UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMA

MANUAL DE PRACTICA PARA BIOQUMICA.

REA DE CIENCIASSUB REA DE CIENCIAS QUMICAS

GUATEMALA ENERO 2011

NDICECONTENIDO PAGINASNDICE2REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA51.INTRODUCCIN52.OBJETIVOS53.MATERIALES64.METODOLOGA6PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO71.INTRODUCCIN72.OBJETIVOS73.MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA84.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO145.MATERIALES166.METODOLOGA167.EVALUACIN DE LA PRCTICA18PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES181.INTRODUCCIN182.OBJETIVOS183.MARCO TERICO204.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2235.MATERIALES246.METODOLOGA257.EVALUACIN DE LA PRCTICA278.PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA:279.INVESTIGAR27PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES281.INTRODUCCIN282.OBJETIVOS283.MARCO TERICO.294.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3345.MATERIALES356.METODOLOGA367.EVALUACIN DE LA PRCTICA408.PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN41PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES431.INTRODUCCIN432.OBJETIVOS:433.MARCO TERICO.444.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4505.MATERIALES526.METODOLOGA.537.PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA:598.EVALUACIN DE LA PRCTICA609.RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE60PRCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRA.631.INTRODUCCIN632.OBJETIVOS633.MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFA (11)644.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 5715.MATERIALES DE LA PRCTICA V726.METODOLOGA747.PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA:80Prctica No. 6 EXTRACCIN DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES831.INTRODUCCIN832.OBJETIVOS833.MATERIALES844.METODOLOGA855.EVALUACIN DE LA PRCTICA87PRCTICA 7 ESTUDIO DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES881.INTRODUCCIN882.OBJETIVOS883.MATERIAL DE APOYO GLCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20)894.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 7965.MATERIALES986.METODOLOGA1007.PREPARACIN DE REACTIVOS1028.PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA:1039.EVALUACIN DE LA PRCTICA103Prctica No. 8 EXTRACCIN DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALESError! Marcador no definido.1.INTRODUCCINError! Marcador no definido.2.OBJETIVOSError! Marcador no definido.3.MATERIALESError! Marcador no definido.4.METODOLOGAError! Marcador no definido.5.EVALUACIN DE LA PRCTICA:Error! Marcador no definido.Prctica No. 9 ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALESError! Marcador no definido.1.INTRODUCCINError! Marcador no definido.2.OBJETIVOSError! Marcador no definido.3.MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALESError! Marcador no definido.4.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 9Error! Marcador no definido.5.MATERIALESError! Marcador no definido.6.METODOLOGAError! Marcador no definido.7.EVALUACIN DE LA PRCTICAError! Marcador no definido.8.PARA EL REPORTE DE PRCTICAError! Marcador no definido.BIBLIOGRAFAError! Marcador no definido.

REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

INTRODUCCIN

Para iniciar el Laboratorio de Bioqumica, se plantea esta primera reunin, de carcter obligatorio, para enterar a los estudiantes de las disposiciones generales que aqu debern cumplirse. Esta es una parte del laboratorio que el estudiante suele obviar, pero que, por la trascendencia de la misma, se plantea como parle de la asistencia.Adems de lo antes dicho, puede aprovecharse la reunin para que el estudiante conozca a su instructor d laboratorio y viceversa, con la finalidad de que se cimienten las bases de una buena comunicacin sobre la cual pueda edificarse el conocimiento. A su vez, el instructor de laboratorio formar grupos de trabajo a quienes har responsables de un locker, con la finalidad de qu las actividades prcticas s realicen con el mayor orden posible.

OBJETIVOSa) b) GENERAL Informar a los estudiantes de las disposiciones generales del laboratorio de Bioqumica.ESPECFICOS: Revisar el contenido del programa de Laboratorio de Bioqumica. Revisar el reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Revisar las normas de cuidado de materiales dentro del laboratorio. Dar lectura a los "aspectos a considerar para el buen uso del Manual de prcticas de bioqumica. Ampliar la informacin antes revisada, o bien aclarar aquellas dudas que el estudiante pudiese tener sobre algn tpico de la informacin general del Laboratorio. Formar los grupos de trabajo para el desarrollo ordenado del Laboratorio de Bioqumica.

[Escr FACULTAD DE AGRONOMA LABORATORIO DE BIOQUMICA

8 MATERIALES

Programa de Laboratorio de Bioqumica. Reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Reglamento para Uso de Materiales de Laboratorio.

METODOLOGA

El instructor de laboratorio habr d presentarse a los estudiantes y tomar asistencia a esta reunin. El instructor de laboratorio repartir los tres reglamentos mencionados en los listados de materiales" de esta sesin de laboratorio. Se proceder a dar lectura al Programa de laboratorio de Bioqumica. Se proceder a dar lectura al Reglamento d laboratorio de Bioqumica. Se proceder, a dar lectura al Reglament para uso de materiales de laboratorio. El instructor de laboratorio ampliar aquella informacin que fuese requerida por los estudiantes. Se formarn grupos de trabajo con un mximo de 4 integrantes, para favorecer la realizacin de las prcticas y el aprendizaje de los estudiantes.

PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO

1. INTRODUCCIN

Algunas veces se ha escuchado en la Subrea de Ciencias Qumicas, la inquietud de los estudiantes por encontrar, desde el inicio, un "sentido" a los laboratorios de la Subrea. No han quedado de lado aquellos estudiantes que ven al laboratorio simplemente como un requisito para la aprobacin del curso, y es qu mucho de lo que un estudiante puede aprovechar de un laboratorio, est ligado con la manera en cmo se lo presenten.Es por ello que ahora se inicia el Laboratorio de Bioqumica con los fundamentos que puedan crear un espritu de inters en el estudiante, esto es, algunas bases sobre las que pueda descansar el proceso de aprendizaje en el laboratorio, con la pretensin de que el estudiante se site en el contenido del Laboratorio de Bioqumica y logre contextualizar l mismo en el campo de la Agronoma.Procurando no caer en la profundizacin terica -lo cual corresponde a la teora de curso- se har una breve descripcin de lo que es una "Biomolcula", y junto a ello la identificacin de las molculas que se estudiarn posteriormente en el Laboratorio.As mismo, se aprovechar la reunin de esta semana para adelantar un poco de la Prctica 2 a fin de que no se sobrecargue de trabajo la semana asignada a dicha prctica.

OBJETIVOS

Explicar la importancia del laboratorio de Bioqumica dentro de la Carrera de Ingeniero Agrnomo. Ubicar el trmino "Biomolcula" en la Jerarqua Organizativa de la Vida. Identificar las Biomolculas y Macromolculas que se van a trabajar en el laboratorio. Seleccionar el material vegetal que se trabajar en el laboratorio. Iniciar el proceso de preparacin del material vegetal seleccionado.MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA c) La materia viva posee diversas caractersticas (15)Alguna vez estudiaste en Biologa General lo que distingue a los organismos vivos de los objetos inanimados; ahora mencionaremos uno de" estos atributos: "Un organismo vivo es estructuralmente complicado y altamente organizado. Poseen intrincadas estructuras internas (Fig. 1) y contienen muchos tipos de molculas. Ello contrasta con la materia inanimada del entorno -arcilla, arena, rocas, agua del mar que suele consistir en mezclas de compuestos qumicos relativamente simples. C4 C3

Fig. 1 corte transe versal de hoja. Observe como se aprecia la organizacin y complejidad microscpica

"Cada uno de los componentes de un organismo vivo tiene una funcin especfica. Esta afirmacin no es solamente cierta para estructuras macroscpicas como las hojas y los tallos, el corazn y los pulmones, sino tambin para estructuras intracelulares microscpicas como el ncleo y los cloroplastos".La bioqumica trata de explicar la vida en trminos qumicos (5) "Las molculas que componen los organismos vivos cumplen todas las leyes familiares dela qumica, pero tambin la interaccin entre ellas, de acuerdo con otra serie de principiosa los que nos referiremos colectivamente como la lgica molecular de la vida. Estosprincipios son un conjunto de relaciones que caracterizan la naturaleza, la funcin, ascomo las interacciones de las Biomolcula."Si los organismos vivos se componen de molculas intrnsecamente inanimadas, cmo pueden estas molculas dar lugar a la remarcable combinacin de caractersticas que llamamos vida? Cuales la razn de que un organismo vivo parece ser ms que la suma de sus partes inanimadas?El objetivo fundamental de la ciencia 'bioqumica es el de determinar de qu modo interactan los organismos vivos con otros los conjuntos de molculas inanimadas que constituyen los organismos vivos para mantener y perpetuar la vida. En otras palabras, la bioqumica tiene como objetivo explicar las estructuras y funciones biolgicas en trminos qumicos. Aunque la bioqumica proporciona conocimientos y aplicaciones prcticas que son importantes en medicina, agricultura, nutricin e industria, su preocupacin ltima es el prodigio de la vida misma.Debajo de la diversidad biolgica subyace una informacin qumica (15)Por favor piense un poco en la diversidad de seres vivos que conoce. Piense en un conejo, en un caballo, en un insecto -de los que se miran en Entomologa General-, en un roble (Quercus sp), en el frijol (Phaseolus vulgaris), piense en una bacteria o un hongo (de los que se pueden apreciar al cursar Microbiologa General). Si compara cada una de las cosas en las que pens, en un principio, parece haber muy pocas cosas en comn. Sin embarg, despus de cien aos de investigacin bioqumica, resulta evidente que los organismos vivos son notablemente similares en los niveles qumico y microscpico.Biomolculas Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que al comenzar el estudio de las biomolculas y susinteracciones, algunas cuestiones bsicas requieren atencin. Qu elementos, qumicospueden encontrarse en las clulas? Qu tipos de molculas conforman la materia viva?En qu proporciones se hallan? Cmo llegaron a formar parteado ella? De qu maneralas molculas presentes en las clulas vivas son especialmente adecuadas para cumplir sucometido?"Prcticamente todos los compuestos orgnicos a partir de los que se construyen los organismos vivos son productos de la actividad biolgica. Estas biomolculas fueron seleccionadas a lo largo del proceso de evolucin biolgica en razn de su idoneidad para llevar a cabo funciones bioqumicas y celulares especficas".Composicin qumica (15) "A principios del siglo diecinueve resultaba claro para los qumicos que la composicin de la materia viva era sorprendentemente diferente de la del mundo inanimado.La materia viva se compone principalmente en los elementos ms ligeros"Los cuatro elementos ms abundantes en loa organismos vivos, en trminos de porcentaje sobre el nmero total de tomos, son el hidrgeno, el oxgeno, el nitrgeno y el carbono, que en conjunto representan ms del 99% de la masa de la mayor parte de los clulas.

