PRACTICA 1

FOTOCOLORIMETRA Y CURVA DE CALIBRACIN Objetivos

1. Analizar los principios bsicos de la fotocolorimetra 2. Determinar el espectro de absorcin de un compuesto coloreado 3. Seleccionar la longitud de onda ptima o de mxima absorcin 4. Realizar la curva de calibracin para una solucin de albmina 5. Calcular concentraciones desconocidas de muestras de protenas

Aspectos Tericos La fotocolorimetra es un mtodo que sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reaccin en experimentos de cintica qumica o enzimtica. La tcnica consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solucin coloreada de uno o varios compuestos. La absorcin mxima ocurre a una longitud de onda () caracterstica para cada compuesto y la intensidad de la energa absorbida a esa longitud de onda, vara proporcionalmente con la concentracin del compuesto en una solucin. El mtodo parece estar restringido a las sustancias coloreadas, sin embargo tambin se puede extender a los compuestos incoloros, hacindolos reaccionar con una especie que genere un producto coloreado. Absorcin de energa por sustancias coloreadas Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiacin electromagntica en la regin visible del espectro, es decir entre 400 y 800 nm (). El color que se observa es una combinacin de las longitudes de onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.

Espectro electromagntico

Cuando una molcula absorbe radiacin ultravioleta (U.V) o visible, lo que fundamentalmente ocurre es que se excitan los electrones de valencia que ocupan orbitales moleculares sigma () o simples, (dobles y triples) y (electrones no enlazados). Al absorber un fotn de energa, el electrn puede ocupar un orbital superior denominado orbital antienlazante, (*) generndose una de las siguientes transiciones:

Estas transiciones requieren diferente energa y por lo tanto diferente longitud de onda. Para una radiacin, su contenido energtico es inversamente proporcional a su longitud de onda:

E = h = hc/

Donde: E = cantidad de energa

= frecuencia de la radiacin h = constante de Planck c = velocidad de la luz en el vaco = longitud de onda de la radiacin

Las transiciones sealadas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos orgnicos, tienen el siguiente orden de acuerdo con su energa o longitud de onda:

Se observa que la transicin que ocurre ms fcilmente (menor diferencia de energa) es la - *, y la que mas difcilmente ocurre es la - *. Las transiciones - * son las que frecuentemente ocurren en compuestos saturados y son poco tiles para fines analticos debido a que requieren mucha energa. Las transiciones - * son las caractersticas de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos, cetonas, aldehdos, cidos carboxlicos, aromticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces conjugados. Cuando esto ocurre, la transicin es ms fcil (menos energa) y la longitud de onda va aumentando, hasta llegar a la regin visible del espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las sustancias coloreadas.

Las transiciones - * y - * ocurren en las molculas que tienen pares de electrones libres y aunque son relativamente poco energticas, su probabilidad es baja; por ello son poco tiles en el campo analtico.

En los complejos e iones coloreados de los metales de transicin (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), los electrones de los orbitales d de baja energa se promueven a orbitales d de alta energa cuando la molcula absorbe radiacin visible. Estas transiciones ocurren porque las molculas que se acomplejan al ion metlico dividen a los orbitales d del ion en dos grupos: de alta y baja energa.

Espectro de absorcin Para saber con precisin la energa (o la ) de la transicin (o transiciones) que ha ocurrido en una molcula cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario determinar para ella una grfica que relacione la intensidad de energa que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la regin del espectro que nos interesa (U.V. o visible, o ambos). Esta grfica se llama espectro de absorcin, y a partir de ella se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energa, es decir, donde ocurre la transicin electrnica. El conocimiento de de mxima absorcin facilita la deteccin de la sustancia ya sea para determinar su concentracin o para seguirle la huella en experimentos de tipo cintico.

Energa absorbida y concentracin (ley de Beer)

La intensidad de la energa absorbida por una especie depende del nmero de molculas que sufren la transicin electrnica a la seleccionada, y ese nmero de molculas depende a su vez de la concentracin de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:

A c x l donde: A = absorcin (intensidad de la energa absorbida)

c = concentracin de la muestra en mol/L l = longitud de la celda en cm.

