sensing elements in a simple chip. There are
available extend bibliography about this type of sensors, so that they
will not be commented in this article.
The capacity of detection systems in analytical chemistry is
being improved by the use of nanomateriales such as magnetic
nanoparticles (MBs), carbon nanotubes (CNTs), nanowires (NWs),
nanocanals (NCs), etc. In electrical sensors, these nanomaterials have
high capacity of charge transfer, therefore they are suitable to obtain
better sensibility results and as consequence to low detection limits in
this kind of analytical techniques. Indeed, nanomaterials can be used
as modifiers in sensors improving its performance. Therefore, in this
article we summarize the different types of nanomaterials that are
used in the development of nanosensors, nanoelectrodes and
nanodevices with analytical applications. Then, a classification of
recent works, which have been published in the last 5-6 years, based
on the electrochemical technique used is proportionated. We do not
intend to provide a complete overview of the available literature, but
we describe the current state of the art of nanosensors and
nanoelectrodes ant their applications in analytical chemistry. We then
briefly discuss the main advantages, drawbacks, weakness, challenges
and actual trends in the use of these nanostructures.
INTRODUCCIÓN
95
2. Classification of nanomaterials
2.1. Carbon derivates
Wide varieties of carbon-based nanomaterials (nanodiamonds,
nano-onions, peapods, nanofibers, nanorings, nanotubules, fullerenes,
nanotubes and graphene) are available and have been applied to
analytical procedures. In Figure 1 is shown the structures of the main
types of carbon nanostructures. Regarding the use of this type of
nanomaterials in nanoelectrodes and nanosensors, recent applications
mainly focus on the use of fullerenes, nanotubes (CNTs) and graphene
[3] have been reported. In the two first cases, the basic structure is
composed of a layer of sp2-bonded carbon atoms, where each atom is
connected to three other carbon atoms in the x-y plane and by a
weakly delocalized π-electron cloud along the z-axis. This
configuration, which resembles that of graphene, is responsible for the
good electrical conductivity and the capability to form charge-transfer
complexes when in contact with electron donor groups. Indeed, this
configuration is also responsible for the development of strong van
der Waals´ forces that significantly hamper the dispersion and
solubility of carbon-based nanomaterials. An interesting aspect
stemming from the simple structure of most carbon-based
nanomaterials is that the reactivity of atoms situated in the plane is
different than those at the edges.
Fullerenes are composed of a thermodynamically-stable
carbon shell ~ 1nm in diameter that can withstand heat, pressure and
radiation but, due to their unique electron-hybrization pattern of sp2
bonds, are also highly configurable [4]. Fullerenes display a relatively
high affinity, and a hydrophobic surface that increases their adsorption
capacity towards organic molecules, as well as their permeability
through lipid membranes. In addition, these compounds have a high
INTRODUCCIÓN
96
A) B)
C) D)
Figure 1. Structures of main carbon derivates. (A) Single-wall carbon nanotube
(SWCNT), (B) Multi-wall carbon nanotube (MWCNT), (C) Graphene, (D) Fullerene.
surface/volume ratio which makes them ideal for extraction
procedures in sample preparation [5, 6].
Carbon nanotubes (CNTs) are built from sp2 carbon units, and
are seamless structure with hexagonal honeycomb lattices. CNTs have
closed topology and tubular structure that are typically several
nanometers in diameter and many microns in length. There are two
INTRODUCCIÓN
97
structural families in CNTs, multi-wall carbon nanotubes (MWCNTs)
and single-wall carbon nanotubes (SWCNTs). MWCNTs are composed
of concentric and closed graphite tubules, where each tubule is made
of a rolled graphite sheet. SWCNT is made of a single graphite sheet
rolled seamlessly, which is an individual cylinder of 1-2 nm diameter.
SWCNTs have the tendency to aggregate, usually forming bundles that
consist of tens of hundreds of nanotubes in parallel and in contact
with each other [7]. The interesting properties of CNTs are associated
with their quasi-one-dimensional shape along with sp2 and π-bonding
between the carbon atoms. The π-electrons above and below the
hexagonal graphene layer are free to move and form an electron
band, producing the semi-metal electrical properties of graphite.
However, for the nanotubes, the finite tube circumference restricts
the number of allowed electron states. Hence, the semi-metal state of
graphene is altered and a band gap may open up at a Fermi energy.
CNTs behave electrically as a metal or semiconductor depending on
their structure based on their diameter and helicity (symmetry of the
two dimensional carbon lattices). SWCNT is a well-defined system in
terms of electronic properties and exhibit properties of quantum dots
and wires at very low temperature by Coulomb blockade and single
electron charging [8]. So far, wide ranges of potential and practical
applications of CNTs have been reported, including chemical sensors,
hydrogen energy storage, field emission materials, catalyst support,
electronic devices, gas sensors, electrodes for electrochemical
reactions and biosensors [7]. When properly selected, these carbon-
based nanomaterials have the potential to produce significant
improvements in all of classical analytical processes: sample
preparation, separation, and detection. In the next chapter, recent
works that have been published using CNTs to prepare and modify
electrodes and sensors in electrochemical detection applications are
provided.
INTRODUCCIÓN
98
Similar to CNT, graphene consists of a one atom thick carbon
(sp2 hybridized) sheet composed of six-member rings providing an
exposed surface are that is nearly twice as large as that of single-
walled carbon nanotubes [9]. This material has several advantages like
its high mechanical strength, high elasticity, high thermal conductivity
and the absence of metallic impurities that can affect the accuracy of a
sensor. Thus, this nanomaterial has been extensively used in several
applications. In the next chapter are summarized selected works
related to graphene- electrochemical nanodevices.
2.2. Noble metals
Noble metal nanomaterials (NMNs) are noble metal
compounds which dimensions are in the nanometer range. These
materials have been intensively pursued for their fundamental
scientific interest and also for their many technological applications,
due to their interesting size-dependent electrical, optical, magnetic,
and chemical properties [10]. Size, shape, architecture, composition,
hybrid and microstructure of NMNs are several important key
parameters in determining, revealing and enhancing their functions
and potential applications as fuel cells and analytical sensors.
Gold nanoparticles (AuNPs) have high chemical stability,
oxidation resistance and good biocompatibility. Therefore, gold
nanomaterials have wide applications in a great number of fields, such
as catalysis, electronics, photonics, chemical sensing and imaging,
information storage, drug delivery and biological labelling [11]. The
shape is critical in the properties and functions of gold nanomaterials,
so the controllable synthesis of them is a prerequisite for the
advancement of nanoscience and nanotechnology. For instance,
spherical gold nanoparticles have size-dependent surface plasmon
resonance (SPR) property and generally exhibit visible SPR absorption
INTRODUCCIÓN
99
whereas gold nanorods, gold nanocage and hollow gold nanospheres
own strong near-infrared (NIR) absorption [12, 13]. AuNPs modified
electrochemical interface behaving as nanoelectrode ensembles have
been widely used as enhancing catalytic interface for the development
of electrochemical sensors. The electroanalytical detection limit at a
nanoelectrode ensemble can be much lower than that at an analogous
macrosized because the ratio between the faradaic and capacity
currents is higher [14]. Several examples of the development of
electrochemical sensors using these nanostructures are discussed in
the next chapter.
Silver nanomaterials are of particular interest because Ag
nanostructures with different size and shape show a wide range of
colours owing their localized SPR (LSRP), which is similar to Au
nanostructure. Most importantly, and interesting LSRP property of
silver nanostructures with diverse morphologies enable them to be
used as excellent surface-enhanced Raman scattering (SERS)
substrates because silver exhibits the best SERS effect compared with
other metals such as gold and copper under certain conditions [15,
16]. Silver also exhibited other important applications including
photonics, optical and electrochemical sensing, and biological
labelling, etc. [17]. As gold nanomaterials, the shape of Ag
nanomaterials is a key factor to the properties and further
applications.
Palladium nanomaterials, well-known for its remarkable
capacity in hydrogen absorption, are widely used as primary catalyst
for the low-temperature reduction of automobile pollutants,
hydrogenation reactions, hydrogen purification, petroleum cracking,
water treatment and a range of organic reactions [18, 19]. Pd
nanomaterials also play a key role in fuel cell technology and exhibit
good surface-enhanced Raman scattering (SERS) and sensing activity
[20]. In all of these applications, the size and shape of Pd
INTRODUCCIÓN
100
nanomaterials are still critical parameters in order to maximize their
performance. At present, high-quality Pd nanomaterials with different
shapes have been obtained through a kinetics-controlled or thermally
controlled process, being hollow [21], nanotube [22], nanowire [23]
and nanohorn [24] nanostructures whose have analytical applications
recently.
Platinum nanomaterials have high catalytic activity so they
have been widely applied in many fields including fuel cells, sensors,
and the petroleum and automotive catalysis [25]. A number of studies
reveal that the catalytic reactivity of Pt nanomaterials depends highly
on their morphology, and therefore the design of novel Pt
nanomaterials with unique morphologies has been greatly intensified
due to their potential for enhanced and new properties and
applications in the last decades. Nowadays, Pt and Pt-based
nanomaterials are indispensable and the most effective catalysis for
fuel cells. Fuel cell, as an environmental friendly energy device, has
been intensively studied because of their numerous advantages, such
as its high-energy density, the ease of handling liquid, low
environmental impacts and their possible applications to microfuel cell
[26].
Multimetallic nanomaterials formed by hybridization (such as
designing core/shell, intermetallic, heterostructured and alloy
nanostructure) provide and effective strategy for enhancing the
functionality of metal nanomaterials. For instance, Au@Pd, Au@Pt,
Pt@Pd and Pd@Pt core-shell structures nanomaterials have shown
superior catalytic properties which are not attainable by their
monometallic counterparts [27]. Accurately controlling size, shape,
composition, pore and microstructure of multimetallic nanomaterials
will provide better potentials for tuning their physical and chemical
properties and enhancing their functions and application potentials. In
fact, at present, controllable synthesis of multimetallic nanomaterials
INTRODUCCIÓN
101
is the hottest research topics in NMNs-based science. In the same way,
noble metal nanoclusters formed by few-atom fluorescent (Au, Ag and
Pt in particular) are an emerging research area. They have molecule-
like characteristics and this intermediate character gives rise to unique
and size-dependent fluorescent properties that allow applications of
these species in electrochemluminiscence, catalysis, single molecular
spectroscopy, biological labelling, optical sensing, and biomedical
technology [28, 29].
2.3. Multifunctional nanoparticles
A variety of nanoparticles with several shapes made of
different materials, from organic dendrimers, liposomes, gold, carbon,
semiconductors, silicon to iron oxide, have already been fabricates and
explored in many scientific fields, including chemistry, material
sciences, physics, medicine and electronics [30]. Whereas mono
functional nanoparticles provide a single function- a quantum dot can
exhibit high fluorescence but it cannot be removed from a matrix
using a magnetic field- multifunctional nanoparticles (MBs) are able to
achieve a mixed effect using one system. In these systems variable
strategies are used to attain a combination of properties. In Figure 2 is
shown the possibilities to combine different properties by
modification of surface the nanoparticle core.
The number of different type of NPs is increasing rapidly. They
can be classified into two major types: particles that contain inorganic
elements (usually metals and metal oxides) as a core and those that
are based on organic molecules (carbon nanotubes, dendrimers,
liposomes) as a major building material. In this section multifunctional
magnetic nanoparticles and silica nanoparticles will be addressed,
because the other types of these structures are explained in other
sections of this review.
INTRODUCCIÓN
102
Figure 2. Possibilities in multifunctional nanoparticles [30].
2.3.1. Multifunctional magnetic nanoparticles
Superparamagnetic nanoparticles can be easily separated from
a matrix by using a magnetic field, so they are exciting prospects in
current analytical nanotechnology. They involved several types of iron
oxides, such as Fe3O4 (magnetite), α-Fe2O3 (hematite), γ-Fe2O3
(maghemite), FeO (wüstite), ε-Fe2O3 and β-Fe2O3. Some applications
examples of these iron oxide nanoparticles or magnetic nanobeads
(MBs) are summarize in the next chapter of this work.
INTRODUCCIÓN
103
2.3.2. Silica nanoparticles
Silica is a very appealing material for analytical applications
because it is relatively inexpensive, chemically inert, thermally stable
and biocompatible. Particles sized can be tuned from 50 to 300 nm,
with stable and rigid frame that allows for resistance to mechanical
stress and degradation. Pore diameters can be tuned between 2 and
10 nm allowing different chemicals/analytes loadings. Also, they have
a high surface area and large pore volume allowing high loading of
chemicals. Silica nanomaterials are “transparent”, and are unlikely to
absorb light in the near-infrared, visible and ultraviolet regions or to
interfere with magnetic fields, which allow dopands/functional groups
inside silica matrix to keep their original optical and magnetic
properties [31]. Consequently, the interior and exterior surface of
silica nanoparticles can be selectively functionalized with different
moieties on either surface. Mainly, analytical applications of these
nanostructures have been published as ion-selective electrodes (see
next chapter).
2.4. Quantum dots
Quantum dots (QDs) are colloidal fluorescent semiconductor
nanocrystals whose excitons are confined in all three spatial
dimensions. Consequently, such materials have electronic properties
intermediate between those of bulk semiconductors and those of
discrete molecules. Therefore, quantum dots are semiconductors
whose electronic characteristics are closely related to the size and
shape of the individual crystal. Generally, the smaller the size of the
crystal, the larger the band gap, the greater the difference in energy
between the highest valence band and the lowest conduction band
becomes, therefore more energy is needed to excite the dot, and
INTRODUCCIÓN
104
concurrently, more energy is released when the crystal returns to its
resting state. This very small size has a definite effect on the QDs
photoluminiscent properties and unique electro-optical properties.
Owing to these properties, these nanomaterials emerged as
advantageous alternatives to the commonly used molecular probes in
biological and biomedical applications. Recent advances in QDs
nanotechnology have slowly introduced these nanomaterials in
analytical areas mostly as chemical sensors in fluorescence-based
measurements. Due to the very small size and high surface-to-volume
ratio of QDs their surface become of utmost importance as any
modification of surrounding medium or interaction of given chemical
species, which could be modulated at distinct levels, would result in
significant alteration of the photoluminiscent properties, namely in
terms of emission intensity [32].
The most broadly applied quantum dots are composed of CdS
and CdSe, i.e. of a combination of II-VI elements. Also, other sulphides
and selenides in addition to oxides, halides and tellurides have been
developed. Interactions between quantum dots and metal ions
showed that the luminescence response was markedly affected by the
nanocrystal surface capping ligands. As a result, by suitable selection
within a variety of QDs surface ligands it would be possible to establish
specifics chemosensors. Regarding electrochemical detection, several
works have been published using QDs as labels for both proteins and
DNA determination (biosensors), but a few ones have been found as
sensors (see the following chapter).
2.5. Hybrids
One of the actual trends in nanotechnology is the use of
hybrids (a combination of various types of nanomaterials) due to the
synergy of properties of each compound in the new material (usually
INTRODUCCIÓN
105
named composites). There are available many types of these new
materials with several applications in all scientific fields, being carbon
derivate the most common pattern material used.
It is important to highlight the intensively use of graphene to
form novel hybrids in a huge variety of applications. Since graphene
was discovered in 2004, it has emerged as a promising candidate for
generating novel hybrid materials with excellent properties for a wide
variety of potential applications, such as catalysis support, electronic
components and chemical sensors. This nanostructure can be
interlinked with CNT for the fabrication of high performance
transparent flexible electrodes, resulting in films with conductivities
and optical properties comparable to commercial indium-tin oxide
[33]. Indeed, graphene has been produced linked with several types of
metal nanoparticles. Due to the extend literature available, in the next
chapter is discussed a selection of different works that have been
published related to this nanostructure.
On the other hand, have been recently published several
reports which used carbon-based nanomaterials integrated with
different polymers as electrode materials with enhanced conductivity
and electrocatalytic activity [34, 35]. In addition, composite materials
based on CNTs and inorganic nanomaterials integrate the unique
characters and functions of the two types of components and may also
exhibit some new properties caused by the cooperative effects
between the two kinds of materials. Therefore, these composite
materials have shown very attractive potential applications in many
fields [36]. CNTs have been used as support for the dispersion and
stabilization of catalyst nanoparticles, due to their high surface areas,
electrical conductivities, chemical stability, and the absence of
micropores, where small metal nanocrystals may sink and become
inaccessible. The absence of micropores may modify the adsorption
properties and residence time of the reactants and products on CNTs
INTRODUCCIÓN
106
[37], improving the selectivity of the catalyst. CNTs-supported metallic
catalysts (including Pt, Pd, Au, Ag, Rh, Co and Ni) show excellent
catalytic activities [38, 39].
3. Incorporation of nanomaterials in electrochemical detection
Electroanalytical methods are a type of techniques
in analytical chemistry which study an analyte by measuring
the potential (volts) and/or current (amperes) in an electrochemical
cell containing the analyte. These methods can be broken down into
several categories depending on which aspects of the cell are
controlled and which are measured. The three main categories
are potentiometry (the difference in electrode potentials is
measured), coulometry (the cell's current is measured over time),
and voltammetry (the cell's current is measured while actively altering
the cell's potential). Potentiometry passively measures the potential of
a solution between two electrodes, affecting the solution very little in
the process. The potential is then related to the concentration of one
or more analytes. The cell structure used is often referred to as
an electrode even though it actually contains two electrodes:
an indicator electrode and a reference electrode (distinct from the
reference electrode used in the three electrode system). Coulometry
uses applied current or potential to completely convert an analyte
from one oxidation state to another. In these experiments, the total
current passed is measured directly or indirectly to determine the
number of electrons passed. Voltammetry applies a constant and/or
varying potential at an electrode's surface and measures the resulting
current with a three electrode system. This method can reveal
the reduction potential of an analyte and its electrochemical reactivity.
This method in practical terms is nondestructive since only a very
small amount of the analyte is consumed at the two-dimensional
INTRODUCCIÓN
107
surface of the working and auxiliary electrodes. Amperometry (Amp) is
the term indicating the whole of electrochemical techniques in which
a current is measured as a function of an independent variable that is,
typically, time or electrode potential. Chronoamperometry is the
technique in which the current is measured, at a fixed potential, at
different times since the start of polarization. Chronoamperometry is
typically carried out in unstirred solution and at fixed electrode. On
the other hand, voltammetry is a subclass of amperometry, in which
the current is measured at varying the potential applied to the
electrode. According to the waveform that describes the way how the
potential is varied as a function of time, the different voltammetric
techniques are defined: anodic adsorptive stripping voltammetry
(AdSV), normal pulse voltammetry (NPV), differential pulse
voltammetry (DPV), square-wave voltammetry (SWV), cyclic
voltammetry (CV) and linear sweep voltammetry (LSV).
3.1. Potentiometric techniques
Potentiometry represents a very attractive option for
numerous analyses due to the low cost, short response time, high
selectivity and broad range of response. However, potentiometric
techniques still suffer from problems, related sometimes to the lack of
sensitivity, high detection limits and difficulties in electrode
miniaturization besides others [40]. In this context, the combination of
nanomaterials with potentiometric sensing devices is a promising area
of research in order to overcome the limitations of the technique.
Beside the exceptional electrical properties and the extraordinary
electrical capacities generated at the nanomaterials interface, the
extremely high surface-to-volume ratio of nanomaterials such as
carbon nanotubes (CNTs) or metal nanoparticles (MNPs) promotes a
greater interaction with targets when nanostructures are present in
INTRODUCCIÓN
108
the recognition layer. The two potentiometric sensors available are
ion-selective electrodes (ISEs) and field-effect transistors (FETs).
ISEs are commonly known as potentiometric sensors that
include a selective polymeric membrane as recognition elements for F-
,I-, CN-, Na+, K+, Ca2+, NH4+, Pb2+, Cd2+, Cu2+ or even gases (i.e. CO, NH3).
The introduction of nanostructures material as transducers in ISEs
enables the development of new types of potentiometric sensors in
which polymeric membrane is replaced by receptors directly linked to
the nanostructured transducer (i.e. CNTs, MNPs, fullerene, graphene,
NWs).
On the other hand, FETs measure the flow of the current
across a transistor that links the source and drain electrodes [40]. FETs
use a semiconducting channel whose conductivity is affected by
externals fields which in this case corresponds to a potential variation.
This variation in the potential is the reason why FETs are classified as
potentiometric sensors. Incorporation of nanostructures materials into
FET designs allows overcoming drawbacks such as unstable response.
The main advantages coming from the nano-FETs can be attributed to
their ultra-low detection limits, possibility of direct functionalization
with the nanostructure material and easy miniaturization. Table 1
gathers different recently works which use potentiometric techniques.
As it can be seen in this table, metal nanoparticles (MNPs),
carbon nanostructures materials (CNTs and graphene), silica based
nanostructures (nanoporous silica (NS) and Si nanowires (SiNWs)) and
combinations of both carbon nanotubes and nanoporous silica have
been reported as potentiometric sensors. In the case of FETs, the most
used nanostructured materials are carbon nanotubes and
semiconductor nanowires. Curiously, the electrode used in almost all
these potentiometric sensors is carbon paste electrode (CPE). Three
works have been reported [41, 42, 43] which used AuNPs as
nanostructure electrode for the determination of Al (III) and Cu (II) in
INTRODUCCIÓN
109
Table 1. Nanomaterials applications in relation to potentiometric techniques
Electrode Technique Analyte Sample LOD (µg/L) Reference
AuNPs-CPE ISE Al (III) Waters - 41
AuNPs-CPE ISE Al (III), Cu (II)
- 0.16 – 0.4 42
AuNPs-CPE ISE Cu (II) - 0.03 43
Graphene-CPE ISE Nitrate Water 30 44
SWCNTs FET Hg (II) - 0.01 45
CNTs-solid contact
ISE Ca (II) - 1.6 46
MWCNTs-CPE ISE Pb (II) - - 47
MWCNTs-CPE ISE Pb (II) Waste water, black tea
0.0003 48
MWCNTs-CPE ISE Hg (II) Water, dental amalgam
0.5 49
NS/Thiourea ISE Hg (II) Waste water, fish
0.07 50
SiNWs FET Cu (II) - - 51
MWCNTs/NS-CPE
ISE Pb (II) Water, black tea
0.1 52
MWCNTs/NS-CPE
ISE Cd (II) Environmental, biological
0.002 53
MWCNTs/NS-CPE
ISE Cu (II) Waste water - 54
ZnONPs ISE Fe (III) - 5 55
INTRODUCCIÓN
110
water samples. Only one of these works [43] reported a detection limit
in the determination of Cu (II), which value was 0.03 ppb. Different
carbon nanomaterials like graphene [44], SWCNTs [45], and MWCNTs
[46-49] have been published as ISEs for the determination of several
metals in real samples, mainly waters. It can highlight the low
detection limit in the range nM (ppt) obtained by Zuo et al. [48] in the
determination of Pb (II) using a MWCNTs-CP electrode. On the other
hand, solid contact ion-selective electrodes (SC-IESs) have been
recognized as the next generation of ISEs, because of they can provide
very low detection limits. Moreover, due to the fact that these
electrodes do not require an optimization of the inner filling solution,
this method presents new advantages such as good mechanical
stability and simplicity [56, 57], so different designs and/or disposable
use are possible. For instance, a SC-IES have been reported by
Heineman and co-workers [46] for the determination of Ca (II) with a
detection limit of 1.6 ppb. Silica nanostructures have been explored to
fabricate IESs [50] and FETs [51]. A highly sensitive and specific copper
ion sensor using single crystalline silicon nanowires (SiNWs) configured
as FETs was reported by Yang et al., obtaining a low detection limit of
10 nM. Potentiometric sensors based on hybrids formed with
combinations of both multiwall carbon nanotubes and nanoporous
silica have been published [52-54] for the determination of several
metals (Pb, Cu, Cd) in different types of samples. Low detection limits
ranged from 0.1 to 0.002 ppb were obtained.
3.2. Voltammetric techniques
Voltammetric techniques are certainly the most widely used
methods in electrochemical analysis. This is due to its relatively low
cost, and the wide-spread diffusion of the related instruments
required for such techniques, in addition to the enhanced sensitivities
INTRODUCCIÓN
111
achieved by new electrode materials in recent decades. The
electrochemical transduction material is a key point in the
electrochemical enhancement sensing strategies. In this context,
nanostructured platforms ranging from carbon nanomaterials to
metallic nanoparticles and other natural nanostructures adsorbents
are being deeply investigated [58, 59]. Table 2 listed selected recent
works published related to the use of nanomaterials involving
voltammetric techniques. As it can be seen from this table, different
voltammetric techniques (from anodic adsorptive stripping
voltammetry (AdSV) to differential pulse voltammetry (DPV)) are
utilized in these works, being, for instance, AdSV the most used
voltammetric technique for the determination of trace metals. Several
types of analytes are determined, involving different drugs, phenolic
compounds, neurotransmitters, metals, halides and reactants for fuel
cells. In the same way, a high variety of samples are analyzed to
demonstrate the real analytical applications of the researches
performed. The fabrication of the modified electrodes depends on the
type of nanomaterial involved, existing different strategies to perform
the novel nanodevices. There is available exceptional literature
regarding this issue, so it is not being commented in this work.
Although, relevant summarize information about it is provided.
Related to CNTs, which are the most extended nanomaterials used,
modified electrodes are fabricated by the incorporation of a small
volume of CNT dispersion over the surface of glassy carbon electrodes
(GCE), carbon microfibers electrodes (CFME), screen printed
electrodes (SPE), graphite electrodes (GE) and carbon paste electrodes
(CPE). In a first step, the electrode is properly cleaned. Then, in order
to prepare homogenous dispersions of CNTs, different ways involving
acid concentrate pre-treatment and organic solvents like
dimetylformamide, dimethylsulfoxide, chitosan and nafion as
dispersants solvents are reported. The modified electrodes are dried
INTRODUCCIÓN
112
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
Carbon derivates
SWCNT-GCE
CV, DPV, Amp
Ranitidine, metrodinazole
Serum 0.06 - 0.08 60
SWCNT-GCE DPV Bisoprolol fumarate
Human urine,
commercial tablets
0.8 61
SWCNTs-GCE CV o-,m-,p-Dihidroxibencene
- - 62
SWCNTs-GCE LSV, DPV Cd (II) Water 0.009 63
SWCNT, MWCNT-GCE
Amp
Antioxidants, vitamins, vanilla flavours, isoflavones
- - 64
MWCNT-CPE AdSV Mo (VI) Water 0.0001 65
MWCNT-GCE CV Hydroquinone - - 66
MWCNT-GCE Amp Isoflavones - - 67
MWCNT-GE AdSV Capsaicin Hot pepper
sauces 0.31 68
MWCNT-SPE
Osteryoung square-wave voltammetry (OSWV)
Arylsulphatase, acid and alkaline phosphatase
Soil - 69
MWCNT-CPE CV, DPV Ascorbic acid, acetaminophen, isoniazid
Commercial drugs, plasma
- 70
MWCNT Amp Hydroquinone, catechol, resorcinol
Artificial wastewater
0.2 - 0.6 71
MWCNT-GCE Amp Phenols - - 72
MWCNTs-GCE CV, DPV Ethamsylate - 0.4 73
MWCNTs-SPE CV Hidroquinone, dopamine, NADH
- - 74
INTRODUCCIÓN
113
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques (cont.)
