modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
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Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable
Preámbulo I
Preámbulo
Para la lectura de este proyecto fin de carrera, se aconseja la lectura este primer documento, donde se situará al lector dentro del marco histórico y científico en el que este estudio se desenvuelve.
A pesar de tratarse de un trabajo sobre Ingeniería Industrial, cuyo desarrollo radica en el estudio del modelado matemático de sistemas, los procesos sobre los que se trabajarán, tienen un cariz algo alejado de lo cotidiano dentro del mundo de la Ingeniería, en concreto, la biología molecular.
Así pues, también se recomienda hacer una lectura del anexo final “Fundamentos Biológicos”, donde se describen los entes e interacciones necesarias para la comprensión global del sistema que se va a tratar.
Muchas Gracias
II Preámbulo
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Preámbulo III
1. Paradigma Actual de la biología sintética
La Revolución Industrial supuso un fuerte cambio de paradigma tecnológico y social que históricamente desembocó en un cambio Era. Durante la edad contemporánea las estructuras económicas europeas fueron remodeladas de tal forma que surgió una nueva estructura social acorde con las nuevas necesidades ocupacionales. A la par con la Revolución Industrial, el propio surgimiento de los modelos de estado democráticos no habría sido tan efectivo sin la participación de los vigentes avances tecnológicos que ayudaron a equiparar el poderío del ciudadano frente a las antiguas clases dominantes. Todo ello ha dado lugar a la adecuada transformación de la sociedad y de las relaciones propias que se establecen entre los diferentes estratos.
Todas las revoluciones de nuestra era han llevado consigo el descubrimiento de un nuevo concepto y el nacimiento de las ciencias que apoyaban estas ideas. La Primera Revolución Industrial se produjo después de la aparición de la máquina de vapor, las mejoras que se sucedieron tras ella incitaron el estudio de la Termodinámica y el uso de la energía térmica. Algo parecido ocurrió con la electricidad durante la denominada Segunda Revolución Industrial que, tras la formulación de las leyes de Maxwell, el estudio desembocó en nuevos avances técnicos. La conjunción del concepto (Energía térmica, democracia, electricidad,…) y el espíritu innovador propio del ser humano, es suficiente para que las bases de una nueva época se establezcan.
Una situación diferente está teniendo lugar con la Información. Ésta ha conseguido un objetivo mucho más amplio que las anteriores, estar presente en diversas disciplinas. Desde la biología con la genética, o la física con las actuales teorías de campos unificados, utilizan el concepto de Información como algo inherente en la realidad. Es esta idea la que radica en la computación o Internet. Por tanto, el avance actual de las ciencias no puede comprenderse sino como una relación interdisciplinar.
Observando el presente, podemos sugerir cuáles serán las disciplinas que están destinadas a revolucionar nuestra concepción del mundo en los años venideros. Entre las posibilidades dentro del mundo de la Ingeniería podemos encontrar el estudio de nuevos materiales que está consiguiendo grandes avances en los últimos años y por otro lado la robótica o la nanotecnología, que, aunque fueron grandes apuestas en las últimas décadas, no han conseguido diversificar su campo de aplicación o reformarse para tomar la iniciativa del verdadero cambio de paradigma que se esperaba de ellos.
La gran apuesta actual parece ser la Biología Sintética. Recordemos que las anteriores revoluciones comenzaron con una idea, un concepto, del cual surgen estudios en diferentes disciplinas y una ciencia la respalde. En este caso concreto, fue el descifrado del código genético junto con la posibilidad de creación de nuevas especies, la idea precursora de este campo de estudios.
IV Preámbulo
2. Perspectivas de la Biología Sintética
La Biología Sintética tiene unas perspectivas de aplicación verdaderamente asombrosas. Medio Ambiente, biomateriales, procesos industriales, bioenergías, Biomedicina son unos de tantos ámbitos en los que la biotecnología podría participar.
Leyendo el Informe de Vigilancia Tecnológica en Biología Sintética realizado por GENOMA ESPAÑA Tendencias en 2006 [1] podemos concretar éstas perspectivas de aplicación y hacernos una idea de cuán cercanas se encuentran. En el apartado sexto ‘Perspectivas Futuras de la Biología Sintética’ se analizan estos aspectos.
Sintetizando el análisis, el informe muestra el siguiente cuadro:
Como se observa en el cuadro resumen, se contempla los siguientes campos: Medio Ambiente, Materiales, Procesos Industriales, Energía y Biomedicina. Efectivamente, la Biología Sintética se muestra como el gigante capaz de revolucionar tantos ámbitos como quepa esperar.