Las biomolculas son compuestos de Carbono"La qumica de los organismos vivos se organiza alrededor del elemento carbono, que representa ms de la mitad del peso seco de las clulas.Recuerde un poco el contenido de curso de "Qumica Orgnica": "los tomos de carbono unidos covalentemente pueden formar cadenas lineales, cadenas ramificadas y estructuras cclicas y en forma de celda. A estos esqueletos carbonados se les unen otros grupos de tomos, denominados grupos funcionales, que confieren propiedades qumicas especficas a la molcula.Las molculas que contienen esqueletos carbonados unidos covalentemente sedenominan compuestos orgnicos; el nmero de ellos y su variedad son casi ilimitados.La mayor parte de biomolculas son compuestos orgnicos; podemos por tanto deducir quela versatilidad de enlace del carbono constituy un factor decisivo en la seleccin de loscompuestos de carbono para la maquinaria molecular de las clulas durante el origen y laevolucin de los organismos vivos"(15)Los grupos funcionales determinan las propiedades qumicas: "Puede considerarse que la mayor parte de biomolculas son derivados de loshidrocarburos, compuestos que tienen un esqueleto de tomos de carbono unidoscovalentemente a los que slo se unen tomos de hidrgeno.Los esqueletos de hidrocarburo son muy estables. Los tomos de hidrgeno pueden serreemplazados por una amplia gama de grupos funcionales para dar lugar a las diferentesfamilias de compuestos orgnicos."Muchas biomolculas son poli funcionales y contienen dos o ms tipos diferentes de grupos funcionales, cada uno de ellos con sus propias caractersticas qumicas y su reactividad propia: Los aminocidos, una importante familia de biomolculas que actan principalmente como subunidades monomricas de las protenas, contienen como mnimo dos tipos diferentes de grupos funcionales: un grupo amino y un grupo carboxlico. La capacidad de un aminocido para condensarse con otros aminocidos para formar las protenas depende de los propiedades qumicas de estos dos grupos funcionales''.Reactividad qumica (15). "Los hidrocarburos saturados -molculas con enlaces simples carbono-carbono y sin enlaces dobles o grupos sustituyentes- no son fcilmente atacados por la mayora de los reactivos qumicos; las biomolculas, quo pueden, poseer diversos tipos de grupos funcionales, son mucho ms reactivas qumicamente. Es posible analizar y predecir el comportamiento qumico y las reacciones de las biomolculas a partir de los grupos funcionales que contienen".

Las macromolculas y sus subunidades monomricas (15)"Muchas de las molculas que se encuentran dentro de las clulas son macromolculas,polmeros de alta masa molecular construidos a partir de precursores relativamente simples. Las macromolculas pueden formar posteriormente estructurassupra macromoleculares, dando lugar a las unidades funcionales del tipo de los ribosomas,las membranas y los orgnulos (Ver Fig. 2):"Las macromolculas son los constituyentes principales de los organismos. Prcticamente toda la materia slida de cualquier tipo de clulas es orgnica y se halla presente en cuatro formas: protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos."Las protenas, largos polmeros de aminocidos, constituyen, el agua aparte, lafraccin celular mes importante; las protenas son quizs las ms verstiles de losbiomolculas, en cuanto a sus mltiples funciones y propiedades. Los cidos nucleicos,DNA y RNA, son polmeros de nucletidos. Participan en el almacenaje, transmisin ytraduccin de la informacin gentica. Los polisacridos, polmeros de azcares simplescomo la glucosa, tienen dos funciones principales: como almacn de combustiblesenergticos y cmo elementos estructurales extracelulares.Los lpidos, derivados hidrocarbonados grasos o aceitosos, sirven de componentes estructurales do las membranas y de reserva de combustible rico en energa, adems de cumplir otras funciones."Las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas. En las macromolculas protenas, cidos nucleicos y polisacridos el nmero de subunidades monomricas es muy grande.NOTA: Si esto ltimo le confunde un poco, no se preocupe, pues esto es lo que se ir estudiando en el laboratorio de Bioqumica. Antes de continuar, se recordar un poco de lo visto en el Curso de Biologa General, respecta a la jerarqua de organizacin de un organismo vivo. Esto servir para poder ubicar el contenido del laboratorio de Bioqumica en un contexto Agronmico, pues con esta Figura 2, es posible concatenar ideas, para ubicar el sitio de las "Biomolculas" en una planta (pilar fundamental de la Agronoma).

Existe una jerarqua en la estructura celular"Las subunidades monomricas (aminocidos, azcares simples como la glucosa, etc.), que se unen para formar las macromolculas, Son muy pequeas comparadas con las macromolculas biolgicas. Una molcula d un aminocido como la alanina tiene una longitud menor de 0.5 nm. Lo hemoglobina, la protena transportadora de oxgeno de los eritrocitos, est formada por aproximadamente 600 aminocidos unidos covalentemente en cuatro largas cadenas, que se pegan en forma globular y se asocian en una estructura tetramrica con un dimetro de 5,5 nm. Por su parte, las molculas de protena son pequeas en comparacin con los ribosomas (de aproximadamente 20 nm de dimetro), que contienen aproximadamente 70 protenas diferentes y diversas molculas de DNA. Los ribosomas, son a su vez, mucho ms pequeos que orgnulos cmo las mitocondrias, de dimetro aproximadamente igual a 1000 nm. Existe pues, un gran salto desde las biomolculas sencillas hasta las estructuras celulares que pueden observarse con el microscopio ptico. (Ver Fig. 2)

Fig. 2 Organizacin jerrquica en la estructura celular

CUESTIONARIO PRE LABORATORIO

1. A qu se le llama la Lgica Molecular de la Vida?

2. Cul es el objetivo fundamental de la Ciencia Bioqumica?

3. Cules son los dos niveles en los cuales los organismos vivos (por ejemplo, un roble, un insecto o un hongo) son notablemente similares?

4. En razn de qu surgieron las biomolculas a lo largo del proceso de evolucin biolgica?

5. Cules son los 4 elementos ms abundantes en los seres vivos?

6. A su juicio personal y fundamentado en lo que ha ledo, qu es lo que determina las propiedades qumicas y el comportamiento de las biomolculas?

7. Elabore una definicin propia de Biomolcula, indique qu es una macromolcula. Adems explique si a su juicio hay alguna diferencia entre ambos trminos.

8. Enumere las 4 macromolculas que se presentan en el material de apoyo a esta prctica. Adems indique cul de esas 4 es la que tiene mayor versatilidad de funciones y propiedades.

9. Seales las funciones generales de los cidos nucleicos, los polisacridos y los lpidos.

10. Esquematice lo que para usted significa la frase siguiente: las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas.

11. Para resolver este tpico piense, por ejemplo, en un conjunto formado por varios subconjuntos. Luego piense cmo la unin de estos lo hace a aqul.

12. Esquematice grficamente, de manera clara y sencilla, cada uno de los trminos sealados en la Fig. 2 del Material de apoyo de esta prctica, procurando que su esquema guarde una secuencia lgica. Por ejemplo: se le pudiera ocurrir esquematizar una hoja de Frijol como ejemplo de rgano.

13. Ordene ascendentemente (en funcin de su tamao), los trminos siguientes: rgano, subunidad monomrica, organismo vivo, complejos supra moleculares, orgnulos, tejido, macromolcula, sistema, clula.

14. Conteste con sinceridad si usted cree que ha podido ubicar el tema central de estudio de este laboratorio (biomolcula) como parte integradora de una Planta. Cree usted que al lograr esta ubicacin es posible enmarcar el Laboratorio de Bioqumica en un Contexto Agronmico? Explique. Recuerde que su Instructor de Laboratorio est para asesorarle y ayudarle a resolver sus dudas.

MATERIALES A cargo de cada estudiante Manual de prcticas de Laboratorio de Bioqumica Cuaderno de prcticas de laboratorio.

METODOLOGA Revisin del fundamento terico y explicacin del instructor de laboratorio: Resolver un examen corto del fundamento terico contenido en el "Material de Apoyo". Revisin del cuestionario pre-laboratorio y solucin a interrogantes de los estudiantes. Entrega del cuestionario pre-laboratorio.Identificacin de las biomolculas y macromolculas que se estudiarn en el Laboratorio de Bioqumica Revisar de forma general el documento de laboratorio de Bioqumica, procurando identificar las biomolculas y macromolculas que se tratarn en las prcticas respectivas. Realizar un listado de las biomolculas y macromolculas que se van a trabajar en las prcticas de laboratorio. En el listado anterior, procure colocar al menos, dos ejemplos de cada biomolcula macromolcula.Seleccin del material vegetal a trabajar en el laboratorio:Al observar los objetivos de su instructivo, se ve que durante el laboratorio de Bioqumica, se va a estudiar las macromolculas. En funcin de ello, la seleccin del material vegetal estar muy ligada al contenido (en porcentaje peso/peso) de dichas molculas. El material a trabajar debe, cumplir con las caractersticas siguientes: Que lo seleccionado sea un rgano vegetal (semilla, tallo, hoja, fruto, etc.) que no posea demasiados pigmentos (como podra ser el caso del caf o el laurel). Que sea factible preparar harina de ese rgano vegetal Para la seleccin de un material vegetal especfico seguir las recomendaciones siguientes: Que se tenga un porcentaje no menor que 10%, de al menos dos biomolculas y/o macromolculas (protenas, carbohidratos, lpidos). Conocer la planta seleccionada. Tener la facilidad de conseguir la planta.Toda vez seleccionada la planta que se va a trabajar, cada sub-grupo de laboratorio, se dirigir o. su instructor para pedir por la aprobacin de la planta a trabajar.Para ello debe tener al menos dos opciones de plantas (que cumplan con lo sealado anteriormente) y presentar al instructor una pequea tabla con los datos siguientes: Nombre comn y nombre cientfico de la planta. Lugar (es) donde se le puede conseguir (nombre del almacn u otro lugar de suministro del material vegetal) Contenido, en porcentaje, de biomolculas y/o macromolculas Contenido de humedad Porcin no comestible de la planta.