Graphene-GCE CV, SWV Paracetamol - 0.03 91
Graphene-SPE CV, DPV Dopamine - 4 92 Graphene-GCE CV Dopamine - 2.64 93
Graphene CV, DPV, AdSV
Cu (II), Pb (II), Cd (II)
- 0.00001 94
CNPs-SPE AdSV Cd(II), Cu (II), Pb (II), Hg (II)
Water - 95
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
MWCNTs-CFME DPV Ascorbic acid Rat brain - 75
MWCNTs-CPE CV, DPV Bergenin Tablets 0.08 76
MWCNTs-GCE AdSV Pb (II), Cu (II) Water 1.0 - 15.0 77
MWCNTs-GCE AdSV Zn (II) Water 0.0014 78
MWCNTs-CPE DPV Ascorbic acid, acetaminophen
Tablets 2.1 - 7.5 79
MWCNTs DPV Levofloxacin Urine 0.008 80
MWCNTs-GCE, GE
DPV Idarubicin - 0.02, 0.04 81
MWCNTs-GCE DPV Nifedipine - - 82
MWCNTs-CPE CV, SWV Norepirefrine - 0.08 83
MWCNTs-GCE CV, DPV O2 - - 84
MWCNTs-GCE SWV Microorganisms - - 85
MWCNTs-GCE CV H2O2 - - 86
MWCNTs-GCE Amp Sulfonamides Tablets,
water, milk 10.0 - 40.0 87
Graphene-GCE CV Baicalein - 0.006 88
Graphene-GCE DPV Cytosine - - 89
Graphene-GCE DPV Hydrazine - - 90
INTRODUCCIÓN
114
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques (cont.)
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
CNPs-GCE DPV Ractopamine Urine 0.0002 96
CNPs-SPE,CPE DPV Nitrite - 0.005 97
CNF-GCE CV, DPV Dopamine, ascorbic acid, uric acid
- - 98
CNF, SWCNTs-GCE Amp H2O2, nitrite - 2 99
CNF-SPE Amp, DPV Nitrofurantoin Water - 100
Noble metals
AuNW array AdSV Pb (II) - 1.095 101
AuNPs-SPE AdSV Sb (III) Water, tablets
0.0009 102
AuNPs-CPE Amp, DPV Terazosin Urine 0.0001 103
AuNPs-SPE SWV Hg (II) Dust - 104
AuNPs-AuE DPV Folic acid Food 0.008 105
AuNPs-AuE CV Iodide - 0.12 106
AuNSs-GCE Amp H2O2 - - 107
AgNPs-GCE DPV Nebivolol Tablets 0.001 108
AgNPs-AuE CV, DPV 4-nitrophenol - 0.19 109
AgNPs-GCE CV Dicloromethane, halothane
- - 110
AgNPs-GCE DPV Nifedipine - 0.72 111
AgNPs-GCE AdSV As (III) - 1.2 112
AgNPs-GCE CV, DPV Nitrite Food 1.2 113
AgNWs-PtE CV, AdSV Halides - 32.0 - 59.0 114
Pd nanohorn CV Formic acid - - 24
Pd-GCE CV Oxygen - - 115
INTRODUCCIÓN
115
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques (cont.)
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
Pd-CFME CV Ethanol - - 116
Pd-CPE CV Ethanol - 20 117
PdNWS-GCE Amp Formaldehyde - 0.5 23
Pt-GCE CV, DPV, Amp
Nitrite - 0.15 118
Pt-SPE CV, DPV, Amp
Dapsone - 0.76 119
Other metal nanostructures
BiNPs-SPE AdSV Zn (II), Pb (II), Cd (II) Water 0.9 - 4.9 120
BiF3-CPE AdSV Heavy metals - 1 121
Bi/IrNWs SWV Pb (II), Cd (II) Water 1.0 - 1.5 122
MnO2NPs-SPE Amp, DPV Diazinon, butyrylcholinesterase
- 0.0006 -
0.000001 123
RuXMo (X=Se,Sn)-GCE CV Oxygen - - 124
Ru-GCE Amp H2O2 - 0.15 125
LaPO4NWs-CPE CV, DPV Dopamine, uric acid - 0.13 - 0.9 126
NiNPs-CPE CV Glycerol - - 127
ZnSNPs-CPE CV, DPV Thioridazine - 0.065 128
ZnONPs-AuE Amp Hydrazine - 0.066 129
Multifunctional nanoparticles
MBs-GCE CV, DPV, Amp
Hydrazine - 0.05 130
MBs-CPE AdSV Sabultamol Tablets, blood
plasma 0.00009 131
SiNPs-GCE CV, DPV Purine bases - 15 132 Quantum dots
CdS-GCE CV Hemoglobin Blood 0.005 133
CdTe-AuE Amp Dopamine - 0.0013 134
Hybrids
Graphene/SWCNTs-GCE CV Acetaminophen - 0.039 135
INTRODUCCIÓN
116
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques (cont.)
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
Graphene/Pt-GCE Amp, CV Oxygen - - 136
Graphene/MBs-GCE CV, DPV, Amp
N-acetylcysteine - 11.1 137
Graphene/Ni-GCE CV Glucose - 0.3 - 2.5 138
Graphene/Ni, Co-GCE CV Microbial fuel cells
- - 139
Graphene/Au-GCE CV Nitric oxide - 0.133 140
Graphene/SnO2NPs CV LIBs - - 141
Graphene/CoFe2O4 CV LIBs - - 142
Graphene/Pt-GCE CV Methanol - - 143
Graphene/Cyclodextrin SWV Pb (II), Cd (II) - 0.00007 - 0.00009
144
Graphene/PANI-GCE CV 4-aminophenol - 0.065 35 Graphene/ phosphotungstic acid
Amp Methyl jasmonate
- 0.2 145
Graphene/Azure I/Au-GCE
CV H2O2 - 10 146
MWCNTs/Cyclodextrin-CPE
Amp Nifedipine Tablets, blood serum
0.025 147
MWCNTs/PS Amp Rutin, quercetin Plant - 34
MWCNTs/Cu-GCE CV Dopamine - 0.05 148
MWCNTs/Ag-GCE CV H2O2 - 0.004 149
MWCNTs/Ag-GCE CV, DPV Oxygen - - 150
MWCNTs/Au-GCE CV, DPV Tramadol Tablets 0.068 151
MWCNTs/Au/MIP AV, Amp Bisphenol A Honey, water,
grape juice 0.004 152
MWCNTs/Au-SPE Amp, CV Hg (II) Water 0.2 153
MWCNTs/PtPd Amp, CV NO2, H2S, NH3, CO
- - 154
MWCNTs/Rh Amp CO, H2 - - 155
SWCNTs/MWCNTs/Pt CV, DPV, Amp
Methanol fuel cell
- - 156
INTRODUCCIÓN
117
Table 2. Nanomaterials applications in relation to voltammetric techniques (cont.)
Electrode Technique Analite Sample LOD (µg/L) Reference
MWCNTs/PtRu Amp, CV Methanol fuel cell - - 157
MWCNTs/Pd-GCE Amp, CV Ethanol fuel cell - - 158
CSs/Zn-Sn CV LIBs - - 159
CSs/Polypyrrol-SPE AdSV Hg (II), Pb (II) Water 0.00002- 0.000004
160
CNPs/MBs-GCE CV, DPV Oxygen - - 161
CNF/Fullerene-GCE Amp, CV NADH - - 162
Fullerene/Pd-GCE Amp, CV Methane - - 163
Pt/MBs CV, DPV Nitrite Water, juice
- 164
MWCNTs/HAP-GCE AdSV Cd (II) Water 0.004 165
Bi/HAP-GCE AdSV Pb (II), Cd (II) - 5 166
Cu/TiO2/CNPs CV LIBs - - 167
AgCl/PANI-GCE DPV Hydrazine - 0.28 168
(in air or under an infrared lamp) to evaporate the solvent. Similar
processes with the others nanomaterials are performed to fabricate
new electrodes. Generally, in a first step is prepared the solution o
dispersion of nanomaterial in order to obtain the adequate size and
structure required. Then, the surface of the electrode is cleaned,
whose treatment depend on the type of electrode. Finally, a small
volume of a solution (or dispersion) of nanomaterial is cast onto the
surface of the electrode and dried (normally in air).
INTRODUCCIÓN
118
Regarding carbon derivate modified electrodes, four works
[60-63] have been selected which used SWCNTs modifying GCE to
determine different types of analytes like drugs, Cd (II) and
dihidroxibencene. Detection limits were reported in the range low sub
µM in the analysis of human fluids (serum and urine), tablets and
water. The group of Gonzalez and co-workers [64] compared the
electrochemical behavior of SWCNTs and MWCNTs in the
amperometric determination of several antioxidants, vitamins, vanilla
flavours and isoflavones using a µ-chip of capillary electrophoresis.
Results indicated that MWCNTs provided better sensitivity in all of
determinations. On the other hand, several groups have proposed
different sensors based on MWCNTs modified electrodes. It can be
highlight that the lower detections limits were obtained in the
determination of trace metals in waters by AdSV technique. Is the case
of the determination of Zn (II) by Heineman et al. [78], who developed
a sensitive sensor with a detection limit of 14 ppt, and the
determination of Mo (VI) by the group of Feng [65] with an
exceptional detection limit of 0.1 ppt. Recently, Ozkan and co-workers
[81] have studied the electrochemical behavior of the anticancer drug
idarubicin at multiwalled carbon nanotubes modified glassy carbon
and edge plane pyrolytic graphite electrodes, using AdSV. Results
showed differences in detection limits with both modified electrodes.
Detection limits were found as 1.87×10−8 M and 3.75×10−8 M based on
modified glassy carbon and edge plane pyrolytic graphite electrodes,
respectively. Also, a novel methodology has been developed by Rios et
al. [87] for the amperometric screening of several sulfonamides using
a MWCNT-GC electrode. This is the first time where this modified
electrode is use in the determination of these analytes, obtaining a
rapid and simple strategy to classified waters and milk samples
according to the current legislation. Graphene modified electrodes
have been performed in the determination of baicalein [88], cytosine
INTRODUCCIÓN
119
[89], hydrazine [90], paracetamol [91], dopamine [92, 93] and
different metals [94]. A detection limit in the low range of ppt was
obtained in the determination of baicalein using a CV technique by the
group of He [88]. Indeed, Zhi et al. [94] developed an extremely high
sensitive sensor for the determination of Cu (II), Pb (II) and Cd (II) (the
detection limit reported for these analytes was 0.01 ppt). Different
voltammetric techniques like CV, DPV, and AdSV were involved in the
study of the electrochemical behavior of these analytes onto the
fabricated electrode. Other carbon derivate such as carbon
nanoparticles (CNPs) and carbon nanofibers (CNF) have been used to
modify several electrodes (GCE, SPE, and CPE). For instance, a sensitive
CNPs-GCE was developed by Zhang and co-workers [96] for the
determination of raptopamine in urine samples. A detection limit of
0.2 ppt was obtained using DPV technique. Palleschi et al. [99]
compared the amperometric performance of CNF and SWCNTs
modifying a GCE in the study of the electrochemical behavior of H2O2
and nitrite. Good results were found with both electrodes.
In relation to the use of noble metals as modifiers to
fabricated novel nanoelectrodes and nanosensors, it has been found
new nanodevices which contain all types of noble metals. For instance,
high sensitive sensors have been developed for the determination of
Sb (II) [102] and terazosin [103] with detection limits in the low range
from 0.1 to 0.9 ppt in samples like water, tablets and human urine,
using AuNPs modified electrodes. Several works have been reported
that use AgNPs modifying mainly GCE. Analytes like nevivolol [108], 4-
nitrophenol [109], dicloromethane and halothane [110], nifepidine
[111], As (III) [112], nitrite [113] and different halides [114] have been
determined, showing the extend variety of new available sensors. Pd
and Pt nanostructures have exceptional catalytic applications when
modified carbon electrodes, and nowadays these nanomaterials are
used in fuel cells with good performances. Examples of these novel
INTRODUCCIÓN
120
electrodes are reported for the electro oxidation of formic acid [24],
oxygen [116], ethanol [117, 118] and formaldehyde [23], using CV as
voltammetric technique.
Other metal nanostructures have been used to fabricate new
devices with analytical applications. Nanoparticles of bismute (BiNPs)
modified SPE were developed by Pinilla et al. [120] for the
determination of heavy metals in water samples, obtaining detection
limits ranged from 0.9 to 4.9 ppb. Later, the group of Efstathiou [122]
carried out the same determination using a combination of BiNPs with
iridium nanowires (IrNWs), but no significant differences were found
related to detection limits. A novel sensor for the determination of a
mixture of diazinon and butyrylcholinesterase based on nanoparticles
of MnO2 modifying SPE, was reported by Kurochkin and co-workers
[123]. Excellent low detection limits (0.6 – 0.001 ppt) were achieved
using DPV and amperometric techniques. Two works have been found
in relation with the use of ruthenium nanostructures. An alloy formed
by RuXMo (X=Se, Sn) was performed to modified GCE for the oxidation
of oxygen [124], and the amperometric behavior of H2O2 was tested by
Sahraei et al. [125] with Ru-GC modified electrode. The group of Jia
[126] developed a sensor of dopamine and uric acid based on a CPE
modified with nanowires of LaPO4. Detection limits in the range sub
µM were obtained. Nanoparticles of ZnS modified CPE for the
determination of thioridazine were used by Afshar and co-workers
[128], who obtained detection limit of 65 ppt using CV and DPV
techniques. Similar results were obtained by the group of Eraiah [129]
in the amperometric determination of hydrazine using a gold
electrode (AuE) modified with ZnO nanoparticles.
Few works are available in the literature related to
multifunctional nanoparticles and quantum dots as modifiers in
electroanalytical applications. It can be explained due to these
nanostructures are extensively used in others research fields. For
INTRODUCCIÓN
121
instance, magnetic beads (MBs) are usually used in biosensors owing
to their good biocompatibility. These types of sensors are out of the
aim of the present work. On the other hand, QDs are mainly used in
fluorescent determinations and biochemical sensors due to their
native properties. Even though, Zheng et al. [130] developed a MBs-
GCE modified electrode for the determination of hydrazine with lower
detection limit than reported by Eraiah [129]. Also, an extremely
sensitive sensor (detection limit of 0.09 ppt) was performed by
Enhessari and co-workers [131] for the determination of salbutamol in
tablets and blood plasma based on MBS-CPE. Indeed, hemoglobin
[133] and dopamine [134] have been determined by QDs modified
electrodes with good detection limits in the range of few ppt.
At present, hybrids formed by composites of at least two types
of combined nanomaterials, suppose the most emerging area of
research. Owing to new properties that have the composites, they can
be used in all scientific fields of analysis, being available a huge
number of papers regarding these new materials. Therefore, it has
been selected some examples of each type of novel hybrids, as it can
be seen in table 2. In spite of the fact that it has been commented in
section 2.5., is important to remark that graphene is one of the most
common nanostructures involved in the fabrication of new
nanocomposites. Graphene linked SWCNTs modifying GCE has been
reported in the determination of acetaminophen by Yang and co-
workers [135]. Also, GCE has been properly modified with graphene
and different metal nanoparticles for the determination of oxygen
[136], N-acetylcysteine [137], glucose [138], nitric oxide [140], and
methanol [143]. There are published several works that use graphene
composites as anode material for lithium ion batteries (LIBs), being
this issue an important current research line. For instance, a
composite fabricated with graphene and nanoparticles of SnO2 has
been developed by Tour et al. [141], and the group of Jia [142] has
INTRODUCCIÓN
122
performed a LIB using a composite formed by graphene linked with
CoFe2O4. Both works have been explored the fabricated hybrids using
a CV technique. On the other hand, Fen and co-workers [35]
developed an electrochemical sensor for voltammetric detection of 4-
aminophenol based on graphene-polyaniline (graphene-PANI)
nanocomposite. Also, a cyclodextrin linked with graphene was
successfully developed by the group of Hu [144] for the determination
of Pb (II) and Cd (II) with detection limits ranged from 0.07 to 0.09 ppt.
Similar composite has been reported by Zarei et al. [147] combining
MWCNTs and cyclodextrin for the determination of nifedine in tablets
and blood serum. Multiwall carbon nanotube/polystyrene
(MWCNT/PS) composite electrodes have been fabricated as sensitive
amperometric detectors of microchip capillary electrophoresis for the
determination of rutin and quercetin in Flos Sophorae Immaturus [34].
Related to MWCNT composites modified with inorganic nanoparticles
as chemical sensors, GCE has been used to fabricated the comment
composites for the determination of dopamine [148], H2O2 [149],
oxygen [150] and tramadol [151]. Huang et al. [152] reported a novel
electrochemical nanosensor based on a molecularly imprinted
polymer (MIP) modified with MWCNTs and AuNPs. The fabricated
imprinted sensor was applied for the determination of bisphenol A in
honey, water and grape juice samples with good recoveries. Screen
printed electrodes were modified with Au nanostructures-CNTs for
electrochemical sensing of mercury in water samples [153]. A gas
chemiresistor fabricated onto alumina using multi-walled carbon
nanotubes (MWCNTs) networked films functionalized with Pt and Pd
nanoclusters for significantly enhanced gas detection of NO2, H2S, NH3,
CO, up to a low limit of sub-ppm level, was developed by Penza and
co-workers [154]. Rh nanoparticles-MWCNTs catalyst was developed
for the conversion of CO and H2 to ethanol [155]. CNTs-metallic
catalysts composites have also been used in fuel cells for chemical
INTRODUCCIÓN
123
energy conversion. Pt/CNT composites possess higher catalytic activity
both for methanol oxidation and for oxygen reduction reaction.
Besides, SWCNTs and MWCNTs exhibit quite different behavior as the
catalyst support for fuel cells [156]. Pt/SWCNT thin film layer allows
efficient proton transfer but mass transfer and mass activity limits,
whereas addition of MWCNTs improve the mass transport and
increase the mass activity. The electro-oxidation of methanol is also
possible by employing PtRu nanoparticles supported on nitrogen-
doped CNT [157]. Another type of composite that can be used in
catalytic reactions is Pd-nanoparticles supported on carboxylic
functionalized CNT for the electro-oxidation of ethanol on a GCE [158].
Other carbon nanostructures like carbon nanospheres (CSs), carbon
nanofibers, carbon nanoparticles and fullerene have been published.
For instance, CSs coated Zn–Sn metal nanocomposite was developed
by the group of Li [159] for anode material for LIBs. The same
nanostructures (CSs) were combined with polypyrrol modifying SPE for
the high sensitive determination of heavy metals in water samples
(detection limits ranged from 0.004 to 0.02 ppt) by AdSV [160]. A
novel all-carbon two dimensionally ordered mesoporous carbon and
fullerene can greatly facilitate heterogeneous electron-transfer
processes and provide a promising electrochemical sensing platform
[162]. Electrodeposition of palladium nanoparticles on fullerene
modified glassy carbon electrode for methane sensing was reported
by Choi et al. [163]. In the last years, other natural adsorbents as
electrochemical surfaces have been developed [165, 166]. Nanosized
hydroxyapatite (HAP) has been used to provide three-dimensional
network structures in electrochemical sensors. For instance, the
combination of HAP with carbon nanotubes has been evaluated for
the determination of Cd (II) in water [165]. Later, the group of
Abdullah [166] proposed a composite fabricated with bismute and
INTRODUCCIÓN
124
HAP for the determination of Cd (II) y Pb (II). Both methods have used
AdSV for quantitative analysis of trace metals.
4. Nanomaterials: Critical discussion
Nanosensors can provide very low detection limits, be used in
a high variety of detectors and they ensure good stability. Indeed,
these nanomaterials consume very low volumes of reactants and time,
and proportionate results with repeatability and reproducibility.
Nevertheless, the main advantage is the user-friendly applicability,
e.g., they needn´t be used by professionals. The idea is to develop
automatic devices which proportionate fast response or assure a
simple communication with the final user.
The introduction of nanomaterials into electrochemical
sensors brings advantages such as: decrease overpotentials of many
analytically important electrochemical reactions, ensure the
reversibility of some redox reactions which are irreversible at
unmodified electrodes and bring novel labelling opportunities
including multidetection capabilities [169]. For instance,
nanomaterials modified electrodes have shown improved
performance in electrochemical analysis of heavy metals due probably
to the improved electronic/catalytic properties. Such improvements
are related to the increased active electrode area due to the size of
nanomaterials. As a consequence of their size, these materials have
flexibility/easy application in various biosensing systems (i.e. DNA
sensing) that in turn are shown to be useful for indirect detection of
heavy metals. Such combination is bringing new advantages in the
heavy metal detection selectivity and sensitivity due to the
combination of biorecognition specificity with the sensitivity and easy
integration of nanomaterials. Given the size of nanomaterials and the
INTRODUCCIÓN
125
various electrical/electrochemical detection technologies the
possibility exists to further miniaturize the heavy metal detection
sensors so as to obtain in situ devices that can easily integrated into
complex monitoring systems that use to incorporate a variety of
devices and where the compactness of the systems is a challenging
issue. Such a system would be with great interest for environmental
monitoring but also for biological/toxicological studies [170].
Compton et al. [171, 172] found that metallic impurities within
CNTs, not CNTs themselves, are responsible for the electrochemical
catalysis in several redox reactions. Indeed, this group demonstrated
that the electrochemistry of CNTs is comparable to that of graphite for
a variety of biologically important compounds, such as
neurotransmitters and NADH. Furthermore, surface modification of
the underlying electrode with CNTs leads to a changed mass transport
regime from semi-infinite diffusion to effective thin layer diffusion in a
porous layer with the result that some authors mistake the increased
current as signs of electrocatalysis. Pumera y Ambrosi [173] had
recently demonstrated that nanographitic impurities are responsible
for the observed “fast” electrochemistry of CNTs towards redox
behaviour of ferro/ferricyanide, hydroquinone and the azo group.
One of the most important weakness of nanomaterials is
about toxicity. Generally, nanomaterials are more dangerous than
“macro-materials”, but are needed to define two cases: first,
nanomaterials closed to others materials, which toxicity only depends
of their nature, and secondly, nanoparticles dispersed in the air, which
can be more dangerous when they are inhaled. Examples in the
literature show that industrial inorganic nanoparticles and carbon
nanostructures may incidentally or intentionally enter into contact
with living organisms and can break down normal activity and may
lead to malfunctioning and disease. NMs are able to cross biological
membranes and access cells, tissues and organs. NMs can also enter
INTRODUCCIÓN
126
the blood stream via inhalation or ingested and penetrate the skin
[174]. For instance, Doak and co-workers show the potential of NMs to
produce mutations in the DNA and to lend structural damages in
mitochondrias and to cause death cell [175].
Size is the main factor to determinate the potential toxicity of
nanoparticles, but is needed to consider other factors such as chemical
composition, shape and morphology, surface structure, surface
charge, aggregation and solubility, and the presence or absence of
other chemical functional groups [176]. For these reasons, is very
difficult to generalize about health risk relationated with NMs; each
new NM have to be individually test, considering all its properties.
Another main issue regarding weakness of NMs is related to
the cost. There are several nanomaterials that have high cost for
routine analysis. For instance, one of the major obstacles for fuel cell
commercialization is the cost and reliability issues of Pt nanocatalysts
used [177].
On the other hand, nowadays there are very scarce regulation
relationated with NMs, so that more research on NMs is needed to
improve of scientific knowledge in support or regulatory work [178]:
development of reliable measurement methods, reference materials
and materials characterization; review and development of test
methods for human health, safety and the environment; development
of exposure information throughout the life-cycle of NMs, review of
existing risk-assessment methods; risk management for protection of
workers, networking existing and establishing new infrastructures to
examine health, safety and environmental aspects of NMs.
5. Challenges and trends
Although the development of sensors based on nanomaterials
has shown to be an excellent tool for analyzing process in laboratories,
INTRODUCCIÓN
127
the reproducibility of these systems in real samples is still limited.
Besides are still problems related to the stability of this type of
nanosensors technology, limiting their use in measurements in situ.
In food field, there are natural NMs, intentionally added
engineered nanomaterials (ENMs, derived from naturally occurring
food components, or engineered using materials that are not
endogenous to foods) and NMs resulting from contamination. Natural
nanomaterials (food proteins which are globular particles of 10s to
100s of nm in size, linear polysaccharides with one-dimensional
nanostructures are less than 1 nm in thickness and starch
polysaccharides have small 3-D crystalline nanostructures that are only
10s of nm in thickness) contribute to the complexity of the analysis for
two reasons: first, they should be distinguished from ENM or
contaminating NMs and second, due to their specific physic-chemical
properties, NPs could interact with proteins, lipids, carbohydrates,
nucleic acid, ions, minerals and water in food, feed and biological
tissues [178]. For these reasons are needed analytical techniques
which can differentiate between kinds of nanomaterials. By other
hand, there are very few studies related to the detection of organic
nanoparticles in foods. In addition, the process of analysis and quality
control is very laborious and requires a lot of time. Nowadays devices
are being developed and innovation techniques that can facilitate
simple treatment, improving accuracy and reducing the cost of the
experimental analysis. From this point of view, development of
nanosensors for detecting microorganisms and contaminants is a very
promising application of food nanotechnology [178].
Nowadays, another key point is about Hydrogen. Hydrogen is
considered to the best energy carrier in the future but one of the main
problems to be solved is its high cost. Nevertheless what will be the
hydrogen price today, in future only hydrogen obtained from
renewable resources using electricity from renewable sources will
INTRODUCCIÓN
128
save the World (as it was stated in 2nd World´s Hydrogen Congress in
Turkey). For Latvia, the hydrogen obtained in electrolysis using
electricity from renewables (wind, Sun, water) also would be the best
solution to move to Hydrogen Economics. That is because all
renewables available in Latvia´s geographical situation are giving non-
stable and interrupt power, for which the storage solutions are
necessary. Usage of hydrogen as energy carrier to be produced from
electricity generated by renewables, stored and after used in fuel cell
stack to generate electricity is the best solution. For these reasons,
efficient and stable electrolysers are required for such purposes,
where the use of NMS is a key factor. Smaller electrolysis units are
necessary also for technical solutions were hydrogen is produced and
used directly on demand, for example, hydrogen welding devices, and
hydrogen powered internal combustion cars [179].
Nowadays, chemistry of nanomaterials and nanotechnology
represents one of the keys to increased interest in the food chemistry
due to the development of new sensors and biosensors.
Nanomaterials currently represent a very important role in the design
of sensors systems in the food field, besides presenting these
nanobiosystems advantages for the design of new detection
strategies. The application of nanosensors in this area of analysis could
lead to a vast improvement in quality control, food safety and
traceability, being able to be used in industrial process related
packaging (with the objective of minimizing the use of high value raw
materials and waste generation) monitoring and storage conditions
[169, 180]. Besides, the NMS in food analysis is still in its infancy and
that although it has tested the effectiveness of various methods for
the detection and characterization of NMs, practically no methods
exist to perform their quantification [178]. Furthermore, to carry out a
proper characterization of NMs, which was previously thought
necessary to separate these particles from the food matrix [181], the
INTRODUCCIÓN
129
current trend is to reduce as much as possible the sample treatment
because is important to measure the nanomaterials in the matrix due
to its properties could depend on and be affected by treatment, for
example, the extraction procedure [178].
Other actual research lines are related to the use of
nanocomposities as anode material for lithium ion batteries, and
nanodevices for fuel cells applications. A extend literature have been
published in the last two years about these issues, showing the
increasing interest to develop new nanosensors and nanoelectrodes
with these analytical purposes.
6. Conclusions
In this article, we have discussed several types of existing
nanoelectrodes and nanosensors and their application in
electroanalytical chemistry, highlighting the type of nanomaterial used
and the electrochemical technique carried out. Although fundamental
developments in the nanoscience field is still appearing, the well-
known effects arising only when the size of the structures is reduced
are being applied to develop new sensing devices.
Most of the reviewed types of nanostructures have
successfully shown a great potential for being used in nanosensors
and/or nanoelectrodes, but these nanomaterials have several
limitations that have not yet been properly studied. Further works in
this context are needed.
Acknowledgements
Financial support from the Spanish Ministry of Science and
Innovation (Project CTQ2010-15027) gratefully acknowledged.
INTRODUCCIÓN
130
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C
Parte experimental
Capítulo I
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
142
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
143
El desarrollo de la parte experimental de esta Memoria ha sido
posible gracias a la utilización de varias herramientas analíticas, entre
las que se incluyen reactivos, disolventes, material de vidrio, aparatos
e instrumentos analíticos, etc. A continuación se describen las
herramientas más características utilizadas en esta Memoria, así como
los protocolos empleados en la modificación de los electrodos y el
tratamiento de las muestras analizadas.
