ESTRATEGIAS DE CLONADO MOLECULAR

BIOLOGÍA MOLECULAR BIOQUÍMICA

AÑO 2019

Dra. GABRIELA GAGO

Vectores de clonado

Son herramientas con las cuales podemos introducir ADN en las células

Derivados de plásmidos

Derivados de fagos

Plásmidos:

-Moléculas de ADN, circular y de cadena doble que tienen replicación autónoma.

-Confieren algún fenotipo (Resistencia a antibióticos, producción de antibióticos oenterotoxinas, producción de tumores en plantas: Ti, Ri)

REPASO

PLASMIDOS

Moléculas circulares de ADN de cadena doble con replicación autónoma

REPASO

Sitio de múltiple clonado(poliligador, polilinker) insertar elADN exógeno

Marcador: Confiere a la célulareceptora un fenotipo particular,por ejemplo resistencia a unantibiótico.

Replicador (pMB1, ColE1) es elsegmento de ADN que contiene elsitio donde empieza la replicaciónOri y los genes codificados por elplásmido para la replicación (algunosRNAs y proteínas)

Se pueden introducir en célulasvivas por un proceso llamadotransformación

REPASO

5

FUENTE??

BACTERIA, etc

REPASO

REPASO

REPASO

CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN

Se refiere a los procesos (conjunto de métodos)empleados para crear copias idénticas defragmentos de ADN, copias idénticas de células ocopias idénticas de organismos

Se pueden clonar organismoscélulasmoléculas de ADN

CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos quepermiten identificar y purificar un fragmento deADN particular a partir de una mezcla complejade ADN, y luego reproducirlo en grandescantidades.

¿PARA QUÉ CLONAR ADN?

Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos

de un gen específico

Identificar y analizar las secuencias reguladoras

que controlan la expresión (promotor) de un gen

Investigar la función de proteína/enzima/RNA

Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con

alguna patología de origen genético)

CLONADO MOLECULAR

PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR

Obtención del ADN a clonarElección de la fuente de ADN y de la metodología para

obtenerlo Purificación del ADNDigestión con las enzimas de restricción apropiadas

Obtención del vectorElección del vector apropiadoDigestión del vector

LigaciónIntroducción de la molécula de ADN recombinante

en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN) Identificación de las células que contienen el ADN

recombinante (SELECCIÓN)

La estrategia depende tanto de la información de partida como del objetivo final de mi clonado

¿Con qué información cuento antes de empezar?

- Secuencia de la proteína- Ubicación en el genoma (positional cloning)- Secuencia del mRNA- Bibliotecas de cDNA o genómica- Secuencias de ADN desconocidas o conocidas- Producto de PCR

¿Cuál es la fuente del ADN?

-ADN (cromosomal, bibliotecas, etc)-ARN-PCR

Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca(teniendo información de la secuencia de ADN)

Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca(teniendo información de proteína/anticuerpos)

Amplificación de secuencias de ADN por PCR

Amplificación de secuencias de ADN por PCR introduciendo sitios de restricción

Mediante el diseñoapropiado de los oligosempleados para laamplificación por PCR, sepueden introducir lossitios de reconocimientopara las enzimas derestricción necesariospara el posterior clonado.

Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o parcialmente desconocidas por PCR

No siempre conozco la secuencia completa quequiero amplificar como para poder diseñaroligonucleótidos específicos. Hay estrategiaspara poder hacerlo (se verán en detalle en laclase de PCR II):

- RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends):Puede ser tanto 5´como 3´.- PCR inversa- Uso de oligonucleótidos degenerados

RT-PCR: Amplificación por PCR cuando el material de

partida es ARNm.

Trascripción Reversa (RT)

seguida de PCR