Esta expresin se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad :

A = x c x l (ley de Beer-Lambert)

Se denomina coeficiente de extincin molar o absortividad molar, con unidades M-1cm-1. Es una constante para cada especie que absorba energa en la regin U.V.-visible, y su valor indica la probabilidad de que la transicin electrnica ocurra. Aplicacin de la ley de Beer-Lambert La aplicacin ms importante de esta ley es la determinacin de concentraciones desconocidas de soluciones de sustancias que absorben en la regin U.V.-visible. Como una primera aproximacin y suponiendo concentraciones cercanas a la de una muestra patrn, la ecuacin de Beer-Lambert se puede usar para calcular la concentracin de una muestra problema (igual sustancia que el patrn), midiendo la absorbancia de la muestra patrn (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.). Si las condiciones de las dos mediciones son iguales (temperatura, sustancia, aparato), se cumple que:

A/C = x l = constante La expresin se puede aplicar tanto a la muestra patrn como a la muestra problema, as:

Apat/Cpat = Aprob/Cprob luego Cprob = Cpat x Aprob/Apat

Para determinaciones ms precisas de concentraciones desconocidas y para minimizar al mximo las desviaciones de la ley de Beer-Lambert, se acostumbra preparar una curva de calibracin, a partir de una serie de soluciones patrn, cuyas concentraciones sean prximas a las de las muestras problema. Tanto a las soluciones patrn como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones patrn se construye la curva de calibracin (A vs. C). Las absorbancias de las muestras problema se llevan a la curva y se deducen de ah sus concentraciones.

Cuantificacin de protenas La cuantificacin de las protenas se puede realizar por diversos mtodos con base en algunas de sus propiedades, como pueden ser los patrones de absorcin de las radiaciones electromagnticas de los grupos aromticos, la reactividad del enlace peptdico, su contenido de nitrgeno, entre otras. En la reaccin de Biuret las sustancias que contengan dos o ms enlaces peptdicos, interaccionan con sales de cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo prpura-violeta, como muestra la siguiente figura. Dicho complejo se cuantifica espectroscpicamente utilizando como base una curva patrn de protena (generalmente con albmina)

C

CH

N

N

O

R

2 Cu2++C

CH

N

N

O

R

2+CuC

CHR

ON

N

Complejo color violetaCadena peptdica

+ 2 H2O

O

O

HH

H H

Espectrofotmetros Los espectrofotmetros permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgnicas. Estos equipos fueron diseados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un compuesto en una solucin. A continuacin se muestran los componentes bsicos de estos equipos:

En el espectrofotmetro la luz de una fuente continua (lmpara de tungsteno para el visible y lmpara de deuterio para el ultravioleta), pasa a travs de un monocromador que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la muestra contenida en una cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la potencia radiante de la luz que sale.

Materiales:

Fotocolormetro Celdas del fotocolormetro Tubos de ensayo grandes

Beaker Frasco lavador

Reactivos:

Reactivo de Biuret Solucin patrn de gelatina (C = 8 mg/mL) Solucin salina al 0.9%

Muestras problema: casena, suero sanguneo, gelatina (sin sabor) o albumina

Seccin Experimental A- MANEJO DEL FOTOCOLORMETRO.

Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las recomendaciones anotadas a continuacin:

a. Seleccione la longitud de onda. b. Ajustar el cero en transmitancia. c. Colocar la celda o tubo que contiene la solucin blanco, la cual se prepara mezclando 2 mL de

reactivo de Biuret con 2 mL de agua destilada. d. Ajustar el 100% de transmitancia. e. Retirar el tubo que contiene la solucin blanco. f. Colocar el tubo que contiene la solucin problema. g. Leer la absorbancia o transmitancia.

