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“ Especialización en Bacteriología Clínica”“ Especialización en Bacteriología Clínica”
MetodologíasMetodologías parapara lala deteccióndetección
dede CampylobacterCampylobacter sppspp..dede CampylobacterCampylobacter sppspp..
Maria Rosa Viñas
Departamento Bacteriología
INEI-ANLIS “C.G.Malbrán”
CARACTERISTICAS GENERALES género Campylobacter familia Campylobacteriaceae
• Bacilos Gram negativos. • Tamaño: 0,2-0,5 mµ• Curvos, espirilados o en forma de S.• Flagelo único en uno o en ambos extremos.• En cultivos de varios días, degeneran a formas cocoides.
Campylobacter jejuni
Campylobacter jejuni
Formas cocoides
ESPECIES TERMOFILAS
Crecen a 42 - 43°C; no crecen a 25°C• *Campylobacter jejuni (subesp. jejuni y doylei). Agente causal de
diarrea (más virulento, resistente a la fagocitosis)
• *Campylobacter coli. Produce diarrea más benigna.(*)Comensales de intestino de: vacas, ovejas, cerdos, cabras,
perros, roedores domésticos y silvestres y aves.
• Campylobacter lari. Aislado de intestino de gaviotas. No estádefinido el rol patógeno para el hombre. Indoxil acetato (-) y R al ac.Nalidíxico.
• Campylobacter upsaliensis. Raro aislarlo de diarreas.Produce bacteriemias en HIC. No está definida la fuente deinfección. Relacionado con animales, especialmente perros y gatos,alimentos como leche no pasteurizada y derivados
ESPECIES NO TERMOFILAS
Crecen a 25°C y 37°C
• Campylobacter fetus (subespecie fetus y venerealis): importancia enmedicina veterinaria por producir aborto esporádico en el ganadoovino y bovino e infertilidad en bovinos.
• C. fetus subesp. fetus: patógeno oportunista para el hombre(infecciones sistémicas en pacientes inmunodeprimidos). Diferencia entre(infecciones sistémicas en pacientes inmunodeprimidos). Diferencia entreambas subespecies: glicina al 1%
• C. fetus subesp. venerealis: aparato genital de vacas causandoinfertilidad.
• C. hyointestinalis: hisopados rectales en pacientes con proctititis, ileítisen cerdos. Pude crecer a 42°C y produce SH2 en TSI.
FISIOPATOGENIA
• Microorganismo ingresa por vía digestiva de alimentos contaminados ó contacto con animales.
• Periodo de incubación: 1 a 7 días.
• Cepas con distinto grado de patogenicidad en diferentes países.Dosis infectiva : 500 a 106 microorganismos. Casos asociados a SGB. En pacientes HIV e IMC :artritis, peritonitis,endocarditis aborto y sepsisneonatal.
MECANISMOS DE VIRULENCIA• Invasión de células epiteliales con abscesos en las criptas e infiltrados • Invasión de células epiteliales con abscesos en las criptas e infiltrados
inflamatorios en la lámina propia (sim. Shigella) Diarreas inflamatorias y disentéricas.
• Atraviesan mucosa intestinal y proliferan a lámina propia y ganglios. Infecciones extraintestinales (sim. Salmonella)
• Pueden producir toxinas termolábiles provocando una diarrea secretora (simil aE. coli y V. cholerae)
• Puede observarse acción citotóxica sobre células Hela y Vero , “cytoletaldistending toxin”, distensión y muerte celular.
Síndrome de Guillain-Barré
Carácteristicas de la enfermedad:
Poliradiculopatia aguda desmielinizante que se asocia a infección previa10 días o 3 semanas por Campylobacter (1 de cada 2000 infecciones).
� Cuadro autoinmune por producción de IgG-AntiGM-1, Ac conespecificidad dirigida al LPS de serotipos de Campylobacter jejuni, (Acreaccionan en forma cruzada con gangliósidos de la vaina de mielina quereaccionan en forma cruzada con gangliósidos de la vaina de mielina querecubre el axón de la célula neuronal).
Para asociar Síndrome con infección previa se aconseja realizar:
Cultivo:• Coprocultivo seriado (3 muestras): con un aislamiento es suficiente
Pruebas serológicas (ELISA):• IgG e IgM post infección por Campylobacter generalmente permanecenelevadas 3 o 4 semanas.• Confirmar aumento de dos o más títulos en serología seriada.
