UNIVERSIDAD CESAR VALLEJO

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE MEDICINA

INFORME DE LABORATORIO:

PRUEBAS DIAGNÓSTICAS PARA NEUMONÍA: NORMAS DE BIOSEGURIDAD, RECUENTO LEUCOCITARIO Y FÓRMULA DIFERENCIAL, TEST DE ELISA Y REACTANTES DE FASE AGUDA.

ESTUDIANTE:

JONATHAN ABRAHAM CHAVEZ GUARNIZ

DOCENTE:

MARÍA AYALA

TRUJILLO, SETIEMBRE DEL 2015

INTRODUCCIÓN

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

Los niveles de bioseguridad hacen referencia a los peligros relativos que entrañan los microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo (grupos de riesgo 1, 2, 3 y 4 (OMS)). Esta clasificación por grupos de riesgo se utilizará exclusivamente para el trabajo de laboratorio. En el cuadro 1 se describen esos grupos de riesgo y se mencionan los microorganismos según cada grupo riesgo.

Cuadro 1

Los laboratorios se clasifican como sigue: laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1; laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2; laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3, y laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. En el cuadro 2 se relacionan, los grupos de riesgo con el nivel de bioseguridad requerido de los laboratorios destinados al trabajo con microorganismos de cada uno de esos grupos.

En cada región geográfica se deberá elaborar una clasificación nacional o regional de los microorganismos en grupos de riesgo, teniendo en cuenta los siguientes factores:

1. La patogenicidad del microorganismo;

2. El modo de transmisión y la gama de huéspedes del microorganismo. Estos dos factores pueden depender de los niveles de inmunidad existentes en la población local, la densidad y los movimientos de la población de huéspedes, la presencia de vectores apropiados y el nivel de higiene ambiental.

3. La disponibilidad local de medidas preventivas eficaces, entre las que cabe citar la profilaxis mediante la administración de antisueros (inmunización pasiva) o vacunas; las medidas de higiene (higiene de los alimentos y del agua, por ejemplo), y la lucha contra los reservorios animales o los artrópodos vectores.

4. La disponibilidad local de tratamientos eficaces, que comprende la inmunización pasiva, la vacunación posexposición y la administración de antimicrobianos, antivíricos y quimioterapia, y debe tener en cuenta la posibilidad de que aparezcan cepas farmacorresistentes.

El nivel de bioseguridad asignado a un trabajo concreto dependerá del juicio profesional basado en la evaluación del riesgo, y no en la asignación automática de un nivel de bioseguridad con arreglo al grupo de riesgo particular al que pertenezca el agente patógeno con el que se va a trabajar. En el cuadro 3 se resumen los requisitos de las instalaciones en los cuatro niveles de bioseguridad.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS BÁSICOS

Todos los laboratorios de diagnóstico y de atención de salud (de salud pública, clínicos o de hospital) deben estar diseñados para cumplir, como mínimo, los requisitos del nivel de bioseguridad 2. En general, siempre deben adoptarse y aplicarse las precauciones normalizadas correspondientes para los niveles 1 y 2 que se exponen a continuación:

Código de prácticas:

Este código es una enumeración de las prácticas y los procedimientos de laboratorio esenciales que constituyen la base de las técnicas microbiológicas apropiadas. En muchos laboratorios y programas nacionales, este código puede utilizarse para elaborar una guía escrita de prácticas y procedimientos para el trabajo de laboratorio en condiciones de seguridad.

Acceso:

1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico (figura 1) deberá colocarse en las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior.

2. Sólo podrá entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado.

3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas.

4. No se autorizará ni permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del laboratorio.

5. El acceso a los locales que alberguen animales habrá de autorizarse especialmente.

6. No se permitirá el acceso al laboratorio de animales que no sean objeto del trabajo del laboratorio.

Protección personal:

1. Se usarán en todo momento monos, batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio.

2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entrañar contacto directo o accidental con sangre, líquidos corporales y otros materiales potencialmente infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y a continuación se lavarán las manos.