B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIN DE UN COMPUESTO.

a. Coloque la longitud de onda en el instrumento a 420 nm. b. Preparar dos celdas o tubos con suficiente solucin (aproximadamente hasta los ), utilizando en

una, agua destilada y en la otra una solucin de albmina coloreada con el reactivo de Biuret.

c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, lmpielos externamente con un papel o tela adecuada.

d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.

e. Coloque el tubo con la solucin problema y anote la absorbancia o transmitancia indicada en el

instrumento. f. Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm (contine tomando

lecturas hasta alcanzar una longitud de onda de 620 nm).

g. Recoja los datos en la siguiente tabla:

(nm) Absorbancia (nm) Absorbancia 420 540 440 560 460 580 480 600 500 620 520

h. Dibuje una grfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde al espectro

para la estructura del complejo protenico formado por el reactivo de Biuret. Observe que se presentar una longitud de onda en la cual habr una mayor absorcin. Esta longitud de onda debe ser una constante, la cual ser tenida en cuenta para posteriores anlisis de albmina.

C. CURVA DE CALIBRACIN PARA SOLUCIONES DE ALBMINA

a. Rotule 9 tubos de ensayo y colqueles las siguientes soluciones como se indica en la tabla siguiente:

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8

Solucin

Patrn (mL) 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2

Solucin Problema

0,5 1,0

Solucin Salina

2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0

Absorbancia Concentracin

b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos. c. Coloque en el fotocolormetro la longitud de onda de mxima absorbancia obtenida en la experiencia

sobre el espectro de absorcin (numeral B), mida la absorbancia para cada uno de los tubos y antelas en la tabla anterior.

d. Calcule la concentracin de protena en cada uno de los tubos, aplicando la frmula de dilucin (C1 x V1

= C2 x V2) y tabule los resultados de la absorbancia y concentracin.

e. Grafique los resultados absorbancia y concentracin tabulados en d, la lnea resultante corresponde a la curva de calibracin.

f. Del grfico, determine la concentracin de las muestras problema.

g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuacin de Beer-Lambert y

comprelas con las obtenidas del grfico.

Todos los desechos se adicionan a residuos con metales Preguntas 1. Qu es una curva de calibracin? Qu caractersticas debe cumplir? 2. Se puede construir una curva de calibracin con sustancias no coloreadas? 3. Cul es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimtricas? 4.- Cul es la protena plasmtica ms abundante? 5. Por qu no se le puede tomar un espectro de absorcin a la albmina sola? 6. Por qu razn se eligi una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva de absorcin? 7. Qu significado tiene la pendiente de la grfica?

PRACTICA 2

CUANTIFICACIN DE PROTENAS Objetivos

6. Separar en una muestra de suero sanguneo, las globulinas de las protenas totales. 7. Calcular la concentracin de protenas totales, globulinas y albminas en una muestra de suero

sanguneo.

Aspectos tericos Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas, constituyen el 50% o ms de su peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada clula, ya que son fundamentales en todos los aspectos de la estructura y funcin celular. Existen muchas clases de protenas, cada una de ellas especializada en una funcin biolgica diferente, que van desde el transporte y almacenamiento de molculas pequeas hasta la organizacin estructural de las clulas y los tejidos, pasando por la contraccin muscular, la respuesta inmunitaria, la coagulacin de la sangre y la catlisis de cientos de reacciones metablicas. Adems la informacin gentica es expresada en su mayor parte por las protenas. La estructura de las protenas, as como su relacin con su funcin biolgica y actividad constituyen problemas centrales de la bioqumica actual. Clasificacin de las protenas a. Segn su composicin Las protenas se clasifican en dos tipos importantes, de acuerdo con su composicin. Las protenas simples, como la albmina de suero sanguneo, nada ms producen aminocidos cuando se hidrolizan; las protenas conjugadas, producen otros compuestos adems de los aminocidos como carbohidratos, grasas o cidos nucleicos. La porcin no aminocido de una protena conjugada se denomina grupo prosttico. b. Segn su forma tridimensional Otra forma de clasificar las protenas es en fibrosas o globulares, segn su forma tridimensional. Las protenas fibrosas o filamentosas, por ejemplo las de colgeno y las de queratina, consisten en cadenas de polipptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas protenas son muy resistentes e insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales como tendones, pezuas, cuernos y msculos. Las protenas globulares, en cambio suelen estar enrolladas en forma semiesfrica y compacta. Estas protenas son por lo general solubles en agua y se mueven dentro de las clulas. La mayor parte de los varios millares de enzimas conocidas son protenas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la hemoglobina.

c. Segn su solubilidad Segn este parmetro, las protenas reciben algunos de los siguientes nombres:

Albminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.

Globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua. Se precipitan en soluciones semisaturadas de sulfato de amonio.

Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80% e insolubles en agua. Histonas, solubles en soluciones salinas. Glutelinas, insolubles en agua, etanol y soluciones salinas, pero solubles en soluciones cidas y

bsicas diluidas. Protenas del suero sanguneo La sangre es el tejido lquido que circula dentro de los vasos sanguneos, compuesto casi en la mitad de su volumen por clulas como los glbulos rojos o eritrocitos, glbulos blancos o leucocitos, plaquetas y por el plasma, que es la porcin no celular y que es el lquido que mantiene a las clulas en suspensin. Cuando la sangre se coagula, aparece un lquido remanente que se llama suero, y que se diferencia del plasma porque ya no contiene los factores de coagulacin como la protena fibringeno. Aunque el plasma sanguneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus protenas representan el 75% de ellas, y una concentracin que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL de suero. Las principales protenas del suero sanguneo son:

Albmina: con una concentracin de 3 a 4.5 g por 100 mL de suero, es el mayor contribuyente a la presin osmtica intravascular. Su funcin principal es la de transportar cidos grasos y medicamentos. Los cidos grasos los llevan desde los adipocitos, donde se generan por hidrlisis de los triacilgliceroles, hasta los tejidos que los requieren para su oxidacin.

Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las infecciones. Es un conjunto heterogneo de protenas que a veces se designan como , y -globulinas y alcanzan una concentracin en la sangre entre 3 y 3.5 g por 100 mL.

Mtodos para aislar y purificas protenas Con el fin de preparar extractos protenicos a partir del complejo medio celular, se han desarrollado tcnicas que se fundamentan en las diferencias que presentan ellas en su tamao, su carga, su masa, su solubilidad y su afinidad por otras molculas. Ests tcnicas son: la centrifugacin, la electroforesis, la cromatografa, la dilisis, ultrafijacin y diferencias en la solubilidad en diferentes medios. En esta prctica se pretende usar las tcnicas de centrifugacin y fotocolorimetra para separar y cuantificar la concentracin de albmina y globulinas en el suero sanguneo, respectivamente. El empleo del reactivo de Biuret en soluciones con concentraciones diferentes de protenas, permitir la medida de la absorbancia para cada concentracin. La determinacin precisa de stas se podr deducir del dato de absorbancia tomado a una solucin patrn de protena (con concentracin conocida) de la siguiente manera:

Cprob = Cpat x Aprob/Apat

Donde: Apat. Y Cpat. = son la absorbancia y concentracin de la solucin patrn, respectivamente. Aprob. Y Cprob. = son la absorbancia y la concentracin de la muestra problema, respectivamente. Materiales:

Fotocolormetro Celdas del fotocolormetro Tubos de ensayo grandes

Beaker Frasco lavador Centrfuga

Reactivos:

Solucin acuosa de NaCl al 0.9% Solucin saturada de (NH4)2SO4 (750 gr en 1 L

de agua) Solucin patrn de albmina o gelatina (0.45 gr

en 100 mL de solucin salina)

Solucin de biuret Muestra de suero sanguneo

humano

Seccin Experimental A. Separacin de las globulinas del suero.

a. Coloque en un tubo de centrfuga 1 mL de suero sanguneo y 4 mL de agua destilada. b. Agregue a la solucin anterior 5 mL de solucin saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando

suave pero constantemente.

c. Deje reposar durante 15 minutos la solucin obtenida en b. Luego centrifugue a 2000 r.p.m, por espacio de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.

d. Separe el lquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de una solucin

salina. Conserve esta solucin para determinar el porcentaje de globulinas.

B. Preparacin de la solucin de protenas totales.

e. Mida 1 mL de suero sanguneo en una probeta y dilyalo hasta completar 20 mL agregndole solucin salina.