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Preámbulo V
La Fundación Alternativas sacó en 2011 un informe llamado Realidad y expectativas de la biología sintética. El documento recoge la transcripción de las ponencias de los participantes un seminario del Laboratorio de Alternativas.
Al final, se hace una recopilación de las conclusiones que se decidieron de las jornadas. Entre ellas, destaco:
“…
2. La aplicación de los sistemas de trabajo de la ingeniería a la resolución de problemas biológicos está originando avances muy significativos en la biología y en sus aplicaciones biotecnológicas.
3. El uso de los métodos de cálculo avanzado permite conocer el funcionamiento de sistemas biológicos complejos. Estos pueden ser distribuidos en unidades teóricas que pueden considerarse como “piezas” de un proceso completo.
…
7. Esta área científica se encuentra en sus fases iniciales. Aunque los grupos norteamericanos son los más avanzados, no existe demasiada diferencia con los pocos grupos europeos que trabajan en este campo.
8. En España hay varios grupos de gran calidad trabajando en biología sintética y las áreas relacionadas.
…” [2]
Entre estos comentarios, se destaca el gran avance que actualmente está sufriendo esta disciplina y cómo no hay grandes diferencias entre los grandes centro de investigación del mundo.
VI Preámbulo
3. Biología Sintética e Ingeniería
Veamos algunas de las definiciones de que se han dado a la Biología sintética:
”…la ingeniería de la biología: la síntesis de complejos, sistemas basados biológicamente inspirados que desempeñan funciones que no existen en la naturaleza.”
Según: Applying Engineering to Biology: Report of a NEST High-Level Expert Group
“…La Biología Sintética se define como la síntesis de biomoléculas o ingeniería de sistemas biológicos con funciones nuevas que no se encuentran en la naturaleza…”
Wikipedia: Biología Sintética
“…Diseño y fabricación de componentes biológicos que no existen en la naturaleza…”
Tanto en las definiciones citadas como en los pilares de la propia Biología Sintética, se incluye la Ingeniería, la creación y el estudio de Sistemas como parte fundamental de su desarrollo. Es por tanto, una de las tareas que los ingenieros han de ir abarcando si, de hecho, este campo tan asombroso puede llegar a revolucionar el mundo.
La Biología Sintética nace después del avance de la Biología de Sistemas y de la Ingeniería Genética. La primera se centra en el estudio de los organismos a través de simulaciones basadas en algoritmos de resolución de los modelos matemáticos que ajustan el comportamiento de los sistemas; mientras que la Ingeniería Genética ha conseguido modificar los genes de los organismos para crear nuevos entes biológicos.
Algunos autores han señalado que hay que adaptar los métodos de trabajo de la Ingeniería para el desarrollo de la Biología Sintética. Bajo este supuesto, las cuatro ideas básicas que se deben ir cubriendo son:
• Estandarización de partes biológicas • Reparto y especialización de tareas • Organización de jerarquías • Diseño de dispositivos autorreplicativos
Bajo estas premisas, aparece en el MIT (Massachusetts Institute of Technology) el primer concurso internacional de Biología Sintética llamado iGEM (International Genetically Engineered Machine)
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Preámbulo VII
4. iGEM International Genetically Engineered Machines
La idea surge entre algunos profesores de ingeniería del MIT (Drew Endy y Tom Knight) con la finalidad de ser referencia internacional en Biología Sintética. Así, en 2003 en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) comienza un curso de verano en el que un grupo de estudiantes diseñan sistemas biológicos. Esto evolucionó hacia una competición que año tras año ha crecido en número de participantes a nivel mundial. Desde 2004 con 5 equipos llegaron a 165 en 2011. El concurso ha conseguido ser uno de los pilares fundamentales de la Biología Sintética a nivel internacional [1].
El iGEM además de servir de herramienta educativa y difusiva, encaja perfectamente en este planteamiento. Además de estimular la creación de grupos de trabajo de estudiantes de diversas disciplinas, se está creando toma una base de datos de registros de partes [2] utilizadas por cada grupo, alcanzando un grado de estandarización dispositivos.