3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y animales infecciosos, así como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio.

4. Se usarán gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de protección cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y fuentes de radiación ultravioleta artificial.

5. Estará prohibido usar las prendas protectoras fuera del laboratorio, por ejemplo en cantinas, cafeterías, oficinas, bibliotecas, salas para el personal y baños.

6. No se usará calzado sin puntera.

7. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos o manipular lentes de contacto.

8. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del laboratorio.

9. La ropa protectora de laboratorio no se guardará en los mismos armarios o taquillas que la ropa de calle.

Procedimientos

1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.

2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las etiquetas.

3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación de aerosoles y gotículas.

4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la aspiración de líquidos de los animales de laboratorio.

5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes.

6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.

7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.

8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación mientras se encuentren en éste.

Zonas de trabajo del laboratorio

1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.

2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.

3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.

4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o internacional aplicable.

5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de artrópodos.

Vigilancia médica y sanitaria

La entidad que emplea al personal del laboratorio tiene la obligación de cerciorarse, por medio del director de éste, de que la salud de dicho personal esté sometida a la debida vigilancia. El objetivo de esa vigilancia es detectar posibles enfermedades contraídas durante el trabajo. Entre las actividades apropiadas para alcanzar ese objetivo figuran las siguientes:

1. Proporcionar inmunización activa o pasiva cuando esté indicada.

2. Facilitar la detección temprana de infecciones adquiridas en el laboratorio.

3. Excluir a las personas muy susceptibles (por ejemplo, embarazadas o personas inmunodeficientes) de las tareas de laboratorio que entrañen mucho riesgo.

4. Proporcionar material y procedimientos eficaces de protección personal.

Normas para la vigilancia de los trabajadores que manipulan microorganismos en el nivel de bioseguridad 1:

La experiencia indica que estos microorganismos tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades humanas o enfermedades animales de importancia veterinaria. No obstante, lo ideal es someter a todo el personal a un reconocimiento médico previo a la contratación en el que se anoten los antecedentes médicos de cada persona. Conviene que se notifiquen rápidamente las enfermedades o accidentes de laboratorio y que todos los miembros del personal comprendan la importancia de aplicar técnicas microbiológicas apropiadas.

Normas para la vigilancia de los trabajadores que manipulan microorganismos en el nivel de bioseguridad 2

1. El reconocimiento médico previo al empleo o a la asignación de un puesto es indispensable. Debe registrarse el historial médico de la persona y realizar una evaluación de la salud ocupacional para los fines del laboratorio.

2. El director del laboratorio debe mantener un registro de enfermedades y bajas laborales.

3. Las mujeres en edad fecunda deberán ser informadas de los riesgos que supone para el feto la exposición profesional a ciertos microorganismos, como el virus de la rubéola. Las medidas concretas que se adopten para proteger al feto dependerán de los microorganismos a los que pueda estar expuesta la mujer.

PRUEVAS DIAGNÓSTICAS PARA NEUMONÍA

ELISA

Un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) implica la reacción de un complejo anticuerpo-enzima con un antígeno o anticuerpo que se mantiene inmóvil sobre una superficie sólida. En la incubación de la enzima conjugada con un sustrato adecuado, un producto es formado. La formación de un producto ayuda a detectar la presencia del antígeno o anticuerpo y su cantidad proporciona una medida de la cantidad de antígeno-anticuerpo de la reacción que se produjo. La prueba de ELISA se puede realizar de dos formas: directa e indirecta.

En la prueba de ELISA directa, un anticuerpo primario se lleva a cabo en las paredes de una placa de microtitulación. Cuando la muestra se sospecha que contienen el antígeno se añade, hay una reacción antígeno-anticuerpo. A continuación, un anticuerpo secundario ligado a una enzima que es capaz de reaccionar con el antígeno se añade. Si el antígeno está presente en la muestra, se une a este anticuerpo ligado a enzimas. Cuando un sustrato incoloro se añade, un color se desarrolla, indica la presencia de antígeno.