PRINCIPALES DIFICULTADES IDENTIFICADAS EN EL PROCESO DE IDENTIFICACIÓN
1- Toma y remisión de muestras
2 - Obtención de una atmósfera adecuada2 - Obtención de una atmósfera adecuada
3- Suplemento antibióticos-Medios selectivos
4- Conservación de cepas
2- Atmosfera de incubación
•Reemplazo de una atmósfera normal por una mezcla de gases apropiados 85% de N2, 10% de CO2 y 5% de O2
•Sobres generadores de gases especiales para CampylobacterBBL, Oxoid, Bio-Merieux 5-10% de O2 y 5-12% de CO2
•Sobres generadores de hidrógeno y oxígeno para anaerobiosis :precaucón por el hidrógeno
•Jarra con vela 17-19% de O2 y de 2-4% de CO2 (usar suplemento FBP)
•Generadores caserosa.Una pastilla de boranato de sodio ( 0,8 gr para una jarra de 3 litros)
Una pastilla de Alka Seltzer o Yastá10 ml de agua destilada.
b.Lana de aceroSolución ácida de sulfato cúprico: SO4Cu2 5gr, H2O 100 ml, H2SO4
0,33ml y Tween80 0,2 ml
Jarras y generadores de microaerofilia
Sistema de cambio de gases en jarra
�Bomba de vacío�Jarra con manómetro�Tubo con mezcla de gases
85% de N2, 10% de CO2 y 5% de O2
Preparación para incubar con atmósfera adecuada-Alimentos
Erlenmayer con caldo de enriquecimiento
Conexión a tubuladuras paraProporcionar atmósfera-Colocación en Baño a 44ºC
Sistema completo de burbujeo
Para procesar alimentos
3- Suplementos antibióticos
• Suplemento Caldo Bolton: Cefoperazona,vancomicina, trimethoprim,cicloheximide
• Suplemento Agar SkirrowVancomicina, trimethoprim, polimixina BVancomicina, trimethoprim, polimixina B
• Suplemento Agar CCDACefoperazona, Amphotericina B
PREPARACION ARTESANAL DE SUPLEMENTOS ANTIBIOTICOS
Epidemiología de Campylobacter
� Las especies de Campylobacter que causan infección entérica se encuentran habitualmente como comensales del tracto gastrointestinal de una gran variedad de maníferos y aves, domésticos y de vida libre.
� Principales fuentes de infección han sido asociadas al contacto con animales, agua o alimentos principalmente de origen aviar contaminados.contaminados.
� En países industrializados Campylobacter es el primer agente de diarrea por consumo de carne mal cocida ó contaminación cruzada al preparar los alimentos.
� En países en vías de desarrollo Campylobacter es el segundo agente de diarrea, según el lugar geográfico, principalmente en niños
Muestra de material fecal
Examen microscópico directo en:- Contraste de fase, campo oscuro u óptico- Tinción de Gram
Aislamiento directo
Placas de medio selectivoSkirrow-Mccda
EnriquecimientoCaldo Bolton (24 h a 42 - 43 ºC)
Incubación 24 - 48 h a 42 - 43 ºCEn condiciones de microaerofilia
Aislamiento indirecto (optativo)
Aislamiento de Campylobacter spp. a partir de materia fecal
En condiciones de microaerofilia
Identificación final
Identificación presuntiva:-examen microscópico directo(contraste de fase)(tinción de Gram)- prueba de oxidasa- prueba de catalasa
Pruebas bioquímicas:- Hidrólisis del hipurato- Hidrólisis del indoxil acetato- Sensibilidad a NAL y CEF
PCR
METODO DE FILTRACION PARA LA DETECCION DE Campylobacter EN
HECES (*)
• El método se basa en la separación de Campylobacter del resto de la flora microbiana presente en las heces, retenidos en la superficie de una membrana de celulosa de 0,45 o 0,66 µm; los bacilos que logran penetrar la membrana van a depositarse sobre una placa de agar sangre.
• De esta manera se obtiene un cultivo selectivo, situación que reemplaza a la adición de antibióticos.