Las esperanzas que están puestas en esta ciencia y concretamente en este concurso han hecho que tenga unos patrocinadores del nivel de FBI, NASA o MathWorks, que además son ajenos a la investigación de este campo. Entre los logros que está consiguiendo este concurso, muestro dos de los proyectos que se han presentado:
• Grupo Imperial College de Londres. En 2011 participaron con el proyecto Auxin, que se presentaba como un refuerzo en la lucha contra la desertificación del planeta. Crearon un producto que ayudaba a las plantas a arraigar en zonas de desertificación. http://2011.igem.org/Team:Imperial_College_London
• Grupo Washington. En 2011 participaron con el proyecto “Make it or Break it: Diesel Production and Gluten Destruction, The Synthetic Biology Way”. Un doble trabajo sobre la producción de Biofuel utilizando bacterias genéticamente ingeniadas, y sobre la eliminación del Gluten de los alimentos como solución a aquellos que sufren Celiaquía. http://2011.igem.org/Team:Washington
Estos dos proyectos son claros ejemplos de cómo esta ciencia es de muy amplia aplicación y de cómo hoy por hoy ya está consiguiendo resultados tangibles.
Randy Rettberg, Ingeniero investigador del MIT de Massachusetts en la división de Ingeniería Biológica, dijo en otro artículo realizado por El País: “…la biología sintética la harán compañías nuevas y acabará creando su propia industria”.
VIII Preámbulo
5. El grupo UPO-Sevilla
En 2010 se crea este grupo por iniciativa de estudiantes de la licenciatura de Biotecnología en la Universidad Pablo de Olavide. Estos estudiantes (Adrián Arellano, David Caballero, Félix Reyes, Paola Gallardo, Eduardo Pavón y Eva Fernández) cuentan con el apoyo, supervisión y colaboración de los profesores Fernando Govantes y Luis Merino para participar por primera vez en el concurso iGEM en ese mismo año. Preparan el proyecto ‘Bacterial Crowding’ con el que terminan compitiendo. El objetivo principal del trabajo fue el de explorar la posibilidad de dirigir una pequeña población de bacterias hacia una diana expuesta en una superficie biológica para conseguir una interacción eficaz.
Fue el primer equipo andaluz y tercero de España en competir en el concurso y recibió una medalla de bronce honorífica por el trabajo realizado.
Página web del proyecto: http://2010.igem.org/Team:UPO-Sevilla
En 2011 tras la experiencia del año anterior, el grupo continúa su voluntad de competir y otros estudiantes y profesores se adhieren, logrando doblar el número de participantes.
• Alumnos: David Caballero, Aida Moreno, José Gutiérrez, Paola Gallardo, Adrián Arellano, Amalia Martínez, Eduardo Pavón, Félix Reyes, Yolanda González y Jesús Jiménez.
• Profesores: Luis Merino, Fernando Govantes, Víctor Álvarez, Manuel Béjar, Rafael Rodríguez, Antonio Prado, Antonio Pérez
La incorporación de personal más especializado hace posible realizar un proyecto más profundo y amplio. El objetivo general marcado fue el de sumergirse en el estudio de sistemas biológicos biestables. Basado en artículos de investigación y en trabajos ya realizados, consiguen preparar un trabajo competitivo.
En la competición regional europea celebrada en Amsterdam en Octubre del 2011, logran el pase a la final mundial y reciben el premio a la mejor labor de difusión ‘Best Human Practices Advance’. El mérito más reconocido, fuera de lo estrictamente científico, fue el de crear el primer blog en español sobre Biología Sintética [1] que tenía 66 post y recibió más 11.000 visitas hasta la fecha de la competición europea.
Página web del proyecto: http://2011.igem.org/Team:UPO-Sevilla
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Preámbulo IX
6. FlashBacter
El proyecto presentado por el grupo UPO-Sevilla para el concurso de Biología Sintética iGEM 2011, pretendía continuar el trabajo realizado por numerosos investigadores en su búsqueda de sistemas biológicos biestables. La búsqueda de un biomarcador robusto, estable y de alta sensibilidad es la base de los sistemas de almacenamiento de la información en informática. El objetivo marcado fue el de la construcción de microorganismos que tengan la capacidad de almacenar información al igual que se hace en electrónica, en dos estados estables distinguibles.
En este sentido, el grupo subdividió parte del trabajo en 3 partes.
• El biestable básico (The Toggle Switch) – Este apartado, puso en marcha el dispositivo descrito por Timothy S. Gardner [1], y trabajar con él hasta conseguir sus curvas de funcionamiento.
• El biestable mejorado (Improving Toggle Switch) – Esta idea se basa en la del artículo mencionado anteriormente, pero lleva dos mejoras con el objetivo de lograr una estabilidad más evidente, y aumentar la robustez del sistema.
• El biestable epigenético (Epigentic Bistable) – Esta idea es algo más compleja desde el punto de vista biológico. De alguna manera, la robustez con este diseño estaría muy por encima de los anteriores. Además de usar unos fundamentos diferentes para conseguir tanto los estados de funcionamiento, como la estabilidad propia del sistema.