En el ELISA indirecto, el antígeno se lleva a cabo en las paredes de la placa de microtitulación. Cuando una muestra sospechosa de contener anticuerpos se añade, una reacción antígeno-anticuerpo se produce. A continuación, un anticuerpo secundario ligado a enzimas capaces de reaccionar con la región no unida del anticuerpo, se añade. Cuando el sustrato incoloro se añade, conduce al desarrollo de color si la muestra utilizada contiene anticuerpos

HEMOGRAMA

RECUENTO LEUCOCITARIO Y FÓRMULA DIFERENCIAL

Aquí se cuentan cada tipo de leucocito, cada uno de los cuales se altera en número bajo ciertas circunstancias, el valor normal total de leucocitos esta entre 4.100 a 10.900 leucocitos por mm3:

Granulocitos o células polimorfonucleares

Neutrófilos, presentes en sangre entre 2.500 y 7.500 células por mm³. Son los más numerosos, ocupando entre un 55 % y un 70 % de los leucocitos. Se tiñen pálidamente, de ahí su nombre. Se encargan de fagocitar sustancias extrañas (bacterias, agentes externos, etc.) que entran en el organismo. En situaciones de infección o inflamación su número aumenta en la sangre. Su núcleo característico posee de 3 a 5 lóbulos separados por finas hebras de cromatina, por lo cual antes se los denominaba "polimorfonucleares" o simplemente "polinucleares", denominación errónea.

Basófilos: presentes en sangre entre 0,1 y 1,5 células por mm³, (0,2-1,2 % de los leucocitos). Presentan una tinción basófila, lo que los define. Segregan sustancias como laheparina, de propiedades anticoagulantes, y la histamina que contribuyen con el proceso de la inflamación. Poseen un núcleo a menudo cubierto por gránulos de secreción.

Eosinófilos: presentes en la sangre entre 50 y 500 células por mm³ (1-4 % de los leucocitos). Aumentan en enfermedades producidas por parásitos, en las alergias y en el asma. Su núcleo, característico, posee dos lóbulos unidos por una fina hebra de cromatina, y por ello también se las llama "células en forma de antifaz".

Agranulocitos o células monomorfonucleares

Monocitos: Conteo normal entre 150 y 900 células por mm³ (2 % a 8 % del total de glóbulos blancos). Esta cifra se eleva casi siempre por infecciones originadas por virus o parásitos. También en algunos tumores o leucemias. Son células con núcleo definido y con forma de riñón. En los tejidos se diferencian hacia macrófagos o histiocitos.

Linfocitos: valor normal entre 1.300 y 4000 por mm³ (24 % a 32 % del total de glóbulos blancos). Su número aumenta sobre todo en infecciones virales, aunque también en enfermedades neoplásicas (cáncer) y pueden disminuir en inmunodeficiencias. Los linfocitos son los efectores específicos del sistema inmunitario, ejerciendo la inmunidad adquirida celular y humoral. Hay dos tipos de linfocitos, los linfocitos B y los linfocitos T.

1. Los linfocitos B están encargados de la inmunidad humoral, esto es, la secreción de anticuerpos (sustancias que reconocen las bacterias y se unen a ellas y permiten su fagocitocis y destrucción). Los granulocitos y los monocitos pueden reconocer mejor y destruir a las bacterias cuando los anticuerpos están unidos a éstas (opsonización). Son también las células responsables de la producción de unos componentes del suero de la sangre, denominados inmunoglobulinas.

2. Los linfocitos T reconocen a las células infectadas por los virus y las destruyen con ayuda de los macrófagos. Estos linfocitos amplifican o suprimen la respuesta inmunológica global, regulando a los otros componentes del sistema inmunitario, y segregan gran variedad de citoquinas. Constituyen el 70 % de todos los linfocitos.

Tanto los linfocitos T como los B tienen la capacidad de "recordar" una exposición previa a un antígeno específico, así cuando haya una nueva exposición a él, la acción del sistema inmunitario será más eficaz.