1. REACTIVOS Y DISOLUCIONES
En la Tabla 1.1 aparecen especificados los analitos utilizados
en esta Memoria junto con las correspondientes casas comerciales de
distribución y el disolvente en el cual han sido preparadas las
disoluciones de trabajo.
Ø Las disoluciones de cada analito en estudio fueron preparadas
en MeOH (1 g L-1) y conservadas en frigorífico a 2-8o C (malvidina-3-
galactosa, procianidina B2 y todas las sulfonamidas) o a -20o C (ácido
cafeico, ácido gálico, rutina, (+)-catequina y todas las aminas) hasta su
utilización. Las disoluciones de trabajo fueron preparadas diariamente
mediante las diluciones apropiadas en el medio de análisis.
Ø La dispersión (1 g L-1) de nanotubos de carbono multicapa
(MWCNTs) fue preparada semanalmente en Nafión 0.1% (v/v)
sonicando durante 15 minutos, y posteriormente fue conservada en
frigorífico entre 2-8o C.
Ø Acetato sódico, di-hidrógeno fosfato potásico, hidrógeno
fosfato potásico, ácido tricloroacético y acetato amónico, Sigma.
Ø Metanol, acetonitrilo, ácido acético y Nafión, Panreac.
Ø Agua de alta calidad purificada en sistema Milli-Q, Millipore.
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
144
Tabla 1.1. Analitos.
Reactivos Compuesto Distribuidor Disolvente
Polifenoles
Ácido cafeico Sigma MeOH
Ácido gálico Sigma MeOH
(+)-Catequina Sigma MeOH
Rutina Sigma MeOH
Malvidina-3-galactosa Sigma MeOH
Procianidina B2 Sigma MeOH
Resveratrol Sigma MeOH
Sulfonamidas
Sulfanilamida Sigma MeOH
Sulfisoxazol Sigma MeOH
Sulfamerazina Sigma MeOH
Sulfaguanidina Sigma MeOH
Sulfatiazol Sigma MeOH
Sulfadiazina Sigma MeOH
Aminas aromáticas
heterocíclicas
Acetato 3-amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indol (Trp-P-1)
Toronto Research
MeOH
3-amino-1-metil-5H-pirido[4,3-b]indol (Trp-p-2)
Toronto Research
MeOH
2-amino-9H-pirido[2,3-b]indol (AαC)
Toronto Research
MeOH
2-amino-3-metil-9H-pirido[2,3-b]indol (MeαC)
Toronto Research
MeOH
1-metil-9H-pirido[3,4-b]indol (H)
Toronto Research
MeOH
9H-pirido[3,4-b]indol (NH) Toronto Research
MeOH
Otros Nanotubos de carbono multicapa
NanoLab Nafion
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
145
2. MATERIALES Y EQUIPAMIENTO
Ø Potenciostato µAUTOLAB Tipo II conectado a un ordenador y
equipado con un software de análisis electroquímico modelo GPES
(Ecochemie, Utrecht, the Netherlands). En la Figura 2.1. se muestra la
vista frontal del potenciostato utilizado.
Figura 2.1. Potenciostato µAUTOLAB Tipo II.
Ø Electrodos serigrafiados de tinta de carbono (Dropsens, S.L.
Asturias, España) que integran los tres electrodos: electrodo de
trabajo (W.E.) y contraelectrodo de tinta de carbono (C.E.) y electrodo
de referencia (R.E.) de plata. Se han utilizado electrodos serigrafiados
de tinta de carbono (DRP-110) y modificados con nanotubos de pared
simple (SPESW, DRP-110SWCNT) y múltiple (SPEMW, DRP-110CNT). En
la Figura 2.2 se muestra un electrodo serigrafiado de tinta de carbono
DRP-110.
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
146
Figura 2.2. Electrodo DRP-110.
Ø Bomba peristáltica Gilson Minipuls-3 (France).
Ø Válvula de inyección de 6 vías (Rheodyne).
Ø Celda de flujo de detección electroquímica (Metrohm
65303020). Esta celda consiste en un electrodo de referencia
Ag/AgCl/3M KCl (Metrohm Model 60727000), un electrodo auxiliar de
platino y un electrodo de carbono vitrificado (Metrohm Model
60805010). En las Figuras 2.3. y 2.4. se muestran, respectivamente, la
celda de flujo y el electrodo de carbono vitrificado utilizados en los
trabajos experimentales de esta Tesis.
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
147
Figura 2.3. Celda de flujo.
Figura 2.4. Electrodo de carbono vitrificado (GCE).
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
148
Ø Detector electroquímico (Metrohm 791 VA) conectado a un
ordenador. El control y procesamiento de los datos se llevó a cabo
mediante el software Labview (Figura 2.5.)
Figura 2.5. Detector electroquímico utilizado en esta Memoria.
Ø Baño de ultrasonidos (Ultrasons J.P. Selecta, Spain).
Ø Cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Hewlett Packard
1090) equipado con un detector ultravioleta-visible de diodos
en fila (Germany). El equipo está conectado a un ordenador y
está controlado por el software de Agilent ChemStation. En la
Figura 2.6. se presenta el equipo de HPLC-ED empleado en los
trabajos experimentales correspondientes a esta Memoria,
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
149
donde se muestra el acoplamiento entre el cromatógrafo de
líquidos y el detector electroquímico.
Figura 2.6. Equipo de HPLC-ED
Ø Columna analítica de separación Zorbax SB-C18 (Agilent, 150 x
4.6 mm I.D.; tamaño de partícula, 3.5 µm).
Ø Dispositivo para la extracción en fase sólida, (Manifold
Supelco, Spain) acoplado a una bomba de vacío Millipore Vacum.
Ø Cartuchos analíticos Strata-X C18 (Phenomenex, Spain) de 300
mg para la extracción en fase sólida.
Ø pH-metro (Crison 2000) combinado con un electrodo de vidrio
(Spain).
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
150
Ø Balanza analítica Gram Precision ST 120.
Ø Placa calefactora (Selecta, Spain).
Ø Centrífuga (Selecta S-240, Spain).
Ø Sistema de purificación de agua (Elix/Milli-Q, Millipore).
3. MÉTODOS
Ø Protocolo de medida con los electrodos serigrafiados de tinta
de carbono
Para llevar a cabo la medida con los electrodos serigrafiados de
tinta de carbono, se deposita con una micropipeta 50µL de la
disolución de estudio sobre el electrodo, cubriendo por completo la
superficie que contiene los 3 electrodos del sistema, teniendo especial
cuidado de no tocar la superficie de los mismos en el proceso de
deposición. En la Figura 3.1. se muestra el dispositivo experimental
empleado para la medida con este tipo de electrodos.
Figura 3.1. Dispositivo experimental electrodos serigrafiados de
tinta de carbono. AE electrodo auxiliar, WE electrodo de trabajo, RE
electrodo de referencia.
50 μL
AEWE
RE
50 μL
AEWE
RE
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
151
Ø Preparación del electrodo de carbono vitrificado modificado
con MWCNTs
La dispersión de los nanotubos de carbono de pared múltiple
(MWCNTs) se preparó mediante la disolución de 1 mg de los mismos
en 1 mL de Nafión 0.1% (v/v), sonicando la dispersión durante 15
minutos en un baño de ultrasonidos. Una alícuota de 10 µL de esta
dispersión se depositó sobre la superficie de un electrodo de carbono
vitrificado (GCE), para la preparación del electrodo modificado
MWCNTs-GC.
Ø Protocolo de extracción en fase sólida (SPE)
Las condiciones de extracción, que se utilizaron para la extracción
de los analitos de interés, fueron las que a continuación se señalan. El
cartucho de C18 fue activado con 5 mL de metanol y, a continuación,
con 10 mL de agua destilada. Seguidamente, se llevó a cabo la carga
del cartucho con la muestra (leche, agua, pastilla de caldo, caldo
comercial, ternera). A continuación se realizó el lavado del cartucho
con 5 mL de disoluciones que contenían diferentes proporciones de
MeOH:H2O dependiendo de la muestra analizada. Finalmente los
analitos se eluyeron con 5 mL de metanol (leche) o 3 mL de mezcla
MeOH:ACN (50:50) (agua, pastilla de caldo, caldo comercial y ternera),
disolventes que posteriormente fueron evaporados mediante una
corriente de nitrógeno.
Ø Preparación de las muestras
Vino: Las muestras de vino se acidificaron con HNO3 1 M hasta pH
=1.30 (±0.01) y se almacenaron entre 2-8o C en el frigorífico.
Suplemento alimenticio: Una muestra de 0.6 g (una pastilla) de
suplemento alimenticio se pulverizó en un mortero, se disolvió con 25
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
152
mL de metanol en un baño ultrasonidos durante 15 minutos y se
almacenó entre 2-8 oC en el frigorífico.
Fruta: Muestras de 5 g (piel) o 10 g (pulpa) se pusieron en
contacto con 10 mL de metanol en un baño de ultrasonidos durante
30 minutos. A continuación se separó el sobrenadante y el residuo fue
tratado con otras dos porciones de metanol de 10 y 5 mL de forma
independiente, sometiéndolos a 150 y 30 minutos respectivamente de
ultrasonidos. El volumen de sobrenadante resultante (25 mL) se
centrifugó a 300 rpm durante 10 minutos, se filtró con membranas de
nylon de 0.45 µm y se almacenó entre 2-8 oC en el frigorífico.
Té verde: 0.6 g se disolvieron en 5 mL de metanol mediante
agitación con imán sobre placa magnética durante 1 hora. A
continuación la disolución fue sonicada durante 10 minutos en baño
ultrasonidos y se centrifugó a 300 rpm durante 15 minutos. El
sobrenadante se almacenó a -20 oC en el frigorífico hasta su
utilización.
Preparación farmacéutica: Una pastilla del fármaco en estudio se
pulverizó en un mortero de porcelana, se disolvió en 25 mL de
metanol, se filtró y se almacenó en el frigorífico entre 2-8 oC.
Agua: La procedencia de las muestras de agua analizadas fue agua
de grifo de Ciudad Real y del río Eresma a su paso por Segovia. Dichas
muestras fueron recogidas en frascos limpios de PVC y su pH fue
ajustado a 7.0 con HCl 0.1M. Una vez ajustado el pH, dichas muestras
fueron sometidas al procedimiento de extracción en fase sólida
descrito en el apartado anterior.
Leche: 5 mL de leche se desproteinizaron mediante la adición de
2.5 mL de ácido tricloroacético 20% (p/v). Transcurridos 15 minutos se
CAPITULO I PARTE EXPERIMENTAL
153
procedió a la separación del precipitado formado mediante filtración.
A continuación se ajustó el pH del sobrenadante obtenido a 4.5 con
NaOH 0.5 M y 1 mL del mismo fue sometido al procedimiento de
extracción en fase sólida descrito en el apartado anterior.
Pastilla de caldo: El peso correspondiente a una pastilla (10 g) se
disolvió en 500 mL de agua destilada hirviendo. 10 mL de ésta
disolución se desproteinizaron mediante la adición de 5 mL de ácido
tricloroacético 20% (p/v). Tras la formación del precipitado
transcurridos aproximadamente 15 minutos, se filtró la dispersión
producida, se ajustó el pH del sobrenadante a 7.0 y 1 mL del mismo se
sometió al procedimiento de extracción en fase sólida descrito en el
apartado anterior.
Caldo comercial: 10 mL de caldo adquirido en un supermercado
local se desproteinizaron mediante la adición de 5 mL de ácido
tricloroacético 20% (p/v). Tras la formación de un precipitado
(transcurridos 15 minutos), la dispersión se filtró y después de ajustar
el pH a 7.0, 1 mL del sobrenadante se sometió al procedimiento de
extracción en fase sólida descrito en el apartado anterior.
Ternera: 1 g de carne se trituró adecuadamente en un mortero
de porcelana, al que se le adicionó 10 mL de NaOH 1 M. La dispersión
resultante fue sometida a 15 minutos de sonicación en baño
ultrasonidos y 1 hora de agitación. Transcurrido este tiempo se
desproteinizó el sobrenadante mediante la adición de 5 mL de ácido
tricloroacético 20% (p/v). Tras la formación de un precipitado, la
dispersión se filtró y se ajustó el pH a 7.0 con HCl 0.5 M. El filtrado
obtenido fue sometido al procedimiento de extracción en fase sólida
descrito en el apartado anterior.
PARTE EXPERIMENTAL CAPITULO I
154
Metodologías analíticas basadas en técnicas de Screening
Capítulo II
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
156
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
157
En el presente capítulo se abordan metodologías analíticas
que suponen una simplificación de los procesos químicos de medida,
contribuyendo así a una de las tendencias actuales de la Química
Analítica. La simplificación en este caso se lleva a cabo mediante
técnicas de screening, las cuales van a ser tratadas en esta parte de la
Memoria.
Se comienza con una introducción en la que se definen los
métodos de screening, se proporciona información sobre el papel que
desempeñan dentro del ámbito de la Química Analítica, y se abordan
los parámetros analíticos característicos de este tipo de metodologías.
A continuación, se incluye la parte experimental asociada a esta
metodología que incluye dos trabajos de investigación. En el primero
de ellos se ha desarrollo un método de screening electroquímico de
polifenoles naturales basado en técnicas serigrafiadas. Las medidas se
han llevado a cabo con electrodos serigrafiados de tinta de carbono
sin modificar y modificados con nanotubos de carbono de pared
simple y múltiple, para el análisis de distintas muestras dentro del
campo agroalimentario. En éste trabajo se determinó por primera vez
antocianidinas, un subtipo de polifenoles muy importantes ya que son
responsables de la coloración de los vinos. El segundo trabajo consiste
en la determinación cualitativa de residuos de sulfonamidas en aguas
de diferente procedencia y leche. El screening de dichos compuestos
se desarrolló utilizando electrodos de carbono vitrificado modificados
con nanotubos de carbono de pared múltiple, permitiendo la
clasificación de las distintas muestras de acuerdo con la legislación
reglamentaria existente para este tipo de compuestos. Además la
metodología propuesta en este trabajo también se utilizó para el
análisis cuantitativo de sulfonamidas en fármacos. Los resultados
obtenidos en ambos trabajos permitieron asegurar que las
metodologías propuestas aportan ventajas significativas con respecto
a las técnicas de análisis convencional establecidas.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
158
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
159
ӏӏ.1. Técnicas de
Screening en Química Analítica
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
160
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
161
1. INTRODUCCIÓN
El análisis de tipo cualitativo está adquiriendo cada vez una
mayor importancia en el ámbito de los laboratorios de ensayos
químicos y biológicos, ya que proporcionan una información rápida
que permite adoptar soluciones ante una amplia variedad de
problemas. Los métodos de screening basados en una respuesta
binaria (muestras positivas o negativas, presencia o ausencia de
analito según un nivel de corte, etc), constituyen una parte importante
de este tipo de análisis. La metrología y las cuestiones relativas al
aseguramiento de la calidad asociada a este tipo de información están
siendo desarrolladas en la actualidad, siendo la fiabilidad de la
respuesta binaria, sustentada en la trazabilidad y la incertidumbre de
la información, y la validación de estas metodologías, los aspectos más
importantes a tener en cuenta [1].
Los métodos de screening o de cribado, que se basan
simplemente en respuestas binarias, aseguran la concordancia entre la
información química que se genera en el laboratorio y la requerida por
el cliente en el contexto del problema analítico [2]. Ésta característica
junto con la rapidez de respuesta que proporcionan, da lugar a que los
métodos de screening sean cada vez más importantes en los
laboratorios de rutina [3, 4]. Las características principales de los
métodos de screening son: su carácter más cualitativo que
cuantitativo; la sencillez y en ocasiones inexistente tratamiento de
muestra; son metodologías simples, rápidas y de bajo coste; ofrecen
una respuesta binaria que requiere una confirmación de aquellas
muestras positivas mediante una metodología analítica convencional;
y se evitan errores por degradación de las muestras ya que el tiempo
transcurrido entre el muestreo y el análisis suele ser pequeño [3, 5].
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
162
2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CUALITATIVOS
En la actualidad no existe una clasificación aceptada de forma
general para los métodos cualitativos, sin embargo, la clasificación
más utilizada se basa en el tipo de sistema de detección empleado,
existiendo dos grandes grupos [6]: análisis cualitativo clásico o
sensorial y análisis cualitativo instrumental.
Ø Análisis cualitativo sensorial
En los métodos cualitativos basados en la detección sensorial,
como sistema de detección se utilizan los sentidos humanos,
principalmente el sentido de la vista. Así estos sistemas se basan en la
aparición o cambio de color en una disolución o tira, o en la aparición
de turbidez como resultado de una reacción química, biológica o
inmunológica entre el analito de interés y los reactivos implicados en
el método analítico [7]. De esta manera el cerebro es el que procesa la
señal y la identificación se realiza por comparación sensorial respecto
a un blanco. Estos métodos comprenden los spot test o test kits
(dispositivos comerciales diseñados para aplicaciones concretas), y se
utilizan para cualificar o clasificar muestras [8].
Ø Análisis cualitativo instrumental
Los métodos cualitativos basados en detección instrumental,
son básicamente métodos convencionales cuantitativos en los que la
información obtenida se trata de un modo cualitativo [9], es decir, se
procesa y transforma en una respuesta binaria [8]. En este tipo de
análisis la respuesta corresponde a una medida instrumental como la
absorbancia, fluorescencia, voltamperometría, etc, que se basa en las
propiedades físico-químicas del analito. De esta manera, la presencia
(respuesta binaria SI) o no (respuesta binaria NO) del analito depende
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
163
del nivel que interese detectarlo. Este nivel puede corresponder con el
límite de detección del método o bien con un nivel superior fijado por
la legislación o el cliente [7]. Este tipo de métodos no utiliza curvas de
calibrado sino que la respuesta de la muestra de estudio se compara
con la respuesta proporcionada por una muestra control, que actúa
como referencia ya que contiene el analito de interés con la
concentración seleccionada (límite establecido por el cliente o la
legislación vigente) [6].
3. VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS CUALITATIVOS
Antes de que cualquier método de análisis, ya sea cualitativo o
cuantitativo, sea aplicado en los laboratorios de análisis de rutina, este
debe ser validado. El proceso de validación consiste en verificar y
documentar la validez del método y su adecuación a unos criterios
previamente establecidos [7, 10]. Estas ideas quedan recogidas en la
norma UNE-EN-ISO 17025, que describe la importancia de la validación
del método y su aplicación en los laboratorios analíticos. La validación
de los métodos cualitativos debe de seguir la misma filosofía (asegurar
la trazabilidad) que los métodos cuantitativos. La validación establece
un nexo crucial entre el enfoque metrológico (propiedades analíticas)
y la resolución de los problemas analíticos para asegurar el propósito
perseguido.
La validación de cualquier método de análisis implica el
establecimiento de los parámetros de calidad (trazabilidad,
incertidumbre, etc.) y los parámetros más representativos. Diferentes
organizaciones han establecido como validar los métodos cualitativos
y cuáles son los parámetros que son representativos para este tipo de
métodos [10-13]. Existen diferencias en los procesos de validación
según los métodos sean cuantitativos o cualitativos debido a que los
parámetros de calidad, utilizados en ambos tipos y relacionados con la
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
164
trazabilidad, fiabilidad, incertidumbre y control de calidad, tienen
connotaciones distintas y por lo tanto la forma en que deben
calcularse es diferente [6]. En la Tabla 3.1. se muestran los parámetros
de calidad de los métodos cuantitativos en comparación con los
propios de los métodos cualitativos. Es necesario indicar que en
algunos casos el nombre es el mismo aunque el concepto y definición
relacionados con cada tipo de método es diferente.
Tabla 3.1. Parámetros de calidad para la validación de métodos
cualitativos y cuantitativos [6, 7].
Método cuantitativo Método cualitativo
Exactitud Probabilidad de falso positivo y negativo
Trazabilidad Sensibilidad
Incertidumbre Selectividad
Precisión Límite de detección
Sensibilidad Límite de corte (Cut-off)
Selectividad Límite legislativo (Threshold)
Rango y linealidad Región de inseguridad
Límite de detección Robusted
Robusted
En el proceso de validación de un método analítico cualitativo,
se distinguen los parámetros de calidad básicos, como la trazabilidad,
fiabilidad, región de inseguridad, etc. y los parámetros propios y
característicos, como los relacionados con niveles de concentración, es
decir, el límite de detección, el límite de corte (Cut-off) y el límite
legislativo (Threshold). No todos los parámetros son siempre
necesarios para validar un método cualitativo. La selección de los
parámetros depende, entre otros factores, de la información que se
necesita para el método seleccionado y el área de aplicación. A
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
165
continuación se trata de forma individual cada uno de los parámetros
de calidad asociados a los métodos cualitativos.
Ø Trazabilidad
Para asegurar la trazabilidad de los métodos cualitativos, tanto
para la identificación de analitos como para el screening de muestras
basado en la respuesta binaria SI/NO, la calibración es crucial. La
calibración directa se emplea en el caso de los métodos de
identificación, mientras que la calibración indirecta constituye el factor
clave para los métodos analíticos binarios que utilizan técnicas
instrumentales. Los métodos analíticos binarios pueden ser trazables a
referencias establecidas como los materiales de referencia certificados
(MRCs), y su trazabilidad se demuestra por comparación directa con
los MRCs (si están disponibles), por comparación con otros métodos
de mayor nivel metrológico, o mediante la participación en ejercicios
interlaboratorio cualitativos [1].
Ø Fiabilidad
La fiabilidad es una propiedad característica a la respuesta
del método cualitativo y surge como una combinación de la exactitud
y precisión que no pueden definirse correctamente en el análisis
cualitativo. La fiabilidad se define como la proporción de respuestas
SI/NO correctas suministradas cuando el test analítico se aplica a una
serie de alícuotas de la misma muestra, y pretende asegurar la
coherencia entre la información química suministrada por el
laboratorio con la que necesita el cliente dentro del contexto del
análisis químico [9]. La fiabilidad se calcula a través de la ecuación [8]:
% fiabilidad = 100% - % falsos positivos - % falsos negativos
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
166
de tal modo que en ausencia de errores el porcentaje es de un 100%
de fiabilidad. Un falso positivo surge cuando la señal de una muestra
que contiene el analito a un nivel por debajo de la concentración de
referencia produce una respuesta positiva. Un falso positivo también
aparece cuando la señal perteneciente a un compuesto distinto del
analito da señal. Por otro lado, un falso negativo resulta de la señal de
una muestra que contiene el analito a un nivel por encima de la
concentración de referencia proporcionando una respuesta negativa.
La fiabilidad es equivalente a la certeza tanto en la identificación de un
analito como en la clasificación/calificación de la muestra y está
directamente relacionada con la inseguridad a través del nivel de
probabilidad [2].
Ø Región de inseguridad
La incertidumbre es una propiedad metrológica de los
resultados cuantitativos, pero no es adecuado su uso para caracterizar
la fiabilidad de las respuestas binarias en los métodos cualitativos. Por
éste motivo, se ha propuesto el término “región de inseguridad” para
caracterizar el rango de respuestas donde se producen errores en los
métodos analíticos binarios [2, 3]. Para estimar el rango de
inseguridad, se pueden utilizar curvas de probabilidad donde se
representa la probabilidad de obtener resultados positivos a distintos
niveles de concentración [14, 15]. Esta representación es sigmoidal, y
la posición y amplitud de la curva es característica para cada sistema
de screening. Si x es la respuesta verdadera, se define P (x) como la
frecuencia de respuestas positivas y N (x) la de respuestas negativas y
se construye una gráfica de probabilidad concentración (Figura 3.1.).
La región de inseguridad se define como el rango de concentración de
C0 a C1 donde se cumple que:
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
167
0% < P (x) < 100% 100% > N (x) > 0%
Figura 3.1. Gráfica de probabilidad concentración para la respuesta binaria de los
métodos de screening.
siendo a0 la proporción de falsos positivos y a1 la proporción de falsos
negativos. El intervalo (C0, C1) tal que P (C0) = a0 y N (C1) = a1 indica que
la región de inseguridad corresponde a la proporción de respuestas
falsas [3]. Siguiendo este modelo se definen las siguientes regiones:
· x < C0: Región fiable con respuestas negativas.
· C0 < x < C: Región de inseguridad, zona de falsos positivos.
· C < x < C1: Región de inseguridad, zona de falsos negativos.
· x > C1: Región fiable con respuestas positivas.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
168
Por tanto, es importante definir correctamente la zona de
inseguridad con respecto al valor umbral usado para la clasificación de
las muestras en un determinado método binario.
Ø Límite de detección, límite de corte y límite legislativo
Para transformar la respuesta analítica a binaria de tipo SI/NO,
se usan tres referencias cuantitativas: el límite de detección, el límite
legislativo y el límite de corte. El límite de detección (LOD), el cual es
una característica intrínseca del método, se define como la
concentración más baja de analito que el test puede detectar como
positiva de forma fiable en la matriz dada. El límite legislativo o
“threshold” está impuesto por la legislación o el cliente y es un límite
teórico. Por último, el límite de corte o "“cut-off”, que es impuesto por
el laboratorio para asegurar la fiabilidad de la respuesta binaria con
respecto al límite legislativo, es un límite experimental que indica el
nivel de concentración para el cual el método cualitativo diferencia las
muestras con una probabilidad de error del 5%. Los límites threshold y
cut-off clasifican las muestras en positivas o negativas, es decir, si la
concentración de un determinado analito está por debajo del límite
cut-off se considera negativa y si está por encima del threshold será
positiva [8].
Ø Representatividad
La representatividad se define como la coherencia o
concordancia que existe respecto de los resultados obtenidos de las
muestras analizadas (exactitud), respecto del sistema objeto de
estudio (muestreo), respecto al problema analítico y respecto al
problema económico-social [16]. Por tanto, dicha coherencia debe
existir: (a) entre los resultados analíticos y las muestras analizadas
(realizándose un chequeo con materiales de referencia certificados y
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
169
expresándose a través de la exactitud), proporcionando el proceso de
muestreo y el tamaño de la muestra a analizar; (b) entre la muestra
global objeto de análisis y las muestras analizadas en el laboratorio; (c)
entre el análisis y el problema analítico que se ha de resolver (es
necesario tener información sobre el analito, sus propiedades físico-
químicas, sus niveles de concentración, posibles interferencias y
matriz de la muestra para seleccionar de forma adecuada el método
para realizar el análisis); y (d) entre la Química Analítica y el problema
real (el análisis químico está relacionado con una amplia variedad de
aspectos sociales y económicos y se va a utilizar para resolver una
serie de problemas). Un 100% de fiabilidad en la respuesta binaria se
obtiene cuando la muestra es representativa del conjunto global de la
muestra y existe coherencia entre los cuatro puntos explicados
anteriormente.
Ø Sensibilidad
La sensibilidad en el análisis cualitativo es la capacidad para
detectar cantidades muy pequeñas de analito en la muestra y se
expresa con el límite de detección (LOD) [8].
Ø Selectividad
La selectividad es la capacidad del método cualitativo para
producir respuestas binarias que dependan exclusivamente del
analito, y no de posibles interferencias [17, 18]. Es decir, es la
capacidad de un método para detectar muestras verdaderamente
negativas como negativa.
Ø Robustez
La robustez en los métodos cualitativos describe la resistencia
al cambio de la respuesta binaria aplicando el método a varias
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
170
alícuotas de la misma muestra bajo ciertas condiciones experimentales
ligeramente diferentes. Su finalidad es definir los puntos débiles del
método cualitativo basándose en las variables que son críticas para
asegurar la fiabilidad de la respuesta [8].
Para los métodos binarios basados en señales instrumentales,
es necesario realizar la filtración digital de la señal para dar
información cualitativa en forma de respuesta binaria ajustándose al
valor umbral usado para la clasificación de las muestras [1]. Todo este
proceso se muestra en la figura 3.2.
Figura 3.2. Transformación de un método instrumental en un método cualitativo
binario.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
171
Para las muestras que están dentro de la zona de inseguridad
(rango comprendido entre S0 y S1), la filtración digital da un “resultado
inconcluso” (MUESTRAS INCONCLUSAS), siendo necesario un método
de confirmación posterior para este tipo de muestras.