C. Medicin de la absorbancia en las soluciones que contienen protenas.

f. Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se indica en la siguiente tabla:

TUBOS BLANCO (mL) PATRN (mL) GLOBULINAS

(mL) PROTENAS

TOTALES (mL) ABSORBANCIA

Solucin salina 1,0 Solucin patrn

1,0

Solucin de globulinas

1,0

Suero diluido 1:20

1,0

Solucin de Biuret

4,0 4,0 4,0 4,0

g. Agite cada tubo y djelo reposar 30 minutos. h. Lleve cada uno de los tubos al fotocolormetro, fijado en una longitud de onda ( ) de 540 nm. Luego de

una previa calibracin con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento.

Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos con metales1

1 Los residuos de suero sanguneo se depositan en un recipiente que contenga una solucin de hipoclorito de sodio

Resultados a. Dilucin del patrn: Calcule la concentracin final de la solucin patrn de protenas aplicando la frmula:

Cf = CiVi/Vf

b. Concentracin de protenas totales en el suero: Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrn con las de protenas totales y calcule el porcentaje de estas ltimas:

(%) protenas totales =(%) sln patrn x Absorbancia (protenas totales)

Absorbancia (sln patrn) Sin embargo, esta concentracin corresponde a 1 mL de solucin de suero sanguneo, el cual fue diluido primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser:

20 x 5 x (%) protenas totales c. Concentracin de las globulinas: Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrn y de albmina obtenida con el porcentaje de la solucin patrn y calcule el porcentaje de la solucin de globulinas:

(%) globulinas =(%) sln patrn x Absorbancia (sln globulinas)

Absorbancia (sln patrn) Sin embargo esta concentracin corresponde a la solucin de globulinas preparada segn la tabla 5-1, la cual fue obtenida por dilucin 1:5:5. En esta forma la solucin original del suero sanguneo debe tener una concentracin 25 veces mayor, o sea:

5 x (%) sln globulinas x 5

La dilucin con5 mL de solucinsalina

Debido a la dilucin1.0 + 4.0 segn la tabla

d. Concentracin de albmina de suero: El porcentaje de albmina se determina restando de las protenas totales el resultado de las globulinas:

(%) Albmina = % Protena Total - % Globulinas Preguntas

1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albmina, con los reportados como normales para el suero. Existen diferencias? Por qu?

2. Consulte la funcin de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento de

separacin de globulinas.

PRACTICA 3

TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimtica

Objetivos

8. Extraer el enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana, papa). 9. Determinar la actividad de la tirosinasa utilizando como sustrato el L-DOPA. 10. Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa a diferentes concentraciones y de diferentes

fuentes. 11. Determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimtica. 12. Deducir el pH ptimo en el cual acta la enzima tirosinasa.

Aspectos tericos

Catlisis enzimtica. Las enzimas son catalizadores biolgicos que aumentan las velocidades de las reacciones bioqumicas. Estas son altamente especficas, esto significa que una enzima solo acta en determinadas molculas, denominadas sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se ha calculado que una clula viva puede contener en promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes, cada una de las cuales cataliza una reaccin especfica en la que un sustrato se convierte en los productos adecuados. La catlisis enzimtica es homognea porque el sustrato y la enzima estn presentes en disolucin acuosa. Una enzima es, bsicamente una protena, que contiene uno o ms sitios activos, donde se llevan a cabo las interacciones con los sustratos; aunque se ha descubierto actividad cataltica en algunos ARN, a los cuales se les denomina ribozimas. Estos sitios, en forma estructural, son complementarios de las molculas de un sustrato especfico, como se muestra en la siguiente figura:

Pardeamiento enzimtico La coloracin caf oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan, se denomina pardeamiento, y se debe a la accin de la enzima tirosinasa, que es una monofenoloxidasa, sobre el aminocido tirosina, que en presencia de oxgeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona y dopacromo (caf oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro llamado melanina.

HO

COOH

NH2HO

COOH

NH2

Tirosinasa

O2

HO

O

COOH

NH2

OTirosinasa

O2

DOPATirosina

Dopaquinona

O

O

N

COOH

HDopacromo

CO2

O

O

N

H

O

O

N

H

N

O

O

H

Melanina

En esta prctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano, manzana y papa), y ponerla en contacto con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto L-metildopacromo, que es de color caf oscuro; la concentracin de ste se puede seguir fotocolorimtricamente a una de 420 nm, que es donde presenta su mxima absorbancia.