• Este método se recomienda para el aislamiento de las especies emergentes: Campylobacter upsaliensis.
Nombre comercial
Blanco Método Tipo de muestra Requerimientos(tiempo de procesamiento)
Sensibilidad / Especificidad
Remel ProSpecT* Campylobacter Microplate Assay
C. jejuni y C. coli ELISA directo Materia fecal fresca o en medio Cary Blair.
3 h S: 89,1% E: 97,7%.
Métodos rápidos comerciales para Campylobacter spp.
SafePath™ Campylobacterassay
Campylobacter spp. termofílicos
ELISA Alimentos medio de enriquecimiento(24 h / 42ºC)36 h
Inmunoensayos visuales 3M™ Tecra™ para detección de Campylobacter
Campylobacter spp. termofílicos
ELISA Alimentos. Hisopados ambientales
medio de enriquecimiento(24 h / 42ºC)36 h
RIDASCREEN®Campylobacter
C. jejuni, C. coli y C. lari
ELISA directo Materia Fecal fresca o congelada a -20ºC.
3 h S: 100 % E: 99,6 %
PCR Campylobacter Termotolerantes Limite de detección en alimentos 104 UFC / 25 g alimento Aislamientos. AlimentosEspecificidad 100% PS Lubeck, P Wolffs, SLW On , P Ahrens,P Rädstrom and J Hoorfar.Toward an international Standard for PCR-based detection of food-borne thermotolerant Campylobacter: assay development and analytical validation.Applied and Environmental Microbiology. 69(9): 5664-69.2003.
PCR MúltipleC. jejuni / coli Limite de detección en alimentos 105 UFC / 25 g alimento Especificidad 100% A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health Organization. Multiplex PCR for differentiation of C. coli and C. jejuni. Laboratory Protocols, Training Course, Feb 2003.
Ensayos de PCR estandarizados para Campylobacter spp.
AislamientosAlimentosPCR Género Campylobacter Aislamientos Alimentos Presentó reacción cruzada con Arcobacter enaislamientos. D Linton, RJ Owen and J Stanley. Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals. Res Microbiol 147:707-18, 1996.PCR Campylobacter lari Aislamientos Especificidad 100%PCR Campylobacter fetus Aislamientos Especificidad 100%
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter spp. A PARTIR DE ALIMENTO ( según ISO/FDIS 10272: 2006)
Resultado
Pre-Enriquecimiento
9 x ml de Caldo Bolton con
suplemento antibiótico (dil1/10)
Incubación del caldo
4 -6 h a 37 ºC±1 ºC 1 ml extracción de ADN por hervido,Chelex
Incubación por 24 – 44 h ±4h
a 41,5 C ± 1ºC en microaerofilia
Enriquecimiento
PCR -16S rDNA Campylobacter spp.
Lavado de la Muestra 25gr carne en 225 ml SF según
ISO
TAMIZAJE
Resultado negativo
Aislamiento en medios selectivos ( mCCD agar , Skirrow ó agar base con
sangre, etc)
Identificación presuntiva y Subcultivo en medio Agar sangre
Incubación por 18 h ±2h a
41,5 ºC ±1 ºC en
microaerofilia
Incubación por 18 h ±3h a
37 ºC ±1 ºC
Confirmación
bioquímica
EXPRESION DE
RESULTADOS
-SF: Solución fisiológica estéril. -mCCD: modified Campylobacter Charcoal differential Agar -Medio Skirrow ó agar base (Caldo nutritivo) -Sangre estéril ( 5-7% en agar base)
Resultado positivo
Continuación
del Flujograma
de aislamiento
� Puesta a punto de PCR para Campylobacter spp. a partir de cepa(Linton y col., 1996) · Revisión taxonómica en los últimos años Campylobacter cryaerophilus como Arcobacter cryaerophilus
- Ensayo de inclusividad y exclusividad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
800 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
800 pb
Campylobacter spp.