En resumen, la validación es la confirmación mediante examen
y aportación de pruebas objetivas de que se cumplen unos
determinados requerimientos para un uso específico. Esta validación
comienza con la identificación de las necesidades informativas de los
clientes y continúa con la selección del método de screening que
satisface los requerimientos informativos. Para estos métodos
binarios, el factor clave para la validación es el valor umbral
establecido como referencia. El método debe ser lo suficientemente
sensible y selectivo con respecto al valor umbral y a la naturaleza de
las muestras, respectivamente. Para asegurar que la sensibilidad del
método es la adecuada, es absolutamente necesario establecer la
región de inseguridad. Por tanto, la optimización del método con
respecto al valor umbral es una parte esencial de la validación [1].
4. REFERENCIAS
[1] A. Ríos, H. Téllez, M.R. Plata, “Metrología del análisis cualitativo”,
Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios. CENMA,
Chile, 2006.
[2] M. Valcárcel, S. Cárdenas, D. Barceló, L. Buydens, K. heydorn, B.
Karlberg, K. Klemm, B. lendl, B. Milman, B. Neidhart, A. Ríos, R.
Stephany, A. Townshend, A. Zschunke, Metrology of Qualitative
Chemical Analysis, Report EUR 20605 EN, Directorate General for
Research, European Commission, Luxemburg, 2002.
[3] A. Ríos, D. Barceló, L. Buydens, S. Cardenas, K. Heydorn, B.
Karlberg, K. Klemm, B. Lendl, B. Milman, B. Neidhart, R. W. Stephany,
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
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[4] B. M. Simonet, A. Ríos, M. Valcárcel, Anal. Chim. Acta 516 (2004)
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[5] A. Pulido, I. Ruisanchez, R. Boqué, F. X. Rius, Trends Anal. Chem. 22
(2003) 647-654.
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[12] 657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing
Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical
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[14] R. Song, P. C. Schlecht, K. Ashley, J. Hazard. Mater. 83 (2001) 29-
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METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
173
II.2. Rapid voltammetric
screening test for dietary antioxidant compounds
using screen-printed multiwalled-carbon
nanotubes electrodes
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
174
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
175
RAPID VOLTAMMETRIC SCREENING TEST FOR DIETARY ANTIOXIDANT
COMPOUNDS USING SCREEN-PRINTED MULTIWALLED-CARBON
NANOTUBES ELECTRODES (*)
Abstract
In this work, it had been performed the electroanalytical
determination of natural antioxidant indexes on screen printed
electrodes (SPE) using differential pulse voltammetry. This developed
methodology has been applied to the rapid screening of
representative Mediterranean diet foods, such as different varieties of
wine, fruits and green tea. Carbon SPE and SPE modified with single
(SWCNTs) and multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) had been
systematically investigated as electrodic materials. For this purpose,
they have been chosen seven representative natural antioxidants:
caffeic acid, gallic acid, (+)-catechin, rutin, malvidin-3-galactoside,
procyanidin B2 and resveratrol. Statistical analysis of the obtained
data had demonstrated that the method has achieved linearity and
precision (between 10-12 %) and the quantitative results obtained
were in agreement with those previous reported in the literature.
Keywords: Screening test; Voltammetry; Screen-printed electrodes;
Multiwalled-carbon nanotubes; Dietary antioxidants; Food samples.
(*)Presentado como Diploma de Estudios Avanzados por Ana María
Bueno Sanz
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
176
Introduction
Clinical and epidemiological studies have established an
inverse correlation between the intake of fruits and vegetables and
the occurrence of diseases such as inflammation, cardiovascular
disease, cancer and other related disorders. Dietary or natural
antioxidants, mainly including polyphenolic compounds, are believed
to be effective compounds in the prevention of these oxidative stress
related diseases. The main types of polyphenolic compounds are
phenolic acids and flavonoids (mainly flavanols, flavonols and
anthocyanidins). Antioxidants have thus become a topic of increasing
interest (Huang, Ou, and Prior, 2005; Blasco, González-Crevillén,
González, and Escarpa, 2007).
Depending on the scientific discipline, the scope and
protection targets are significantly different. The term antioxidant has
a multifaceted nature. In food environments, antioxidants have a
broad scope in that they include components that prevent fats from
becoming rancid as well as dietary antioxidants “a substance in foods
that significantly decreases the adverse effects of reactive species,
such as reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS), on normal
physiological function in humans” (National Academy of Science,
2000). Therefore, a dietary antioxidant can sacrificially scavenge
ROS/RNS to stop radical chain reactions, or it can inhibit the reactive
oxidants from being formed in the first place.
A review dealing about the classical antioxidant capacity
assays have been reported (Huang et al., 2005) and the relevant role
of electrochemical techniques in the evaluation of antioxidant capacity
has been conceptually stated as well (Blasco et al., 2007). In the
particular case of controlled-potential techniques, such as cyclic and
pulse voltammetry’s, on the one hand, oxidation potential is
conceptually correlated with the antioxidant capacity. Indeed, low
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
177
oxidation potentials inform about their high antioxidant capacity. On
the other hand, the amperometric current and/or charge measured
under fixed oxidation conditions should give us an idea about the
extension of their capacity as well as the estimation of their total
content. Also, due to the complexity of the composition of food
samples, and taking also into account the possible synergistic
interactions among the antioxidant compounds in the samples,
separating each antioxidant compound and studying it individually is
costly and inefficient. This is the particular case of polyphenols, a lot of
unknown structures could occur in the final extract where the signal
observed is due to all of them. This fact dramatically opens up the
analytical possibilities of electrochemical techniques which could be
used in direct measurement taking into account their inherent
advantages of selectivity and sensitivity. Several works where these
concepts and strategies have been introduced have been published
using conventional cells involving a glassy carbon disk electrode
(Blasco, González, and Escarpa, 2004; Blasco, Rogerio, González, and
Escarpa, 2005; Avila, González-Crevillén, González, and Escarpa, 2006;
Escarpa, González, Blasco, and Rogerio, 2007).
Besides its high sensitivity and inherent miniaturization, an
additional advantage of electrochemical detection is the
possibilities to modify the electrode surface towards the
development of new applications. An excellent example of this
approach is the use of carbon nanotubes (CNTs) (Iijima, 1991;
Iijima, and Ichihashi, 1993). CNTs are a group of nanomaterial with
unique geometrical, mechanical, electronic and chemical properties
(Wang, 2005; Merkoçi, Pumera, Llopis, Pérez, del Valle, Alegret,
2005; Banks, and Compton, 2006). However, the use of CNTs is still
very scared regarding their use in the analysis of real samples and
especially in food ones. CNTs have demonstrated an enhanced
detection performance of antioxidants and other compounds with
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
178
food significance exhibiting a clear electrocatalytic effect enhancing
analytical performance in terms of selectivity and sensitivity
(González-Crevillén, Avila, Pumera, González, and Escarpa, 2007;
Gonzalez-Crevillén, Pumera, González, and Escarpa, 2008;
González-Crevillén, Pumera, González, and Escarpa, 2009, a) y b)).
On the other hand, screen printing technology is a well-established
technology for the fabrication of (bio-) chemical sensors which has
been recently reviewed (Metters, Kadara, and Banks, 2011). This
technology open new doors for de-centralized sensing which is ever
more necessary and thus traditional techniques utilizing high
expensive and immovable analytical equipment.
These interesting advantages derived from the
nanomaterials-based electrochemistry, strategically coupled with
the screen-printed technology, offer a lot of opportunities to
develop sensitive, economical, and disposable screening tools for
the fast and simple detection of target analytes. However, to our
best knowledge, this easy, cheap and disposable technology
combining screen-printed electrodes with CNTs has not been used
for electrochemical screening of these important target analytes in
complex food samples. Therefore, the aim of this work is to explore
the analytical possibilities of commercial screen printed electrodes
(SPEs) modified with CNTs for fast and simple, but reliable
screening of the most prominent antioxidant-classes by analysis of
selected food samples from Mediterranean diet. Without question,
the use of these novel simple and low cost miniaturized
technologies will improve the useful electroanalytical methods
used until date.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
179
2. Experimental
2.1. Apparatus and electrodes
The electrochemical measurements, cyclic voltammetry (CV)
and differential pulse voltammetry (DPV), were performed using a
µAutolab Type II: potentiostat from Eco Chemie (Utrecht, the
Netherlands) with GPES software. Screen printed electrodes from
Dropsens, S.L. (Asturias, Spain) which integrate three-electrode cell
system were also used. It has been explored screen printed carbon
electrodes (DRP-110), modified with simple-wall nanotubes (SPESW,
DRP-110SWCNT) and multiple-wall nanotubes (SPEMW, DRP-110CNT).
2.2. Materials and standards
Caffeic acid, gallic acid, (+)-catechin, rutin, malvidin-3-
galactoside, procyanidin B2 and resveratrol were purchased from
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Red, rose and white wines,
apples and pears, food supplement and green tea tables were
acquired from a local supermarket in Madrid (Spain). Methanol was of
HPLC grade and acquired from Panreac (Barcelona, Spain). In all cases
water was of high quality, purified in a Milli-Q system (Millipore,
Bedford, MA, USA).
2.3. Procedures
Stock solutions of natural antioxidants were dissolved in
MeOH and then stored at -20 oC (caffeic acid, gallic acid, (+)-catechin,
rutin and resveratrol) or at 2-8 oC (malvidin-3-galactoside and
procyanidin B2). Working solutions were appropriately diluted in
electrolytic medium (KCl 10-3M and HNO3 0.1M) at pH= 1.30 (± 0.01)
and used within 24h after preparation.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
180
Wine samples were acidified with 1M HNO3 to pH= 1.30 (±
0.01) and stored at 2-8 oC. Samples of 600 mg of food supplement
were pulverized and extracted with 25mL of methanol in an ultrasonic
bath (15 min) or ultrasound probe (5, 10 and 15 min), and stored
between 2-8 oC. In the case of fruits, are used two different
procedures to the peel or fresh pulp. Samples of 5g (peel) and 10g
(fresh pulp) were extracted with 10ml of methanol for 30 min using an
ultrasonic bath. The samples were extracted with 10 mL of solvent for
1h and 30 min, and then 5 mL for 30 min. The three extracts were
combined giving a final volume of 25 mL. Samples were centrifuged at
1370 x g for 10 min, and then filtered using 0.45 µm nylon
membranes. To green tea, samples of 600 mg were extracted with 5
mL of methanol. The mixture was dissolved by stirring with a magnet
plate for 1 hour. Then, it was extracted in an ultrasonic bath for 10 min
and centrifuged at 1370 rpm (5 min). The sample was stored at -20 °C.
All samples were appropriately diluted with electrolytic medium
(wines and fresh pulp (1:4 v/v), food supplement and peel fruits (1:8
v/v), and tea (1:50 v/v)).
To carry out the measure with screen printed electrodes, a
drop of 50 μL of the solution is deposited with a micropipette on the
surface of electrode, covering completely the surface containing the 3-
electrode system. The measures were carried out by differential pulse
voltammetry (DPV) and cyclic voltammetry (CV), using potential
window between 0-1 V, 70 mV/s as pulse amplitude and 10 mV/s as
scan rate for DPV, and potential window between 0-1.0 V and 10-100
mV/s as scan rate for CV. The screen printed electrodes was
electrochemically cleaned after each run using cyclic voltammetry with
250 cycles at 10V/s as scan rate.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
181
3. Results and discussion
3.1. Electroanalytical characterization of natural antioxidants on
screen printed electrodes.
Caffeic and gallic acids, (+)-catechin, rutin, procyanidin B2 and
malvidin-3-galactoside were properly chosen as representative of the
prominent antioxidant types (phenolic acids and flavonoids) widely
distributed in foods, especially in the real samples studied in this work.
Firstly, the degree of reversibility of antioxidant compounds by cyclic
voltammetry (CV) was examined at pH=1.3 since the use of strongly
acidic medium improves the detection of polyphenolic compounds.
Results indicated that the two acids and flavonoids (+)-catechin and
rutin showed a reversible electrochemical behaviour whereas that for
the anthocyanidin and procyanidin exhibited an irreversible
electrochemical behaviour. Secondly, cyclic voltammograms were
obtained at different scan rates (5 -100 mV/s) for the same antioxidant
standards. The results revealed that the process is controlled by
diffusion in all cases examined.
Then, natural antioxidants were systematically studied using
differential pulse voltammetry (DPV) on carbon (CSPE), single-wall
carbon nanotubes (SWCSPE) and multiwalled- carbon nanotubes
(MWCSPE) screen-printed electrodes. For each material assayed,
Figure 1 shows the voltammograms obtained for each analyte and
Table 1 list the values of oxidation potentials and their corresponding
intensities for each antioxidant by the measure of three consecutive
drops. These results indicated that MWCNTs showed the best
sensitivity and precision performances and in consequence, these
electrodes were chosen for the detection of antioxidants in samples.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
182
Figure 1. Voltammetric profiles of selected antioxidants. (A): Background electrolyte;
(B): CSPE; (C): SWCSPE; (D): MWCSPE. Conditions: Electrolytic medium: KCl 1mM y
HNO3 0.1M (pH = 1.30), scan rate: 10mV/s and pulse amplitude: 70mV.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
183
Table 1. Oxidation potentials (E) and peak intensities (i) with the three sort of
screen printed electrodes for each antioxidant. *SD, standard deviation (n=3)
Antioxidants
CSPE SWCSPE MWCSPE
E (V) i ± SD*
(µA) R.S.D (%) E (V)
i ± SD* (µA)
R.S.D (%) E (V)
i ± SD* (µA)
R.S.D (%)
Caffeic acid 0.339 3.6 ± 1.9 52 0.341 3.8 ± 1.1 30 0.337 5.1 ± 0.6 11
Gallic acid 0.336 3.9 ± 2.1 54 0.321 2.7 ± 1.0 40 0.321 3.1 ± 0.4 12
(+)- Catechin 0.288 5.6 ± 2.2 33 0.292 5.9 ± 0.7 12 0.29 6.2 ± 0.5 8
Procyanidin B2 0.288 2.3 ± 0.8 33 0.302 4.4 ± 1.3 30 0.282 4.7 ± 0.5 10
Rutin 0.362 5.0 ± 1.5 30 0.375 7.3 ± 2.0 28 0.377 9.4 ± 1.3 14
Malvidin-3-galactoside
0.512 1.3 ± 0.7 50 0.516 2.4 ± 0.6 23 0.496 2.8 ± 0.3 11
In fact, values of precision for CSPE and SPEMW electrodes are
extremely high and, therefore, these electrodes would not be used for
natural antioxidants determination in these conditions of analysis.
3.2. Fast electroanalytical screening of natural antioxidants on
carbon nanotube screen printed electrodes in Mediterranean
food samples
Representative selected food samples (food supplement),
wines (red, white and rose), fruits (apples and pears) and green tea
were chosen to be studied by DPV on the CSPEs. All target samples
were also studied using the three electrodes (CSPE, SWCSPE and
MWCSPE) to confirm the choice of optimal electrode MWCSPE for
carrying out the measures in real samples. As expected, again
MWCSPEs gave the best results for all samples studied showing well-
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
184
defined and more sensitive peaks. As selected example, Figure 2(1)
shows the voltammograms obtained for food supplement and Figure
2(2) shows the overlapped voltammograms obtained for the food
supplement and the standards identified to each peak. Please, note
that Arabic numbers are used for the identification of standards while
roman numbers were used to assign the voltammetric peaks in real
sample since the voltammetric response is due to all antioxidants class
contained in the sample. The first two peaks (I and II) were identified
as (+)-catechin and malvidin-3-galactoside, respectively, due to the
fact that they have the same voltages. As expected, procyanidin B2
exhibited the same oxidation potential that (+)-catechin because they
are from the same polyphenolic type termed flavan-3-ols. In summary,
the identification of dietary antioxidant classes for this sample can be
set as the flavan-3-ols ((+)-catechin and procyanidin B2 and related
compounds), anthocyanidins (malvidin-3-galactoside and related
compounds) and resveratrol for first, second and third voltammetric
peaks, respectively. Resveratrol is a phenolic compound which
becomes a stilbene type and its identification was assayed because it
is one of the components in the food supplement. Next, wine samples
were also explored. The voltammetric profile of wine samples is shown
in Figure 3 (note that in this figure, the voltammetric profile obtained
for food supplement is also shown in order to compare all Vitis vinífera
samples). As expected, red wine profiles were identical to that
achieved in the functional food (which was manufactured using peel
and seed from red grapes) while rose wines showed a similar
voltammetric profile to red wine and the functional food, but with less
intensity in the resulting peaks. On the contrary, white wines showed
only one peak was identified with the (+)-catechin. There was an
absence of the anthocyanidin malvidin-3-galactoside, which could be
explained because this anthocyanidin is responsible for the colour of
red and rose wines.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
185
Figure 2 (1.) Voltammetric profile of food supplement. (A): Background electrolyte;
(B): CSPE; (C): SWCSPE; (D): MWCSPE. (2.) Voltammetric comparative profile between
food supplement and the antioxidants identified for each peak. (A): Background
electrolyte; (B): (+)-catequin; (C): malvidin-3-galactoside; (D): resveratrol; (E): food
supplement. Conditions are the same as Figure 1.
Figure 3. Voltammetric profile of Vitis Vinifera samples. (A): Background electrolyte;
(B): White wine (C): Rose wine; (D): Red wine; (E) Food supplement. Conditions are the
same as Figure 1.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
186
Figure 4 shows the voltammograms obtained for apple and
pear, in both peel and pulp matrices. It was observed differences
between peel and pulp samples in both fruits. As expected, while
apple peels showed two peaks, which could be identified as (+)-
catechin (I) and rutin (IV), respectively; pulps showed just (+)-catechin
peak since rutin is only present in the peel of certain fruits. Similar
results were obtained for the pear samples. These results are in
agreement with previous ones (Blasco et al., 2004) indicating the
suitability of the approach.
Figure 4. Voltammetric profiles of fruits samples. (1.): Apple; (2): Pear; (A): Background
electrolyte; (B): Pulp; (C): Peel. Conditions are the same as Figure 1.
The voltammetric profile obtained for green tea extracts is
shown in Figure 5 exhibiting three peaks, which was only possible to
identify the first one as (+)-catechin. It is known from the literature
that tea has a high content in flavonoids the type of catechins and its
derivatives, so that it is possible that unidentified peaks belong to one
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
187
of these compounds. Tables 2 and 3 lists the precision (repeatability
inter-droplet) obtained for all samples studied. As it is observed, RSDs
≤ 10% and RSDs ≤ 12% for the oxidation potentials and amperometric
currents were obtained, respectively. In addition, all samples exhibited
a high antioxidant activity in vitro since all samples showed
voltammetric peaks at low oxidation potentials (around 300 mV). Pulp
samples showed the simplest voltammetric profiles, however, both
exhibited the highest antioxidant peak at low potentials. Red wines
and related samples showed an oxidation peak at moderate
potentials.
Figure 5. Voltammetric profile of tea sample. (A): Background electrolyte; (B): (+)-
Catequin; (C): Tea. Conditions are the same as Figure 1.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
188
Table 2. Intra-droplet precision of the proposed method in Vitis vinifera samples. *SD, standard deviation (n=3).**ND, not determined
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
189
Table 3. Intra-droplet precision of the proposed method in fruits and tea samples.
*SD, standard deviation (n=3).**ND, not determined
Sample Peak I Peak IV
E (V) R.S.D (%)
i ± SD* (µA)
R.S.D (%)
E (V) R.S.D (%)
i ± SD* (µA)
R.S.D (%)
Apple peel 0,308 2 1.15 ± 0.1 7 0,404 3 22.8 ± 1.4 6
Apple pulp 0,316 4 19.6 ± 1.7 9 ND** ND** ND** ND**
Pear peel ND** ND** ND** ND** 0,388 4 8.4 ± 1.0 12
Pear pulp 0,320 5 6.5 ± 0.6 9 ND** ND** ND** ND**
Tea 0,332 2 25.5 ± 2.5 10 ND** ND** ND** ND**
3.3. Analytical characteristics of the method proposed. Estimation
of antioxidant indexes in real samples.
Another important issue is regarding to the possibilities to
perform a fast and simple quantitative assessment of dietary
antioxidants in foods in order to know the quality of the food but
avoiding complex calibration protocols. To reach this aim, firstly, the
external calibration protocol was carried out for each antioxidant. The
analytical parameters for the calibration are listed in Table 4. A very
good linear dependence with the concentration and excellent values
for coefficient of determination were noticed for all analytes studied.
The sensitivity (in terms of calibration slope) was greater for rutin,
followed by (+)-catechin. Statistically, the value of the intercept in all
cases studied was zero. Because one of the most important required
information in the field is “total phenolics”; an antioxidant class-index
is additionally proposed. The strategy is to measure a drop with a
solution containing the mixture of standards and then, in a
consecutive drop, the antioxidant in the food sample. From the signal
of the standard, the calibration factor is defined as fcalibration =
signalstandard/[standard]. Next, as a consequence that the calibration
factor is a constant value, the concentration of antioxidant in the
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
190
sample is simply calculated as [Antioxidant]=signalsample/fcalibration. The
proposed strategy will allow perform calibration in situ and analysis
under repeatability conditions in the same working electrode, thereby
significantly reducing the time and improving the analysis reliability
opening new possibilities for the decentralized analysis.
Table 4. Analytical parameters using external calibration protocol (calibration
equation, y = a + bx). 1
Limit of determination (LOD) expressed as 3sa/b. 2
Limit of
quantification (LOQ) expressed as 10sa/b.
Table 5 lists the calculated calibration factors for antioxidants
differences in the (+)-catechin between the calculated calibration
factor and the slope obtained by external calibration. These
differences were probably due to the electrode and the nature of the
samples. However, as the simplified calibration was performed on the
same electrode as the samples, the indexes obtained can be accepted
as provisional content. From these calibration factors and the
equation given above, it was calculated the indexes of antioxidants
identified in each of the samples and the total polyphenol index (Table
6). It is shown that the amounts estimated for red wine are higher
than those of rose and white wines, which is consistent with general
Antioxidants Linearity
range (µM) R2 (%) y=(a ± tsa) + (b ± tsb)x
LOD (µM) 1
LOQ (µM) 2
(+)-Catequin 3 – 40 99.6 y=(0.21 ± 0.31) + (0.506 ± 0.023)x 1 3
Rutin 5 – 80 99.8 y=(0.50 ± 0.82) + (0.811 ± 0.026)x 1 5
Malvidin-3-galactoside
5 – 40 99.3 y=(0.002 ± 0.260) + (0.215 ± 0.016)x 2 5
Resveratrol 17 – 80 99.6 y=(0.13 ± 0.22) + (0.041 ± 0.005)x 5 17
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
191
knowledge about the composition of different varieties of wine. In
relation to fruit samples, it was obtained a greater amount of
polyphenols in the peel with regard to the pulp, which is consistent
with the literature (Escarpa, and González, 1998; Escarpa, and
González, 1999). Samples with the highest amount of phenolic
compounds were red wine and green tea (with the exception of the
food supplement), which was predicted from previous knowledge of
such samples. For all this, it can be concluded that the quantitative
results obtained by the developed experimental method were highly
satisfactory.
Table 5. Calibration factors (fC ) for antioxidants studied in samples (µA/µM). Values
are expressed as means ± standard deviation of the three assays for each sample.
*ND, not determined.
Compound fC (red wine) fC (white wine) fC (Apple) fC (Tea) Slope
(external calibration)
(+)-Catequin
0.219 ± 0.012 0.225 ± 0.015 0.426 ± 0.061 0.501 ± 0.125 0.506 ± 0.023
Malvidin-3-galactoside
0.339 ± 0.041 0.361 ± 0.016 ND* ND* 0.215 ± 0.016
Resveratrol 0.048 ± 0.002 0.049 ± 0.003 ND* ND* 0.041 ± 0.005
Rutin ND* ND* 0.911 ± 0.233 ND* 0.811 ± 0.026
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
192
Table 6. Total antioxidant and polyphenol indexes for samples. Values are
expressed as means ± standard deviation of three assays for each samples. (Food
supplement g/Kg, Wines mg/L, Fruits mg/Kg and Tea g/Kg). *ND, not determined.
Sample Total
Catechins Total
Anthocyanidins Resveratrol
Total Flavonols
Totals
Food suplement
15 ± 4 21 ± 3 5 ± 1 N.D.* 41
Red wine 149 ± 6 185 ± 1 83 ± 1 N.D.* 417
Rose wine 87 ± 7 9 ± 1 71 ± 1 N.D.* 167
White wine 129 ± 1 N.D.* N.D.* N.D.* 129
Apple peel 226 ± 9 N.D.* N.D.* 419 ± 10 645
Apple pulp 28 ± 3 N.D.* N.D.* N.D.* 28
Pear peel N.D.* N.D.* N.D.* 196 ± 5 196
Pear pulp 12 ± 2 N.D.* N.D.* N.D.* 12
Tea 7 ± 1 N.D.* N.D.* N.D.* 7
4. Conclusions
The results show MWCSPE modified electrodes as the best
electrode material enhancing sensitivity and allowing a clear detection
of the main antioxidants peaks with a very good repeatability between
screening runs, as well as a clear discrimination between samples. This
methodology can clearly differentiate between the different varieties
of wine as well as differentiate between the peel and the pulp in fruit
samples with the use of a small amount of sample (50 µL). As a
consequence, this disposable technology allows rapid, simple and
cheap screening of natural antioxidants in Mediterranean diet food
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
193
samples with promising results towards the in situ antioxidant
screening diagnosis.
Acknowledgements
Financial support from the Spanish Ministry of Economy and
Competitiveness (CTQ2010-15027) are gratefully acknowledged.
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CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
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METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
197
II.3. Validation of a
screening method for rapid
control of sulfonamide
residues based on
electrochemical detection
using multiwall carbon
nanotubes-glassy carbon
electrodes
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
198
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
199
VALIDATION OF A SCREENING METHOD FOR RAPID CONTROL OF
SULFONAMIDE RESIDUES BASED ON ELECTROCHEMICAL DETECTION
USING MULTIWALL CARBON NANOTUBES-GLASSY CARBON
ELECTRODES
Ana María Bueno, Ana María Contento and Ángel Ríos*
Department of Analytical Chemistry and Food Technology, University
of Castilla–La Mancha, Campus de Ciudad Real, E-13004 Ciudad Real,
Spain.
Abstract
An amperometric screening method for the control of
sulphonamides in different matrices has been developed. The
detection was improved by using multiwall carbon nanotubes-glassy
carbon electrodes (MWCNTs-GCE). Six representative sulphonamides
(SAAs), such as sulfanilamide, sulfaguanidine, sulfamerazine,
sulfisoxazole, sulfathiazole and sulfadiazine were selected for this
purpose. Statistical analysis of the obtained data demonstrated that
this type of modified electrodes presented considerably better
stability and sensitivity than the conventional unmodified ones.
Detection limits were in the 0.01 and 0.04 µg mL-1 range, whereas
quantification limits were between 0.05 and 0.1 µg mL-1. The
usefulness of the method was demonstrated by the analysis of
different types of samples. Particularly interesting is the application to
milk samples, where the European legislation establishes a maximum
residue level for SAAs at 0.1 µg mL-1. The developed method
demonstrated to be a good alternative screening method for this
threshold of reference, with an unreliability zone between 0.05-0.09
µg mL-1, useful for a reliable classification of milk samples.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
200
Keywords: Carbon nanotubes, Amperometric detection, Screening of
samples, Sulphonamides.
Introduction
Sulfonamides (SAAs) have widely been used as effective
chemotherapeutics and growth promoters in animal´s feeding. They
are a group of synthetic antibiotics that played important role for the
treatment in both human medicine and veterinary. SAAs represent
one of the most commonly used families of antibiotics in veterinary
medicine because of their low cost, low toxicity and excellent activity
against common bacterial diseases. Nowadays, they are much used for
the theraphy, prophylaxys, and growth promotion in farms1,2. Because
of the toxicology of the residues of these compounds for the human
health, the European Union (EU) has set the maximum combined
residues of all substances in the sulphonamide group at 100 µg/kg3.