HO

COOH

NH2

Tirosinasa

O2

HO

L-metildopa (incolora)

O

O

N

COOH

HL-metildopacromo(caf oscuro)

CH3 CH3

La medida de la absorbancia a travs del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reaccin en trminos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que va reaccionando:

Absorb./t = velocidad = + d [L-matildopacromo]/dt = - d[L-metildopa]/dt Obtencin del extracto enzimtico Se conoce como extracto enzimtico a una fraccin de material animal, vegetal o microbiano, que contiene una mezcla de varias sustancias pero que se caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas La preparacin general de un extracto enzimtico se inicia con la adicin al material seleccionado una solucin amortiguadora, que garantice la conservacin de la actividad de la enzima objeto de la extraccin. Luego, se tritura en un mortero, se filtra y centrifuga para separar los residuos poco solubles. Medida de la actividad enzimtica Las velocidades de varias reacciones enzimticas se pueden usar para comparar la eficiencia de las enzimas involucradas cuando se expresan en trminos de la cantidad usada de stas. Ello significa que:

Actividad Enzimtica = Velocidad de la reaccin/Cantidad de enzima Si se conoce con precisin la concentracin molar de la enzima usada, la expresin anterior se llamar actividad molar de la enzima:

Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] = sustrato/enzima x t Donde son moles

Este valor representa las moles de soluto que es capaz de transformar en producto un mol de enzima por unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima. Si no se conocen las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor de comparacin el volumen de los extractos enzimticos preparados en condiciones similares; no se podr hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimtica:

Actividad enzimtica = reaccin/vol. extracto enzimtico = d[s]/dt x mLextracto = [s]sustrato/mLextracto x t De donde [s]sustrato/t se puede determinar indirectamente de la pendiente de un grfico de Absorbancia vs tiempo, ya que la concentracin de sustrato est relacionada con la absorbancia mediante la ecuacin de Beer-Lambert.

Variables que afectan la actividad enzimtica Las enzimas son macromolculas protenicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por varios factores: concentracin del sustrato y de la enzima, la ausencia o presencia de cofactores, inhibidores y efectores, el aumento o disminucin de la temperatura y las variaciones del pH.

Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el ptimo funcionamiento de una enzima, se tendr que proceder a la evaluacin de su actividad cataltica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reaccin enzimtica en funcin de uno de los parmetros mencionados anteriormente, o determinando la presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reaccin, a medida que se vara uno de los parmetros. Efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin La evaluacin del efecto de la concentracin de la enzima se hizo en la regin de la curva hiperblica de Vi vs [S], donde la cintica es de orden cero con respecto al sustrato. Ah, la enzima se encuentra completamente saturada y habr sustrato en exceso. Al adicionar ms cantidad de enzima, se encontr un aumento lineal en la velocidad de reaccin, proporcional a la cantidad de enzima agregada.

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica La mayora de las enzimas poseen un pH caracterstico al cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funcin del pH de muchas enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se muestra en la figura siguiente:

Del grfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la enzima es mxima:

Para la tripsina, que hidroliza pptidos en el intestino, el pH ptimo est alrededor de 8. Para las colinesterasas, que se encuentran principalmente en la sangre y en el hgado y catalizan la

hidrlisis del neurotransmisor acetilcolina, trabajan en un rango de pH entre 7.5 y 10. Para la pepsina, que funciona en el estmago, el pH ptimo estar cercano a 2.5. La papana, que es una peptidasa aislada de la papaya, trabaja bien en un rango de pH entre 5 y 9.