Fig 4. .Electroforesis en gel de agarosa de productos amplificados por PCR de Campylobacter spp.:
Calle 1: Aislamiento Campylobacter fetus, calle 2: cepa de Refencia WHO 7.1 Campylobacter lari, calle 3:
Aislamiento Campylobacter coli, calle 4: cepa de Referencia WHO 6.1 Campylobacter jejuni, calle 5:cepa
de Referencia WHO 6.2 Campylobacter coli, calle 6: Cepa de Referencia CDC P/08 Campylobacter jejuni,
calle 7: Aislamiento Salmonella serov Typhimurium, calle 7: Aislamiento Enterobacter sakasakii, calle 8:
cepa de Refencia RC Vibrio cholerae no-O1, calle 10: control de reacción (mezcla de reacción sin ADN)
calle M: Marcador de peso molecular 100 bp .
800 pb
Fig 4. .Electroforesis en gel de agarosa de productos amplificados por PCR de Campylobacter spp.:
Calle 1: Aislamiento Campylobacter fetus, calle 2: cepa de Refencia WHO 7.1 Campylobacter lari, calle 3:
Aislamiento Campylobacter coli, calle 4: cepa de Referencia WHO 6.1 Campylobacter jejuni, calle 5:cepa
de Referencia WHO 6.2 Campylobacter coli, calle 6: Cepa de Referencia CDC P/08 Campylobacter jejuni,
calle 7: Aislamiento Salmonella serov Typhimurium, calle 7: Aislamiento Enterobacter sakasakii, calle 8:
cepa de Refencia RC Vibrio cholerae no-O1, calle 10: control de reacción (mezcla de reacción sin ADN)
calle M: Marcador de peso molecular 100 bp .
800 pb
Foto de PCR de Campylobacter spp.
816 pb
500 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M
Fig 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR- género a partir de ADN de muestra de alimento inoculadas con 1 a a 10000 UFC de Campylobacter jejuni/coli en presencia del IACCalles 1, 2, 3 y 4: ADN de muestra de alimento con 1, 10, 100 y 1000 UFC de Campylobacter jejuni , Calles 5, 6, 7 y 8: ADN de muestra de alimento con 10, 100 ,1000 y 10000 UFC de Campylobacter coli; calle 9 : IAC 10 -6 (, calle 10: control del sistema, calle 11: Control positivo Campylobacter jejuni , calles 12 y 13 : IAC 10-7 y 10-8. Calle 15: Marcador de peso molecular 100 bp.
M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M
� PCR para Campylobacter spp . (con BSA ) a partir de muestras de ciego de pollo inoculadas experimentalmente con Campylobacter jejuni pre-enriquecidas en caldo Bolton
sin Chelex con Chelex
800 pb
10 102 104 108 0 10 102 104 108
Fig. 5 . Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR- género a partir de muestras de ciegos inoculadas experimentalmente con Campylobacter jejuni
Calle M: marcador de peso molecular DNA 100 pb, Calles2 – 5: Muestras de ciego (1 g) inoculadas con 1-10, 100, 104, y 108 UFC/ ml de la cepa de referencia WHO 6.1 Campylobacter jejuni;, Calles 6 - 9 extracción de
ADN con Chelex: calle 6: Muestra de ciego sin inocular, calles 7-10: Muestra de ciego inoculada con 1-10 , 100, 104 y 108 UFC/ ml de la cepa de referencia WHO 6.1 Campylobacter jejuni , Calle 10 y 13 : Cepa de referencia WHO 6.1 Campylobacter jejuni, calle 11: C. coli, calle 12: C. lari,, calle 14: C. fetus, calle 15::control del sistema (mezcla de reacción sin templado), calles 16, 17 y 18 cepa referencia WHO 6.2 Campylobacter coli,
calle 19: cepa Referencia Salmonella Enteritidis.