Several analytical methods have been developed to separate
and detect these compounds in different samples, such as milk, egg
and shrimp. The most commonly used methods include liquid
chromatography (LC) using UV diode array (DAD)5, fluorescence (FD)6,7
or mass spectrometry detection (MS)8-11. There are only a few
references on the use of electrochemical detection, probably due to
problems such as electrode fouling and deactivation4,12,13. The
detection limit was lower for all these compounds than the
conventional UV detection. For instance, Alawi and Russel14
developed an LC-ED method for the analysis of sulfadiazine and
sulfadimine in milk samples, obtaining good recoveries and low
detection limits. Amperometric methods were also used in the
oxidation15 and reduction16 of sulphadiazine in pharmaceuticals with
good results. A similar study for electroanalytical oxidation of
sulphamerazine was carried out by Pingarrón et al.13. Boron-doped
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
201
conductive diamond electrodes (BDD) were also used for the
electrochemical determination of several sulfonamides17,18, reporting
excellent performance with high sensitivity and reproducibility. Souza
et al. also used this type of electrode for pharmaceuticals, in order to
determine sulphadiazine and sulphamethoxazole by square-wave
voltammetry (SWV)19. Results obtained showed very low detection
limits and good recoveries.
Carbon nanotubes (CNTs) were discovered by Iijima20 in 1991
and, then, a large number of works had been developed investigating
their properties and possible applications21-23. Because of the special
tube structure, CNTs have several unique properties such as good
electrical conductivity, high chemical stability and extremely high
mechanical strength24,25. In addition, the subtle electronic behaviour of
CNTs reveals that they have the ability to promote electron-transfer
reaction and have high electrocatalytic effect when used as electrode
materials. All these properties make them suitable for the
modification of electrodes26,27 and suggest a great promise for
amperometric detection28-30. Carbon nanotubes were incorporated
into a paste electrode in the determination of sulphamethoxazole at
the first time by Arvand et al.31. Results showed a marked decrease on
overvoltage for sulphamethoxazole oxidation and enhanced the signal-
to-noise characteristics compared to those observed at the carbon
paste electrode.
Qualitative analysis is an important and primary part of
chemical analysis. Today, samples screening methods based on a
binary response (positive/negative samples, presence/absence of an
analyte, etc.) have been recognized as a second type of qualitative
analysis. This type of analysis is becoming more common in routine
analytical laboratories, in order to respond to social problems. For this
reason, new qualitative screening methods should be developed in
order to provide rapid and inexpensive analytical tools for routine
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
202
laboratories. The development and optimization of such methods
must follow a different pattern than those used for quantitative ones.
Performance criteria and characteristics of these screening test
methods are key aspects in order to assure their validation, as K.
Ashley and co-workers have pointed out in many cases32,33.
In this work, we report for the first time, the development of a
simple and rapid method for the analytical control of six sulfonamides
(sulfisoxazole, SXZ; sulphamerazine, SMZ, sulfathiazole, STZ;
sulfanilamide, SAA; sulfaguanidine, SGN; and sulfadiazine, SDZ), based
on the amperometrics response at multi-wall carbon nanotubes-
modified glassy carbon electrodes (MWCNTs-GCE). A high sensitivity
and good precision of the response obtained with these electrodes
were achieved. The proposed method was applied to the analysis of
these compounds in several types of samples. Particularly interesting
is the development of a new screening method for controlling these
drugs in milk, according to the legislation in Europe (threshold: 0.1 µg
mL-1) for veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin.
As a sample screening method, it can be used to classify samples
according to the legislation requirements.
2. Experimental
2.1. Apparatus and electrodes
A flow system was arranged with a peristaltic pump (Model
Minipuls 3, GILSON, France), a Rheodyne six-ways injection valve with
a 20 µL loop, a wall-jet flow-cell (Metrohm 65303020), and an
amperometric detector (Metrohm 791 VA) using Labview software.
The wall-jet flow-cell consisted of a Ag/AgCl/3M KCl reference
electrode (Metrohm Model 60727000), a platinum auxiliary electrode,
and a conventional GCE (Metrohm Model 60805010, shaft diameter
bottom 7 mm) or a MWCNTs-GCE as working electrodes.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
203
The measurements using both electrodes as amperometric
sensors were carried out in a 0.05 M K2HPO4(pH=3):ACN:MeOH
mixture (80:15:5) at an applied potential of 1200 mV at room
temperature (20 ± 1 ºC). The length of the tubing connecting the
injector and the detector was 40 cm.
An ultrasonic bath (Ultrasons J.P. Selecta, Barcelona, Spain)
was used to clean the surface of the electrodes and the
homogenization to the solutions.
2.2. Materials and standards
Sulfanilamide (SAA), sulfisoxazole (SXZ), sulfathiazole (STZ),
sulfamerazine (SMZ), sulfaguanidine (SGN), sulfadiazine (SDZ), sodium
acetate, potassium monobasic phosphate and dibasic one were
purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Polymeric
solid phase extraction (SPE) columns (Strata-X) were supplied by
Phenomenex (Germany). Multi-walled carbon nanotubes with 95%
purity were obtained from NanoLab (Brighton, MA). Methanol, acetic
acid and acetonitrile were of HPLC grade and acquired from Panreac
(Barcelona, Spain). In all cases water was of high quality, purified in a
Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA).
Stock standard solution (1 mM) of each sulphonamide was
prepared in MeOH and stored in the dark at 5º C. Working standard
solutions were prepared daily by diluting the stock solutions with
carrying medium (0.05 M K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH (80:15:5)).
2.3. Preparation of the MWCNTs dispersion and MWCNTs-GCE
The MWCNTs solution was obtained by dispersing 1.0 mg of
MWCNTs in 1.0 mL of 0.1% (v/v) Nafion solution followed by
sonication for 15 min. The GCE surface was polished with alumina,
rinsed with distilled water, sonicated into water and acetone with an
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
204
ultrasonic bath and dried in air. An aliquot (10 µL) of the dispersion
was dropped on the electrode surface and the solvent was evaporated
under an infrared heat lamp28. Any other additional pre-treatment of
the electrode was applied, following the procedures previously
described 34-36.
2.4. Samples preparation
Pharmaceutical preparation (Sulfadiazina Reig Jofré, S.A,
Barcelona, and Azol Kern Pharma, S.L Barcelona): a tablet was
pulverized in a mortar and dissolved in 25 mL of methanol and stored
between 2-8º C. A 40 µL of this solution was diluted with the carrying
medium (0.05 M K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH; 80:15:5) to 25 mL and
injected in the flow system.
Tap water (Ciudad Real) and river water (Segovia) were used
for the analysis. These samples were collected using glass bottles
prerinsed with ultra-pure water and stored at 5º C. 5 mL of each
sample was diluted with carrying medium (0.05 M acetate bufferpH =
4.8: ACN: MeOH; 80:15:5) to 25 mL and injected in the flow system.
Milk samples (Hacendado, Mercadona) were acquired in a
local market. These samples were deproteinized with acid
trichloracetic 20% (p/v). The pretreatment consisted of adding 2.5 mL
of the acid trichloroacetic 20% (p/v), the corresponding amount of the
sulphonamide to 5.0 mL of milk, and waiting 15 minutes until a
precipitate was formed. Then, the sample was filtered and the filtrate
was adjusted at pH 4.5 – 5 with 0.5 M NaOH and applied to a Strata-X
cartridge pre-conditioned with 5 mL of methanol, 5 mL of 0.05 M
K2HPO4 and 10 mL of water. The column was washed with 5 mL of
methanol:water (5:95) and eluted with 5 mL of methanol. The extract
was properly diluted with the carrier solution and injected in the flow
system.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
205
3. Results and discussion
The structures of the six sulphonamide compounds are shown in
Figure 1. Due to the presence of potentially oxidative functional
groups, such as sulfamide, amperometric detection of sulphonamides
at glassy carbon electrode has demonstrated to be a useful and
sensitive method for the determination of this type of drugs4,14.
However, the detection limits achieved with these methods were not
low enough to permit the direct determination of SAAs at the
concentration level required in certain applications, as it is the case of
environmental samples. Consequently, preconcentration of these
analytes is commonly required. A useful alternative strategy to achieve
this goal consists of suitable modification of the electrode surface.
Considering the attractive properties of CNTs, due to intense catalytic
activity towards the electrochemical oxidation, we used the
amperometric detection using MWCNT- modified GCE, in order to
decrease the limit of detection.
All the p-amino-substituted sulphonamides exhibited an
irreversible 2-electron oxidation wave at a glassy carbon electrode
surface, the potential of which was found to depend on pH. In this
reaction an iminobenzoquinone is known to be the main oxidation
product of these compounds4.
3.1. Optimization of MWCNT dispersion over GCE surface
In order to prepare the appropriate MWCNTs-GC electrode
producing the best analytical response, several studies related to the
preparation process of this modified electrode were carried out. The
results obtained are described below.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
206
Figure 1. Chemical structures of six SAAs analyzed in this study.
In all the studies the current value was measured at a
potential of 1200 mV after injection of 20 µL aliquots of 3 mgL-1
sulfamide into the carrier solution consisting of a mixture of 0.05 M
K2HPO4(pH=3):ACN:MeOH (80:15:5). Nafion solution was used in order
to disperse the CNTs following a previous work27. Dispersions of
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
207
MWCNTs in concentrations between 0.5 – 5 mg mL-1 in Nafion were
prepared. A 10 µL of this dispersion was deposited onto the GCE. The
amperometric response for 3 mgL-1 sulfanilamide was measured after
15 minutes. The maximal current was obtained when 1 mg/mL was
used for preparation of MWCNTs dispersion. Larger concentrations of
MWCNTs considerably increased the baseline noise. Therefore, a
dispersion of 1 mgmL-1 of CNTs in Nafion were used for modified the
GCE.
With respect to the amount of modifier (dispersion of
MWCNTs) onto the electrode surface, different volumes between 5-20
µL of 1 mg mL-1 MWCNTs dispersion in Nafion were deposited onto
the GCE, and the current response for 3 mgmL-1 of sulfanilamide was
checked. The sulfanilamide peak current increased with the volume of
MWCNTs dispersion deposited up to 10 µL, following by a decrease in
current signal for longer volumes. Therefore, 10 µL of MWCNTs
dispersion in Nafion was used for modified the GCE. Finally, to assess
the correct adsorption of MWCNTs dispersion over the surface
electrode, this modified electrode was exposed, during several times
(between 1-20 minutes), under an infrared lamp in order to evaporate
the solvent. For each time the peak current for 3 mg mL-1 of
sulfanilamide was measured. No significant differences were found in
this study. Therefore, 10 minutes was selected because is the time
needed to evaporate completely the solvent of the MWCNTs
dispersion. These optimized conditions were used to prepare de
MWCNTs-GC electrode in all cases. It was needed to generate a new
modified electrode every working day.
3.2. Amperometric flow set-up
The MWCNTs-GCE was located into a three-electrode flow-cell
in a monochannel manifold (described in Section 2.1.). The responses
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
208
for SAA compounds were compared between MWCNTs-CGE and the
simple GCE. Excellent performance was observed for MWCNTs-GCE for
the detection of the six sulphonamides (SAA, SXZ, STZ, SMZ, SGN and
SDZ) in comparison to the use of GCE.
The supporting electrolyte plays an important role in the
electrochemical response. The thermodynamics and kinetics of
electrochemical processes, as well as mass transfer within the cell, are
dependent on its nature, concentration and pH. For these reasons,
different carrier solutions were tested: 0.05 mol L-1 phosphate buffer
at pH=7:ACN:MeOH (80:15:5); 0.05 mol L-1 acetate buffer at pH = 4.8:
ACN: MeOH (80:15:5); and 0.05 mol L-1 K2HPO4 at pH=3:ACN:MeOH
(80:15:5). The best results were obtained using a 0.05 mol L-1K2HPO4 at
pH=3:ACN:MeOH (80:15:5) electrolyte, because the peak current for
sulphonamides was well-defined, being this carrier stream used for all
measurements. Also, the effect of the carrier solution flow rate was
tested between 0.5 and 2.0 mL/min, obtaining the best results (in
terms of current intensity and peak shape) with a flow rate of 1.8
mL/min. This flow rate was used for all further measurements.
To obtain the optimal potential for amperometrics detection
in flow injection analysis, the hydrodynamic behaviour of
sulphonamides was carried out. Figure 2 shows a i-E hydrodynamic
voltammetric curve obtained using MWCNTs-GCE (A) and GCE (B) for
an injection volume of 20 µL, and 3 µg mL-1 to each SAA in a 0.05 molL-
1 K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH (80:15:5) solution. Each value represents
the average of four injections. The maximum absolute magnitude of
the background current, at each potential, is also shown in Figure 2 for
comparison purposes. The S/N ratios were calculated at each potential
for both electrodes. In general, for all the essayed potential the S/N
ratio was higher when MWCNTs-GCE was used. The maximum S/N
ratio for both electrodes was obtained at 1200 mV. Therefore, this
potential was selected for the amperometric detection.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
209
Figure 2. Hydrodynamic amperometric results for 3 µg/mL of each SAA. The
average peak current obtained from injections(n=4) of sulfadiazine (SDZ),
sulfamerazine (SMZ), sulfamide (SAA), sulfaguanidine (SGN), sulfathiazole (STZ)
and sulfisoxazole (SXZ) in 0.05 M KH2PO4 pH=·3:ACN:MeOH (80:15:5) solution at
(A) MWCNTs-GCE and (B) GCE.
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
SMZ
SGN
SAA
SDZ
STZ
SXZ
Background
I/mA
E/V vs. Ag/AgCl
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4
0
10
20
30
40
50
60
SMZ
SGN
SAA
SDZ
STZ
SXZ
Background
I/ m
A
E/V vs. Ag/AgCl
(A)
(B)
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
210
3.3. Analytical characteristics of the method proposed. Comparison
between unmodified and modified GCE
In a preliminary step, it was calculated the experimental
detection limits for all compounds with an unmodified GCE and the
modified one (MWCNTs-GCE), in order to evaluate each electrode.
This analytical parameter was calculated by measuring decreasing
concentrations of each compound until the lost of the amperometric
signal. Then, the external calibration method for the analytes was
carried out. Amperometric recordings were obtained for series of
sulfanilamide solutions at different concentrations, ranged between
0.1 and 10.0 µg/mL according to the SAAs studied. The calibration
graph of the peak current versus concentration was recorded using
data from these measurements. The analytical parameters for the
calibration are summarized in Tables 1 and 2. A good linear
dependence with the concentration and excellent values for the
coefficient of determination were obtained. The main different
between the two electrodes was the sensitivity, in terms of calibration
slope, which was clearly better by using the modified MWCNTs-GCE in
all cases. This electrode increased the sensitivity 2-3 times compared
to the unmodified electrode. The precision of the current peak for five
measurements of every SAA compound (solutions at 7 µg/mL), under
optimized conditions, showed relative standard deviation values lower
than 5-6%, in all cases, in terms of reproducibility (inter-day
measurements). When these results were compared with the
obtained in previous works13,19, it can be seen the improvement
observed related to detection limits. In the present work detection
limits were in the 10 and 40 ppb range, whereas a LOD= 1.6 ppm13 and
LOD= 0.5 ppm18 were obtained previously.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
211
Table 1. Analytical parameters using external calibration protocol (calibration
equation, y = a + bx) with GCE. 1 y and x are, respectively, the current peak and
concentration of the analytes. α = 0.05. 2
Limit of determination (LOD) expressed as
3sa/b. 3
Limit of quantification (LOQ) expressed as 10sa/b.
Table 2. Analytical parameters using external calibration protocol (calibration
equation, y = a + bx) with MWCNTs-GCE. 1,2
y 3 as the same as Table 1.
Compound
Lineal
range
(µg/mL)
r a ± tsa
1
(µA)
b ± tsb1
(µA/µg/mL)
RSD(%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)2
LOQ
(µg/mL)3
Sulfathiazole 0.5 – 4.0 0.988 12.0 ± 5.5 25.4 ± 2.0 4.7 5.2 0.23 0.5
Sulfisoxazole 1.0 – 10.0 0.998 4.0 ± 0.9 5.1 ± 0.2 3.5 5.1 1.27 0.5
Sulfanilamide 1.0 – 5.0 0.998 0.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1 5.1 5.6 3.18 0.5
Sulfadiazine 0.5 – 2.0 0.999 -9.7 ± 0.6 23.9 ± 0.4 3.3 4.7 0.26 0.5
Sulfamerazine 2.0 – 10.0 0.998 12.5 ± 1.3 6.0 ± 0.2 4.6 5.4 1.06 0.5
Sulfaguanidine 1.0 -10.0 0.999 9.7 ± 0.5 4.9 ± 0.1 2.3 4.2 1.27 0.5
Compound Lineal range
(µg/mL) r
a ± tsa1
(µA)
b ± tsb1
(µA/µg/mL)
RSD(%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)2
LOQ
(µg/mL)3
Sulfathiazole 0.1-5.0 0.995 7.1 ± 6.6 48.1 ± 2.4 3.3 4.7 0.03 0.10
Sulfisoxazole 0.5-10.0 0.998 2.0 ± 1.8 11.2 ± 0.4 2.8 4.4 0.01 0.05
Sulfanilamide 0.1-10.0 0.994 8.4 ± 2.0 5.8 ± 0.4 4.2 5.3 0.01 0.05
Sulfadiazine 0.1-5.0 0.996 6.5 ± 2.3 17.5 ± 0.9 3.1 5.1 0.04 0.10
Sulfamerazine 0.1-3.0 0.998 9.0 ± 0.6 10.0 ± 0.3 5.2 5.6 0.02 0.05
Sulfaguanidine 0.1-10.0 0.996 11.7 ± 3.8 16.6 ± 0.8 3.5 4.4 0.03 0.10
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
212
3.4. Analytical applications
The method has been applied to three different situations,
demonstrating its potential for a variety of analytical purposes.
Results are reported in the following sections.
3.4.1. Quality control in pharmaceutical field
To demonstrate the usefulness of the method in
pharmaceutical field, it was applied to the determinations of
sulphonamides in pharmaceutical preparations. The pharmaceutical
preparations analyzed were generic Sulfadiazina and Azol, which are
used in the treatment of many common infections and their contain
sulfadiazine and sulfanilamide respectively as active principle.
Preparation of the samples is described in the Section 2.4.
Determination of the content of each SAA in these preparations was
performed in triplicate using an external calibration protocol and
standard addition method. As it can be seen from Table 3, similar
results were obtained by external calibration and standard addition
and these values were in good agreement with the information
provided by the pharmaceutical company.
Table 3. Sulfonamides determination in commercial pharmaceutical products.
Sample Active
principle
Concentration by
external calibration
(µg/mL)
Concentration by
standard addition
(µg/mL)
Concentration provided by
the pharmaceutical company
(µg/mL)
Sulfadiazine Sulfadiazine 2.9 ± 0.3 3.1 ± 0.2 3.0
Azol Sulfanilamide 3.4 ± 0.5 3.2 ± 0.4 3.0
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
213
3.4.2. Screening of sulphonamides in water samples
For analysis of water samples, 0.05 M acetate buffer pH = 4.8:
ACN: MeOH (80:15:5) was used as a carrying medium in order to
eliminate interferences. All the samples were spiked with amounts of
sulphonamides in the 1.0 and 9.0 mg/L range. The procedure
described in Section 2.4 was followed. The summary of the obtained
results are shown in Table 4. The averages of recoveries indicate very
good agreement between amounts added and those found for all SAAs
(recoveries in the 96.4% - 102.6% range). In this context, it has been
reported that acceptable recovery percentages, as a function of the
analytical concentration, are acceptable between 80 to 110% for 1-10
mg/L concentrations.33 In consequence, it can be concluded the
successful use of this method for the analysis of water samples.
3.4.3. Screening of sulphonamides in milk samples
The method was also characterized as a sample screening
method for milk samples, which is of strongly interest in compliance
with the European Directive.3 On the other hand, more and more
screening methods are internationally recommended against
quantitative methods for these types of analyses (e.g. Decision of the
European Commission 2002/657/CE for the application of Directive
96/23/CE on performance of analytical methods and the
interpretation of results). As a qualitative method of analysis for the
classification of samples, signals above the detection limits were used
and characterized. Due to the differences in the sensitivities of the
responses for each compound a strategy to avoid false negatives in the
quantification of total sulphonamides content must be followed. Thus,
the sensitivity of the response of SXZ (the compound with the lowest
response at this analytical region) was chosen as the reference.
Therefore, the following sensitivity factors (fs) were obtained: fs(SXZ) =
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
214
Table 4. Recovery studies in environmental samples.
Sample
SAA
added
Concentration range
added (µg/mL)
Recovery (%)
Average ±SD
Relative error
range (%)
River water Sulfanilamide 1-9 99.9 ± 3.4 5.2-4.4
Sulfadiazine 1-5 98.3 ± 3.5 1.8-6.7
Sulfaguanidine 1-9 99.7 ± 1.6 1.6-2.3
Sulfathiazole 1-5 100.8 ± 1.9 3.2-1.2
Sulfamerazine 1-9 96.4 ± 5.5 1.0-2.0
Sulfisoxazole 1-5 100.3 ± 5.8 7.3-8.0
Tap water Sulfanilamide 1-9 99.1 ±5.5 7.2-8.2
Sulfadiazine 1-5 98.0 ± 5.3 5.4-9.5
Sulfaguanidine 1-9 101.9 ± 8.2 14.4-6.1
Sulfathiazole 1-5 102.6 ± 4.2 6.7-3.8
Sulfamerazine 1-9 96.4 ± 5.0 5.0-6.7
Sulfisoxazole 1-5 97.7 ± 4.6 5.0-6.5
1.00; fs(SDZ) = 1.08; fs(SAA) = 1.18; fs(SMZ) = 1.31; fs(STZ) = 1.56; and
fs(SGN) = 1.75. To quantify the total sulphonamide content, the “best-
worst-case scenario” approach can be used, by alternatively assuming
that the whole electrochemical signal comes either from the
compound with the highest response (SGN) or from the compound
with the lowest response (SXZ).
In order to characterize the reliability of analytical information,
the term “unreliability” was used to characterize the range of
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
215
responses where errors are produced37,39. To estimate the unreliability
for sulphonamide screening test, the probability of obtaining a positive
response P(x) is represented versus sulfanilamide concentration. The
real probability-concentration graph is shown in Figure 3, in which
each experimental point was obtained from 10 replicates. Three
different regions can be distinguished in this graph, by working at 99%
of confidence level in all cases:
a) C ≤ 0.05 µg mL-1: region of reliability given correct negative
responses according to the threshold (0.1 µg mL-1).
b) 0.05 < C < 0.09 µg mL-1: unreliability region.
c) C ≥ 0.09 µg mL-1: region of reliability given positive
responses.
This unreliability region must be amplified taken into account
the responses of the other more sensitive compounds. This must be
done by checking the P(x) – response graph of SXZ in comparison to
the corresponding one for SGN (the most sensitive sulphonamide).
Figure 4 shows both probability-response curves. From this figure it
can be concluded that the real amplified unreliability zone
corresponding to electrochemical signals between 7.6 and 13.4 µA.
True positive responses are obtained for signals higher than 13.4 µA,
whereas true negative responses are obtained for signal lower than
7.6 µA. The line connecting both signals can be used as an estimation
of the probability of positive samples within this expanded
unreliability region (7.6 – 13.4 µA; Figure 4) for the inconclusive
samples.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
216
Figure 3. Probability-concentration graph for the proposed screening of sulfamide
using concentrations near the legal limit. The unreliability region and the legal
threshold are shown by the dash lines. Cut-off values correspond to 99%
confidence limits for negative/positive probabilities.
For calibrating the screening method, two calibrant solutions
(CS) associated to the extreme values of the expanded unreliability
zone must be used. In this case, CS(-) was a 0.05 µg mL-1 SGN standard
solution, whereas CS(+) was a 0.10 µg mL-1 SGN standard solution.
Figure 5 summarizes the overall strategy. A dedicated computerized
program allowed the automatic classification of samples as positive or
negative, as well as an advanced estimation of the probability of
positive/negative for inconclusive samples.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
217
Figure 4. Probability-signal curves for SAA and STZ, as well as the identification of the different sample classification zones established by the calibrant solutions (CS) used for applying the screening method.
In order to demonstrate the applicability of the test, it was
applied to the screening of different real samples. First, the
pretreatment of these samples was optimized. Solid-phase extraction
(SPE) procedure was tested using two kinds of cartridges, Strata-X and
Water Sep-Pak. Water Sep-Pak cartridge did not retain the
compounds, so Strata-X was consequently selected for further
experiments. Two solutions containing methanol and phosphate
buffer pH=7 or 0.05M KH2PO4 were tested to equilibrate the
cartridges. The solution with phosphate buffer showed a high
amperometric peak and, hence, this solution containing was selected
for this purpose. Then, different solutions (20% MeOH + 80% H2O
(v/v), 5% MeOH + 95% H2O (v/v) and 5% MeOH + 2% HAc + 93% H2O
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
218
(v/v)) were tested in order to clean the system. The interferences were
removed properly with 5% MeOH + 95% H2O. Finally, three organic
solutions were tested as eluent: ACN, MeOH and the carrying medium
0.05 mol L-1 K2HPO4 at pH=3:ACN:MeOH (80:15:5). Only MeOH eluted
the retained compound completely, therefore this dissolvent was
selected as eluent.
Figure 5. Schematic view of the overall screening strategy, including from the experimental procedure to data acquisition and processing carried out by the computerized program designed for the screening method.
Forty-five milk samples were tested. They were prepared by
spiking milk samples (free of sulphonamides) with different amounts
of SAA, SDZ, STZ, SMZ, SXZ and SGN. Results obtained for these
samples are listed in Table 5. As can be seen, most of samples were
classified as positive or negative with 100% reliability. The screening
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
219
system was designed to avoid any false negative sample, although
false positive samples can be reported. Although false positive
samples should be confirmed by an alternative method, it is worth
nothing the significant reduction in analytical time achieved by
applying this screening method (only a few minutes), with respect any
chromatographic method, which normally requires 15-20 minutes for
a complete scan of the chromatographic recording. This feature is
particularly important for routine laboratories.
Table 5. Results obtained for the analysis of test samples using the proposed screening
method. (*)
Probability of positive results; for 100% = POSITIVE and for 0% = NEGATIVE.