La relacin entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende principalmente del comportamiento cido-base de la enzima y del sustrato. La forma de la curva de actividad-pH vara con la concentracin del sustrato, ya que el valor de KM de muchas enzimas vara con el pH. Las mencionadas curvas son mucho ms significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cintica enzimtica, el pH se mantiene constante al pH ptimo. El pH ptimo de una enzima no es necesariamente idntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho sugiere que la relacin pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica Al igual que ocurre con la mayora de reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica, aproximadamente, por cada 10 C de aumento de la temperatura. Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura ptima, como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad cataltica frente a la temperatura se produce porque las enzimas, al ser protenas, se desnaturalizan por la accin del calor y se inactivan cuando la elevacin de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura ptima es, por lo tanto, la resultante de dos procesos:

El incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura, y, El incremento en la velocidad de desnaturalizacin trmica de la enzima al sobrepasar una temperatura

crtica.

Aunque la mayora de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 C, algunas de ellas son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, las enzimas de diversas especies de bacterias termoflicas que habitan en las termas de agua siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 C. Materiales:

Fotocolormetro Celdas del fotocolormetro Tubos de ensayo grandes Mortero Silica gel Bao mara Bao de agua hirviendo

Bao de hielo Beaker Frasco lavador Centrfuga Lienzo Tubos de ensayo grande Pipeta

Reactivos:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 4.0, 5.0, 7.2, 7.5.

Solucin buffer 0.1 M de borato pH= 8.0, 9.0 y 10.0

Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 7.2

Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa)

Hielo picado

Seccin Experimental Nota: esta prctica est dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo el grupo, y la C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados. A. Extraccin de la enzima

a. Coloque 10 g de la fruta en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2). b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

c. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

d. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

e. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin

como extracto diluido 10 veces. El extracto de manzana no se diluye. Rotule esta solucin como extracto enzimtico.

B. Medida de la actividad enzimtica

a. En un tubo de ensayo prepare una solucin blanco mezclando:

1 mL del extracto enzimtico 3 mL de buffer pH = 7.2 1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1 mL de extracto enzimtico 3 mL de buffer pH = 7.2 1 mL de solucin de L-metildopa

d. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y

lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

f. Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solucin de

extracto enzimtico de la siguiente manera:

Adicione a cada tubo, respectivamente, 1.5, 2.0 y 2.5 mL de extracto. Complete cada tubo hasta 4 mL con buffer pH = 7.2 Agregue a cada tubo, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1 mL de la solucin de L-

metildopa.

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min)/Tubo 1 2 3 4 Absorbancia

0.5 1.0

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

C. Medida de la actividad enzimtica con cambio de la temperatura

a. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solucin de buffer pH = 7.2 b. Introduzca el tubo en un bao mara a 37 oC durante 5 minutos

c. Cuando el tubo se haya enfriado, agrguele 1 mL de L-metildopa, agite y mida la absorbancia igual que

en el caso anterior.

d. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min) Absorbancia 4 oC Absorbancia 37 oC Absorbancia 95 oC 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un bao de hielo y despus en un bao de agua hirviendo a 95 oC. Tabule sus resultados en la tabla anterior.

D. Efecto del pH sobre la actividad de enzimtica:

a. Marque 12 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente tabla:

b. Mida el pH resultante en cada uno de los tubos

c. Incube los tubos 5 minutos en un bao a 37-40 oC.

d. Adicione a los tubos A1 y B1 1 mL de L-metildopa y agite.

e. Calibre el fotocolormetro con la solucin B1 a = 420 nm f. Lea la absorbancia de la solucin A1 y antela g. Repita los pasos b hasta f para los otros tubos h. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min)/Tubo A1 A2 A3 A4 Absorbancia

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos no halogenados

Resultados a. Con los resultados de las dos tablas, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y multiplique estos valores por los factores de dilucin as:

Tubo 1: m1 x 10/1.0 = A.E1 Tubo 2: m2 x 10/1.5 = A.E2

Tubo B1 A1 B2 A2 B3 A3 B4 A4 B5 A5 Buffer pH 4.0 3 2 Buffer pH 5.0 3 2 Buffer pH 8.0 3 2 Buffer pH 9.0 3 2 Buffer pH 10.0 3 2 Extracto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 L-metildopa - 1 - 1 - 1 - 1 - 1

Tubo 3: m3 x 10/2.0 = A.E3 Tubo 4: m4 x 10/2.5 = A.E4

Donde m es la pendiente de la curva y A.E es la actividad enzimtica. La actividad enzimtica con variacin de la temperatura y del pH se calcula igual que el tubo 3.