REACTANTES DE FASE AGUDA

PROTEÍNA C REACTIVALa PCR es miembro de la clase de reactivos de fase aguda o proteína de fase aguda y su nivel

aumenta dramáticamente durante los procesos inflamatorios que ocurren en el cuerpo. Este incremento se debe a un aumento en la concentración plasmática de IL-6, que es producida por macrófagos,2 células endoteliales y linfocitos T, como también lo hacen losadipocitos.3 La PCR se liga a la fosfocolina de los microorganismos. Se piensa que colabora con el complementoligándose a células extrañas y dañadas, y que realice la fagocitosis hecha por macrófagos, quienes expresan un receptor para PCR. También se cree que desempeña un papel importante en la inmunidad innata, como un sistema de defensa temprano contra infecciones. La

PCR aumenta hasta 50.000 veces en estados inflamatorios agudos. Se eleva sobre su nivel normal dentro de las 6 horas siguientes y alcanza el pico máximo en 48 horas.

Un test de PCR de alta sensibilidad, mide niveles bajos de PCR mediante el uso de nefelometría láser. La prueba arroja resultados en 25 minutos, con una sensibilidad menor a 0.04 mg/L. La concentración sérica normal en los adultos sanos, usualmente es inferior a 1 mg/L, aumentando ligeramente en la vejez. En mujeres embarazadas al final de la gestación y en inflamación leve e infecciones virales, oscila entre 1–4 mg/L. En proceso inflamatorios activos e infección bacteriana, entre 4–20 mg/L y en infecciones bacterianas severas y quemaduras >20 mg/L.5

Proteínas de fase aguda positivas:

Proteína Función en el sistema inmunológico

Proteína C reactiva Opsonina que actúa sobre microbios5

Amiloide sérico componente P

Opsonina

Amiloide A sérico

Reclutamiento de las células inmunitarias al sitio de inflamación

Inducción de enzimas que degradan la matriz extracelular

Factores del complemento Opsonización, lisis y aglutinación de las

células diana. Quimiotaxis

Lectina fijadora de manano Vía de la lectina fijadora de manano de

activación del complemento

Fibrinógeno, protrombina, factor VIII,Factor de von Willebrand

Factores de coagulación, atrapamiento de microorganismos invasores en coágulos sanguíneos.Algunos provocan quimiotaxis

Plasminógeno Degradación de los coágulos sanguíneos

Alfa-2-Macroglobulina

Inhibidor de la coagulación por medio de la inhibición de la trombina.6

Inhibidor de al fibrinólisis por medio de la inhibición de la plasmina

Ferritina Fijadora de hierro, limita el acceso

microbiano al hierro necesario para su metabolismo

Hepcidina7

Estimula la internalización de la ferroportina, previniendo la liberación del hierro fijado por la ferritina dentro de los enterocitos ymacrófagos

Ceruloplasmina Oxida al hierro, facilitando su fijación por la

ferritina, inhibiendo así el acceso microbiano al hierro.

HaptoglobinaFija a la hemoglobina, inhibiendo el acceso microbiano al

hierro

Orosomucoide(glicoproteína ácida alfa-1, AGP)

Transportadora de esteroides

Alfa 1-antitripsina Serpina, regula a la baja la inflamación

Alfa 1-antiquimotripsina Serpina, regula a la baja la inflamación

MATERIAL Y MÉTODO:

Para el conteo de leucocitos, se utilizó el método manual de recuento celular, este incluye 3 fases:

Dilución de la sangre Muestreo de la sangre diluida en un volumen Recuento de células en ese volumenPara el recuento de leucocitos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que

corresponden a los campos 1, 3,7 y 9.

Se realiza una dilución de 1/20. Se utiliza como diluyente el líquido de Turk. El líquido de Turk es hipotónico de modo que se destruyen los hematíes y así no entorpecen en el recuento. El líquido de Turk consta de ácido acético glaciar 2ml, violeta de genciana disolución de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deberá filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos.