Concentrations added
Signal
Milk sample
Total SAA SDZ STZ SMZ SXZ SGN ( µA ) P(x), % (*)
1 0 0 0 0 0 0 0 0 NEGATIVE
2 0,01 0,01 0 0 0 0 0 0,8 NEGATIVE
3 0,01 0 0,01 0 0 0 0 0,9 NEGATIVE
4 0,01 0 0 0,01 0 0 0 1,3 NEGATIVE
5 0,01 0 0 0 0,01 0 0 1 NEGATIVE
6 0,01 0 0 0 0 0,01 0 0,8 NEGATIVE
7 0,01 0 0 0 0 0 0,01 1,4 NEGATIVE
8 0,05 0,05 0 0 0 0 0 4,7 NEGATIVE
9 0,05 0 0,05 0 0 0 0 4,1 NEGATIVE
10 0,05 0 0 0,05 0 0 0 5,8 NEGATIVE
11 0,05 0 0 0 0,05 0 0 5 NEGATIVE
12 0,05 0 0 0 0 0,05 0 3,9 NEGATIVE
13 0,05 0 0 0 0 0 0,05 6,7 NEGATIVE
14 0,1 0,1 0 0 0 0 0 9,2 27,8
15 0,1 0 0,1 0 0 0 0 8,8 20,8
16 0,1 0 0 0,1 0 0 0 11,9 74,6
17 0,1 0 0 0 0,1 0 0 10,1 43,4
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
220
Table 5. Continuation
Concentrations added
Signal
Milk sample Total SAA SDZ STZ SMZ SXZ SGN ( µA ) P(x), % (*)
18 0,1 0 0 0 0 0,1 0 8,4 13,9
19 0,1 0 0 0 0 0 0,1 13,3 98,9
20 0,15 0,15 0 0 0 0 0 13,5 POSITIVE
21 0,15 0 0,15 0 0 0 0 13,2 97,2
22 0,15 0 0 0,15 0 0 0 17,9 POSITIVE
23 0,15 0 0 0 0,15 0 0 15 POSITIVE
24 0,15 0 0 0 0 0,15 0 11,9 74,6
25 0,15 0 0 0 0 0 0,15 19,5 POSITIVE
26 0,08 0,02 0,02 0,02 0 0,02 0 7,3 NEGATIVE
27 0,09 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 0 8,4 14,7
28 0,09 0 0,02 0,03 0,02 0,02 0 8,7 19,8
29 0,11 0,02 0,02 0 0,04 0,03 0 10,2 45,1
30 0,11 0,03 0,02 0,03 0,02 0,02 0 11,7 71,2
31 0,12 0,02 0,02 0,04 0,02 0,02 0 12,4 83,3
32 0,1 0,05 0 0,05 0 0 0 10,6 52,1
33 0,1 0,04 0 0,06 0 0 0 10,7 54,4
34 0,1 0,06 0 0,04 0 0 0 10,3 46,9
35 0,1 0,03 0,02 0,03 0,01 0,01 0 9,7 36
36 0,1 0 0,01 0,07 0,01 0,01 0 10,9 57,5
37 0,14 0 0,05 0 0,04 0,05 0 12,5 85,1
38 0,15 0 0,03 0,05 0,04 0,03 0 14,7 POSITIVE
39 0,15 0,05 0,04 0 0,02 0,04 0 13 93,7
40 0,13 0 0,03 0,03 0 0,03 0,04 13,7 POSITIVE
41 0,15 0,05 0,01 0,02 0,02 0,03 0,02 14,6 POSITIVE
42 0,2 0,03 0,02 0,03 0,05 0,03 0,02 17,6 POSITIVE
43 0,22 0,04 0,03 0,03 0,03 0,04 0,05 21,1 POSITIVE
44 0,25 0,04 0,03 0,03 0,03 0,04 0,08 23,4 POSITIVE
45 0,3 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 30,2 POSITIVE
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
CAPITULO II
221
4. Conclusions
One interesting novelty of this work is the use of MWCNTs-
GCE for amperometrics detection of SAAs (sulfanilamide,
sulfaguanidine, sulfamerazine, sulfadiazine, sulfathiazole and
sulfisoxazole) in a screening format methodology. It has been
demonstrated that this electrode exhibits good electrocatalytic
behaviour for these compounds, increasing the sensitivity compared
with a conventional GCE. Good linearity, precision and detection and
quantification limits were obtained. The proposed method was used
for the determination of SAAs in different types of samples and
scenarios (pharmaceutical, environmental, and food fields). Particular
interest presents the control of SAAs in milk products in compliance
with the European Directive. In this case, the screening method
exhibits interesting features to be used as a routine method for
classifying milk samples, avoiding the complete analysis of the clear
negative ones. It is a simple, cheap and rapid alternative.
Acknowledgements
Financial support from the Spanish Ministry of Economy and
Competitiveness (Project CTQ2010-15027) is gratefully acknowledged.
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38 Report EUR 20605 EN European Commission, Metrology of
qualitative chemical analysis, 2002.
CAPITULO II METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS DE SCREENING
224
39 A. Ríos, D. Barceló, L. Buydens, S. Cardenas, K. Heydorn, B. Karlberg,
K. Klemm, B. Lendl, B. Milman, B. Neidhart, R.W. Stephany, A.
Townshend, A. Zschunke and M. Valcárcel, Accred. Qual. Assur., 2003,
8, 68.
Metodologías analíticas basadas en técnicas confirmativas por cromatografía líquida de alta resolución
Capítulo III
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
226
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
227
Este capítulo está caracterizado por el empleo de
metodologías analíticas que utilizan la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) como técnicas confirmativas para la determinación
de dos grupos de compuestos que son tóxicos para los organismos
vivos.
En primer lugar, el capítulo comienza con una breve
descripción de los fundamentos básicos de la cromatografía líquida de
alta resolución, centrándose en la descripción del acoplamiento de
dicha técnica de separación con la detección electroquímica (HPLC-
ED), ya que esta metodología es la que se ha empleado en el
desarrollo experimental del presente capítulo.
A continuación se exponen los dos trabajos experimentales
que componen esta parte de la Memoria. En ambos trabajos se
utilizan HPLC como técnica de separación y detección amperométrica
usando electrodos de carbono vitrificado modificados con nanotubos
de carbono de pared múltiple. En el primero de ellos se aborda la
separación y posterior determinación de residuos de sulfonamidas en
diferentes muestras de leche. Este trabajo comprende dos partes: una
inicial en la que se realiza un screening electroquímico para clasificar
las muestras de estudio, seguido de un método de confirmación que
proporciona información más detallada de las muestras clasificadas
como positivas. La metodología desarrollada permite de manera
conjunta el análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras
seleccionadas con un único equipamiento instrumental. En el segundo
trabajo se ha llevado a cabo la determinación de aminas mutagénicas
en diferentes muestras como diferentes tipos de agua y varios
alimentos como caldos de carne comerciales y carne de ternera. La
metodología desarrollada supone el empleo por primera vez de
nanomateriales para la determinación de éste tipo de compuestos y el
consiguiente análisis de muestras características.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
228
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
229
ӏӏӏ.1.
Cromatografía Líquida acoplada
a Detección Electroquímica
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
230
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
231
1. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
La cromatografía líquida propiamente dicha fue descrita por
primera vez en 1930 por Kuhn y Lederer [1], a pesar de que
experimentos y trabajos anteriores [2, 3] pueden asociarse a ésta
técnica. A partir de este momento la cromatografía no deja de
desarrollarse de modo prácticamente continuo, pero no es hasta 1966
[4] cuando aparece el primer artículo publicado sobre cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), suponiendo la culminación moderna
del desarrollo de la cromatografía líquida. Las principales
características de la técnica pueden resumirse en los siguientes
puntos:
· Inyección automática de las muestras en la columna.
· Bombeo continuo del disolvente a través de la columna
mediante bombas de alta presión, aumentando la velocidad y rapidez
de las separaciones.
· Columnas reutilizables.
· Detección de los compuestos en continuo al salir de la
columna.
· La representación de la señal detectada frente al tiempo
constituye un cromatograma.
· Todo el proceso está automatizado e informatizado.
A partir de 1976 se producen importantes progresos en el
empleo de HPLC, abriéndose nuevos campos de aplicación en el área
de la bioquímica [5, 6], de la farmacología y de las ciencias biomédicas
[7]. Alrededor del año 1990 se considera que la técnica ha adquirido su
plena madurez ya que las necesidades de la técnica, a nivel de
comprensión del proceso y disponibilidad de equipamiento, han sido
satisfechas, teniendo una gran aplicación en todo el mundo. En la
actualidad, HPLC es la técnica más empleada como metodología
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
232
separativa, teniendo una inversión económica muy superior a
cualquier otra técnica analítica.
Ø Instrumentación
Un sistema moderno de HPLC está compuesto por los
siguientes cuatro elementos básicos [8]:
· Bomba de alta presión: Sistema encargado de impulsar
el/los disolventes al resto del sistema. Las bombas modernas tienen la
capacidad para impulsar varios disolventes en proporciones variables y
programables (modo gradiente), y disponen de sistema de
desgasificación de los disolventes.
· Columna cromatográfica: Contiene la fase estacionaria y
en ella tiene lugar la separación de los analitos. A veces va precedida
de una “pre-columna” que impide que lleguen a la columna
componentes de la muestra que pueden dañar la fase estacionaria.
Generalmente la columna está ubicada dentro de un horno
termostatizado `para mantener la temperatura constante, ya que se
asegura una mayor reproducibilidad de las separaciones.
· Inyector: Sistema que permite introducir una cierta
cantidad de muestra en el sistema.
· Detector: Sistema que produce señales o respuestas
analíticas ante la presencia de las especies que salen de la columna,
informando del resultado de la separación. Puede utilizarse más de
uno simultáneamente colocándolos en serie. Suele estar conectado a
un sistema de adquisición de datos formado por un ordenador, el cual
está dotado con programas informáticos específicos para el
tratamiento de los datos.
Estos cuatro elementos básicos pueden adoptar diferentes
configuraciones y/o especificaciones dependiendo del modo
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
233
cromatográfico elegido y particularmente de las características de la
fase móvil utilizada y de la propia muestra a separar.
En el proceso de separación cromatográfico, la muestra es
inyectada y transportada a través de la columna mediante el bombeo
de la fase móvil. Según la afinidad de los analitos de la muestra con
respecto a la fase móvil y a la fase estacionaria de la columna, se
produce la separación de los mismos, de manera que los analitos más
afines a la fase estacionaria quedan retenidos en su matriz y se eluyen
más lentamente a través de la columna. De forma análoga, los analitos
más afines a la fase móvil son menos retenidos por la fase estacionaria
y se eluyen antes. A medida que los analitos se van eluyendo llegan al
detector proporcionando una respuesta (absorbancia, fluorescencia,
intensidad electroquímica) que depende de la propiedad medida del
analito por el tipo de detector empleado. El procesado de ésta señal
produce el cromatograma, en el que se representa la respuesta
obtenida por el detector frente al tiempo. Cada analito, por tanto, está
representado por un pico que posee un determinado tiempo de
retención (tR), característico de cada tipo de compuesto en las
condiciones de análisis. La intensidad de cada pico (altura, área) es
directamente proporcional al factor de respuesta y a la concentración
del analito correspondiente en la muestra.
Ø Tipos de separación en HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución en columna tiene
una gran variedad de alternativas según la naturaleza de la fase
estacionaria [9] (Tabla 1.1).
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
234
Tabla 1.1. Tipos se separación en HPLC
Tipo cromatográfico
Fase estacionaria
Adsorción Sólido con propiedades superficiales
Partición Líquido retenido en soporte sólido Cambio iónico Sólido con propiedades cambiadoras de iones Exclusión por tamaño
Sólido con porosidad controlada
Afinidad Sólido con propiedades de retención bioespecíficas
Quiral Reactivo quiral unido a la fase móvil o al soporte sólido
Para el desarrollo de la parte experimental que comprende
este capítulo de la memoria se ha utilizado el modo cromatográfico de
partición, que comprende el 90% de las aplicaciones analíticas de
interés. El fundamento de este tipo de cromatografía es el reparto o la
distribución de los solutos entre una fase móvil líquida y otra
estacionaria inmiscible soportada sobre un sólido inerte; es decir, la
causa de la discriminación entre los solutos se encuentra, de manera
genérica, en las diferencias de solubilidad. Dentro de este tipo de
cromatografía existen dos modalidades que dependen de la naturaleza
de las fases líquidas implicadas:
· Fase normal: la fase móvil es de naturaleza no polar (o
poco polar) y la estacionaria es fuertemente polar.
· Fase inversa: la fase estacionaria es no polar y la móvil
polar.
La modalidad en fase inversa es la alternativa más importante
y utilizada de este tipo de cromatografía, ya que la mayoría de las
muestras de estudio en diversos ámbitos tienen naturaleza hidrofílica.
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
235
En relación con la fase móvil empleada en esta modalidad, la
composición de la misma suele estar formada por un disolvente
orgánico (o una mezcla) y una fase acuosa (generalmente una
disolución reguladora o tampón). Esta composición puede permanecer
constante durante la separación (modo isocrático), o puede variar
gradualmente durante el proceso (modo gradiente). La elección de
uno de estos modos (junto con la composición de la fase móvil) es uno
de los puntos clave en el proceso de optimización de la separación,
además del ajuste adecuado de la temperatura y el pH de trabajo.
2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ACOPLADA A DETECCIÓN
ELECTROQUÍMICA
Las características de un detector ideal para HPLC son [10]:
· Alta sensibilidad y respuesta predecible.
· Respuesta a todos los analitos.
· No verse afectado por cambios de temperatura o
velocidad de flujo.
· Respuesta independiente de la fase móvil.
· Que no contribuya al ensanchamiento de los picos.
· Ser fiable y adecuado para el uso.
· Respuesta lineal frente a la concentración de analito.
· No destructivo.
· Proporcionar información cualitativa y cuantitativa del
pico detectado.
Actualmente, ningún detector posee todas éstas
características, pero los más utilizados cumplen con muchos de los
requisitos mencionados. En esta Tesis Doctoral se utilizó un detector
amperométrico, el cual va a ser descrito a continuación.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
236
Ø Detector electroquímico (ED)
La detección electroquímica se aplica para cuantificar
selectivamente compuestos que pueden oxidados o reducidos cuando
se les aplica un potencial eléctrico. Para ello, los analitos deben de
poseer grupos funcionales electroquímicamente activos. El potencial
de reducción estándar en el electrodo se mide y transforma en una
señal detectable. Las detecciones electroquímicas son principalmente
aplicadas en análisis clínicos, alimentarios y ambientales, siendo los
detectores amperométricos los más comúnmente usados para
determinaciones sensibles y selectivas en HPLC [11, 12].
Mediante éste método, se mide la corriente entre los
electrodos de referencia y trabajo, en función del voltaje aplicado.
Dado que dicho voltaje es generalmente constante, y solo varía la
corriente como resultado de la reacción electroquímica del analito, los
detectores electroquímicos son denominados de forma más precisa
detectores amperométricos. Los compuestos susceptibles de ser
sensibles a los detectores electroquímicos se presentan en la Tabla
2.1. Muchos de estos compuestos pueden ser detectados también por
absorción UV, pero otros o bien no son detectados o su sensibilidad es
muy reducida y a longitudes de onda muy bajas.
El acoplamiento de la cromatografía líquida y la detección
electroquímica se empezó a desarrollar hace treinta años. Una de las
condiciones que presentan los detectores electroquímicos para que
sea posible dicho acoplamiento es que la fase móvil sea conductora de
la electricidad, limitación bastante reducida ya que la mayoría de las
separaciones en HPLC se producen en fase inversa utilizando algún
tampón en la fase móvil. Por otro lado, una de las principales ventajas
que presenta la detección electroquímica es la alta sensibilidad que
proporciona, pero para conseguir esta elevada sensibilidad es
necesario trabajar con fases móviles altamente purificadas para
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
237
reducir el ruido de fondo. Además, la composición del efluente debe
permanecer tan constante como sea posible, empleado elución
isocrática, ya que si se emplea un gradiente para la elución la línea
base sufre una deriva, provocando pérdida de sensibilidad. En la
actualidad, el énfasis dentro de la investigación orientada al
acoplamiento HPLC-ED se ha puesto en miniaturizar la tecnología para
acomodarlo al estudio de muestras pequeñas, a menudo de
volúmenes de microlitros, generalmente pertenecientes a muestras
biológicas. Para los propósitos analíticos no hay pérdida en la
concentración correspondiente a los límites de detección al reducir la
superficie total disponible de ambas metodologías. En LC, esta
reducción se consigue utilizando columnas de diámetros inferiores
(generalmente comprendidos entre 0.1 y 1.0 mm) y en ED mediante el
uso de electrodos más pequeños.
Tabla 2.1. Compuestos sensibles a la detección electroquímica
Oxidación Reducción
Fenoles Cetonas
Oximas Aldehídos
Mercaptanos Oximas
Peróxidos Ácidos conjugados
Hidroperóxidos Ésteres conjugados
Aminas arométicas, diaminas Nitrilos conjugados
Purinas Insaturaciones conjugadas
Halógenos activados
Halógenos aromáticos
Compuestos nitrogenados
Anillos Heterocíclicos
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
238
La celda en la que se produce la reacción electroquímica está
compuesta por tres electrodos (ver Figura 2.3. del capítulo I). Además
del electrodo de trabajo, para mantener el circuito eléctrico se
requiere un segundo electrodo, el electrodo auxiliar, generalmente de
platino. Este electrodo introduce en la celda la corriente generada por
la reacción electroquímica, manteniendo así constante el potencial en
la celda. El tercer electrodo o electrodo de referencia, generalmente
de Ag/AgCl 3M KCl, tiene un potencial conocido y se usa como
referencia por la cual el potencial aplicado al electrodo de trabajo se
mantiene estable mediante retroalimentación del circuito. Los
electrodos auxiliares y de referencia deben estar situados detrás del
electrodo de trabajo de modo que cualquier producto de reacción en
el electrodo auxiliar o una fuga en el electrodo de referencia no
interfiera en el electrodo de trabajo. Los electrodos son muy
susceptibles a las interferencias y a la contaminación, teniendo un
tiempo de vida limitado. Por esto, el electrodo de referencia debe ser
cambiado de 3 a 12 meses de uso, mientras que la superficie del
electrodo de trabajo debe ser limpiada cada cierto tiempo con alúmina
para eliminar cualquier sustancia depositada en la superficie.
En relación al electrodo de trabajo, se suelen emplear
electrodos sólidos que poseen un intervalo anódico superior que los
electrodos basados en mercurio, incluyendo distintos tipos de carbono
y electrodos de metales nobles. El carbono es el material más
empleado por sus propiedades electroquímicas que permiten medidas
en un amplio intervalo de potencial, de -0.8 V a +1.2 V y porque no se
contamina con facilidad. Además, son estables en todos los
disolventes empleados, como el acetonitrilo y el metanol. Por otro
lado se pueden emplear también electrodos de platino, plata y oro o
amalgama de oro para aplicaciones más especializadas, así como
electrodos de películas de mercurio [13-15]. Dentro de los electrodos
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
239
formados por carbono, el electrodo de carbono vitrificado es el más
comúnmente empleado en las celdas electroquímicas, siendo el
electrodo utilizado como base en los trabajos experimentales de la
presente Memoria (ver Figura 2.4. del capítulo I). A diferencia de los
electrodos de pasta de carbono, que han sido empleados para la
detección amperométrica por su baja respuesta de fondo y la buena
relación señal/ruido, los electrodos de carbono vitrificado ofrecen
mejor resistencia química.
Un inconveniente del uso de ED en HPLC es la desactivación de
los electrodos. La pérdida de respuesta normalmente se ve
acompañada por una disminución en la corriente. Para solventar este
inconveniente, además de las beneficiosas propiedades que poseen
(efecto electrocatalítico que mejora la selectividad y aumento en la
sensibilidad como consecuencia de la gran superficie activa), se
modifican los electrodos de trabajo con nanotubos de carbono. Este
tipo de nanomateriales posee resistencia al ensuciamiento,
disminuyendo la pasivación de los electrodos. Este es uno de los
procedimientos que se están empleando en la actualidad para mejorar
la detección electroquímica, y en el caso de la presente Memoria es el
que se ha utilizado para el desarrollo de la parte experimental.
Electrodos de carbono vitrificado se han modificado mediante la
aplicación en su superficie de dispersiones de nanotubos de pared
múltiple en Nafión, según trabajos previos [16]. Diferentes variables
como la concentración de la dispersión y volumen de la misma se han
optimizado, para conseguir las mejores condiciones de la respuesta
analítica. Los resultados de este proceso pueden verse en el apartado
2 del capítulo II.
El acoplamiento entre HPLC y ED se ha utilizado para detectar
compuestos fácilmente oxidables como fenoles, aminas aromáticas,
índoles, fenotiazinas, tioles y PAHs, y compuestos fácilmente
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
240
reducibles como compuestos nitrogenados y quininas. Estos métodos
se han empleado para análisis ambientales, farmaceúticos y de
alimentos, así como para determinar residuos hormonales en
muestras de suelo, agua, y en productos animales y vegetales [17-22].
3. REFERENCIAS
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CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
241
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METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
242
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
243
III.2. Determination of
sulfonamides in milk samples by HPLC with
amperometric detection using a multiwall carbon nanotubes-glassy carbon
electrode
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
244
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
245
DETERMINATION OF SULFONAMIDES IN MILK SAMPLES BY HIGH
PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH AMPEROMETRIC
DETECTION USING A MULTIWALL CARBON NANOTUBES-GLASSY
CARBON ELECTRODE
Ana María Bueno, Ana María Contento and Ángel Ríos*
Department of Analytical Chemistry and Food Technology, University
of Castilla–La Mancha, Campus de Ciudad Real, E-13004 Ciudad Real,
Spain.
Abstract
A sensitive and accurate method for determining five
sulfonamides (SAAs) based in HPLC with amperometric detection using
a glassy carbon electrode modified with multiwall carbon nanotubes is
proposed. Optimal conditions for the quantitative separation of
selected SAAs were investigated and glassy carbon electrodes
unmodified and modified with carbon nanotubes were systematically
investigated as electrodic materials. Statistical analysis of the obtained
data demonstrated that these kind of modified electrodes achieved
considerably better stability and sensitivity than the conventional
unmodified ones. Detection limits were in the 1.2 and 6.0 ng/mL
range. The usefulness of the method was demonstrated by the
analysis of milk samples, taken into account the European legislation
on residues in food products, following both a screening method to
classify the samples and a confirmation method to provide more
detailed information in the case of positive samples.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
246
Keywords: Liquid chromatography; Carbon nanotubes;
Electrochemical detection; Sulfonamides; Milk samples.
Introduction
Sulfonamides (SAAs) are a class of antibacterial drugs which
are used in farm animals for the treatment of a variety of bacterial
infections. In food-producing animals, sulfonamides are used not only
for therapeutic but also for prophylactic purposes [1,
(http://fri.wisc.edu/docs/pdf/FRIBrief_VetDrgRes.pdf)]. The
quantification of these antibacterial drugs in milk represents a
challenge, since the antibacterial drugs and their metabolites are
secreted in milk. Although the use of veterinary drugs has helped to
increase the food supply, negative consequences, such as presence of
drug residues in food, cannot be ignored. The presence of drug
residues in foods can be a health hazard to consumers. First,
carcinogenicity of some drugs may be a serious concern [2-5]. Second,
continuous exposure of certain microorganisms to these drugs may
result in the development of drug-resistant strains. Because of the
toxicology of the residues of these compounds for the human health,
the European Union (EU) has set the maximum combined residues for
all substances in the sulphonamide group at 100 µg/kg [6].
Several analytical methods have been developed to separate
and detect these compounds in different samples. Gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS) methods were
developed for detecting sulfonamides after derivatization [7-09].
Several methods using capillary electrophoresis with UV [10],
fluorescence (FD) [11], electrochemical detector (ED) [12] and mass
spectrometry (MS) [13] detection have been used for the
determination of these drugs in meat, tissues, tablets and human
urine samples respectively. But the most commonly used methods
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
247
include liquid chromatography (LC) using UV diode array (DAD) [14-
19], FD [20-22], MS [22-27] or tandem MS-MS detection [28-30]. These
methods require significant amounts of time associated with clean-up
steps, sophisticated instrumentation and skilled operators. There are
only a few references using ED, probably due to problems related to
the electrode fouling and deactivation [31-33]. Thus, in this way, the
voltammetric behavior of eight sulfonamides at the glassy carbon
electrode (GCE) was studied and lower detection limits was obtained
[31]. The same electrode was used in the oxidation [34] and reduction
[35] of sulphadiazine in pharmaceuticals with good results. A similar
study for the electroanalytical oxidation of sulphamerazine was carried
out by Pingarrón et al. [33]. Some previous works used boron-doped
conductive diamond electrodes for the electrochemical determination
of several sulfonamides [36, 37], characterized by an excellent
performance with high sensitivity and reproducibility. Thus, this type
of electrode was used by Souza et al. in pharmaceuticals, in order to
determinate sulfadiazine and sulfamethoxazole by square-wave
voltammetry (SWV) [37]. The results obtained show very low
detection limits and good recoveries.
Recently, many research works have revealed that
modification of electrode surface with nanomaterials is a promising
avenue. Carbon nanotubes (CNTs), consisting of cylindrical graphene
sheets with nanometer diameter, have attracted much attention due
to their unique mechanical, chemical and electronic properties [38, 39]
since discovered by Iijima [40] in 1991. All these properties make them
suitable for the modification of electrodes [41-43] and suggest great
promise for amperometric detection [44-46]. The performance of
multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) modified electrodes has been
found to be superior to the performance of other conventional carbon
electrodes in terms of electron transfer rate, reversibility and
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
248
conductivity [47, 48]. Carbon nanotubes were incorporated into a
paste electrode in the determination of sulfamethoxazole, at the first
time, by Arvand et al. [48]. Results showed a marked decrease on
overvoltage for sulfamethoxazole oxidation and enhanced the signal-
to-noise characteristics compared to those observed at the carbon
paste electrode.
In this work, we report the development of an accurate and
precise method for the determination of five representative
sulfonamides (sulfisoxazole, SXZ; sulfamerazine, SMZ; sulfathiazole,
STZ; sulfanilamide, SAA; and sulfadiazine, SDZ) based on the
amperometric response at MWCNTs-modified glassy carbon
electrodes after separation by HPLC. The structures of these five
compounds are shown in Figure 1. A high sensitivity, together with a
good repeatability and reproducibility of the response obtained with
these electrodes were achieved. The proposed method was applied to
the analysis of these compounds in different types of milk samples by
using a screening method or a confirmatory method, according to the
experimental chromatographic conditions used. The screening /
confirmation strategy avoids the detailed analysis of the samples,
especially when samples are negative (the main part of samples will be
negative samples). In addition, screening method is closer to the
customer information needs and to the legislation requirements. From
a technical side, or for decision making purposes, the information
about positive samples must be completed with the particular
concentrations. Thus, the screening/confirmation strategic meets this
double important role.
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
249
2. Experimental
2.1. Apparatus and electrodes
Liquid chromatographic experiments were carried out with a
HP 1090 Liquid Chromatograph and amperometrics detector
(Metrohm 791 VA) using Labview software. The wall-jet flow-cell
consisted of a Ag/AgCl/3M KCl reference electrode (Metrohm Model
60727000), a platinum auxiliary electrode and glassy carbon GCE
(Metrohm Model 60805010, shaft diameter bottom 7 mm) or GCE-
CNTs as working electrode.
A Zorbax SB-C18 column (Agilent, 150 x 4.6 mm I.D.; particle size, 3.5
µm) was used for the separation of the drugs. Solution of 0.05
MK2HPO4 pH=3:ACN:MeOH(80:15:5) at room temperature (20 ± 1
ºC)was used as the eluent in the liquid chromatographic experiments.
The potential detection applied was 1200 mV for all measurements.
The length of the tubing connecting the HPLC and the detector was 10
cm.
The wall-jet flow-cell consisted of an Ag/AgCl/3M KCl
reference electrode (Metrohm Model 60727000), a platinum auxiliary
electrode and glassy carbon GCE (Metrohm Model 60805010, shaft
diameter bottom 7 mm) or CNTs-GCE as working electrode.
Samples were extracted using an SPE-Vacuum manifold from
Supelco (Madrid, Spain).An ultrasonic bath (Ultrasons J.P. Selecta,
Barcelona, Spain) was used to clean the surface of the electrodes and
homogenization to the solutions.
2.2. Materials and standards
Sulfanilamide (SAA), sulfisoxazole (SXZ), sulfathiazole (STZ),
sulfamerazine (SMZ), sulfadiazine (SDZ), acid tricloroacetic, potassium
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
250
H2N S
O
O
NH
N
N
CH3
Sulfisoxazole (SXZ) Sulfamerazine (SMZ)
H2N S
O
O
NH
N
S
H2N S
O
O
NH2
Sulfathiazole (STZ) Sulfanilamide (SAA)
H2N S NH
N
NO
O
Sulfadiazine (SDZ)
Figure 1. Chemical structures of five SAAs analyzed in this study.
phosphate monobasic and dibasic and sodium hydroxide were
purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Multi-walled
carbon nanotubes with 95% purity were obtained from NanoLab
(Brighton, MA). Methanol and acetonitrile were of HPLC grade and
acquired from Panreac (Barcelona, Spain). Nafion was supplied from
Fluka (USA). In all cases water was of high quality, purified in a Milli-Q
system (Millipore, Bedford, MA, USA).