10 102 104 108 0 10 102 104 108
Coloniassospechosas
Coloniassospechosas
Gram(bacilo gram (-) curvo)
Morfología típicaMovimiento en espiral(en contraste de fase o
campo oscuro)
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE Campylobacter spp
Colonias típicas en Agar
Karmali
Oxidasa (+)Catalasa (+)
PROBABLE CAMPYLOBACTER
Confirmar con pruebas bioquímicasColonias típicas en Agar
Skirrow
Karmali
IDENTIFICACION FINAL
• Crecimiento a 42-43°C y a 25°C
• Sensibilidad al ácido nalidíxico y cefalotina
• Hidrólisis del hipurato
• Hidrólisis del indoxil acetato
• Producción de ácido sulfhídrico(Medio de Lior)
Hidrólisis del hipurato –Hidrólisis del indoxil acetato
Hidrólisis del hipurato
Hidrólisis del indoxil acetato
Produccion de sulfhidrico (Medio de Lior)Sensibilidad a Acido Nalidixico y Cefalotina
MEDIO DE LIOR
CEFALOTINAResistente
ACIDO NADÍLIXICO
Sensibilidad variable
Temperaturas de Desarrollo de las Diferentes Especies de Campylobacter
25°C 37°C 42°C
C. jejuni subsp. jejuni - + +
C. jejuni subsp. doylei - + -
C. coli - + +
C. fetus subsp. fetus + + d
C. fetus subsp. venerealis + + -C. fetus subsp. venerealis + + -
C. lari - + +
C. upsaliensis - + +
C. hyointestinalis d + d
C. sputorum subsp. sputorum - + +
C. sputorum subsp. bubulus d + -
C. curvus - + +
C. rectus - + d
C. showae - - +
Características Bioquímicas de Especies de Campylobacter Termotolerantes
C. jejuni
jejuni Doyle
C. coli C. lari C.
upsaliensis
Hidrólisis del
hipurato
+ + - - -
Oxidasa + + + + +
Producción de + + + + -/d
catalasa
Reducción de
nitratos
+ - + + +
Producción de SH2 - - -/d + -
R. Ac. Nalidíxico S S S R S
R. cefalotina R V R R S
Indoxil acetato + + + - +
TTC S/d S S
Glycina 1% + + + + V
S: sensible R: resistente d: débil V: variable TTC: cloruro trifenil tretazolium
PRUEBAS BIOQUIMICAS PCR
� Bajo espectro de pruebas bioquímicas para caracterización fenotípica a nivel de las especies más frecuentemente implicadas como agentes de transmisión alimentaria: Campylobacter jejuni/coli
� Dificultad en la definición de especie por la prueba del hipurato.
PCR COMO HERRAMIENTA MOLECULAR PARA CONFIMAR LA IDENTIFICACION A NIVEL DE ESPECIE, A PARTIR DEL AISLAMIENTO.
i- Existencia de cepas de C. jejuni hipurato negativo (2%)ii- Cepas de C. jejuni con baja producción de la enzima hipuricasa.iii- Presencia de contaminantes capaces de reaccionar con el
revelador (falsos positivos)
773 pb C. jejuni
364 pb C. coli
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fig.1: Electroforesis en gel de agarosa de la reacción de PCR- Simple yPCR- Multiplex específica de especie Campylobacter jejuni /coli.
Test de Exclusividad
Calle M: marcador de peso molecular DNA 100 pb , calle: 1 : aislamiento deSalmonella spp.; calle 2: aislamiento de Pseudomona aeruginosa, calle 3 :
aislamiento de Enterococo spp., calle 4 : aislamiento de Escherichia coli,
calle 5 : aislamiento de Klebsiella spp., calle 6: aislamiento deStaphylococcus spp, calle 7: cepa control Campylobacter jejuni, calle 8:
cepa control Campylobacter coli, calle 9: cepas controles Campylobacter
jejuni / coli, calle 10: mezcla de reacción sin templado.
364 pb C. coli
C.jejuni773 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M
C.jejuni773 C.jejuni773 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M
C.jejuni773
Fig 2. Electroforesis en gel de agarosa de productos de amplificación obtenidos por PCR- Multiplex de aislamientos de C. jejuni/coli de Argentina
Test de Inclusividad
773 pb
C.coli364 pb
773
C.coli364
773 pb
C.coli364 pb
773
C.coli364
PCR-Multiplex para C. jejuni/coli.
Calles 1, 2, 3, 5, 6, 8 y 9: aislamientos de C.jejuni; calles 4, 7 y 10: aislamientos de C.coli ; calle 11: cepa control negativo Salmonella Enteritidis 2041/06; calle 12: control de reactivos (sin templado); calle 13: cepa control positivo C.coli del WHO-Global Salm Surv-EQAS; calle 14: cepa control positivo de C.jejuni del WHO-Global Salm
Surv-EQAS; marcador de peso molecular 100 bp ladder (Invitrogen
4- Métodos de conservación
Suspender una ansa de cultivo puro en:
• Medio con glicerol: en 0.5 ml de caldo triptosa -fosfatocon 5 % de suero equino estéril y 17 % de glicerol, llevara -70 ºC antes de los 20 minutos.a -70 ºC antes de los 20 minutos.