El Biestable Básico
El sistema básico consiste en un conjunto de dos represores controlados por dos promotores que se reprimen en presencia del represor gobernado por el promotor adversario.
La imagen esquemática del sistema recuerda al esquema de los biestable electrónicos tipo RS, donde tenemos dos señales de acción y dos salidas. A pesar de que pueda parecer más complejo, se tratan básicamente de mismos esquemas.
X Preámbulo
El cambio de estado se produce por la adición de un químico que se asocia con alta afinidad al represor 1 y lo inactiva. Así se favorece la síntesis del represor 2 y queda reprimida la expresión del primero. La estabilidad se encuentra en el propio ciclo de retroalimentación que provoca que la aparición de uno de los productos sea inhibidora de la acción contraria. Durante la síntesis del represor 2 se produce una molécula fluorescente (GFP – green fluorescent protein) que facilitará el reconocimiento de este estado ya que la bacteria, físicamente, se iluminará de color verde. Si en este momento, aumentamos la temperatura del ambiente en el que está inmersa la bacteria hasta unos 42ºC, la proteína represora 2 se desestabiliza y se degrada más rápidamente. Esto hace que la expresión del represor 1 sea posible al no sufrir la acción inhibitoria que ejercía la partícula adversaria. De forma análoga a la anterior, el represor 1 se unirá al promotor 1 evitando así la expresión de su competidor. La nueva producción de proteína lleva asociada otra partícula fluorescente (RFP – red fluorescent protein)
Veamos el Data Page elaborado por Amalia Martínez Segura en el marco de este proyecto.
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Preámbulo XI
Otros sistemas parecidos a éste han sido desarrollados y probados por otros investigadores consiguiendo un éxito considerable. Sin embargo, la simplicidad de estas construcciones tiene ciertos inconvenientes en la consecución de un biestable con unas características similares a las de los informáticos:
• Baja velocidad en el cambio. Esto provoca que durante las etapas intermedias nos encontremos con una mezcla de partículas de ambos represores en convivencia transitoria que hace difícil la determinación del estado.
• En ausencia de señal de control, el sistema tiende espontáneamente a un estado aleatorio. Incluso en el caso de favorecer alguna expresión, la falta de autoexclusión hace fallar la robustez.
• Incluso con la inducción del químico, no siempre es posible asegurar que el estado se mantenga estable.
XII Preámbulo
El biestable Mejorado
El núcleo del sistema sigue siendo el mismo que el del biestable básico, sin embargo, en este caso se añaden dos nuevos efectos que mejorarán la exclusión de una reacción frente a la otra.
Los dos efectos que se añaden en este nuevo concepto son: Proteólisis y ARN antisentido.
PROTEÓLISIS
Cuando se expresa una de las proteínas represoras se crean además, proteasas. La labor de las proteasas es la de digerir las proteínas del estado anterior que queden en la bacteria. De esta manera se acelera la posición de la primera proteína como mayoritaria. La proteasa utilizada en la construcción es ClpX, que degrada sustratos a los que se les asocia un adaptador SspB.
ARN ANTISENTIDO
Durante la expresión de una de las proteínas, junto con ella se producen estas moléculas. Estos ARN tienen la misma estructura que la del ARN mensajero de la proteína adversaria. Cuando un ARN mensajero y su ARN antisentido se encuentran, se unen, eliminando así la posibilidad de que sean traducidas en una nueva proteína.
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Preámbulo XIII
COMPORTAMIENTO GLOBAL
Estas dos nuevas acciones trabajan en colaboración con el sistema anterior para la robustez del sistema.
La idea por tanto, es añadir esta secuencia (Das4) específica en la fase de la proteína LacI y expresar condicionalmente el adaptador proteico bajo el promotor que controla el otro estado, de modo que cuando se añade IPTG, este inhibe la acción de lacI, que además es degradado por ClpX, incluso en ausencia de IPTG, eliminando cualquier actividad residual del inhibidor LacI y haciendo el cambio mucho más rápido.
En el otro caso además se incluirá en la fase de la GFP y su regulador correspondiente una secuencia con alta afinidad por un RNA antisentido específico que previsiblemente inhibirá su traducción. La secuencia se identifica como Ompn.
Veamos el Data Page realizado por Félix Reyes Martín y Yolanda Elisabet González Flores.
Estas implementaciones por un lado aumentarán radicalmente la velocidad de cambio de un estado a otro y por otro harán mucho más robusto todo el sistema, ya que los posibles niveles basales de los promotores y la relajación de los sistemas de inhibición se verán anulados imponiendo dos escalones más de regulación por la proteólisis e inhibición de la traducción.
XIV Preámbulo