Inicio del proceso de preparacin de la muestra vegetal aprobada;

Cuando el instructor apruebe la planta a trabajar, los estudiantes procedern a comprar el material suficiente para poder preparar una buena cantidad de harina de la muestra vegetal. De 700 gramos en adelante, de material vegetal. Cuando tengan la muestra vegetal, refirase al numeral 6.1 de la prctica 2 (en caso de semillas) y/o al numeral 6.4 de la prctica 2 (para el secado de la muestra vegetal). Luego los alumnos averiguarn el porcentaje de humedad de la muestra vegetal, utilizando el horno de conveccin (a una temperatura no mayor a 60oC). Refirase a la metodologa que se emplea en el laboratorio de la Subrea de Ciencias Biolgicas de la FAUSAC, para averiguar el contenido de humedad de la muestra vegetal. Para hacer esto puede serle de utilidad los numerales 6.1 y 6.2 del Instructivo de la Prctica 2 de este laboratorio. Anote los resultados de sus clculos en su cuaderno de laboratorio y entrguelos como parte de la Tarea No. 1. Recuerde que el material vegetal que se va a utilizar en la siguiente prctica debe llevarlo seco, para que su instructor autorice la realizacin de dicha prctica.EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 1: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado, que aparecen en el Instructivo de Prctica 1. La parte prctica indicada en esos mismos ser evaluada al momento de que los estudiantes lleven su material debidamente seco, para la preparacin de la harina, en la Prctica 2.

PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIN

En el laboratorio de Bioqumica, se plantea un estudio de protenas, carbohidratos y lpidos dentro de un contexto agronmico, y es por ello que el anlisis de estas biomolculas se har en muestras de vegetales.No obstante el aplicar pruebas analticas a muestras de vegetales a alguien le pudiese parecer insuficiente para crear un contexto agronmico en cada prctica. En funcin de esto, se realiz una planificacin de actividades, la semana anterior (Prctica 1), y en esa oportunidad se pudo seleccionar aquel vegetal, que por su contenido, de al menos dos de las tres molculas biolgicas en cuestin, es adecuada para el trabajo a lo largo de todo el laboratorio.Luego cada grupo de trabajo ha conseguido una muestra suficiente de la planta escogida. As se llega a la presente reunin de laboratorio, en donde la atencin se centrar en preparar dicho material vegetal, con lo, cual se pretende proveer al estudiante de herramientas de trabajo del campo agronmico.

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica, el alumno deber estar en capacidad de: Preparar muestras vegetales para el anlisis a realizar en el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC. Utilizar de manera correcta, el equipo de laboratorio utilizado en la presente prctica.

MARCO TERICO Cuando se hace referencia a "preparar" muestras vegetales para anlisis qumico, en el contexto del laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se est hablando del proceso de colecta, secado, molido y tamizado de dichas muestras. Este proceso incluye la "extraccin" de los compuestos a analizar, sin embargo, esto se deja como un apartado puesto que se estar trabajando ms adelante (16)3. Recopilacin botnicaEs el estudio botnico de la familia o gnero de plantas a investigar con el objeto de no cometer errores en el momento de la recoleccin, pues en ocasiones hay varias plantas, miembros de familias o gneros, que por lo comn contienen las mismas sustancias de inters y debe decidirse cul planta escoger en el momento. (6)

Investigacin bibliogrfica de la planta de inters (6)Consiste en hacer un estudio exhaustivo sobre todo lo que se encuentra escrito sobre determinado gnero o familia del vegetal a investigar con el objeto de tener la mayor cantidad posible de informacin y conocer, por ejemplo, que parte de la planta es rica en ciertos constituyentes, qu tipo de constituyentes se conoce que contiene, qu parte de la planta recolectar, qu mtodo de extraccin utilizar, etc.La mayor cantidad de informacin sobre estudios qumicos en plantas y sustancias aisladas de ellas, son publicadas en revistas cientficas de muy diversa ndole, pertenecientes a las reas de Farmacia, Medicina, Agronoma, Botnica, Qumica, Zootecnia, etc.. Por lo tanto la localizacin de datos sobre un vegetal puede ser muy dificultosa. Sin embargo utilizando publicaciones de Chemical Abstrais u otros abstractos de la rama de vegetales, puede facilitarse esta bsqueda bibliogrfica. Adems, actualmente, el recurso Internet es de mucha ayuda.Recoleccin de las muestras vegetalesSegn Medinilla (lT), idealmente el anlisis qumico de muestras vegetales debera realizarse sobre tejidos vegetales frescos. Sin embargo, muchas veces la planta a estudiar proviene de lugares distantes, o quizs fue colectada en otro continente. En tales casos la planta debe ser secada antes de la extraccin de compuestos.Debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio se encuentre libre de contaminacin con otra planta. Asimismo, es esencial emplear plantas sanas, que no estn infectadas por virus, bacterias u hongos. La razn de esto es que no solo podran detectarse productos de sntesis microbiana, sino que adems estas infecciones podran alterar seriamente el metabolismo de la planta y formarse productos inesperados, quizs en grandes cantidades (lT).Es necesario reconocer de antemano al vegetal a recolectar entre grupos similares de plantas, as como saber que parte o partes se van a colectar de acuerdo al inters del investigador. Es imperativo llevar a cabo una recoleccin de acuerdo a las normas establecidas para ello. (6)De la tcnica do colecta de plantas en el campo, puede obtenerse una buena referencia consultando el documento "Algunas indicaciones para la preservacin de plantas", del Herbario de la FAUSAC (13), razn por la cual no se detalla aqu.Secado de las muestras vegetalesMedinilla (17), dice: "es esencial que la operacin de secado se efecte bajo condiciones controladas para evitar que ocurran cambios qumicos en los constituyentes. Toda muestra vegetal debe secarse lo ms pronto posible, evitando usar altas temperaturas, y preferiblemente con una adecuada circulacin de aire".Segn el documento "Mtodos de Investigacin Fitoqumica" (6), el secado de muestras vegetales puede realizarse de 2 maneras:Tcnica de secado al sol: Esta tcnica es la ms utilizada, debido a que no hay descomposicin de constituyentes, por lo cual es la tcnica ms recomendable. Secando sobre papel peridico cambiable cada 24 horas hasta unas 4 a 5 veces hasta la eliminacin total del aguaTcnica de secado artificial: Utilizando mtodos elctricos o de cualquier otro tipo. Es necesario no calentar a temperaturas mayores de 60C que podran descomponer ciertos compuestos.En el documento del Herbario de la FAUSAC (13), dice que en el proceso de colecta de muestras vegetales, muchos buenos especmenes se pierden por pudricin. Por ello el secado de esas muestras es imperativo. En ese documento se citan tcnicas de colocacin de muestras vegetales en una "prensa", con el objeto de preservar de mejor forma la morfologa de la planta, y proveer una tcnica fcil de secado -que es lo particularmente nos interesa -. Una vez hecho el paquete en la "prensa", puede dejarse secando lejos de la intemperie y haciendo cambios constantes de papel peridico, o bien utilizando una cmara desecadora, comnmente utilizada en el herbario.Molienda y tamizado del material vegetal Moler es reducir un cuerpo a partes menudas, o aplastarlo mucho (de aqu en adelante procuraremos no confundir este trmino con "macerar", por las razones que habrn de explicarse posteriormente). Para el caso del anlisis de las plantas en el laboratorio de Bioqumica, se realiza la molienda con el fin de homogeneizar el material a analizar, pues muchas veces, los compuestos qumicos de inters se encuentran distribuidos heterogneamente en un rgano vegetal"La molienda debe efectuarse con el material ya seco; con el objeto de reducir a lo mnimo posible el tamao de la partcula del material a utilizar. Con races o material leoso debe usarse un molino, teniendo cuidado de que la friccin producida no eleve la temperatura del sistema para evitar descomposiciones de principios activos o compuestos qumicos de inters. Cuando el material es ligero (hojas, tallos, flores, etc.) puede utilizarse un mortero manual" (1).Para el tamizado se utiliza un tamiz de 20 mallas, con el objeto de dejar pasar nicamente aquellas partculas ms pequeas y separarla de grumos que no suelen ser de inters.Procesamiento de las semillasEn el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC suelen utilizarse semillas para el anlisis de las biomolculas de inters. Por ello debe hacerse una breve referencia de aquellas razones en las que se fundamentan algunos hechos de la metodologa del instructivo de prctica.Para principiar, se recomienda eliminar la testa de las semillas a usar, para evitar que exista una interferencia de pigmentos (13). Sin embargo, esto se hace en funcin de que con el anlisis a realizar en este laboratorio, se pretende acercar al estudiante al estudio cuali-cuantitativo de biomolculas, y no se pretende hacer un anlisis detallado de todas las molculas para cada parte de la planta a utilizar.Es bueno hacer referencia a la definicin de testa. Testa es la capa exterior de la semilla, y suele conocerse vulgarmente como la "cascara" de la semilla. Algunas veces es difcil de eliminar (por ejemplo en el frijol negro, Phaseolus vulgaris) y por ello se recomienda hacer un remojo de no ms de 25 minutos para esa eliminacin. Lo que sucede es que la testa no es impermeable y permite el paso de agua hacia su interior, provocando que los tejidos internos de la semilla (endospermo y embrin) absorban agua y se hinchen, facilitando de tal manera la eliminacin de la testa.

CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2

1. A qu se refiere la "preparacin de muestras vegetales" para anlisis qumico, dentro del contexto de laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC?

2. Cul es la importancia de hacer un recopilado botnico y una investigacin bibliogrfica de la planta de inters?

3. Por qu debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio debe estar sano?

4. Qu documento se le recomienda aqu para la colecta y secado de material vegetal?

5. Por qu razn la operacin de secado debe hacerse bajo condiciones controladas?

6. En qu consiste la tcnica de secado artificial de muestras vegetales

7. Explique por qu cree que se hace la molienda del material vegetal.

8. Qu es la testa de una semilla?

NOTA Cada grupo de trabajo debe traer, para la realizacin de esta prctica, lo siguiente: La muestra vegetal que se puso a secar das antes de la presente prctica, segn lo estipulado por el Instructivo de\ Prctica I. Esta muestra debe estar debidamente seca para no: daar el equipo de laboratorio, por ello su instructor revisar esto al inicio de la prctica.

