Compactación de la cromatina espermática: posible explicación de la infertilidad idiopática asociada a semen de potros “buenos

congeladores”Compaction of sperm chromatin: possible explanation of idiopathic infertility associated with

sperm foals "good freezability"

Hartley, R1; Alvarenga, M2; Ramírez, C2; Romero, F3, Ramírez-Reveco, A1

1 Laboratorio Criobiología y Análisis de Funcionalidad Espermática, Instituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile2 Universidad Estadual de Sao Paulo UNESP, Botucatu, Sao Paulo, Brasil.3 Laboratorio de Neurociencia y Biología de Péptidos (CEBIOR-BIOREN), Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

74.33

17.5

2.89

13.03

34.58

89.6

60.7

21.7

21.7

84.15

7.045

17.5

2.66

19.08

29.2

85.6

52.4

26.6

26.6

58.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tasa Preñez

Caspasa positivo

Merocianina positivo

Peroxidación positivo

Acrosoma reaccionado

Motilidad total

Motilidad progresiva

Morfología anormal

Halomax Positivo

Decompactación nuclear (tioglicolato)

Variables Analizadas (% promedio)Grupo fertilGrupo sub-fertil

ResumenContar con técnicas que orienten un manejo eficiente dereproductores equinos de alto valor, es una constante problemáticaen el área. En el caso de la evaluación espermática, diversos son losestudios que han indicado la importancia de la compactación de lacromatina nuclear, tanto como un indicador de la correctaespermatogénesis y maduración epididimaria, como también en laformación del pronúcleo post fecundación. En el presente estudioevaluamos 21 potros cuyos eyaculados presentaban óptimosvalores de congelabilidad, y que agrupados presentabandiferencias significativas (un orden de magnitud) en la tasa degestación al día 15 post inseminación, 74,33% para el grupo fértil(n=10) y 7,45% para el sub-fertil (n=11). Al evaluar la calidad seminalpost congelación, no se encontraron diferencias significativas(p<0,05) tanto en su integridad de membrana, morfología, motilidad(total y progresiva), estado acrosomal, peroxidación lipídica,estabilidad de membrana y activación de caspasa. Por otra parte enla evaluación de la integridad nuclear, que contemplo los ensayosde fragmentación de DNA (Halomax) y test de tioglicolato (Hartleyet al, 2016), solo se obtuvieron diferencias significativas entre losdos grupos solo en el parámetro que evalúa el estado decompactación de la cromatina (p<0,05). Nuestros resultadossugieren poner especial atención en estado de la compactaciónnuclear como un factor de calidad seminal crítico asociado a lafertilidad en equinos

Publicaciones asociadasHartley, R., Aros, P., Bustos-Obregón, E., Romero, F., Alvarenga, M., & Ramírez-Reveco, A. (2016). Reevaluating the sperm nuclear Chromatin Decondensation test by sodiumThioglycolate of Stallions Spermatozoa. Journal of Equine Veterinary Science, 36, 10–14. doi:10.1016/j.jevs.2015.10.002

MetodologíaMuestras problema y cálculo tasa de preñez: Fueron seleccionados21 potros sanos, de los cuales 11 presentaban bajo índice de preñeza los 15 días con semen criopreservado (definidos al inseminar almenos 6 yeguas por dosis de cada potro, considerando al menos 7ciclos por yegua).Decompactación nuclear: Se siguió protocolo según Hartley et al2016.Fragmentación (Halomax): Se evaluó por microscopía defluorescencia según recomendaciones fabricanteMorfología: Se evaluó por microscopía de contraste de fases (DIC),evaluando 200 espermatozoides con aumento 100x. Seconsideraron alteraciones en la cabeza, pieza intermedia, cauda ypresencia de gota citoplasmática.Motilidad: Evaluada en Hamilton Thorne® (IVOS-10 Sperm Analyser,Hamilton Thorne Biosciences Inc, Bervely, MA, EE.UU.)obteniéndose la motilidad total y la progresiva, registrándose almenos tres campos al azar para completar 500 células por muestra.Estado Acrosomal: Fue analizada por citometría con una mezcla deyoduro de propidio (PI; P470 Sigma-Aldrich Co., Saint Louis,Missouri, EUA), PSA-FITC (L-0770, Sigma-Aldrich) y Hoechst 33342.Peroxidación: Fue analizada por citometría con la sonda BODIPY-C11(D-3861; Molecular Probes).Merocianina: Fue analizada por citometría por tinción conmerocianina 540 (M540.Caspasa: La detección de caspasa 3/7 activada se realizó con el kitCellEvent C10427 (Molecular Probe) por citometría de flujo,contrastando los espermatozoides con Hoescht 33342 y SYTOXpara identificar la población con integridad de membrana. Para elloa un 1 ml de muestra diluida en TALP a concentración de 1x106espermatozoides por mL, se le añadió 1 µL de CellEvent junto conde 5uL de Hoescht (concentración 100 ug/mL). Luego se incubó lasolución por 25 minutos a 37ºC. Posteriormente, se añadió 1uL deSYTOX incubándose por 5 minutos para su posterior cuantificación.

Resultados

ConclusiónSi bien los parámetros que clásicamente se evalúan en el análisis seminal entregan orientaciones delpotencial fértil en el macho, tanto en el semen pre y post-congelado, no siempre correlaciona con éste.En el caso de estos potros problema, ninguna de las variables evaluadas pudieran entregar informaciónsobre los dos grupos de potros previamente evaluados como sanos según la evaluación seminal., pero quesin embargo, post congelación, uno de ellos presentaba baja tasa de preñez.De los parámetros evaluados, solo la compactación se vio alterada post descongelación, pudiendo ser unaherramienta complementaria en la evaluación espermática.

FinanciamientoBeca Conicyt Tesis Doctoral Ricardo Hartley, Folio 21120861

Proyecto Fondef D08I1076

ContactoDr. Alfredo Ramirez-Reveco ✉alfredoramirez@uach.cl

Dr(c) Ricardo Hartley ✉at.ricardo@icloud.com @cridhe

Grupo fe

rtil

Grupo su

b-ferti

l0

20

40

60

80

100

Tasa

pre

ñez

al d

ía 1

5 (%

)

****

Tasa de gestación observado a los 15 días postinseminación con semen criopreservado. Fueronconsideradas 7 yeguas para cada donante (6 ciclos porcada una), grupo fertil (n=10 potros, 74,33 promedio), gruposub-fértil (n=11 potros, 7,045 promedio). Mann-Whitney test,p<0,05. La gráfica indica el promedio con su error standard

Comparación de los efectos en la decompactación decromatina (espermatozoides reactivos) entre los gruposfértiles e infértiles. Mann-Whitney test, p<0,05. La gráficaindica el promedio con su error standard