H2N S
O
O
NH
NO
CH3
H3C
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
251
Stock standard solution (1 mM) of each sulphonamide was
prepared in MeOH and stored in the dark at 5º C. Working standard
solutions were prepared daily by diluting the stock solutions with
carrying medium (0.05 M K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH(80:15:5)).
2.3. Preparation of the CNTs dispersion and GCE-CNTs
The CNTs dispersion was obtained by dispersing 1.0 mg of
MWCNTs in 1.0 mL of 0.1% (v/v) Nafion solution followed by
sonication for 15 min. The GCE surface was polished with alumina,
rinsed with distilled water, sonicated into water and acetone with an
ultrasonic bath and dried in air. An aliquot (10 µL) of the dispersion
was dropped on the electrode surface and the solvent was evaporated
under an infrared heat lamp [32].
The CNTs dispersion was prepared each week, but it did not
lose its electrochemical properties for longer periods.
2.4. Samples preparation
Milk samples like whole, semi-skim and skim milk (Hacendado,
Mercadona) were acquired in a local market. These samples were
doped with several concentrations of studied SAAs and2.5 mL of the
acid tricloroacetic 20% (p/v) was added to 5.0 mL of each milk sample
in order to separate the proteins. After 15 minutes, samples were
filtered, adjusted to pH 5 with NaOH 0.5 M and properly diluted with
mobile phase (0.05 M K2HPO4 pH=3: ACN: MeOH (80:15:5) to 10
mL.Then, samples were filtered and the filtrate was adjusted to pH 4.5
– 5 with NaOH 0.5 M and applied to a Strata-X cartridge pre-
conditioned with 5 mL of methanol and 10 mL of water. The cartridge
was washed with 5 mL of methanol:water (5:95) and eluted with 5 mL
of methanol:acetonitrile (50:50). The dissolvent was evaporated to
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
252
dryness under a stream of nitrogen and the extract was re-dissolved
with 200 µL of mobile phase and injected in the HPLC-ED system.
Infant milk powder (Nestlé, Spain) was acquired in a local
pharmacy.50 g of the powder was dissolved in 100 mL of milli-Q water.
Then, 5.0 mL of this solution was doped with the several
concentrations of studied SAAs and treated with the same procedure
described above for milk samples.
3. Results and discussion
3.1. Optimization of GCE-CNTs preparation
Several studies on the preparation of the GCE-CNTs were
carried out in order to obtain the best analytical response. To modify
the surface of the electrode, dispersions of CNTs in Nafion in
concentrations between 0.5 – 5 mg/mL were prepared. The
amperometric response for 3 µg/mL sulfanilamide was checked, and
the maximal current was obtained for 1 mg/mL of CNTs dispersion.
Larger concentrations of CNTs considerably increased the baseline
noise. Moreover, different volumes (between 5-20 µL) of 1 mg/mL
CNTs dispersion in Nafion were checked by measuring the current
response for 3 µg/mL sulfanilamide. The sulfanilamide peak current
increased with the volume of CNTs dispersion up to 10 µL, following by
a decrease in current signal for longer volumes. Therefore, 10 µL of 1
mg/mL of CNTs dispersion in Nafion was used to modify the GC
electrode. Finally, to assess the correct adsorption of CNTs dispersion
over the surface electrode and evaporate the solvent, the modified
electrode was exposed under an infrared lamp for 10 minutes. These
optimized conditions were used to prepare the GCE-CNTs in all cases.
It was needed to generate a new modified electrode every working
day.
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
253
3.2. Optimization of chromatographic conditions
First, the length of the tubing connecting the HPLC system and
the amperometric detector were reduce to the maximum in order to
minimize the dispersion of studied compounds.
In preliminary studies, in order to address the
chromatographic separation of SAAs, several types of C18 columns
with different lengths and different diameters of particle were used.
The best separation of the five studied SAAs was obtained when a
diameter of particle of 3.5 µm was used. Moreover, different mobile
binary phases, formed by different ratios of acetonitrile or methanol
and buffer solution at several pH values were tested. Ternary mobile
phase containing acetonitrile/methanol/buffer solution at several pH
and concentrations were too essayed. As a compromise between
adequate retention times and good sensitivity when peak areas are
measured, and acetonitrile:methanol:0.05M phosphate buffer (pH=3)
(15:5:80) mobile phase was selected.
The effect of the mobile-phase flow rate was tested between
0.5 and 1.5 mL/min. As expected, both retention time and peak width
decreased as the flow rate increased for all the studied compounds.
However, a lower resolution between peaks was observed for higher
flow rates. Best resolution between all the peaks was obtained when 1
mL/min was used. Therefore, this value was selected as optimum.
Under these conditions, the retention times (min ± SD, n=3) were: 2.66
± 0.01 (SAA), 6.04 ± 0.01 (SDZ), 8.04 ± 0.01 (STZ), 9.52 ± 0.01 (SMZ),
26.63 ± 0.87 (SXZ).
Under the selected chromatographic conditions, the choice of
the potential to be applied CNT-GC electrode for its use as an
amperometrics detector was established by plotting the current values
measured at different applied potentials, after injection of 20 µL
aliquots of 3 µg/mL of studied SAAs solutions into a mobile-phase
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
254
solution consisting 0.05 M K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH(80:15:5) and flow
rate of 1 mL/min. The maximum current for all the studied compounds
was observed at 1.2 V. Therefore, this value of potential was selected
for the determination of the studied SAAs. Under these experimental
conditions, no cleaning or pre-treatment of the electrode after each
injection was required. It was enough to condition the CNT-GC
electrode at the beginning of the experiments, in order to obtain a
fresh electrode surface and no appreciable fouling signals were
observed after successive scans. The modified electrode was
regenerated after 20 consecutive injections.
3.3. Comparison between CNTs-GC and GC electrodes. Analytical
characteristics.
CNTs-GC and GC electrodes, as amperometric detectors for
HPLC, were compared in terms of sensitivity and background current
stabilization. Figure 2 shows the comparison of LC chromatograms
obtained at a CNTs-GC and GC electrodes for 20 µL of a 3 µ/mL
solutions of studied compounds injected in the mobile phase 0.05 M
K2HPO4 pH=3:ACN:MeOH(80:15:5) and flow rate of 1mL/min. As it can
be seen, the electrochemical response is considerably larger for all
studied SAAs at the CNTs-GC than at GC electrodes.
The rapid stabilization of the background current was very
advantageous in order to reduce the analysis time, which in turn
allows the analysis of large numbers of samples for a given time. In
this sense, Figure 3 shown the comparison of the background current
stabilization time between CNTs-GC and GC electrodes. It is important
to highlight the differences between the background current
stabilization time for both electrodes. Although the GC electrode
appeared to have stabilized after 30 minutes, a continuous decrease in
the background current is evident for higher times. Moreover, CNTs-
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
255
GC electrode shows stability after 15 min, so it can be concluded that
this modified electrode exhibit some resistance to oxidative attack.
The long stabilization time for GCE are believed to be due to oxidation
of the electrode itself, together with oxygen evolution [25].
The external calibration for the analytes with both electrodes
was achieved. Chromatograms were obtained for a series of
sulfonamides solutions with various concentrations, ranged between
1.0 and 10.0 µg/mL according to the SAAs studied. The calibration
graph of the peak current versus concentration was constructed using
data from these measurements and the least squares were evaluated
using the linear regression method. The analytical parameters for the
calibration are summarized in Table 1. A very good linear dependence
with the concentration and excellent values for the coefficient of
determination were notices for all analytes studied. The main different
between the two electrodes was the sensitivity, in terms of calibration
slope, which was clearly greater by the modified CNTs-GCE in all cases.
Indeed, it had been observed that improvement in the sensitivity
obtained with CNTs-GC electrode with the values obtained for the
determination and quantification limits.
The repeatability for five measurements of the current peak
for solutions of 3 µg/mL each sulfa compound, under optimized
conditions, was satisfactory, with relative standard deviations lower
5%. The reproducibility of the current peak was tested over two days
using solutions prepared at the concentration of 3 µg/mL for each
compound, obtaining relative standard deviation values lower than
10%.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
256
A)
B)
Figure 2. Chromatograms for (A) GC and (B) CNTs-GC electrodes vs. Ag/AgCl of
a standard mixture containing3 µg/mLconcentrations of each compound.
Conditions:Mobile phase:0.05 M KH2PO4pH=·3:ACN:MeOH (80:15:5)
solution,injection volume: 20 µL, potential detection:1.2 V and flow rate: 1.0
mL/min.
0 5 10 15 20 25
t (min)
50 mA
SAA
SDZ
STZ
SMZ
SXZ
0 5 10 15 20
t (min)
200 mA
SAA
SDZ
STZ
SMZ
SXZ
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
257
(A)
(B)
Figure 3. Background current vs. time profiles for (A) GC and (B) CNTs-GC
electrodes at 1.2 V under flow conditions. Mobile phase: 0.05 M KH 2PO4pH=·3:
ACN:MeOH (80:15:5).
0 10 20 30 40 50 60 70 80
3000
4000
5000
6000
7000
8000
I (mA)
t (min)
GCE
0 2 4 6 8 10 12 14 16
960
980
1000
1020
1040
1060
1080
1100
1120
1140
I (mA)
t (s)
GCE-CNTs
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
258
Table 1. Analytical parameters using the external calibration method. (A) By using the
GCE. (B) By using the CNTs-GCE. 2
Limit of determination (LOD) expressed as 3sa/b. 3
Limit of quantification (LOQ) expressed as 10sa/b.
(A)
(B)
Compound Lineal range
(µg/mL) R2 y= (a ± tsa) + (b ± tsb)x
RSD (%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)1
LOQ
(µg/mL)2
Sulfathiazole 0.09 – 9.2 0.994 y=(-1.8 ± 1.7) + (3.1 ± 0.3)x 4.8 6.6 0.005 0.018
Sulfisoxazole 0.08 – 10.1 0.994 y=(0.1 ± 0.2) + (1.1 ± 0.1)x 5.5 7.3 0.015 0.050
Sulfanilamide 0.10 – 10.0 0.994 y=(1.7 ± 0.8) + (1.6 ± 0.1)x 6.1 7.8 0.010 0.034
Sulfadiazine 0.10 – 6.4 0.994 y=(0.7 ± 0.8) + (0.8 ± 0.1)x 4.3 6.4 0.020 0.068
Sulfamerazine 0.09 – 8.7 0.998 y=(-1.2 ± 0.6) + (1.5 ± 0.1)x 5.4 7.4 0.011 0.036
Compound Lineal range
(µg/mL) R2 y=(a ± tsa) + (b ± tsb)x
RSD (%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)1
LOQ
(µg/mL)2
Sulfathiazole 0.07 – 8.5 0.994 y=(-4.4 ± 0.9) + (6.5 ± 0.1)x 3.5 5.2 0.001 0.004
Sulfisoxazole 0.06 – 7.3 0.994 y=(-1.6 ± 1.6) + (2.2 ± 0.4)x 4.7 5.9 0.004 0.012
Sulfanilamide 0.08 – 9.8 0.994 y=(-2.7 ± 2.9) + (5.3 ± 0.5)x 3.8 5.2 0.002 0.005
Sulfadiazine 0.08 – 8.9 0.994 y=(-1.4 ± 0.7) + (1.3 ± 0.1)x 4.3 6.1 0.006 0.020
Sulfamerazine 0.09 – 10.5 0.998 y=(-2.0 ± 0.2) + (2.6 ± 0.1)x 4.1 5.5 0.003 0.010
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
259
3.4. Analytical applications
3.4.1. Qualitative determination of SAAs. Screening of
samples
In preliminary steps in the analysis of samples, a screening test
based on HPLC/CNTs-GCE method is proposed. For this purpose,
according to the European Union (EU) that has set the maximum
combined residues of all substances in the sulphonamide group at 100
µg/kg (threshold) [3], a unique peak containing the overall response
for the total amount of the SAAs was obtained. The conditions to
achieve a single peak as the sum of the oxidation of all SAAs studied
were optimized. Different mobile ternary phases containing
acetonitrile:methanol:buffer solution at several ratios were tested.
The optimum peak was obtained with acetonitrile:methanol:0.05M
phosphate buffer (pH=3) (20:40:40) solution as mobile phase.
Moreover, mobile-phase flow rate was tested between 0.5 and 1.5
mL/min, being a flow rate of 0.7 mL/min the optimum to obtain a well-
defined peak.
Under these optimized conditions, several milk samples
fortified with different amounts of SAAs were analyzed. Figure 4
shows (A) the screening protocol and (B) confirmative procedure by
HPLC-ED methodology proposed, and the results obtained for four
representative samples: (1) sample into reliability region with negative
response according to the threshold; (2) y (3) samples into unreliability
region so they are inconclusive samples according to the threshold;
and (4) sample into reliability region with positive response according
to the threshold. This proposed methodology allows the rapid and
simple classification of milk samples according to the legislation
(threshold) and the confirmation of the inconclusive samples.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
260
Figure 4. Chromatograms for (A) screening test and (B) confirmative procedure by
HPLC of four milk samples obtained with CNTs-GC electrode vs. Ag/AgCl.
Conditions:(A) Mobile phase: 0.05 M KH2PO4pH=·3:ACN:MeOH (40:20:40), injection
volume: 20 µL, potential detection: 1.2 V and flow rate: 0.7 mL/min; (B) Mobile phase:
0.05 M KH2PO4pH=·3:ACN:MeOH (80:15:5), injection volume: 20 µL, potential
detection: 1.2 V and flow rate: 1.0 mL/min.
3.4.2. Quantitative analysis in milk samples
The developed HPLC/ GCE-CNTs method was used to confirm
and determine the studied SAAs in different types of milk samples,
such as whole, semi-skim, skim and infant milks. First, milk samples
were spiked with SAA, SDZ, SMZ, STZ and SXZ at variable
concentrations (between 50 and 140 µg/Kg), in order to study the
presence of potential matrix effects. It is clear that in natural collected
milk samples it is not possible to assure that the antibacterial drugs
and their metabolites could present some potential matrix effect with
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
261
respect to spiked samples. This possibility, which is not a trivial matter,
will require a specific study with the assistance of the responsible
veterinarians for administering antibacterial drugs. Although this study
is out of the scope of this work, in general analytical terms this
potential problem (if appear in specific cases), it could be solved by the
appropriate modification of the sample preparation procedure, the
modification of the chromatographic conditions, and/or the use of the
standard addition method for the calibration. For the purpose of this
work, the preparation of the spiked samples is described in Section
2.4. In all the analyzed samples, no chromatographic interferences
were observed for the studied SAAs. Figure 5 shows the
chromatograms obtained for a whole (A) and infant (B) milk samples.
This method can be used as HPLC confirmation procedure after the
previous screening method described before, in order to identify the
peaks obtained by comparing the retention times of samples with
those of standard compounds. Efficient, reproducible and sensitive
separation and detection of the SAAs of interest were obtained in less
than 30 minutes. Table 2 shows the results obtained for the
determination of the five SAAs. As can be seen in this table, the
concentrations added and found were generally in good agreement
with high recoveries (between 96% and 104%).
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
262
(A)
(B)
Figure 5. Chromatograms for (A) whole and (B) infant milk samples obtained with
CNTs-GC electrode vs. Ag/AgCl. Conditions:Mobile phase:0.05 M
KH2PO4pH=·3:ACN:MeOH (80:15:5), injection volume: 20 µL, potential detection:
1.2 V and flow rate: 1.0 mL/min.
0 5 10 15 20 25
t (min)
200 mA
SAA
SDZ
STZ
SMZ
SXZ
0 5 10 15 20 25
t (min)
200 mA
SXZ
SAA
SDZ
STZ
SMZ
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
263
Table 2. Recovery studies carried out in milk samples.
Sample SAA (µg/Kg) SDZ (µg/Kg) STZ (µg/Kg) SMZ (µg/Kg) SXZ (µg/Kg)
Added Found %R Found %R Found %R Found %R Found %R
Whole milk
50 49.7 99.4 48.4 96.9 48.6 97.3 48.2 96.5 49.2 98.5
60 58.4 97.3 61.1 101.8 60.5 100.9 59.5 99.1 56.9 94.8
70 70.4 100.6 72.6 103.7 69.2 98.9 73.4 104.8 71.7 102.4
80 77.4 96.7 77.4 96.8 77.8 97.2 79.9 99.9 76.6 95.8
90 91.4 101.5 87.6 97.3 87.1 96.8 91.4 101.5 87.5 97.2
100 97.1 97.1 101.3 101.3 103.4 103.4 97.1 97.1 98.9 98.9
110 107.8 98.0 114.4 104.0 108.0 98.2 107.8 98.0 114.5 104.1
120 123.4 102.8 119.3 99.4 116.5 97.1 119.3 99.4 123.1 102.6
130 129.0 99.2 126.8 97.5 129.2 99.4 127.0 97.7 125.4 96.5
140 136.8 97.7 137.5 98.2 145.7 104.1 135.7 96.9 137.8 98.4
Semi-skim milk
50 48.4 96.9 50.1 100.2 47.9 95.8 48.6 97.3 52.2 104.3
60 58.5 97.5 62.0 103.4 57.7 96.1 57.1 95.2 61.4 102.3
70 71.2 101.7 71.3 101.8 69.6 99.4 72.2 103.2 68.4 97.7
80 82.8 103.5 77.8 97.3 82.2 102.8 78.7 98.4 79.4 99.3
90 88.4 98.2 87.1 96.8 86.7 96.3 90.6 100.7 92.5 102.8
100 96.8 96.8 97.7 97.7 98.9 98.9 93.9 93.9 96.1 96.1
110 107.0 97.3 109.3 99.4 114.3 103.9 112.6 102.4 109.1 99.2
120 122.2 101.8 122.9 102.4 116.8 97.3 118.1 98.4 124.7 103.9
130 134.4 103.4 127.4 98.0 125.4 96.5 127.1 97.8 135.3 104.1
140 141.3 100.9 136.5 97.5 134.0 95.7 141.5 101.1 134.8 96.3
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
264
Table 2. Recovery studies carried out in milk samples (continuation)
Sample SAA (µg/Kg) SDZ (µg/Kg) STZ (µg/Kg) SMZ (µg/Kg) SXZ (µg/Kg)
Added Found %R Found %R Found %R Found %R Found %R
Skim milk
50 47.6 95.2 47.8 95.6 48.6 97.3 52.2 104.5 48.8 97.5
60 58.6 97.6 58.9 98.1 62.6 104.3 57.7 96.2 59.6 99.3
70 69.4 99.1 67.7 96.7 71.3 101.9 72.0 102.8 67.1 95.9
80 81.9 102.4 79.9 99.9 77.0 96.3 77.9 97.4 76.9 96.1
90 88.6 98.5 87.6 97.3 92.9 103.2 91.4 101.5 93.4 103.8
100 103.2 103.2 96.6 96.6 98.5 98.5 105.3 105.3 98.1 98.1
110 105.9 96.3 114.2 103.8 112.6 102.4 111.0 100.9 113.7 103.4
120 122.3 101.9 117.2 97.7 118.9 99.1 117.8 98.2 116.5 97.1
130 135.6 104.3 129.2 99.4 126.9 97.6 129.0 99.2 132.5 101.9
140 136.2 97.3 145.3 103.8 133.3 95.2 134.4 96.0 134.0 95.7
Infant milk
powder
50 50.8 101.5 52.6 105.3 48.2 96.3 50.1 100.2 49.6 99.3
60 58.0 96.7 58.3 97.2 62.5 104.1 58.8 98 58.0 96.6
70 70.3 100.4 72.0 102.8 72.7 103.9 70.3 100.4 72.9 104.2
80 77.8 97.3 78.8 98.5 79.4 99.2 78.2 97.7 82.3 102.9
90 89.8 99.8 87.9 97.7 86.5 96.1 85.9 95.4 88.8 98.7
100 98.4 98.4 100.9 100.9 102.8 102.8 98.4 98.4 100.1 100.1
110 112.6 102.4 105.7 96.1 109.2 99.3 112.0 101.8 111.0 100.9
120 117.0 97.5 117.8 98.2 125.0 104.2 120.2 100.2 117.0 97.5
130 134.4 103.4 129.2 99.4 125.6 96.6 132.0 101.5 133.9 103.0
140 134.8 96.3 145.5 103.9 136.5 97.5 137.5 98.2 147.1 105.1
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
265
4. Conclusions
The novelty of this work is the use of CNTs-GCE for
amperometric detection after HPLC separation of several SAAs
(sulfanilamide, sulfamerazine, sulfadiazine, sulfathiazole and
sulfisoxazole). This work has demonstrated that this electrode exhibits
high and good electrocatalytic behavior for these compounds,
increasing the sensitivity compared with a conventional GCE. Good
linearity, precision and detection and quantification limits were
obtained. The proposed method was used for the determination of
SAAs in milk samples obtaining percentage recoveries very
satisfactory. It is also important to remark the capacity of the
methodology to be adapted as a simple and rapid screening method to
give information about the potentially contamination of milk samples,
and moreover to be used as a common confirmatory method,
providing individual information of every sulfonamide compound.
Acknowledgements
Financial support from the Spanish Ministry of Science and
Innovation (Project CTQ2010-15027)is gratefully acknowledged.
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CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
269
III.3. Determination of
mutagenic amines in water and food samples by HPLC
with amperometric detection using a multiwall
carbon nanotubes-glassy carbon electrode
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
270
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
271
DETERMINATION OF MUTAGENIC AMINES IN WATER AND FOOD
SAMPLES BY HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH
AMPEROMETRIC DETECTION USING A MULTIWALL CARBON
NANOTUBES- GLASSY CARBON ELECTRODE
Ana María Bueno, Miguel Ángel Marín, Ana María Contento and Ángel
Ríos*
Department of Analytical Chemistry and Food Technology, University
of Castilla–La Mancha, Campus de Ciudad Real, E-13004 Ciudad Real,
Spain.
Abstract
A chromatographic method using amperometric detection for
the sensitive determination of six representative mutagenic amines
was developed. A glassy carbon electrode (GCE), modified with
multiwall carbon nanotubes (MWCNTs-GCE), was prepared and its
response compared to a conventional glassy carbon electrode. The
chromatographic method (HPLC-MWCNTs-GCE) allowed the
separation and the determination of heterocyclic aromatic amines
(HAAs) classified as mutagenic amines by the International Agency for
Research of Cancer. The new electrode was systematically studied in
terms of stability, sensitivity, and reproducibility. Statistical analysis of
the obtained data demonstrated that the modified electrode provided
better sensitivity than the conventional unmodified ones. Detection
limits were in the 3.0 and 7.5 ng/mL range, whereas quantification
limits ranged between 9.5 and 25.0 ng/mL were obtained. The
applicability of the method was demonstrated by the determination of
the amines in several types of samples (water and food samples).
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
272
Recoveries indicate very good agreement between amounts added
and those found for all HAAs (recoveries in the 92% and 105% range).
Keywords: Amperometric detection; modified electrode; multiwall
carbon nanotubes; liquid chromatography; mutagenic amines; water;
food.
1. Introduction
Heterocyclic aromatic amines (HAAs) are formed during the
heating process of organic products containing nitrogenous
compounds, mainly proteins. These compounds contain from two
to five (generally three) condensed aromatic cycles with one or
more nitrogen atoms in their ring system and, usually, one
exocyclic amino group. The exactly structure of the studied
compounds is shown in Figure 1, as well as their scientific name and
their acronyms. The HAAs are mutagenic for bacteria and some
mammalian cell systems and can produce chromosomal aberrations
and sister chromatic exchanges in cultured cells. In 1993, the
International Agency for Research on Cancer (IARC) [1] considers
four of the studied HAAs (2-amino-9H-pirido[2,3-b]indol AαC, 2-
amino-3-metil-9H-pirido[2,3-b]indol MeAαC, acetato 3-amino-1,4-
dimetil-5H-pirido[4,3-b]indol Trp-P-1 and 3-amino-1-metil-5H-
pirido[4,3-b]indol Trp-P-2) as possible human carcinogens and
recommends a reduce exposure to these compounds. These HAAs
have been isolated from proteinaceous foods including cooked
meats and fish, meat extracts or process flavours. They are also
present in cooking fumes [2,3], several foods [4,5], coffee [6],
alcohol beverages [5,7], and from environmental sources, such as
cigarette smoke [8-12], air [8], river and rain water [13, 14]. Also,
some HAAs have been detected in human tissues [15], hair [16],
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
273
and in biological fluids, such as plasma, urine o bile [17-23], as well
as in milk of healthy women [24, 25].
NH
N
CH3
3-Amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole (Trp-P-1) 1-Methyl-9H-pyrido[3,4-b]indole (Harman, H)
N
NH
3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole (Trp-P-2) 9H-pyrido[3,4-b]indole (nor-harman, NH)
N
NH
NH2
N
NH
NH2
CH3
2-Amino-9H-pyrido[2,3-b]indole(AαC) 2-Amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole (MeAαC)
Figure 1. Chemical structures of the HAAs determined by the proposed method.
NH
N
H3C
CH3
NH2
NH
N
H3C
NH2
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
274
Owing to concern over HAAs, a number of analytical
methods have been proposed to separate and detect these
compounds in different samples. The most commonly used
methods include GC-MS after derivatization step [26], HPLC using
UV [27-29], fluorescence [30, 31], electrochemical (ED) [32-36], or
mas spectrometric [37, 38] detectors. Capillary electrophoresis (CE)
with UV [39], DAD [40-42] or ED detection [43] too, has been
proposed but high detection limits have been obtained.
Electrochemical detection offers increased sensitivity compared
with UV detectors and the selectivity results from the fact that
HAAs are oxidized at lower potentials than other compounds [44].
Most of the impurities detected as overlapping peaks with UV
detection are not oxidized at the working potential and do no
perturb the detection. This detection mode can be improved by
using nanomaterials, because of their unique properties. In fact,
recently, many research works have revealed that modification of
electrode surface with nanomaterials is a promising avenue. Carbon
nanotubes (CNTs), consisting of cylindrical graphene sheets with
manometer diameter, have attracted much attention due to their
unique mechanical, chemical and electronic properties. The
performance of multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) modified
electrodes has been found to be superior to the performance of
other conventional carbon electrodes in terms of electron transfer,
reversibility and conductivity [45]. In fact, these nanomaterials
have been used to modify electrodes (usually glassy carbon
electrodes) that have been applied after in the determination of
several analytes like hydroquinone [46], insulin [47], metals [48-
50], isoflavones [51, 52] and phenols [53] in several types of
samples. The same authors have recently proposed a screening
method for the control of sulfonamides residues in milk samples based
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
275
on electrochemical detection using MWCNTs-glassy carbon electrode
and the obtained results are very satisfactory [54].
This paper reports, for the first time, the development of a
method for the determination of six HAAs based on the
amperometric monitoring of their oxidation responses at MWCNT-
modified glassy carbon electrode coupled to HPLC system. The
proposed method has been applied successfully to the analysis of
water and foods samples containing low concentrations levels of
these compounds previous to a preconcentration step.
2. Experimental
2.1. Apparatus and electrodes
Liquid chromatographic experiments were carried out with a
HP 1090 Liquid Chromatograph and amperometric detector (Metrohm
791 VA, Gomensoro S.A., Spain) using Labview software. The wall-jet
flow-cell consisted of an Ag/AgCl/3M KCl reference electrode
(Metrohm Model 60727000, Gomensoro S.A., Spain), a platinum
auxiliary electrode and GCE (Metrohm Model 60805010, Gomensoro
S.A., Spain, shaft diameter bottom 7 mm) or GCE-CNTs as working
electrode.
A Zorbax SB-C18 column (Agilent, 150 x 4.6 mm I.D.; particle
size, 3.5 µm) was used for the separation of the compounds. Solution
of 0.05 M CH3COONH4 pH=7:ACN(75:25) at room temperature (20 ± 1
ºC)was used as the mobile phase in the liquid chromatographic
experiments. The potential detection applied was 1000 mV for all
measurements. The length of the tubing connecting the HPLC and the
detector was 10 cm.
Flow injection analysis was arranged with a peristaltic pump
(Model Minipuls 3, GILSON, France), and a Rheodyne six-ways
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
276
injection valve with a 20 mL loop. The wall-jet flow-cell and the
amperometric detector used as the same described above.