MATERIALES

Preparar el rea de trabajo del rea de trabajo: 01 Mortero y 01 pistilo (1 marceador) 02 esptulas 01 Becker de 600 ml 01 balanza mono plato Papel peridico 01 tamiz de 20 mallasA cargo del da de laboratorio: 01 horno de conveccin Papel encerado Etiquetas auto adhesivo Tijeras Masking tape

METODOLOGA

Nota: Debido a que la mayora de grupos de trabajo utilizarn "semillas" de la planta de inters, la metodologa que se describirn ser para ese rgano vegetal. En caso de utilizar otra parte de la planta, consultar con su instructor de laboratorio.EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 2: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado para el reporte.PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA:

Reporte la cantidad de semilla utilizada para preparar harina. Reporte la cantidad de harina obtenida Reporte el porcentaje de prdida en el proceso de preparacin de harina. Trate de indicar las razones de prdida de harina. Indique qu cuidados especiales debern aplicarse a la harina en su almacenamiento.INVESTIGAR Por qu debe eliminarse la testa de las semillas que se utilizaren como muestras vegetales para el anlisis en este laboratorio? Refirase a documentos de Tecnologa de Semillas" o dirjase al rea Tecnolgica (Subrea de Manejo y Mejoramiento de Plantas) y pregunto sobre quien puede asesorarle en este tpico. Por qu se utiliza ms la "tcnica de secado al sol" que la de "secado artificial", en la preparacin de muestras vegetales para anlisis qumico? Por qu es necesario calentar las muestras vegetales a temperaturas menores de 60 0C en la tcnica de secado artificial? Cul es la razn de efectuar la "molienda" con material vegetal seco?

PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCIN

El contenido proteico es un componente de los anlisis bromatolgicos que se realizan en cultivos para evaluar su calidad nutricional o para evaluar el efecto, en este aspecto, de algn tratamiento practicado (16).Para el estudio de las macromolculas, en este laboratorio, han de realizarse pruebas analticas (cuantitativas y cualitativas). Dichas pruebas estn diseadas para llevarse a cabo en medio acuoso. Es por ello que en esta prctica de laboratorio se prepararn soluciones salinas y acuosas de protenas a travs del proceso de "Extraccin de Protenas" indicado ms adelante.Con la finalidad de no confundir al estudiante en su proceso de aprendizaje, en esta prctica se pretende dar a conocer cmo caracterizar a la macromolcula "Protena", sin profundizar, todava, en las subunidades monomricas que le componen. As que se detendr, por el momento, en el estudio a travs de dos pruebas de caracterizacin de protenas, que son: La Prueba de Biuret y la Prueba de Metales Pesados.Es necesario mencionar, que el estudio cuantitativo de protenas se realizar en una prctica posterior, a fin de evitar que se sobresature el contenido de prcticas de laboratorio siguientes.

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el estudiante deber estar en capacidad de:

Efectuar extraccin salina y extraccin acuosa de las protenas de una muestra Vegetal. Efectuar la prueba de Biuret para la deteccin de protenas y/o pptidos (de al menos dos enlaces peptdicos), en los extractos. Efectuar la prueba de "Precipitacin Proteica por Metales Pesados" para la deteccin de protenas en los extractos. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.

MARCO TERICO.

3. ProtenasLa importancia de las protenas fue reconocida a comienzos del S. XIX por Mulder (1838): En las plantas y animales hay presente una sustancia que, sin duda es la ms importante entre las sustancias conocidas de los seres vivos, y sin ella, la vida sera imposible en el planeta.Esta sustancia se llama protena. El nombre protena atestigua la importancia que sematribuye a esta clase de biomolculas". (19)Bohinski (2) dice lo siguiente: "Cada protena es nica en trminos de estructura y funcin. No obstante, tambin existen numerosas semejanzas entre las protenas. Su caracterstica ms comn es que todas son polmeros formados por aminocidos, los cuales son sus monmeros, stos se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico. La estructura resultante, que tiene forma de cadena, recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido. Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se considera una protena".Como dicen Lehninger, Nelson y Cox (15), casi todo lo que sucede en la clula requiere la intervencin de una o ms protenas. Las protenas proporcionan estructura, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo una multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejado en el hecho que la informacin gentica se expresa en ltimo trmino en forma de protenas. En una clula tpica existen miles de protenas diferentes, cada una codificada por un gen y encargada de realizar una tarea especfica. Las protenas se encuentran entre las macromolculas biolgicas ms abundantes y son tambin extremadamente verstiles en sus funciones. Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en el interior de las clulas, pues constituyen el 50% o ms de su peso seco.Las protenas ocupan una posicin central en la composicin y en funcionalismo de la materia viva. Las actividades fsicas y qumicas que constituyen la vida de la clula estn catalizadas por enzimas, las cuales son todas de naturaleza proteica (19).Extraccin proteicaLa visin bioqumica general sobre la estructura y funcin de las protenas proviene del estudio de muchas protenas individuales. Los mtodos de separacin de protenas aprovechan las propiedades tales como la carga, tamao y solubilidad, que varan en una y otra protena (15).La Extraccin de Protenas tiene que ver mucho con su solubilidad en diversos compuestos. Dado que muchas protenas se unen a otras biomolculas, las protenas tambin se pueden separar en base a sus propiedades ligantes. La fuente de una protena es generalmente un tejido o clulas microbianas. Las clulas deben romperse liberando la protena en una solucin denominada extracto crudo.Protena: del griego protos, primero. Mulder en 1838 introdujo esta palabra con el sentido de "de primer orden, o sea, la sustancia ms importante de la materia viva, Para el caso particular de los laboratorios de Bioqumica de la FAUSAC, interesa la extraccin acuosa y la extraccin salina. Se suelen preparar soluciones de protena a razn de 5 g. de protena por litro de solvente. La casena se disuelve en un poco de NaOH (6N), la albmina, gelatina y peptona se disuelven en solucin salina (NaCl 0.2N) (19) Composicin de las protenasEn la prctica siguiente, se ver cmo las protenas se conforman a partir de aminocidos. El objeto de colocar aqu, un poco sobre "composicin de Protenas", es para tocar un poco lo de la solubilidad de las protenas y con ello comprender un poco mejor el tema de la "Extraccin de Protenas".Segn Lelninger (15), del aislamiento de muchas protenas en forma pura y cristalina, se ha aprendido que todas contienen carbono, hidrgeno, nitrgeno y oxgeno, y casi todas tambin azufre. Asimismo, hay protenas que contiene elementos adicionales, como fsforo, hierro, zinc y cobre. Lehninger(15) y Bohin.ski(2) coinciden en que las protenas se dividen en dos clases principales basndose en su composicin: Protenas simples y Protenas conjugadas.1. LAS PROTENAS SIMPLES: son aquellas que por hidrlisis producen solamente aminocidos, sin ningn otro producto principal, orgnico o inorgnico. Comprenden los siguientes grupos: Albminas: Solubles en agua, coagulan por el calor y precipitan con las soluciones salinas saturadas. Globulinas: Solubles en soluciones diluidas de sales de cidos y bases fuertes (NaCl por ejemplo); insolubles en agua pura o en soluciones salinas de mediana concentracin; coagulan por el calor. Glutelinas: Solubles en cidos y lcalis diluidos; insolubles en los solventes neutros; coagulan por el calor. Ejemplo: glutelina del trigo. Prolaminas: Solubles en alcohol de 70 a 80%; insoluble en alcohol absoluto, en agua y en otros solventes neutros. Ejemplos: la zena del maz y la gliadina del trigo. Albuminoides: Solubles en todo solvente neutro y en cidos y lcalis diluidos. En este grupo entran las protenas de sostn. Ejemplo: queratina, colgeno. Histidias: Solubles en agua y en cidos muy diluidos; coagulables por el calor. Predominan los aminocidos bsicos. Protaminas: Poli pptidos bsicos, solubles en agua predominan aminocidos bsicos en su estructura; precipitan a otras protenas. Se encuentran principalmente en las clulas huevo.

2. Las PROTENAS CONJUGADAS son aquellas que por hidrlisis producen no solamente aminocidos, sino tambin otros componentes orgnicos o inorgnicos (esta porcin no aminocido, de una protena conjugada se denomina grupo prosttico). Las protenas conjugadas pueden subdividirse de acuerdo con la naturaleza qumica de sus grupos prostticos, y pueden identificarse as: Nucleoprotenas: Compuestos formados por una o varias molculas de protena unidas al cido nucleico. Glucoproteas: Compuestos que tienen carbohidratos como grupos prostticos. Ejemplo: la mucina. Fofoprotenas: Compuestos con un radical que contiene fsforo que no sea ni un fosfolpidos ni cido nucleicos. Ejemplo: la casena. Cromoprotenas: Compuestos conjugados con un grupo cromforo. Ejemplos: hemoglobina, citocroruo y flavoproienas. Lipoprotenas: Poseen grasas neutras (triglicridos) u otros lpidos tales como fosfolpidos y colesterol. Metaloprotenas: Resultan de la unin con un metal. Flavoprotenas: Tienen una flavina como grupo prosttico. De vez en cuando pueden estar presentes dos o ms grupos prostticos idnticos o diferentes.Configuracin (forma) de las protenasSegn la forma o estructura tridimensional de las protenas, estas pueden ser: fibrosas y globulares.Las protenas fibrosas tienen formas moleculares muy alargadas. Como dicen Sniith y Woocl(19), son insolubles en medio acuoso. Dentro de ellas encontramos: Cartlagos, tendones, cabello, seda, exoesqueleto de los insectos, etc...Las protenas globulares son ms compactas que las fibrosas; en general son ms solubles que las protenas fibrosas. Incluyen la mayora de enzimas, muchas hormonas y otros como los anticuerpos (2,19).Extraccin salina de las protenasSegn White, et.aL (20), las sales pueden disminuir o aumentar la solubilidad de una protena. El efecto salino haciendo mayor la cantidad de protena disuelta se conoce como salling-in, o solubilidad por salado.Como usted recordar, del contenido terico de la Qumica General II, la solubilidad de cualquier sustancia depende de la afinidad relativa entre la correspondiente a las molculas del soluto entre s y la existente con las molculas del solvente. Como dicen White et.al. (20): "Cualquier factor que disminuya las interacciones entre las molculas del soluto tender a aumentar la solubilidad. En el efecto salling-in, los pequeos iones de las sales neutras interaccionarn con los grupos inicos de las molculas proteicas, disminuyendo la interaccin proteica y, por tanto, favoreciendo la solubilidad".Reacciones de color de protenas (20)An cuando todas las protenas son: Compuestos formados por aminocidos unidos por enlaces peptdicos, estas sustancias presentan variaciones considerables en sus propiedades qumicas y biolgicas.Las protenas reflejan las propiedades qumicas de los aminocidos que estas contienen en su estructura. Muchas de las reacciones de color de las protenas dependen de la presencia de un aminocido en su molcula.Prueba de precipitacin proteica con metales pesadosEsta prueba permite detectar la presencia de protenas. La precipitacin de las protenas se llama "desnaturalizacin". En ella hay prdida de la actividad biolgica de la molcula. La desnaturalizacin puede ser causada por: a) agentes fsicos o b) por agentes qumicos.La prueba se basa en que no todas las protenas son igualmente sensibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas protenas de una mezcla. A pH 7 o por encima de l, las protenas estn usualmente cargadas negativamente, as que la adicin de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la protena precipita. La precipitacin por metales pesados es, por lo tanto, ms efectiva a valores de pH neutros o ligeramente alcalinos, pero la solucin no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que se precipiten hidrxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en exceso de iones de metal pesado, ya que tal exceso confiere a las partculas, cargas positivas estables.