• 85 ml de caldo Brucella + 15 ml de glicerol. Llevar a -70ºC (3 años) o -20 ºC (1 año).
• Medio Wang: Caldo Brucella con 0.5 % de agar y 10 %de sangre, inocular por punción e incubar 24 hs 42 ºCen microaerofilia. Guardar a -20ºC hasta 4 meses.
� Estudio de Campylobacter spp.: Se evaluó la
jejuni 476
coli 74
Campylobacter spp.
Totales: 555
fetus 1
Aislamientos analizados en LNR 2010 – 2011(Sivila)
� Estudio de Campylobacter spp.: Se evaluó larelación genética de aislamientos deCampylobacter spp. de origen humano, demascotas y aves de corral por PFGE. Sedetectaron patrones relacionados
� Se detectaron patrones de PFGE de C. jejuni yC. coli en diferentes provincias indicandocirculación en el país de aislamientos conpotencial de diseminación.
Resistencia a antimicrobianos Resistencia a antimicrobianos –– Red WHONETRed WHONET--ARG ARG
(2007(2007--2010)2010)
% de NS en Campylobacter spp. Grupo Campylobacter -Arg Años 2007-2010 (N=834)
0
20
40
60
80
100
%
2007 (n=247)
2008 (n=199)
2009 (n=142)
2010 (n=246)
0TET ERI CIP CHL NIT AZI
Antibiótico
Campylobacter spp. (2007-2010): 834 aislamientos, alto % de R a CIP (65.7%) y a tetraciclina (TET) (34.2%) y muy bajo % de R a eritromicina (ERI) (4.2%).
CampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacter sppsppsppsppsppsppsppspp: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011: porcentaje de resistencia, 2011
Puntos de corte: 1Tabla 4.M45-A2 CLSI 2010. 2 Extraídos de la literatura internacional
Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test: Condiciones del test:
Medio: MH enriq. con 5% de sgre. de carnero desfibr.
CampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacterCampylobacter sppsppsppsppsppsppsppspp: : : : : : : : Método de Difusión por discoMétodo de Difusión por disco
Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:Drogas a ensayar para cepas provenientes de diarreas:
CIPROFLOXACINA Y ERITROMICINA.CIPROFLOXACINA Y ERITROMICINA.Adicionales: Adicionales: nitrofurantoinasnitrofurantoinas, cloranfenicol y tetraciclina, cloranfenicol y tetraciclina
Servicio ANTIMICROBIANOSINEI – ANLIS Dr Carlos G. Malbran
InterpretacionInterpretacionInterpretacionInterpretacionInterpretacionInterpretacionInterpretacionInterpretacion:::::::: Los ATB que no presentan zonas de inhibición
correlacionan bien con CIMs de resistencia, por lo que deben interpretarse como R.
Medio: MH enriq. con 5% de sgre. de carnero desfibr.
Inóculo: suspención directa de la colonia. 0.5 de McFarland
Incubación: a 42°C por 24 horas o a 36-37°C por 48 hs. en microaerofília(10 % CO2, 5% O2 y 85% N2).
Dice (Opt:1 .50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-SmaI
100
8060
PFGE-SmaI
Cj145/11 La Pampa 2011-05-11 C. jejuni ARDBRS16.0022 ave S S
Aislamiento Provincia Fecha aisl. Especie Nº patrón Origen Perfil de Resistencia CIP TET
Campylobacter spp.: prevalencia y caracterizaciónfeno-genotípica de aislamientos de pacientes con diarrea y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, Argentina. ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiologia (2012) 44: 266-271
Campylobacter jejuni en humanos y mascotas
Cj145/11
Cj376/10
Cj379/10
Cj49/11
Cj375/10
Cj324/10
Cj129/11
Cj130/11
Cj111/11
Cj112/11
Cj116/11
Cj144/11
Cj332/10
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
La Pampa
2011-05-11
2010-11-10
2010-11-10
2011-02-01
2010-10- 07
2010-10-04
2011-04-25
2011-04-25
2011-04-14
2011-04-14
2011-04-11
2011-05-11
2010-10-07
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
ARDBRS16.0022
ARDBRS16.0022
ARDBRS16.0022
ARDBRS16.0104
ARDBRS16.0130
ARDBRS16.0132
ARDBRS16.0128
ARDBRS16.0128
ARDBRS16.0080
ARDBRS16.0080
ARDBRS16.0080
ARDBRS16.0080
ARDBRS16.0101
ave
canino
humano
humano
canino
humano
humano
canino
ave
ave
humano
felino
humano
S
S
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R
S
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-SmaI
100
8060
PFGE-SmaI
Cc143/11
Cc51/11
La Pampa
La Pampa
2011-05-11
2011-02-02
C. coli
C. coli
ARDBBS16.0018
ARDBBS16.0029
humano
canino
R
S
R
S
Aislamiento Provincia Fecha aisl. Especie Nº patrón Origen Perfil de Resistencia CIP TET
Campylobacter coli en humanos y mascotas
Aislamientos de Campylobacter spp.origen humano – 2010 (GFN)
Distribución de Campylobacter spp.
