PRODUCCIÓN PORCINO

Mejora de la calidad seminalen inseminación artificial

Aunque la producción dedosis seminales decalidad óptima obliga arealizar un análisiscompleto del eyaculadoprevio a su elaboración, latendencia sigue siendo lautilización de muy pocosparámetros para unaevaluación rápida de lasdosis.Es por ello que una partede los fallos de fertilidaddebería imputarse a estafalta de información de lacalidad del eyaculadoutilizado.

P. García-Casado', C. López2,B. Pérez-Llano', R. Hernándezl,J. Ibáñez' y J. Gosálvez2

'Gestión Veterinaria Porcina, S.L.2 Universidad Autónoma de Madrid

L

a inseminación artificial es, en laactualidad, una técnica amplia-mente extendida en el sectorporcino, después de muchos

años de implantación y mejoras de lametodología utilizada, para tratar deobtener cada vez mejores resultados defertilidad.

Para conseguir este fin, por un lado sehan desarrollado los métodos de insemi-nación y se ha mejorado la composiciónde los diluyentes utilizados para la pre-paración de las dosis seminales. Pero,por otro lado, aunque la producción dedosis seminales de calidad óptima obligaa realizar un análisis completo del eya-culado previo a su elaboración, la ten-dencia sigue siendo la utilización demuy pocos parámetros para una evalua-ción rápida de las dosis. Una parte delos fallos de fertilidad debería imputarsea esta falta de información de la calidaddel eyaculado utilizado.

Problemática de la evaluaciónde la calidad seminalEn el ganado porcino, en estos momen-tos, la tendencia apunta al uso cada vezmás frecuente de la inseminación post-

cervical, es decir, al depósito del semenen el cuerpo del útero, cuando habi-tualmente y de forma tradicional, la in-seminación se realiza a nivel cervical.Esto hace posible una reducción delnúmero de espermatozoides utilizadopor cada dosis de inseminación. De estaforma, mientras en la inseminación cer-vical se utilizan una media de 3.000 mi-llones de espermatozoides, la insemina-ción intrauterina se puede acometercon 1.500 e incluso con 1.000 millonesde espermatozoides. Por ese motivo, elanálisis de la calidad de los espermato-zoides que se utilicen para estos propó-sitos adquiere una mayor importancia,imponiéndose la selección de los eyacu-

lados que contengan una población deespermatozoides de óptima calidad.

Obviamente, la inseminación de tipocervical también resultaría beneficiadacon una selección previa de eyaculadosmás exigente.

En el eyaculado se encuentra unapoblación de células espermáticas dediferente calidad que coexisten en elmismo, aunque la evaluación se realizade forma global. Lo que se obtiene endicha evaluación es la estimación delporcentaje de células que está en bueno mal estado según la prueba realizada.A su vez, el espermatozoide analizadode forma individual, tiene diferentes ca-racterísticas que definen su calidad yque deben ser evaluadas para conocerel estado de todas sus funciones o de lamayor parte de ellas.

Los parámetros más utilizados en elanálisis de la calidad seminal, son enprimer lugar, la motilidad, la cual tansólo indica que los espermatozoides es-tán vivos, dado que la metodología deevaluación es tan importante, que la al-teración tan sólo de un grado de tempe-ratura al analizarlo varía el movimientoespermático. Por tanto, es un paráme-

tro el cual no debe tener toda la impor-tancia que se le da, ya que el esperma-tozoide una vez dentro del útero, seestimula con diversas sustancias secre-tadas por el útero, logrando su máximamotilidad después de producirse el fe-nómeno de "capacitación" a la alturadel oviducto, indispensable para lograrla fecundación del ovocito.

Por otra parte, el estudio de la mor-fología, indica que el espermatozoideha llegado bien a su grado final dedesarrollo y que no tiene ningunaanormalidad que le impida realizar lafecundación (persistencia de gotas cito-plásmicas proximales, anomalías en ca-beza, tracto intermedio o cola). Pero es-

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PORCINO

tos parámetros no son suficientes si latendencia es a disminuir el número deespermatozoides utilizados en la dosisseminal, ya que cada espermatozoideadquiere una mayor responsabilidadpara conseguir la fecundación, siendonecesario el análisis de las estructurasde membrana, y como se ha constatadoen nuestras más recientes investigacio-nes, el estado de la cadena del ADN.