En un principio es un poco difícil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematíes hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son más refringentes (más brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hematíes. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmática y de la membrana nuclear (a veces más) como líneas finas y brillantes. Esto se observa fácilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrás

MATERIAL Pipeta de Thoma para glóbulos blancos (perla blanca) Equipo para venopuncion (Tubo lila) Boquilla blanca Tubo de goma Tubos de ensayo

Papel parafilm Cámara de Neubauer Cubrehematimetro Microscopio GasasSUSTANCIAS Alcohol al 70% Sangre venosa Liquido de Turk

PROCEDIMIENTO1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción

venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA2. Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la micropipeta y diluir a 1/20 con

líquido de Turk.3. Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento. Debe estar limpia y seca.4. Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca

de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente.5. Dejar 3 minutos que los leucocitos se sedimenten6. Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar en los 4

cuadrados angulares.7. En el recuento a 40 x se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las

líneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeño de recuento y no se consideran los que estén en los límites inferior y derecho.

RESULTADOSRecuento LeucocitarioDespués de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de

ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo:N° de leucocitos x mm3 = altura x dilución x área N° de leucocitos x mm3 = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000N° de leucocitos x mm3 = 4/200 = 1/50N° de leucocitos x mm3 = N° de leucocitos contados x 50

En el análisis hecho, los resultados de la cuenta de células quedaron así por casilla:

Resultados de la muestra 1(mujer): 146 x 50 = 7300 leucocitos por mm3Resultados de la muestra 2(varón): 151 x 50 = 7550 leucocitos por mm3

VALORES DE REFERENCIA(Millones de células/mm3)Hombres y Mujeres:………………………………..5 000-10 000

Fórmula Diferencial:Muestra 1 (%) Muestra 2 (%)

Abastonados 13 2Segmentados 48 46Monocitos 7 11Basófilos 1 0eosinófilos 0 4linfocitos 31 37

ANÁLISIS Y CONCLUSIONESLos leucocitos son las células sanguíneas que dentro del organismo participan desarrollando

diferentes funciones como son: fagocitosis, defensa inmunológica específica o inespecífica.La cámara de Neubauer o hemocitómetro es una lámina portaobjeto gruesa, en cuyo centro

se hayan dos superficies cuadriculadas iguales, separadas del resto de la lámina por surcos y dos barras transversales algo más elevadas.

Una laminilla cubreobjetos ópticamente plan, que al colocarse sobre las barras elevadas de la lámina forma una cámara entre el cubreobjetos y la superficie cuadriculada, teniendo una altura de 0.1mm.

El recuento leucocitario representa el número de leucocitos en un litro de sangre completa. La cuantificación o recuento de leucocitos es muy importante para el diagnóstico de enfermedades.

Un bajo número de glóbulos blancos se denomina leucopenia y puede deberse a:

Insuficiencia de la médula ósea (por ejemplo: debido a infección, tumor o cicatrización anormal).

Enfermedades vasculares del colágeno (como el lupus eritematoso sistémico).

Enfermedad del hígado o el bazo. Radioterapia o exposición a la radiación.

Un alto número de glóbulos blancos se denomina leucocitosis y puede deberse a: Tumores de la médula ósea.

Enfermedades infecciosas.

Enfermedad inflamatoria (como artritis reumatoide o alergia).

Leucemia.

Estrés emocional o físico intensos.

Daño tisular (por ejemplo, quemaduras).

En la práctica todos los resultados obtenidos estuvieron dentro del rango de normalidad, lo cual es un indicador de ausencia de alguna enfermedad infecciosa

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Organización Mundial de la Salud. MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. 3ra ed. Ginebra. 2005, pág. 5-20.

2. Balcells. LA CLÍNICA Y EL LABORATORIO. Barcelona. Masson. 2010, p 23-543. Longo. HARRISON. PRINCIPIOS DE MEDICINA INTERNA. 16 ED. 2006, P 1043-1098.