Figura 3: Resultados de prueba de nitrato de plata, as como la reaccin.

Figura 4: Resultados de la prueba de (CH3COO)2PbFuente: Marvin Pec.

BiuretEl ion cobre formar un complejo con las protenas de una manera similar al que forma con el amonio. El complejo en el caso de las protenas es rojo o violeta, y azul en el caso del amonio. La prueba es positiva cuando la muestra analizada posee, al menos, dos enlaces peptdicos (tripptidos, polipptidos y protenas); esto quiere decir que los aminocidos y los dipptidos dan una prueba negativa de Biuret.La sustancia ms simple que tiene dos uniones peptdicos es el Biuret (NH2CONHCONH2) y esta es la razn por la cual esta reaccin lleve el nombre de Biuret.

Figura 5: Resultados de prueba de Biuret y figura que muestra la interaccin entre cobre y aminocidos

CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3

1. Elabore una definicin propia de: protena.2.Cules son los cinco elementos que se encuentran ms comnmente en lasprotenas? 3.Cmo pueden clasificarse las protenas segn su "composicin"?4.Cul es la diferencia entre una protena simple y una protena conjugada?5.Mencione tres protenas simples que sean solubles en agua.6. De una definicin de grupo prosttico. Mencione al menos tres compuestos que pueden, existir corno grupos prostticos, en las protenas.7. Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o las globulares?8. A qu se refiere la "solubilidad por salado" o salting-in?9. A qu se le llama "desnaturalizacin" de protenas?10. A pH 7 o por encima de l, las protenas precipitan cuando se les adicionan metales pesados. Por qu? Adems, por qu en esta reaccin la solucin no debe estar demasiado alcalina?11. Qu caracterstica debe tener un compuesto para dar positiva la prueba de Biuret? 12. Indique el cambio que evidencia un resultado positivo para la prueba de "Metales Pesados" y para la prueba de "Biuret".

MATERIALESA cada del grupo de trabajo: Balanza mono plat 2 Becker de 150 ml. 2 erlenmeyer de 50 ml. 1 anillo de hierro 1 esptula 12 tubos de ensayo

A cargo del da de laboratorio:

Centrfuga manual 2 varillas de agitacin Probeta de 25 ml 1 plancha agitadora 1 embudo plstico 1 soporte universal Agua destilada Solucin de Biuret [0.2M 1 estufa elctrica Papel parafilm No. 42 Papel encerado 2 probetas de 10 ml. 1 piceta 4 tubos de ensayo c/tapn de rosca-1 pinza p/tubo de Solucin NaCl 10.2N] Solucin Acetato de Pb Refrigeradora Papel filtro Whatman Centrifugadora Solucin de HCl (6N) 1 beacker de 500 mL Solucin de Sulfato Cu [0.2M] 1 gradilla de metal 2 tubos p/centrfuga Etiquetas autoadhesivas Solucin Nitrato de Hg 10.2M Centrifugadora

METODOLOGA

PRUEBAS DE CARACTERIZACIN DE PROTENASEl siguiente cuadro, es una gua para el estudiante para que sepa qu muestras se van a analizar con cada prueba, en esta prctica.CUADRO 1. Resumen de pruebas cualitativas, a realizar a soluciones patrones y extractos de protenas. PRUEBA

MUESTRA A ANALIZARMETALES PESADOSBIURET

Extracto Acuoso

Extracto Salino

Peptona

Albumina

Casena

Gelatina

NOTA: Las soluciones patrn (peptona, albmina, casena y gelatina) son protenas. Estas soluciones se utilizan para que el estudiante tenga cuatro "testigos" de resultados positivos en cada prueba. En otras palabras, estas soluciones sirven para poder observar como es el resultado positivo para cada una de estas pruebas.

EVALUACIN DE LA PRCTICA

Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO.La metodologa de evaluacin tambin incluye un Informe de prctica. Este informe puede hacerse en parejos o individualmente, y debe incluir: Cartula RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones:Para los resultados de los numerales 6.1 y 6.2 de la metodologa, solamente resuelva lo que se le indica en los "cuadritos negros" que all aparecen.Para los numerales 6.3 y 6.4, primeramente debe presentar un cuadro de resultados pura cada prueba: Siga el modelo indicado en el Cuadro 2.CUADRO 2. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrn y los dos extractos de protenas.MUESTRA ANALIZADA

COLORACIN OBTENIDA

DICTAMEN

Extracto Acuoso

Extracto Salino

Peptona

Albmina

Casena

Gelatina

REFERENCIA: Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-).Adems del cuadro anterior, para los numerales 6.3 y 6.4, debe incluir el anlisis y explicacin de los dos cuadros de resultados, a fin de establecer la presencia o ausencia de protenas en cada muestra problema. (Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis sobre si hay concordancia de los resultados prcticos con el fundamento terico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificacin valida).

Resuelva los "cuadros" que aparezcan en su metodologa (6.3 y 6.4); debe presentarlos tambin, intercalados con los resultados, y anlisis de resultados. Esto puede servirle tambin como una gua para ou anlisis de resultados.PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN

Qu es una solucin patrn? Qu utilidad encontrada con el uso de este tipo de soluciones en la presente prctica?De la extraccin de protenas: Cul cree que es (son) la(s) razn(es) para realizar dos tipos de extraccin de protenas?Cuntos tipos de "extraccin de protenas" existen y cules son? En qu se diferencian estos tipos de extraccin?Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o los globulares? En funcin de ello qu tipo de protena -segn su configuracin- habr en mayor cantidad en sus "Extractos de protenas"?Esquematice (utilice dibujos sencillos: No se complique) el procedimiento general para extraer protenas de una muestra vegetal. Sugiera usted el solvente para extraccin (agua o solucin salina) En qu se basa la prueba de Precipitacin proteica por metales pesados? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? En qu se basa la prueba de Biuret? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Agua. (Vea la parte Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica) Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Solucin salina. (Vea la parte "Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica)A qu se refiere la solubilidad por salado o "salting in"? Qu tiene que ver con esta prueba de la prctica?

PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES

1. INTRODUCCIN

En la prctica anterior se ha efectuado el estudio cualitativo de protenas de una muestra vegetal. Esta vez el estudio recae en las unidades que componen a las protenas; usted recordar que en la prctica 1 se mencion que las protenas se construyen a partir de aminocidos, los cuales son las subunidades monomricas que se unen para formar esas macromolculas.Tal como se ver ms adelante, pueden obtenerse aminocidos libres a partir de la hidrlisis de protenas. Esto es, entonces, la primera parte de esta prctica, la hidrlisis de protenas; luego, mediante el anlisis de los hidrolizados, se habr de comprobar si la hidrlisis de las protenas fue o no fue completa.El desarrollo de esta prctica contina con un estudio cualitativo de los hidrolizados obtenidos; es este el momento en que el estudiante de laboratorio centrar su atencin en los aminocidos y podr detectar su presencia/ausencia.Esta prctica es una de las ms que necesita ms tiempo para su realizacin. A s que deben emplearse al mximo las dos horas de laboratorio y en caso de no poder terminar con la metodologa de prctica, se tendr que trabajar en otro momento, acordado por el instructor y los estudiantes, dentro de la semana asignada para esta prctica.OBJETIVOS:

Al finalizar la prctica, el estudiante deber estar en la capacidad de: Efectuar la hidrlisis cida e hidrlisis alcalina de protenas extradas de la muestra vegetal. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos en hidrolizados de protenas. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con ncleo aromtico, en hidrolizados de protenas. Determinar la presencio o ausencia de aminocidos fenlicos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de thioaminocidos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con grupo imidazol, en hidrolizados de protenas. Utilizar soluciones patrn, para obtener resultados positivos que acten como testigos en cada prueba de esta prctica. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.MARCO TERICO.

La hidrlisis proteica es el proceso de rompimiento del enlace peptdico con lo que se producen ppticos y/o aminocidos libres. La hidrlisis proteica puede ser de tres tipos: cida, alcalina o por enzimas (10,15)La hidrlisis con cido o base no es especfica y existen algunos aminocidos que sufren modificaciones o pueden ser destruidos. Mediante la hidrlisis enzimtica es posible romper los enlaces peptdico entre residuos de aminocidos especficos. La hidrlisis es un proceso fundamental para llegar a determinar la secuencia de aminocidos que conforman la estructura primaria de la protena. (15).Hidrlisis de las protenas mediante cido: (De Harper (10) y Lehninger (15)): la mayora de las protenas son completamente hidrolizadas hasta sus aminocidos constituyentes calentando a 110oC durante 20 a 70 horas en HCL 6N. La hidrlisis se realiza en un tubo cerrado. El hidrolizado resultante contiene los aminocidos en forma de clorhidratos.Sin embargo, no todos los aminocidos de un pptido o de una protena determinada se recuperarn cuantitativamente. Esto quiere decir lo siguiente:Todo el triptfano y cantidades variables se serina y treonina son destruidos.Los grupos amida de la glutamina y la asparagina resultan hidrolizados, con produccin de los cidos glutmico y asprtico y de iones amonio.Hidrlisis de las protenas por lcali: esta se usa para recuperar el triptfano y la tirosina, los cuales no se destruyen por hidrlisis alcalina. Sin embargo, la hidrlisis alcalina provoca la destruccin de la arginina, la cistina, la serina y la treonina; todos los aminocidos son racemizados. Por ello el mtodo se emplea para la determinacin por separado del triptfano, que es estable a la calefaccin con bases. (10,15)3. AminocidosAnteriormente se cit a Bohinski (2) para conocer que la caracterstica ms comn de las protenas es que todas son polmeros formados por aminocidos. Este autor dice que los aminocidos son monmeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico, y dan por resultado una estructura que tiene forma de cadena; esa estructura recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido.Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se consideran una protena.El primer aminocidos que se aisl de una protena fue la glicina (del griego glykis, dulce, pues la sustancia tiene cierto sabor dulce); la obtuvo Braconnot, en 1820, al hidrolizar la gelatina con cido sulfrico diluido, en un intento de averiguar si la gelatina, como la celulosa, producira un azcar por hidrlisis. Durante un perodo de 50 aos, el aislamiento de aminocidos a partir de hidrolizados de protena era una cuestin de azar, ms que un problema de investigacin sistemtica (10). A partir de estos bloques unitarios, los aminocidos, los diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, la protena del cristalino del ojo, antibiticos, venenos de hongos y muchas sustancias con actividades biolgicas distintas (15)Estructura de los aminocidos caractersticas generales Se sabe que existe alrededor de 300 aminocidos diferentes de origen natural. Muchos de ellos solo se observan en determinadas formas de vida, y algunos solo aparecen en una especie. Sin embargo, todos los organismos usan solo 20 de ellos para la biosntesis de protenas, lo que constituye un notable ejemplo de la unidad bioqumica en la biosfera (2).Como seala Lehinger, Nelson y Cox (15), debido a que cada uno de esos aminocidos tiene una cadena lateral propia que determina sus propiedades qumicas, se puede considerar a este grupo de 20 molculas precursoras como el alfabeto en el que est escrito el lenguaje de la estructura proteica . Las clulas pueden producir protenas con propiedades y actividades claramente diferentes uniendo los mismos 20 aminocidos en multitud de combinaciones y secuencias distintas. Como dice Bohinski (2) y White & Handler (18), casi todos los aminocidos (salvo la Prolina y la hidroxiprolina) son alfa-aminocidos pues tienen un grupo amino (-NH2) y Un grupo carboxilo (-COOH) unidos al mismo tomo de carbono, llamado alfa.