Samples were extracted using an SPE-Vacuum manifold from
Supelco (Madrid, Spain). An ultrasonic bath (Ultrasons J.P. Selecta,
Barcelona, Spain) was used to clean the surface of the electrodes and
homogenization to the solutions.
2.2. Materials and standards
1-metil-9H-pirido[3,4-b]indole (H), 9H-pirido[3,4-b]indole
(NH), 2-amino-9H-pirido[2,3-b]indole (AαC), acetate 3-amino-1,4-
dimetil-5H-pirido[4,3-b]indole (Trp-P-1), 3-amino-1-metil-5H-
pirido[4,3-b]indole (Trp-P-2), 2-amino-3-metil-9H-pirido[2,3-b]indole
(MeAαC) were purchase from Toronto Research Chemicals Inc. (North
York, ON Canada). Acid trichloroacetic and ammonium acetate were
purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Multi-walled
carbon nanotubes with 95% purity were obtained from NanoLab
(Brighton, MA). Methanol and acetonitrile were of HPLC grade and
acquired from Panreac (Barcelona, Spain). Nafion was supplied from
Fluka (USA). In all cases water was of high quality, purified in a Milli-Q
system (Millipore, Bedford, MA, USA).
Stock standard solution (1 mg mL-1) of each amine was
prepared in MeOH and stored at -20 oC. Working standard solutions
were prepared daily by diluting the stock solutions with the mixture
used as mobile phase (0.05 M CH3COONH4 pH=7:ACN (75:25)).
2.3. Preparation of the MWCNTs dispersion and MWCNTs-GCE
The carbon nanotubes solution was obtained by dispersing 1.0
mg of MWCNTs in 1.0 mL of 0.1% (v/v) Nafion solution followed by
sonication for 15 min. The GCE surface was polished with alumina,
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
277
rinsed with distilled water, sonicated into water and acetone with an
ultrasonic bath and dried in air. An aliquot (10 µL) of the dispersion
was dropped on the electrode surface and the solvent was evaporated
under an infrared heat lamp [55].
2.4. Preparation of samples
2.4.1. Water samples
Tap water (Ciudad Real) and river water (Segovia) were used
for the analysis. These samples were collected using glass bottles
prerinsed with ultra-pure water and stored at 5º C. 10 mL of each
sample was doped with the corresponding amount of studied HAAs
and applied to a Strata-X cartridge pre-conditioned with 5 mL of
methanol and 10 mL of water. The cartridge was washed with 5 mL of
methanol:water (5:95) and eluted with 3 mL of methanol:ACN (50:50).
The extract was evaporated to dryness under a stream of nitrogen,
redisolved with 200 µL of mobile phase and injected into the HPLC-ED
system.
2.4.2. Food samples
Aneto broth (Hacendado, Mercadona) was acquired in a local
market. This sample was deproteinized with 20% (p/v) trichloracetic
acid. The pretreatment consisted of adding 5 mL of this acid solution
and the accurately measure of amounts of each standard amine
solution to 10 mL of sample and waiting 15 minutes until a precipitate
was formed. Then, the sample was filtered with Millipore filters and
applied to a Strata-X cartridge pre-conditioned with 5 mL of methanol
and 10 mL of water. The cartridge was washed with 5 mL of
methanol:water (15:85) and eluted with 3 mL of methanol:ACN
(50:50). The extract was evaporated to dryness under a stream of
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
278
nitrogen, reconstituted with 200 µL of mobile phase and injected into
the HPLC-ED system.
Commercial beef broth tablets (Hacendado, Mercadona) were
acquired in a local market. A tablet (10 g) was dissolved in 500 mL of
boiling milli-Q water. A 10 mL of this solution was doped with the
studied HAAs and treated by the same procedure explained above for
Aneto broth.
Beef meat (Hacendado, Mercadona) was acquired in a local
market. 1 g of meat was pulverized and homogenized in 10 mL of
NaOH 1M with sonication, and the suspension was shaken for 1 h
using a rotating shaker. Then, the supernatant (alkaline solution) was
deproteinized with acid trichloracetic 20% (p/v) by the same method
described for broth samples. 5 mL of the acid trichloroacetic 20% (p/v)
and the corresponding amount of the amine was added to 10 mL of
sample and waiting 15 minutes until a precipitate was formed. Then,
the sample was filtered with Millipore filters and adjusted to pH 7 with
HCl 0.5 M. The sample was filtered again and applied to a Strata-X
cartridge pre-conditioned with 5 mL of methanol and 10 mL of water.
The cartridge was washed with 5 mL of methanol:water (15:85) and
eluted with 3 mL of methanol:ACN (50:50). The extract was
evaporated to dryness under a stream of nitrogen, re-solved with 200
µL of mobile phase and injected into the HPLC-GCE-CNTs system.
3. Results and discussion
Due to presence of oxidizable groups of HAAs (Figure 1),
amperometric detection at glassy carbon electrode (GCE) has been
used in order to determine these compounds in several samples.
Considering the attractive properties of MWCNTs, due to intense
catalytic activity towards the electrochemical oxidation, the
amperometric detection using a GCE modified with multiwall carbon
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
279
nanotubes (MWCNT) for detecting the HAAs studied, were used.
Therefore, as first step, the optimization of MWCNT dispersion over
GCE surface, in order to obtain the best analytical response for
determining these compounds was studied. The best conditions
obtained for preparing the MWCNTs-GCE are summarized in Section
2.3.
3.1. Fabrication of the modified GCE-CNTs
To obtain the best analytical response with GCE-CNTs, several
parameters related to the preparation process of this modified
electrode were studied. All optimization process was carried out by
measuring the current value at a potential of 1000 mV after injection
of 20 µL aliquots of 3 µg/mL of studied HAAs solutions into the carrier
solution consisting of 0.05 M ammonium acetate pH=7:ACN (75:25)
and flow rate of 1.8 mL/min, using a flow system.
Nafion solution was used to disperse the CNTs, and
concentrations between 0.5 and 5 mg mL-1 of dispersion of CNTs were
tested. Aliquots of 10 µL of the prepared dispersions were properly
deposited onto the GCE, and the amperometric response of 3 µg/mL
of each HAA was measured after 15 minutes. Larger concentrations of
CNTs dispersion considerably increased the baseline noise, and the
maximal current was obtained when dispersions of 1 mg mL-1 was
used. Therefore, a dispersion of 1 mg mL-1 of CNTs in Nafion was used
to prepare the modified electrode. Other important parameter in the
preparation of the electrode is about the amount of the optimized
dispersion onto the electrode surface. Thus, different volumes
between 5 and 20 µL of 1 mg mL-1 CNTs dispersion were cast onto the
GCE, and the current response of 3 µg/mL of each HAA was checked.
Peak current increased with the volume of CNTs dispersion deposited
up to 10 µL, following by a decrease in current signal for larger
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
280
volumes. As a result, 10 µL of CNTs dispersion was selected for the
preparation of the modified GCE. To assess the correct adsorption of
CNTs dispersion over the surface electrode, two different methods like
to dry in air and to evaporate under an infrared lamp (in order to
evaporate the solvent) were tested. The modified electrode was
exposed under an infrared lamp between 1 and 20 minutes time and
dried in air. Each condition was measured and compared in relation to
the current response obtained for solution of 3 µg/mL of each HAA.
Better results were obtained when the solvent was evaporated under
an infrared lamp in terms of current signal, but the time of exposition
did no show significant differences. Therefore, 10 minutes was
selected because this was the time needed to completely evaporate
the solvent from the CNTs dispersion. These optimized conditions
were used to prepare the GCE-CNTs in all cases, being necessary to
generate a new modified electrode every working day.
3.2. Selection of the amperometric conditions
The choice of the potential to be applied GCE-CNTs for its use
as an amperometric detector was established by plotting the S/N
ratios from current values measured at different applied potentials,
after injection of 20 µL aliquots of 3 µg/mL of studied HAAs solutions
into the carrier solution consisting of 0.05 M ammonium acetate
pH=7:ACN (75:25) and flow rate of 1.8 mL/min, using flow system. In
this sense, the hydrodynamic behaviour of studied amines was carried
out and the Figure 2 shows a S/N-E hydrodynamic voltammetric curve
obtained. Each value represents the average of four injections. As it
can be seen, the maximum S/N ratio for all the studied compounds
was 1.0 V. Therefore, this value of potential was selected for the
determination of the studied HAAs. Under these experimental
conditions, no cleaning or pre-treatment of the electrode after each
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
281
injection was required. It was enough to condition the GCE-CNTs at
the beginning of the experiments, in order to obtain a fresh electrode
surface and no appreciable fouling signals were observed after
successive scans. The modified electrode was regenerated after 20
consecutive injections.
Figure 2. Hydrodynamic amperometric results for a mixture of 3 µg/mL of HAAs. The
average peak current was obtained from injections (n=4) in 0.05 M amonium acetate
pH=·7:ACN (75:25) solution at MWCNTs-GCE.
3.3. Optimization of chromatographic conditions
The chromatographic separation of studied HAAs was
achieved using HPLC coupled to the optimized GCE-CNTs
amperometric detector. In preliminary studies various types of C18
columns with different lengths and different diameters of particle
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2
0
10
20
30
Trp-P-2
Trp-P-1
AC
H
NH
MeAC
Background
I/mA
E/V vs. Ag/AgCl
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
282
were used. The best separation of the six studied HAAs was obtained
when a diameter of particle of 3.5 µm and 15 cm of lengths of column
were used. Moreover, different mobile binary phases, formed by
different ratios of acetonitrile or methanol and buffer solution at
several pH values (between 5 and 8) were tested. Only, isocratic
conditions of mobile phase are used due to instability of the baseline
in electrochemical detection. As a compromise between adequate
retention times and good sensitivity when peak areas are measured,
acetonitrile:0.05M ammonium acetate (pH=7) (25:75) was selected as
mobile phase.
The effect of the mobile-phase flow rate was tested between
0.5 and 1.5 mL/min. As expected, both retention time and peak width
decreased as the flow rate increased for all the studied compounds.
However, a lower resolution between peaks was observed for higher
flow rates. Best resolution between all the peaks was obtained when
1.3 mL/min was used. Therefore, this value was selected as optimum.
Under these conditions, the retention times (min ± SD, n=3) were: 7.25
± 0.03 (Trp-P-2), 9.98 ± 0.03 (Trp-P-1), 13.87 ± 0.06 (AαC), 16.58 ± 0.08
(H), 18.02 ± 0.11 (NH) and 28.46 ± 0.17 (MeAαC).
3.4. Analytical characteristics of the proposed method. Comparison
between unmodified and modified GCE with carbon nanotubes
As preliminary studies, using the optimum chromatographic
and amperometric conditions, multiwall carbon nanotubes electrode
(GCE-CNTs) and GCE were compared as electrochemical detectors in
the liquid chromatography system for the determination of studied
amines. External calibration method for the analytes with both
electrodes was achieved. Chromatograms were obtained for a series
of amine solutions at different concentrations, ranged between 0.05
and 10 µg/mL according to the HAAs involved. The calibration graph of
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
283
the peak current versus concentration was constructed using data
from these measurements and the least squares were evaluated using
the linear regression method. A very good linear dependence with the
concentration and good values for the coefficient of determination
were notices for all analytes studied with both electrodes. The
repeatability for five measurements of the current peak for solutions
of 0.5 µg/mL each amine compound, under optimized conditions, was
satisfactory, with relative standard deviations lower than 5%. The
reproducibility of the current peak was tested over two days using
solutions prepared at a concentration of 0.5 µg/mL of each compound,
obtaining relative standard deviation values lower than 7%. The
detection limit (LOD) and quantitative limit (LOQ) for the studied HAAs
under these experimental conditions were obtained from LOD=3Sb/b
and LOQ=10Sb/b, when Sb was the standard deviation of the mean
value for eight signals of the blank and b was the slope of the
calibration graph. All the analytical parameters obtained are
summarized in Tables 1 and 2 using GCE and GCE-CNTs as
electrochemical detectors respectively. As can be seen in these tables,
the main different between the two electrodes was the sensitivity, in
terms of calibration slope, and detection limits, which was clearly
better for the modified GCE-CNTs in all cases. Also, these obtained
results were compared with those published in previous works, and
regarding LOD and LOQ, only methodology that using MS as detection
system exceed slightly our results [27-38].
The stabilization of the background current using both
electrodes was compared working with the HPLC system. The results
demonstrated that while the GCE required a total setting time greater
than 30 min, the GCE-CNTs only needed 15 min to obtain a total
stabilization of the background current, so it can be concluded that
modified electrode exhibit some resistance to oxidative attack. The
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
284
long stabilization time for GCE are believed to be due to oxidation of
the electrode itself, together with oxygen evolution [56].
Figure 3 shows the chromatograms obtained for GCE and GCE-
CNTs vs. Ag/AgCl of a standard mixture containing 0.5 µg/mL
concentrations for each compound. It can be seen the improvement
achieved in sensitivity and peak shape when the modified electrode
was used with respect to the conventional one.
Table 1. Analytical parameters using external calibration protocol with GCE as the
detector. 1Limit of determination (LOD) expressed as 3sa/b.
2Limit of quantification
(LOQ) expressed as 10sa/b
HAA Lineal range
(µg/mL) R2 y=(a ± tsa + (b ± tsb)x
RSD (%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)1
LOQ
(µg/mL)2
Trp-P-2 0.05 – 4.7 0.994 y=(-4.1 ± 0.7) + (2.3 ± 0.2)x 4.8 6.5 0.05 0.15
Trp-P-1 0.07– 8.9 0.994 y=(4.8 ± 0.7) + (1.9 ± 0.1)x 5.2 6.8 0.03 0.09
AαC 0.06 – 10.2 0.996 y=(5.2 ± 1.8) + (2.9 ± 0.3)x 5.3 6.7 0.02 0.06
H 0.04 – 9.5 0.992 y=(0.2 ± 1.5) + (1.9 ± 0.2)x 5.6 7.2 0.03 0.09
NH 0.05 – 10.1 0.998 y=(1.3 ± 0.5) `(2.0 ± 0.1)x 4.9 6.7 0.02 0.08
MeAαC 0.05 – 8.3 0.994 y=(-0.9 ±1.0) + (2.0 ± 0.2)x 5.5 7.1 0.03 0.09
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
285
Table 2. Analytical parameters using external calibration protocol with MWCNTs-GCE. 1Limit of determination (LOD) expressed as 3sa/b.
2Limit of quantification (LOQ)
expressed as 10sa/b
3.5. Clean-up procedure of samples
In order to demonstrate the usefulness of proposed
methodology, water and foods samples were selected to apply this
method. Therefore, previously the different steps of sample
preparation and clean-up procedure were studied. The analysis was
performed by HPLC-GCE-CNTs using the optimized conditions. In order
to study the effect of different concentrations of heterocyclic amines
in the clean-up procedure, the recoveries were obtaining using
standard solutions at three concentration levels (0.1, 0.5 and 1
µg/mL).
Regarding water samples, 10 mL of these samples were spiked
with standard solutions of the amines and introduced in SPE
cartridges. Different types of cartridges preconditioned with 5 mL of
HAA Lineal range
(µg/mL) R2 y=(a ± tsa)+ (b ± tsb)x
RSD(%)
Intra day
RSD (%)
Inter day
LOD
(µg/mL)1
LOQ
(µg/mL)2
Trp-P-2 0.05 – 9.3 0.992 y=(-1.7 ± 1.0) + (5.7 ± 0.2)x 3.4 5.2 0.003 0.010
Trp-P-1 0.06 – 9.0 0.994 y=(-4.9 ± 1.7) + (3.1 ± 0.3)x 4.0 5.9 0.006 0.018
AαC 0.05 – 10.6 0.994 y=(-2.8 ± 1.7) + (4.2 ± 0.3)x 4.2 6.1 0.004 0.013
H 0.07 – 11.1 0.996 y=(2.3 ± 0.5) + (2.2 ± 0.1)x 3.8 5.5 0.008 0.025
NH 0.03 – 8.8 0.998 y=(-7.5 ± 3.4) + (4.7 ± 0.7)x 4.3 5.8 0.004 0.012
MeAαC 0.06 – 10.5 0.994 y=(0.3 ±1.6) + (2.5 ± 0.3)x 4.0 6.0 0.007 0.022
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
286
MeOH and 10 mL of water were tested, such as Strata-X, Reverse
phase Phenomenex and Water Sep-Pak. Only Strata-X cartridges
retained properly the analytes; hence this type of cartridge was
selected for further analyses. Different volumes (5, 10 and 15 mL) of
solution containing MeOH and water (5:95) were used in a cleaning
step, being 5 mL of MeOH:H2O (5:95) adequate to properly remove
the interfering substances. Then, 2 mL of ACN, MeOH, ACN:MeOH
(50:50) solution and the mobile phase used in HPLC-system
(acetonitrile:0.05M ammonium acetate (pH=7) (25:75)) were used as
eluent. Only ACN:MeOH (50:50) completely eluted the retained
compound. Therefore, this solution was selected as the eluent
solution. Finally, volumes of eluent between 1- 5 mL were tested. The
higher recoveries of the studied HAAs were obtained using 3 mL of
ACN:MeOH (50:50) for all analytes, so this volume was selected as
optimum to elute ours compounds.
In relation to broth samples, 10 mL of these samples were
spiked with standard solutions of the amines and treated with 5 mL of
trichloroacetic acid 20%, in order to eliminate proteins. The
supernatant was introduced in a Strata-X cartridge preconditioned
with 5 mL of MeOH and 10 mL of water. Several binary solutions
formed by MeOH and water were used in order to obtain the more
interference-free extract. It was achieved using a step washing of
cartridge with 3 mL of MeOH:H2O (15:85) solution. Finally, eluent
composition and volume was too optimized. The best result were
obtained when 2.5 mL of ACN:MeOH (50:50) were used.
With respect to beef meat sample, a 1g of the sample was
pulverized and homogenized in 10 mL of 1 M NaOH and spiked with
standard solutions of the amines. After the treatment of this sample
and the addition of 5 mL of tricloroacetic acid 20% (see section 2.4.),
the extract was introduced in a Strata-X cartridge preconditioned with
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
287
5 mL of MeOH and 10 mL of water. Different solutions formed by
MeOH and water (10:90, 15:85 and 20:80) were tested to obtain the
more interference-free extract. 5 mL of MeOH:H2O (15:85) solution
provided a sample properly cleaned. Finally, eluent composition and
volume was too optimized and the best result were obtained when 3.0
mL of ACN:MeOH (50:50) were used.
3.6. Analytical applications
To demonstrate the usefulness of developed HPLC-MWCNTs-
GCE method, it was applied to the determination of amines in
different kind of samples, such as waters from different sources and
various types of foods. The preparation of these samples was
described in Section 2.4. Analysis of these samples showed no
presence of any of the compounds. Therefore, samples were spiked
with each amine (water samples between 0.2 and 5.0µg/mL and food
samples between 0.05 and 5.0 µg/mL) and submitted to the procedure
described in Section 2.4. The recovery results are shown in Table 3.
The obtained recoveries indicate very good agreement between
amounts added and those found for all studied HAAs (ranged between
92% and 105%).
Figure 4 shows the chromatograms obtained for tap water (A),
and beef meat (B) samples when 0.5 µg/mL of all the HAAs studied
were added. No chromatographic interferences were observed for the
studied HAAs in all tested samples.
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
288
A)
B)
Figure 3. Chromatograms obtained for a standard mixture containing 5 µg/mL of each
compounds: (A) by using the GCE; and (B) by using the MWCNTs-GCE. Reference
electrode: Ag/AgCl in all cases. Experimental conditions: mobile phase: 0.05 M
amonium acetate pH=·7:ACN (75:25); injection volume: 20 µL; potential detection: 1
V; and flow rate: 1.3 mL/min.
0 10 20 30
t (min)
20 mA
MeAaC
NH
H
AaC
Trp-P-1Trp-P-2
0 5 10 15 20 25 30
t (min)
40 mATrp-P-2
Trp-P-1
AaC
H
NH
MeAaC
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
289
Table 3. Recovery values obtained for the analysis of different types of samples by
using the proposed method (HPLC-MWCNTs-GCE).
HAA
Tap water (µg/mL)
River water (µg/mL)
Tablet broth (µg/mL)
Aneto broth (µg/mL)
Beef meat (µg/g)
Added %R Added %R Added %R Added %R Added %R
Trp-P-1
0.2 94.4 0.2 96.5 0.05 92.4 0.05 95.5 0.05 93.5
0.5 95.3 0.5 96.1 0.1 96.3 0.1 96.1 0.1 94.1
1 100.6 1 104.8 0.5 95.6 0.5 98.8 0.5 102.8
3 97.7 3 99.9 1 102.7 1 102.9 1 99.9
5 101.5 5 103.2 5 101.5 5 97.2 5 101.7
Trp-P-2
0.2 93.9 0.2 97.5 0.05 94.9 0.05 97.5 0.05 95.5
0.5 96.5 0.5 96.1 0.1 100.5 0.1 96.1 0.1 94.1
1 99.7 1 104.8 0.5 99.7 0.5 104.8 0.5 96.8
3 103.5 3 99.9 1 98.5 1 99.9 1 103.3
5 98.2 5 101.5 5 103.2 5 101.5 5 98.5
AαC
0.2 92.9 0.2 92.5 0.05 95.9 0.05 92.5 0.05 97.5
0.5 94.8 0.5 94.8 0.1 94.8 0.1 94.8 0.1 99.8
1 101.7 1 102.4 0.5 101.7 0.5 102.4 0.5 102.4
3 98.4 3 95.8 1 97.4 1 95.8 1 97.8
5 97.3 5 97.2 5 98.3 5 97.9 5 99.2
H
0.2 93.2 0.2 93.3 0.05 94.2 0.05 93.3 0.05 92.3
0.5 95.4 0.5 96.3 0.1 94.4 0.1 96.3 0.1 97.3
1 101.8 1 97.7 0.5 103.8 0.5 97.7 0.5 95.7
3 102.3 3 99.3 1 97.3 1 99.3 1 96.3
5 97.8 5 102.8 5 101.8 5 102.8 5 99.8
NH
0.2 94.3 0.2 93.8 0.05 93.9 0.05 93.8 0.05 95.8
0.5 93.9 0.5 95.1 0.1 96.9 0.1 95.1 0.1 97.1
1 98.9 1 98.3 0.5 98.9 0.5 98.3 0.5 103.3
3 102.7 3 102.4 1 102.7 1 102.4 1 101.4
5 96.8 5 101.7 5 98.8 5 101.7 5 101.2
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
290
Table 3. Continuation
HAA
Tap water (µg/mL)
River water (µg/mL)
Tablet broth (µg/mL)
Aneto broth (µg/mL) Beef meat (µg/g)
Added %R Added %R Added %R Added %R Added %R
MeAαC
0.2 95.8 0.2 94.1 0.05 95.8 0.05 94.1 0.05 98.1
0.5 96.1 0.5 96.9 0.1 103.1 0.1 96.9 0.1 103.4
1 99.4 1 96.6 0.5 99.4 0.5 96.6 0.5 97.6
3 102.8 3 98.2 1 102.8 1 98.2 1 102.2
5 96.3 5 103.1 5 99.3 5 103.1 5 98.6
4. Conclusions
It has been developed an accurate and sensitive method to
determine six HAAs in real samples based on the amperometric
response of MWCNTs-GCE after HPLC separation. This work has
demonstrated that this electrode exhibits high and good
electrocatalytic behaviour for these compounds, increasing the
sensitivity compared with a conventional GCE. Good linearity,
precision and detection and quantification limits were obtained. The
percentages of recoveries calculated in all the analyzed samples were
appropriate for this type of analyses. This method provides a good
alternative with respect to conventional process to quantify HAAs in
this kind of samples. The simplicity of the procedure to modified
available commercially glassy carbon electrodes with MWCNTs opens
interesting possibilities to transfer this methodology to routine
analytical laboratories working in food safety and control field.
CAPITULO III METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
291
(A)
(B)
Figure 4. Chromatograms for (A) tap water and (B) beef meat samples obtained
with MWCNTs-GCE vs. Ag/AgCl. a) Sample without spiked compounds. b) Sample
doped with HAAs. Experimental conditions as in Figure 3.
0 5 10 15 20 25 30
t (min)
a)
b)
Trp-P-2 Trp-P-1
AaC
HNH
MeAaC
40 mA
0 5 10 15 20 25 30
t (min)
a)
b)Trp-P-2 Trp-P-1
AaC
H
MeAaC
40 mA
NH
METODOLOGÍAS ANALÍTICAS BASADAS EN TÉCNICAS CONFIRMATIVAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN CAPITULO III
292
Acknowledgements
Financial support from the Spanish Ministry of Economy and
Competitiveness (Project CTQ2010-15027) is gratefully acknowledged.
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Conclusiones
CONCLUSIONES
296
CONCLUSIONES
297
En esta Tesis Doctoral se han desarrollado diversas
metodologías electroanalíticas para llevar a cabo la discriminación
tanto de muestras como de analitos, y la determinación y
cuantificación de analitos con precisión y de forma sensible en
muestras reales, demostrando así la aplicabilidad de las metodologías
propuestas. Para su desarrollo se han utilizado dispositivos
miniaturizados, nanomateriales como los nanotubos de carbono y se
han acoplado diversas técnicas instrumentales.
Las conclusiones que se pueden extraer de los resultados
obtenidos en esta Tesis Doctoral se exponen a continuación:
· Se ha propuesto y desarrollado un nuevo método de screening
para la identificación y cuantificación de antioxidantes
naturales en muestras características de la dieta
mediterránea. Esta metodología ha permitido la detección de
los principales grupos de antioxidantes y la correcta
discriminación entre las muestras estudiadas mediante el
consumo mínimo de reactivos y productos (50 µL). El carácter
miniaturizado, desechable y económico de los electrodos
empleados, unido a la rapidez y sencillez del método
propuesto, indican resultados prometedores para una futura
diagnosis in situ de este tipo de muestras.
· Se ha llevado a cabo la puesta a punto, optimización,
validación y aplicación de un nuevo método de screening para
el control de residuos de sulfonamidas en diversos tipos de
muestras, teniendo especial interés el screening
correspondiente a muestras de leche de acuerdo al límite
establecido por la legislación europea (0.1 µg mL-1). El empleo
de nanotubos de carbono como material electródico sensible
supone una interesante novedad en el análisis de este tipo de
CONCLUSIONES
298
compuestos. La metodología propuesta supone una ventajosa
alternativa para el análisis de rutina en comparación con los
métodos convencionales de análisis, dadas sus características
relacionadas con la rapidez, la sencillez y el bajo coste.
· Se ha desarrollado un método conjunto de screening con
posterior confirmación de residuos de sulfonamidas en
muestras de leche, basado en el empleo de electrodos
modificados de nanotubos de carbono mediante el
acoplamiento de la cromatografía de alta resolución con la
detección electroquímica. Los resultados obtenidos muestran
excelente linearidad y precisión, proporcionando límites de
detección y cuantificación inferiores a los requeridos por la
legislación vigente para este tipo de muestras (0.1 µg mL-1). La
adaptabilidad de la metodología propuesta para ser empleada
como método cualitativo y cuantitativo de manera conjunta
supone una ventaja frente a las alternativas tradicionales de
análisis, reduciendo los tiempos de análisis ya que únicamente
es necesario realizar el proceso confirmatorio para las
muestras clasificadas como dudosas o positivas.
· Se ha propuesto, desarrollado y validado un nuevo método de
determinación de agentes mutagénicos en diversas muestras
dentro del campo agroalimentario. La novedosa metodología
implica el empleo de electrodos modificados con nanotubos
de carbono, que como se ha demostrado proporcionan
mejores resultados que los descritos previamente en
bibliografía en términos de sensibilidad. La simplicidad del
procedimiento de preparación de los electrodos modificados
abre interesantes oportunidades para la transferencia de esta
metodología hacia el análisis de rutina de laboratorios
analíticos que trabajan dentro del campo del control y
seguridad alimentario.