En cuanto al estado de las membra-nas, es muy importante analizar el esta-do del acrosoma, que debe estar intac-to. Es la estructura situada en la parteapical de la cabeza del espermatozoide,que contiene las enzimas necesarias pa-ra poder realizar la penetración del ovo-cito. Este análisis, es más importantecuanto más tiempo se mantengan lasdosis conservadas. Las pruebas demembrana como el HOST corto y elHPAR (espermatozoides HOSTc posi-tivos con el acrosoma intacto) mues-tran el estado estructural y la capacidadfuncional de la membrana plasmática ydel acrosoma.

Por otra parte, no se puede olvidarque la calidad del ADN del espermato-zoide es esencial para conseguir un des-arrollo embrionario perfecto. El indicede fragmentación del ADN (IF ADN)indica el porcentaje de espermatozoi-des con el ADN fragmentado. La pre-sencia de fragmentación del ADN enun espermatozoide implica que, aun te-niendo capacidad fecundante, por pre-sentar buena motilidad, no tener nin-guna anormalidad y tener lasmembranas en buen estado, se puedeproducir una muerte embrionaria, alno poder repararse de forma eficien- »

Cuadro 1. Valores medios de calidad seminal obtenidosen el estudio (233 eyaculados de 22 verracos).

Motilidad 75,7%

Porcentaje de acrosomas normales 75,9%

Gotas proximales 8,2%

Gotas distales 11,3%

Colas en látigo 6,8%

indice de fragmentación de ADN 3,1%

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•Foto 2

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Espermatozoides de verraco sometidos a la técnica SCD (Sperm-Sus-Halomax, Chromacell,) para la evaluación del nivel de fragmentación deADN con microscopia de fluorescencia (fluorocromo Sybr-Green; Foto 1) o de campo claro (tinción de Wright; Foto 2). Los espermatozoidescon un halo alrededor de la cabeza tienen el ADN fragmentado.

G e La generalización de lainseminación post-cervical

resalta la importancia del análisisde la calidad de los eyaculados

te por el ovocito. Una mala reparaciónde la molécula de ADN impedirá undesarrollo embrionario normal.

Este problema, no era posible detec-tarlo hasta ahora, salvo por medio detécnicas poco accesibles y muy costo-sas. De esta forma, el índice de frag-mentación de ADN espermático, unparámetro de indiscutible interés, no seha incorporado de forma rutinaria en la

evaluación de la calidad seminal. En es-te momento, el test de dispersión de lacromatina (SCD), permite evaluar deforma sencilla y rápida la calidad delADN en espermatozoides de verraco,teniendo la posibilidad de clasificar ycontrolar a los animales de un centrode inseminación.

El problema de la evaluación de lacalidad seminal es que hasta ahora noexiste ninguna prueba que valore todaslas características que interesan. Todasellas son independientes aunque existacierto grado de interdependencia entreellas, de forma que el conocimiento dela motilidad no informa del estado delos acrosomas, ni del grado de fragmen-

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tación del ADN del espermatozoide.En otras palabras, una buena motilidadespermática, no implica que el eyacula-do tenga capacidad fecundante.

Investigación: ensayos realizadosConscientes de esta problemática, serealizó un estudio de la calidad seminalintegrando varios parámetros para es-tudiar la evolución de los mismos a lolargo del ario y tratar de identificar lasposibles diferencias individuales en lacalidad seminal.

Se recogieron y analizaron un totalde 233 eyaculados de 22 verracos, pro-cedentes de varios centros de insemina-ción españoles durante dos arios, desdejunio de 2006 hasta junio de 2008. Laspruebas de calidad seminal utilizadasen este estudio fueron: valoración de lamotilidad espermática, porcentaje deacrosomas normales, porcentaje de for-mas anormales e índice de fragmenta-ción del ADN (Sperm-Sus-Halomax,Chromacell).

Los valores medios de calidad semi-nal obtenidos durante los dos arios deestudio en las muestras analizadas semuestran en el Cuadro I. Estos valoresmedios se pueden considerar comonormales para la especie y tomando to-dos los datos de forma global.Considerando los datos correspondien-tes a cada verraco durante los dos ariosde estudio, se puede observar la evolu-ción de la calidad seminal de cada unode ellos, la evolución de cada uno de »

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Figura 1. Grupo 1. Buena calidad en todos los parámetros. Figura 2. Grupo 2. Calidad variable con IF bajo.