Cada aminocido posee propiedades nicas debido a la variacin en la estructura de los Grupos R (el grupo R se refiere a la cadena lateral del aminocido).Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que algunos aminocidos son mucho menos frecuentes q otros. Por ejemplo, muchas protenas poseen relativamente pocos restos de Histidina y de triptfano.Reacciones qumicas de los aminocidosAlfa-amino ms caracterstica y ms ampliamente utilizada es la reaccin de la Las reacciones qumicas de los aminocidos son las de sus grupos funcionales, es decir, las de los grupos alfa-carboxilo y alfa-amino, as como las de los grupos funcionales presentes de las cadenas laterales. Una de las reacciones del grupo ninhidrina, que puede utilizarse para valorar los aminocidos cuantitativamente en cantidades muy pequeas (15)Solubilidad de los aminocidosLa naturaleza del radical R de los aminocidos, puede ser, por un lado, hidroflico o Hidrofbico y, por otro, acida, bsica o neutra. Fieser y Fieser (10) sealan que como los aminocidos contienen simultneamente grupos carboxilo y amino, se comportan como sustancias anfteras que se ionizan como cidos y como bases.En el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se acostumbra preparar soluciones patrn de aminocidos a razn de 1g de aminocidos por litro de agua destilada.Para disolver los aminocidos hay que considerar si estos son cidos, bsicos o neutros. As: los aminocidos se disuelven en agua y agregando unas gotas de HCl 1N; por otro lado los aminocidos bsicos se disuelven agregando, al agua, unas gotas de NaOH6N. Los aminocidos neutros se disuelven simplemente en agua (5, 16).Esto de aminocidos cidos, neutros o bsicos depende del grupo R de los aminocidos. Para profundizar en ello se recomienda referirse al captulo 5 de Lehninger, Nelson y Cox (15)Protenas vegetales y nutricin humana (18)Salisbury y Ross (18) sealan lo siguiente: seres humanos y otros animales dependen de los vegetales para obtener muchos de sus aminocidos, por lo que la composicin protenica de semilla, hoja y tallo es importante para la dieta. Nosotros y otros animales, utilizamos estos aminocidos para formar nuestras propias protenas y como fuente alimenticia ( de energa ). Aunque los humanos adultos podemos sintetizar la mayor parte de los aminocidos que necesitamos, a partir de carbohidratos y diversos compuestos orgnicos nitrogenados, hay ocho aminocidos que debemos obtener del alimento. Estos son: leucina, isoleucina, valina, lisina, metionina, triptfano, fenilalanina y treonina. Adems parece que slo se pueden formar cantidades adecuadas del aminocido azufrado Cistenas cuando se dispone de suficiente metionina (otro aminocido azufrado ), y Utilizamos la fenilalanina para sintetizar tirosina, que de lo contrario tambin seria Esencial en la dieta.La mayor parte de las protenas en la dieta humana provienen de semillas, en especial granos de cereales como maz, trigo y arroz. Una contribucin menor, pero an importante, la hacen semillas de leguminosas como frjol, chcharo y soya.Comparados con casi cualquier protena animal, las protenas de los granos de cereal tienen bajo contenido de lisina, mientras que las semillas de las leguminosas tienen bajo contenido de metionina. Los agricultores estn logrando algunos avances con la introduccin de especies nuevas o hibridas con mayor contenido protenico y mayores porcentajes de aminocidos esenciales.Cuadro 3. Contenido proteico y composicin de aminocidos de algunos cereales y Leguminosas.

PRUEBAS DE CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE AMINOCIDOS: (5,16)

a) Prueba de la ninhidrina:Esta prueba se utilizar en este laboratorio para la deteccin de aminocidos. Al reaccionar la Ninhidrina, un agente oxidante poderoso, con cualquier alfa aminocido a un pH entre 4 y 8 se forma un compuesto azulado o violeta. Con la prolina o Hidroxiprolina, que poseen un grupo amino libre, el color producido es amarillo.

Fig. 6. Reaccin de Ninhidrinab) Prueba de sanger:En solucin dbilmente alcalina, el 1-fluor-2,4-dinitrobenceno (FDNB) convierte cualquier aminocido en su derivado 2,4 dinitrofenicado, por sustitucin de un hidrogeno del grupo-amino en un grupo 2,3-dinitrofenilo. En esta prueba, el desarrollo de un precipitado amarillo denota la presencia de aminocidos.

Fig. 7. Reaccin de Sangerc) Prueba xantoproteica:Los aminocidos que poseen un ncleo aromtico forman nitro derivados de color amarillo cuando se calientan con acido ntrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja. Por lo tanto, el aparecimiento de color naranja, en esta prueba, denota la presencia de aminocidos aromticos.Las protenas que contienen triptfano, tirosina, y fenilalanina, dan prueba positiva. Esta prueba la realizan inadvertidamente los estudiantes cuando derraman cido ntrico sobre su piel.

Figura No. 8 coloracion de los extractos tanto acido como basico despues de la aplicacin de acido nitrico. Ademas de la coloracion de los patrones

d) Prueba de millon:Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva.

Fig. 9 Reaccin positiva de millon e) Prueba del sulfuro:Los thioaminocidos reaccionan en medio alcalino con el acetato de plomo, precipitando sulfuro de plomo (de color negro) como uno de los productos.

Fig. 10 Reaccin de Sulfuro f) Prueba del bromo:El bromo acta en medio alcalino con aminocidos que poseen el grupo imidazol (como la Histidina), provocando una reaccin de adicin al eliminar un doble enlace. El compuesto as formado posee una cloracin azul- violeta. Esto quiere decir, que cuando en esta prueba se produce un color azul-violeta, se denota la presencia de Histidina.

Figura No. 11 Reaccin del bromo.CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4

1. Qu Es la hidrlisis proteica?

2. Qu tipo de hidrlisis se utiliza para la determinacin por separado del triptfano? Explique.

3. Elabore una definicin propia de: Aminocido.

4. A qu se refiere el trmino alfa-aminocido?

5. A qu se refiere el grupo R que poseen los aminocidos?

6. Mencione al menos 5 productos que se pueden formar a partir de las distintas combinaciones de aminocidos:

7. Qu grupos funcionales son los que propician las reacciones qumicas de los aminocidos?

8. Cmo disolvera usted 3 gramos de un aminocido cuyo grupo R es de naturaleza alcalina?

9. En la reaccin de Nihidrina Qu reaccin provoca una coloracin azulada o violeta? Cul reaccin provoca un color amarillo?

10. Explique en qu consiste la prueba de Sanger, la prueba Xantoprotica, la prueba de Millon, la prueba de Sulfuro y la prueba del Bromo.

11. Investigue a que se refieren los trminos: aminocido fenolico, thioaminoacido, y aminocido con grupo imidazol. Consulte a su instructor de laboratorio, a su catedrtico de curso o en alguno de los libros que se le sugieren como bibliografa del curso.

12. Cules son los 8 aminocidos que los adultos debemos obtener del alimento?

13. Refirase al cuadro 1 del material de apoyo de esta prctica. Observe los aminocidos que all se le presentan. Diga cules de ellos se trabajarn en esta prctica (vea cuadro 2 que est en el instructivo de practica).

MATERIALES

A cargo del grupo de laboratorio: Extracto acuoso Extracto salino Muestra desconocida 4 beackers de 50 Ml 2 varillas de agitacin 1 pizeta 4 tubos grandes con tapn de rosca 1 gradilla de metal grande 4 frascos con gotero para cada una de las siguientes soluciones: NaOH (1N), NaOH(GN), HCl(6N), Y HCl(1N). 30 tubos de ensayo 2 gradillas de metal 2 pinzas p/tubo de ensayo 1 estufa elctrica 2 probetas de 10 mL 1 beacker de 500 mL 1 beacker de 100 ml Frasco gotero identificado para cada una de las siguientes soluciones: Nihidrina, FDNB, Millon, NaNO2 1 % y acetato de plomo 2%

A cargo del auxiliar de laboratorio 1 estufa elctrica colocada en una campana de gases 1 beacker de 500 mL Recipiente de polietileno con solucin NaOH (6N) Agua destilada Etiquetas autoadhesivas Gotero de pico de gallo con acido ntrico (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con acido sulfrico (ubicado en lavadero de laboratorio) Gotero pico de gallo con solucin de bromo (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con carbonato de Amonio (ubicado en campana de gases) Solucin de HCl (6N) Solucin HCl Autoclave Mechero de Meckler Manguera de hule Trpode para autoclave Rollos de papel pH Potencimetros (medir pH).

METODOLOGA.