121 4
jejuni
coli
Na: Número total de aislamientos: 1.354 (100%) Nc: Número total de aislamientos caracterizados: 1.242 (91.7%)
Países que reportaron datos: Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Paraguay y Perú
1115
coli
fetus
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]PFGE-SmaI
100
50
PFGE-SmaI
Cj 82/08
Cj12/09
Cj121/08
Cj21/08
Cj132/09
Cj 35/08
Cj23/08
Cj51/06
Cj121/09
Cj122/09
Cj 38/08
Cj120/09
Cj73/06
Cj85/06
CjP25/07
Cj209/08
Cj102/09
CjP27/07
CjP43/07
Cj115/06
Cj115/09
Cj123/06
Cj26/09
Cj120/08
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Paraguay
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Paraguay
Paraguay
Paraguay
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Resistencia
Neuquen
Rosario
Rosario
Asuncion
Neuquen
Rosario
Santa Fe
Asuncion
Asuncion
Neuquen
Asuncion
Mar del Plata
Santa Fe
San Lorenzo
Cordoba
Asuncion
Asunción
San Lorenzo
Santa Fe
Asuncion
Santa Fe
Bariloche
Rosario
Human
Human
Animal
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
2008-08-07
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2008
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2008-11-19
2008-11-19
2008-07-01
2008-11-19
2006
2006-01-25
2007-03-03
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2008-07-14
2007-03-07
2007-05-18
2006-04-04
2008-11-07
2006
2009-01-06
2008
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
ALDBRS16.0001
ALDBRS16.0002
ALDBRS16.0003
ALDBRS16.0004
ALDBRS16.0005
ALDBRS16.0006
ALDBRS16.0007
ALDBRS16.0008
ALDBRS16.0009
ALDBRS16.0009
ALDBRS16.0010
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0012
ALDBRS16.0013
ALDBRS16.0014
ALDBRS16.0015
ALDBRS16.0016
ALDBRS16.0017
ALDBRS16.0018
ALDBRS16.0019
ALDBRS16.0020
Cluster A
Cluster B*
*
Cepa Pais Ciudad Origen año aisl. especie NºPatrón Regional
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]PFGE-SmaI
100
50
PFGE-SmaI
Cj 82/08
Cj12/09
Cj121/08
Cj21/08
Cj132/09
Cj 35/08
Cj23/08
Cj51/06
Cj121/09
Cj122/09
Cj 38/08
Cj120/09
Cj73/06
Cj85/06
CjP25/07
Cj209/08
Cj102/09
CjP27/07
CjP43/07
Cj115/06
Cj115/09
Cj123/06
Cj26/09
Cj120/08
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Paraguay
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Paraguay
Paraguay
Paraguay
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Resistencia
Neuquen
Rosario
Rosario
Asuncion
Neuquen
Rosario
Santa Fe
Asuncion
Asuncion
Neuquen
Asuncion
Mar del Plata
Santa Fe
San Lorenzo
Cordoba
Asuncion
Asunción
San Lorenzo
Santa Fe
Asuncion
Santa Fe
Bariloche
Rosario
Human
Human
Animal
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
2008-08-07
2009-01-27
2008
2008-05-20
2008-12-23
2008-06-01
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2008-11-19
2008-11-19
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2008-11-19
2006
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2006-04-04
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2006
2009-01-06
2008
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
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C. jejuni
ALDBRS16.0001
ALDBRS16.0002
ALDBRS16.0003
ALDBRS16.0004
ALDBRS16.0005
ALDBRS16.0006
ALDBRS16.0007
ALDBRS16.0008
ALDBRS16.0009
ALDBRS16.0009
ALDBRS16.0010
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0011
ALDBRS16.0012
ALDBRS16.0013
ALDBRS16.0014
ALDBRS16.0015
ALDBRS16.0016
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ALDBRS16.0018
ALDBRS16.0019
ALDBRS16.0020
Cluster A
Cluster B*
*
Cepa Pais Ciudad Origen año aisl. especie NºPatrón Regional
CAMPYLOBACTER CAMPYLOBACTER sppspp.: PRIMEROS ESTUDIOS DE SUBTIPIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS .: PRIMEROS ESTUDIOS DE SUBTIPIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS CIRCULANTES EN CIRCULANTES EN ARGENTINA Y PARAGUAYARGENTINA Y PARAGUAY (COMIC,2009) (COMIC,2009) (BDR Pulse Net)(BDR Pulse Net)