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Figura 3. Grupo 3. Calidad variable en todos los parámetros. Figura 4. Grupo 4. Mala calidad en todos los parámetros.

los parámetros de calidad dentro de ca-da verraco y las diferencias que hay en-tre verracos en dicha evolución(Figuras 1 a 4).

Estudiando los datos detenidamente,se ha encontrado que existen varios casosposibles de coincidencia o discrepanciaentre los parámetros de calidad seminal,y se han clasificado en cuatro grupos:• Grupo 1: Buena calidad en todos los

parámetros.• Grupo 2: Calidad variable en motili-

dad, acrosomas y de formas anorma-les, pero bajo índice de fragmenta-ción del ADN.

• Grupo 3: Calidad variable con osci-laciones marcadas en todos los pará-metros.

• Grupo 4: Mala calidad en todos losparámetros.Los resultados que se presentan en

este trabajo, muestran una vez más, quela calidad seminal, puede estar asociadaa cada individuo. Esto abre la posibili-dad de poder predecir la calidad semi-nal futura de un verraco si se realizanestudios de manera periódica.

Aunque en trabajos anteriores losautores encontraron una relación signi-ficativa entre la incidencia de morfoa-nomalías, sobre todo las que indican in-madurez de los espermatozoides, y el IFADN, no se puede asegurar que todoslos eyaculados con un alto porcentajede formas anormales van a presentar unalto índice de fragmentación del ADN,como se puede ver en los casos estudia-dos.

Por tanto, el análisis de motilidadpor sí solo no basta para valorar la cali-dad seminal de forma completa. El es-tado de los acrosomas puede variarmás, ya que la membrana del acrosomaes muy sensible a los cambios bruscosde temperatura. Así mismo, el IF ADNno está relacionado siempre con el restode características seminales. Un esper-matozoide con buena motilidad y unestado óptimo de los acrosomas puedecontener ADN fragmentado.

Estos resultados indican que si sequiere obtener una información fiablesobre la calidad seminal real de un eya-culado, se tiene que realizar todas las

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diluyentes de semen

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PORCINO PRODUCCIÓN

pruebas a nuestro alcance que analicentodos los aspectos que caracterizan elestado y la función del espermatozoide.

Este análisis completo debería reali-zarse desde el momento en el que se es-tá seleccionando al verraco como do-nante de semen para la inseminaciónartificial. Sería un análisis inicial en elque se valoraría la calidad seminal delverraco, con todos los parámetros co-mentados. Posteriormente, debería re-petirse este control completo al menosuna vez cada 2 ó 3 meses (análisis pe-riódico), ya que, como se puede com-probar en las gráficas de resultados, lacalidad de cada parámetro puede variary siempre lo hará de forma indepen-diente de los demás.

Se ha observado en otros estudiosque el índice de fragmentación delADN espermático puede verse afectadopor infecciones bacterianas o víricas delindividuo, periodos febriles, estrés, epi-sodios de aumento de temperatura am-biental. Por tanto, la realización de esteanálisis periódico sería aconsejable.

Como conclusión, hay que insistir enla importancia de la evaluación comple-ta del eyaculado, para que otros esfuer-zos que se están realizando hacia la me-jora de los resultados de inseminaciónartificial porcina, como la mejora de lapropia técnica de inseminación, no seanen balde. De nada sirve que se depurela técnica de deposición del semen en elcuerpo uterino, si luego se utiliza un se-men contrastado deficientemente.

AgradecimientosEste trabajo ha sido realizado en elmarco del Proyecto "Mejora de las téc-nicas de congelación de semen y vitrifi-cación de embriones" financiado por laCAM, exp. N° 33/2008 Biotecnología.Agradecer la labor realizada en los tra-bajos de laboratorio a F. Arroyo de laUAM y a R. A. Millán de GestiónVeterinaria Porcina SL. •Bibliografía en poder de la redacción adisposición de los lectores interesados(mundoganadero@eumedia.es )

Foto 3. Espermatozoides de verracoprocesados con la técnica SpermChromatin Dispersión, prueba que permiteel análisis rápido de la fragmentación delADN. Microfotografía realizada conmicroscopia de fluorescencia y dobletinción combinada con Sybr Green y GelRed. Los espermatozoides que presentanun halo de cromatina expandida alrededorde la cabeza presentan la molécula deADN fragmentada.