NOTA IMPORTANTE TODO LO QUE SOBRE DE EXTRACTO DE PROTENAS DEBE SER ALMACENADO NUEVAMENTE EN REFRIGERACIN, PARA SER UTILIZADO EN LA PRCTICA 5PRUEBA DE CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE AMINOCIDOSEl cuadro siguiente es una gua para el estudiante para que sepa que muestras se van a analizar en las pruebas de esta prctica.Cuadro 4. Resumen de pruebas cualitativas, a realiza a soluciones patrones e hidrolizados de protenas y muestra desconocida. PRUEBAS MUESTRAS AANALIZAR NinhidrinaSangerXantoproteicaMillnSulfuroBromo

Hidrolizado acuoso bsico

Hidrolizado acuoso acido

Hidrolizado salino bsico

Hidrolizado salino bsico

Muestra desconocida

SOLUCIN PATRN

Lisina

Triptfano

Tirosina

Leucina

Histidina

Cistena

Fenilalamina

TOME EN CUENTA LA LIMPIEZA DE LA CRISTALERA PARA LA REALIZACIN DE ESTAS PRUEBAS EN LA PRESENTE PRCTICA

PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA:

Responda, como trabajo post laboratorio, las cuestiones siguientes: Usted observa en el cuadro 4 una serie de cheques ( ) que le indican que prueba realizarle a cada muestra o solucin patrn. Para cada una de las muestras o soluciones patrn, justifique por que se le deben realizar las pruebas sealadas por los cheques. Ejemplo: Porque en la lisina se van efectuar solamente las pruebas de la Ninhidrina y la Sanger. Qu es una solucin patrn? Por qu se utiliza? Haga un listado de las soluciones patrones que se usaran en cada prueba. Qu utilidades(es) ha encontrado en el uso de soluciones patrn? Qu es la hidrlisis proteica? Esquematice de forma sencilla el procedimiento general para realizar hidrlisis a una solucin extracto de protenas. En qu consiste la hidrlisis proteica mediante acido? En qu consiste la hidrlisis proteica de lcali? Para que se utiliza ese tipo de hidrlisis? A su criterio Cul es la razn de mantener la temperatura de la autoclave en un rango que no sobrepase los 228 F? Investigue en que otros lugares de la Facultad de Agronoma existen autoclaves. Adems indique si hay diferencias entre los autoclaves que encontr. Indique el procedimiento general para detectar, visualmente, la presencia del triptfano en una muestra recin colectada de granos de cebada. (si usted plantea que se debe efectuar hidrlisis, indique y justifique cual utilizara, la acida o la alcalina). Cul es la utilidad de la prueba Biuret? Qu se logra identificar con esta prueba? Qu le indicara un resultado negativo de esta prueba? y un resultado positivo? Para la comprobacin de una hidrlisis completa debe hacer una comparacin entre el resultado obtenido para cada hidrolizado en dos pruebas que son la de Biuret y la de la Ninhidrina. Diga si la siguiente explicacin es falsa o verdadera, justifique su respuesta: Se tiene una solucin X a la cual se le han aplicado las metodologas de hidrlisis. Esta solucin ha dado positivo la prueba de Biuret, y un resultado negativo en la prueba de la Ninhidrina. Por eso podemos decir que en la solucin X hemos identificado solamente aminocidos y por lo tanto estaremos hablando de una hidrolisis completa de protenas. Utilizando los resultados de la Ninhidrina y de Biuret de cada uno de los hidrolizados y justificando su respuesta indique si cada una de las hidrlisis fue o no fue completa. De una razn vlida para la aplicacin de la prueba de Biuret y de la Ninhidrina como comprobante de hidrlisis proteica completa. (En otras palabras, Por qu se usa Biuret para ver si hubo o no una hidrlisis completa de protenas?)

Para Ninihidrina, Sanger, Xantoproteica, Millon, Sulfuro, bromo colocar lo siguiente. En que se basa esta prueba? Qu expresa para usted un resultado positivo da la prueba? Que se logra identificar con esta prueba.EVALUACIN DE LA PRCTICA

Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRELABORATORIO. La metodologa de evaluacin tambin incluye un informe de prctica. Este informe puede hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir:CartulaRESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE

Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Para los resultados de los numerales 6.1, 6.2, 6.3 y 6.4 solamente debe resolverse los cuadritos negros que aparezcan all. Posteriormente presente resueltos los cuadros negros que aparezcan en la metodologa (numerales 6.5 al 6.10). Procure colocar el titulo de cada pareja de respuestas (es decir el titulo del numeral). Para los resultados de los numerales 6.5, 6.6, 6.8, 6.9 y 6.10, tambin debe presentarse un cuadro de resultados para cada Muestra Problema, (hidrolizado acuoso acido, hidrolizado salino acido, hidrolizado acuoso bsico, hidrolizado salino bsico y Muestra desconocida). Loa cuadros deben seguir el siguiente modelo

CUADRO 5. Cuadro de resultados de las pruebas realizadas a la muestra de HIDROLIZADO ACUOSO ACIDO:NOMBRE DE LA PRUEBApHCOLORACINDICTAMEN

Biuret

Ninhidrina

Sanger

Xantoproteica

Millon

Sulfuro

Bromo

REFERENCIA: pH = VALOR EN NUMERO Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-).OJO: Utilice como criterio de dictamen, los resultados obtenidos con las soluciones patrn.Procure Intercalar Los Resultados De Cada Muestra Con Su Anlisis respectivo. Toda vez presentados estos resultados, se realizara un anlisis y explicacin de cada cuadro, a fin de establecerla presencia o ausencia de aminocidos en cada muestra problema. Si sus resultados se lo permiten, tambin debe indicar el nombre o nombres posibles de aminocidos identificados. Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis si hay concordancia, plantee una justificacin valida. Compare los resultados de sus muestras problemas con los resultados con las soluciones patrn y tener otro criterio de anlisis. Como una gua de anlisis le recomienda utilizar la solucin a los cuadritos negros que aparecen para cada parte de la metodologa.

PRCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRA.

1. INTRODUCCIN

Esta semana, continua es estudio de aminocidos y protenas. Son prcticas de aplicacin frecuente en los laboratorios de anlisis de bioqumica y hoy se pretende que el estudiante tenga un contacto con estas prcticas. Debido a lo extenso de la metodologa de las prcticas pasadas, estas molculas biolgicas no se han podido estudiar de una sola vez y por ello se emplea una semana ms.

La cromatografa es una tcnica que sirve para separa, identificar y a veces purificar una mezcla compleja de solutos solubles en un solvente comn. Esta semana se utilizara esta tcnica para que el estudiante tenga un contacto con esta alternativa de anlisis cualitativo de sustancias en este caso con aminocidos. Por ende tratara de enlazarse lo obtenido con la cromatografa.

La continuacin al estudio de protenas se hace desde un punto de vista cuantitativo y para ello se utiliza una tcnica denominada Espectrofotometra.

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica, es estudiante deber estar en capacidad de:

Utilizar la tcnica Cromatografa en Capa Fina como parte del anlisis cualitativo de aminocidos de la muestra vegetal.

Utilizar Espectrofotometra en la cuantificacin de protenas extradas de la muestra vegetal.

MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFA (11)

La cromatografa es una tcnica que sirve para separar identificar y a veces purificar una mezcla compleja de solutos solubles en un solvente comn.

Como dice Gaxiola (11), una mezcla de sustancias que van a ser separadas se aplica en solucin a un medio de sostn. Este puede ser papal, una capa de slice, o una columna rellena de resina absorbente o de intercambio inico. La prueba consiste en que se deja correr por el medio de sostn un solvente revelador y dicho solvente lava junto con el la mezcla de las sustancias aplicadas previamente. En el proceso, las diferentes molculas de la mezcla son arrastradas por el lavado a distintas velocidades, resultando en su separacin.

En la mayora de los mtodos cromatogrficos la separacin est basada en un proceso de reparto mltiple o uno continuo de absorcin desorcion, aunque en la prctica existe una combinacin de ambos, dominando ms o menos uno y otro tipo.

El grado de la separacin depende de cuatro fuerzas que operan independientemente una de la otra. Estas son: (1) la velocidad de flujo del solvente, (2) la solubilidad de las sustancias en el solvente, (3) los efectos de fraccionamiento, y (4) los efectos de absorcin. Los dos primeros factores son responsables de la movilizacin de la mezcla de sustancias a travs del medio de sostn y los dos ltimos factores con responsables del retardo del movimiento de la mezcla a travs del medio de sostn.

El flujo del solvente es el mismo para todas las sustancias presentes en la mezcla. Si todas las sustancias fueran completamente solubles, no habra separacin. No obstante, por fortuna es muy raro que las sustancias tengan la misma solubilidad en cualquier solvente. Consecuentemente, si la sustancia es muy soluble, tendera a movilizarse a travs del medio de sostn y aparecer en el frente del solvente en movimiento. Por otra parte, si es relativamente insoluble, tendera a permanecer en su punto de origen. Por lo tanto, uno de los factores primordiales que determinan la separacin cromatogrfica es la combinacin de la solubilidad y del flujo del solvente. Los otros factores, los factores retardants, son igualmente importantes y merecen alguna discusin.

Hay cuatro tipos principales de procedimientos cromatogrficos, cada uno de los cuales est basado en ciertos principios fsicos. Ellos son: (1) cromatografa por fragmentacin; (2) cromatografa por absorcin; (3) cromatografa por intercambio inico, y (4) cromatografa con filtracin en gel.

En la cromatografa de absorcin existe, como mnimo, un sistema de tres componentes-absorbente, medio de elusin (disolvente) y compuesto cromatografado. El comportamiento cromatogrficos depende tanto del absorbente como del medio de elusin. Entre los absorbentes ms utilizados en la cromatografa en la capa fina, se encuentran los xidos, xidos hidratados y sales. Los ms comunes son la gel de slice (silicagel) y el oxido de aluminio (almina).

3. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (11)

La cromatografa en capa fina es una tcnica muy utilizada en la actualidad, por su gran rapidez y versatilidad. Tambin se conoce como cromatografa en columna abierta o cromatografa en pelcula delgada. Es una tcnica donde la separacin ocurre sobre una capa delgada de adsorbente que est adherida a un soporte inerte, generalmente vidrio. Se pueden usar variedad de adsorbentes, desde la gel de slice o la almina hasta la celulosa la cual la separacin es similar a la cromatografa de papel. Se diferencia de la hecha en papel porque la separacin ocurre ms rpido, las manchas son ms discretas y compactas, y se pueden usar reactivos detectores corrosivos sin daar el substrato o el adsorbente.