Dendrograma de relación genética entre los aislamientos de C. jejuni de Paraguay y Argentina
Cj120/08
Cj38/06
Cj9/07
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Cj81/08
Cj1/09
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CjP31/07
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Cj109/09
Cj65/07
Cj35/06
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Cj40/06
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Cj82/06
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C 73/08
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Rosario
Cordoba
Santa Fe
Asunción
Resistencia
Neuquen
Neuquen
Rosario
Cordoba
Capital Federal
Junin
Resistencia
Asunción
Lanus
Gral Pico
Asunción
Santa Fe
Cordoba
Asuncion
Santa Fe
Cordoba
Asunción
Cordoba
Neuquen
Santa Fe
Rosario
Cordoba
Bariloche
Asuncion
Neuquen
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
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C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0021
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0023
ALDBRS16.0024
ALDBRS16.0025
ALDBRS16.0026
ALDBRS16.0027
ALDBRS16.0028
ALDBRS16.0028
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ALDBRS16.0030
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0032
ALDBRS16.0033
ALDBRS16.0034
ALDBRS16.0035
ALDBRS16.0036
Cluster C
*
Cluster D
*
**
Cluster E*
Cluster F
Cj120/08
Cj38/06
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Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Paraguay
Argentina
Rosario
Cordoba
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Resistencia
Neuquen
Neuquen
Rosario
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Capital Federal
Junin
Resistencia
Asunción
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Gral Pico
Asunción
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Cordoba
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Santa Fe
Cordoba
Asunción
Cordoba
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Santa Fe
Rosario
Cordoba
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Asuncion
Neuquen
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
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C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
C. jejuni
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0020
ALDBRS16.0021
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0022
ALDBRS16.0023
ALDBRS16.0024
ALDBRS16.0025
ALDBRS16.0026
ALDBRS16.0027
ALDBRS16.0028
ALDBRS16.0028
ALDBRS16.0029
ALDBRS16.0030
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0031
ALDBRS16.0032
ALDBRS16.0033
ALDBRS16.0034
ALDBRS16.0035
ALDBRS16.0036
Cluster C
*
Cluster D
*
**
Cluster E*
Cluster F
-Clusters compartidos entre Argentina y Paraguay, indicados con círculos rojos y las letras B, C, D y E, círculo verde el “cluster” A de Paraguay y con círculo azul el “cluster” F Argentina. ** Perfil electroforético de un aislamiento de C. jejuni recuperado de un caso de SGB
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
� La implementación de la reacción de PCR en el laboratorio para la identificación de Campylobacter spp. y a nivel de especie representa una herramienta diagnóstica y de caracterización genotípica, como ensayo complementario y factible de ser transferible a otros laboratorios.
� Los niveles de R observados nos alerta sobre el uso de antimicrobianos tanto en humanos como en animales destinados al consumo y nos impulsa a continuar con la vigilancia de la R.
�Fortalecer e intensificar la investigación de Campylobacter spp en inmunocomprometidos para un tratamiento adecuado.
�Promover la vigilancia de laboratorio a nivel nacional y regional