El disolvente utilizado para la separacin se mueve sobre esta capa fina, ya sea hacia arriba, por capilaridad (cromatografa ascendente) o hacia abajo, por gravedad (cromatografa descendente). La separacin de sustancias se basa en sus caractersticas de polaridad. Por consiguiente, una sustancia polar se mover muy lentamente con relacin al frente del disolvente, mientras que una sustancia no polar se mover ms rpido.

Bajo ciertas condiciones experimentales, el movimiento de una sustancia en particular es constante, con respecto al movimiento del frente de un disolvente determinado. Esta constante se llama valor Rf y se define como:

CTIVACIN DE LAS PLACAS:Antes de que se puedan usar las placas, generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que acta como una impureza y evita una buena separacin. Con frecuencia el agua est firmemente ligada al adsorbente, por lo cual se debe calentar la placa fuertemente. La magnitud del calor depende del tipo de separacin que se requiere.

Para compuestos hidroflicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados; pero para los compuestos hidrofbicos o no polares es necesario un calentamiento ms intenso. Las placas de almina o silicagel con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 minutos y despus ser activadas en un horno a 10C (nunca arriba de 105C) alrededor de 30 minutos.

Las placas de xido de aluminio y de silicagel sin adhesivo requieren secado al aire durante 1.5 a 2 horas y ser activadas en el horno a 120C durante aproximadamente 60 minutos.

APLICACIN DE LA MUESTRA:La muestra se aplica en solucin con una micro pipeta o con tubo capilar en cantidades de aproximadamente 5 micro litros. Esto asegura que la mancha no se extienda. Una mancha ideal tendr ms o menos 5 mm de dimetro.

La mancha debe ser secada tan pronto como sea posible, usando un secador de pelo (esto adems evita que la mancha se extienda). Si la solucin est diluida, se pueden repetir muchas aplicaciones en el mismo sitio una vez que la anterior se ha secado. Debe tenerse cuidado de no sobre cargar la mancha, de lo contrario se presentar el rayado (escurrimiento). Otro factor importante es que debe tenerse cuidado de no maltratar la capa delgada del adsorbente durante el manchado.

Con paciencia y con prctica resulta posible no tocar la capa con el extremo de la micro pipeta (o tubo capilar) durante el manchado o el trazado de una placa para CCD. An ms, dado que la capa est adherida a su soporte inerte de vidrio o de aluminio, no es necesario usar placas de vidrio para sostener el cromatograma durante el manchado.

REVELADO DEL CROMATOGRAMA:

Existen numerosos mtodos para detectar sustancias en los cromatogramas. Algunos de ellos usan sistemas fsicos, pero la mayora utiliza mtodos qumicos.

Las tcnicas para localizar en el cromatograma sustancias, que no son visibles, se clasifican en tres categoras:

a. Nebulizacin: En esta tcnica el reactivo se disemina en forma de fino aerosol sobre la cromatoplaca mediante un atomizador. Debe aplicarse en un gabinete cerrado (campana de extraccin de gases) para gases y para vapores a fin de evitar que el reactivo penetre en el laboratorio. Si sta se hace muy cerca del papel o la cromatoplaca, se aplicar demasiado reactivo y har que se corra el cromatograma. Es preferible colocar el atomizador a 30-38 cms del cromatograma.

b. Inmersin: Esta es mejor que la nebulizacin por numerosas razones, ya que no se requiere de gabinete contra emanaciones en muchos casos; es mucho ms fcil obtener una aplicacin uniforme del reactivo detector. Se necesita un recipiente (preferentemente plstico) que contenga el solvente. La cromatoplaca se pasa uniformemente dentro del solvente de inmersin y se cuelga para que se seque.

c. Exposicin a gas o vapor: Est requiere equipo especial y por ello no se trata aqu.

PRESERVACIN DE LOS CROMATOGRAMAS DE CAPA DELGADA:

Con la mayora de las placas rociadas con cido, o con reactivos que producen colores que se desvanecen con rapidez (como la ninhidrina), no slo es difcil almacenarlos como referencia, sino que tambin resulta caro, ya que las placas de vidrio se pueden volver a usar. Tan pronto como se seque un cromatograma rociado, las manchas debern ser delineadas con un lpiz afilado o con un alfiler y se deben rastrear. Debido a que los colores tienden a desteirse despus de algn tiempo, es recomendable hacer una copia del original tan pronto como sea posible.

ESPECTROFOTOMETRA (9)

Uno de los mtodos fisicoqumicos ms empleados en anlisis bioqumico es el de la medida de la absorcin o emisin de energa radiante. La gran difusin de esta tcnica es consecuencia de:

1. El amplio intervalo de longitudes de onda o de frecuencias de energa radiante y sus diferentes modos de interaccin con la materia.

2. La existencia en el mercado de instrumentos de medida cada vez ms precisos.

3. Las ventajas inherentes al mtodo.

La energa radiante se define como la energa transmitida en forma de radiacin electromagntica. Esta energa puede ser absorbida, transmitida, reflejada y refractada por muchas sustancias en diferentes estados de agregacin (slido, lquido, disolucin, gas), si la radiacin incidente tiene una longitud de onda apropiada.

En espectrofotometra, la energa que incide sobre una muestra, es una radiacin monocromtica (energa radiante de una sola longitud de onda, o por razones prcticas, una banda muy estrecha de longitudes de onda). Las medidas de la radiacin transmitida se realizan mediante aparatos muy sensibles como el espectrofotmetro.

Un espectrofotmetro consta de una Fuente de radiacin; Dispersor de longitud de onda (prisma de cuarzo o de vidrio o de NaCl); Lentes; Clulas espejos; y un Detector (Fotomultiplicador). (Vea figura 1)

Cuando se encuentra un sistema coloreado o un color producido en una reaccin, es preciso una investigacin para desarrollar una determinacin espectrofotomtrica adecuada del constituyente, para lo cual es necesario hacer una seleccin de la longitud de onda analtica.

NATURALEZA DE LA ABSORCIN DE ENERGA RADIANTE

El espectro de la energa radiante, contado a partir de la de menor longitud de onda (o, lo que es lo mismo, e la de ms alta frecuencia), incluye los rayos csmicos, las radiaciones gamma, los rayos X, la regin del ultravioleta, la regin de la luz visible, la zona del infrarrojo y l regin de las ondas de radio. Tanto los tomos como las molculas pueden adoptar varios estados electrnicos o diversos niveles de energa. La absorcin de energa involucra la transicin de los electrones a niveles energticos ms elevados; cuanto ms larga es la longitud de onda de la radiacin absorbida, menor es la transformacin energtica por esa absorcin. Ahora bien, estas son normas generales, vlidas para todos los casos, pero cuando se pretende interpretar con ms detalle los fenmenos de absorcin, las cosas se hacen bastante ms complicadas, especialmente en el caso de las molculas orgnicas.

LEYES DE LA ABSORCIN DE LA ENERGA RADIANTE

Estas Leyes hacen referencia a las relaciones existentes entre la magnitud de la absorcin de energa radiante y la cantidad de la sustancia absorbente. Para un sistema absorbente (solucin) dado, a una longitud de onda concreta y con una determinada intensidad de la energa incidente, hay dos variables que influencian la intensidad de la absorcin: la concentracin del absorbente y el espacio recorrido por la radiacin energtica a travs de la solucin.

La ley de Beer, expresa la absorcin de un rayo de energa radiante, efectuada por un absorbente determinado, en las siguientes condiciones:

a) Se supone que la energa radiante es monocromica (es decir, con una longitud de onda nica).

b) El medio es homogneo o istropo (es decir, su ndice de refraccin es idntico en todas direcciones).

c) La absorcin del solvente es despreciable.

d) No hay asociacin ni disociacin de las molculas absorbentes.

e) No existe reaccin entre el absorbente y las molculas del solvente.

La ley de Beer afirma que, si se cumplen esos requisitos, la absorcin, A, es directamente proporcional a la concentracin del absorbente y a la longitud del trayecto recorrido por la energa radiante a travs de la solucin.

De aqu se puede escribir:

Donde:

A1: Absorcin de una solucin problema (de la que se quiere averiguar la concentracin)

A2: Absorcin de una solucin patrn de concentracin conocida.

C1: Concentracin de la solucin problema

C2: Concentracin de la solucin patrn (estndar)

Esta es una frmula que se aplicara en esta prctica de laboratorio, a pesar de que las lecturas de un instrumento determinado espectrofotmetro- pueden variar significativamente en el curso de unas pocas semanas a consecuencia del desgaste de sus componentes, puesto que todo esto no representan un problema cuando se calculan los resultados deducindolos de la comparacin de la absorcin del problema con la de un patrn (9).

La dificultad es grave, en cambio, cuando hay que deducir los resultados a partir de valores establecidos de absorcin, sea por no disponer de patrones, sea por no resultar practico analizar un patrn simultneamente con cada problema o grupo de problemas (9).

PROCEDIMIENTO A REALIZAR EN ESPECTROFOTOMETRA (9)

DETERMINACIN DEL ESPECTRO DE ABSORCIN

Este se estudia en el espectrofotmetro la disolucin del constituyente que se analiza, despus de desarrollado el color, determinndose su espectro de absorcin. La longitud de onda seleccionada es normalmente una, a la que la diferencia entre la absorbencia del compuesto coloreado y el reactivo sea mxima. Aunque la longitud de onda conseguida no sea muy sensible, debe ser segura.[footnoteRef:1] [1: ]

BLANCO DE REACTIVOS

Generalmente cuando se hace una determinacin con un problema, se hace una lectura similar sustituyendo la solucin problema por agua o por el o los reactivos que sirvan para detectar la sustancia problema. Esta ltima lectura es la del blanco de reactivos y sirve para determinar la absorcin de la solucin problema no derivada de la sustancia cuya concentracin se trata de medir si no de los reactivos en s. En esta prctica la absorcin en blanco se debe a la razn que se explica seguidamente:

En esta prctica se utilizara la prueba de Biuret para detectar la sustancia problema de nuestro inters: Protenas. Piense en el reactivo de Biuret. Es de color azul recuerda? Cuando se utiliza este reactivo para detectar protenas, y medir su concentracin, sucede que la lectura en espectrofotmetro es la suma del color del reactivo de Biuret mas el color de la sustancia problema. Por ello se hace necesario hacer una correccin.

Al colocar el espectrofotmetro en absorcin 0 (100% transmitancia) con agua u otro solvente, entonces la le