Absorvancia

tiempo

A2

A1

t1 t2

m =t2 - t1

A2 - A1

b. Analice la actividad enzimtica de los tubos 1-4, cual es la explicacin? c. Analice la actividad enzimtica del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio de la temperatura (haga el grafico de actividad enzimtica vs temperatura) cul es la explicacin? d. Analice la actividad enzimtica del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH (haga el grafico actividad enzimtica vs pH) cul es la explicacin e. Compare sus resultados con los resultados obtenidos para otra fruta Preguntas 1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo Por qu? 2. Cul es la funcin de la tirosinasa en los animales superiores? 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la prctica, Cul es la interpretacin y explicacin que se le da a la fruta o frutas que tienen una mayor concentracin de tirosinasa? 4. Qu se podr recomendar (y que no se podr recomendar), para evitar el pardeamiento de las frutas y las papas cortadas? Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.

PRACTICA 4

TIROSINASA II: Determinacin de la constante Michaelis-Menten y la velocidad mxima Objetivos

13. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentracin del sustrato (L-metildopa). 14. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el mtodo de la curva hiperblica de Michaelis

Menten y la ecuacin de los inversos o de LineweaverBurk.

Aspectos tericos Cintica qumica La cintica qumica es el estudio de las velocidades de las reacciones qumicas y de los factores que influyen en ella. La velocidad de la reaccin es una medida de la rapidez con que se forman los productos a partir de los reactantes.

Las reacciones qumicas pueden clasificarse sobre una base cintica por el orden de reaccin, entre estas tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden, segn como resulte influida la velocidad de la reaccin por la concentracin de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones determinado como son la temperatura y la adicin de catalizadores. Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional a la concentracin de un reaccionante. El ejemplo ms sencillo es cuando la velocidad de la reaccin:

A B es directamente proporcional a la concentracin de A. En este caso la velocidad de la reaccin en cualquier tiempo t, viene dada por la ecuacin:

-d [A] / dt = k [A]

en donde [A] es la concentracin molar de A y -d [A] / dt es la velocidad a que disminuye la concentracin de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad, la cual, tiene dimensiones del recproco del tiempo, s-1. La forma integrada de esta ecuacin es:

ln [A] = (- k) (t) + ln [A]0

y = m x + b

kt= log[A0]

[A] 2.303

donde ln es el logaritmo natural, [A]0 y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t, respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede seleccionarse cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentracin de A. Por lo tanto, una grfica de ln [A] contra t es una lnea recta con una pendiente k. Este anlisis grfico permite calcular la constante de velocidad k, como se muestra en la figura siguiente:

Para una reaccin de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresin: t = 0.693 / k

la anterior ecuacin indica que la vida media de una reaccin de primer orden es independiente de la concentracin inicial del reactivo.

Una reaccin de segundo orden es una reaccin cuya velocidad depende de la concentracin de uno de los reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentracin de dos reactivos diferentes, cada uno elevado a la primera potencia. El caso mas sencillo comprende solo una clase de molcula como reactivo:

2 A C la ecuacin de velocidad de segundo orden es:

- d [A] / dt = k [A]2

La constante de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen unidades de 1/ M x s. Por medio del clculo, se puede obtener la siguiente expresin para la ecuacin anterior:

1[A]

1[A]0

+ kt=

por lo tanto, una grfica de 1/[A] contra t, es una lnea recta con una pendiente k:

Otro tipo de reaccin de segundo orden es:

A B C+ donde la ley de velocidad esta dada por:

- d [A] / dt , - d [B] / dt d [C] / dt

velocidad = k [A] [B] la reaccin es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un orden global de 2. El tiempo de vida media viene dado por: t = 1 / k [A]0 Observe que la vida media de una reaccin de segundo orden es inversamente proporcional a la concentracin inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones iniciales es una forma de distinguir entre una reaccin de primer orden y una de segundo orden. Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de tres trminos de concentracin. Algunas reacciones qumicas son independientes de la concentracin de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero. En este caso, la velocidad depende de la concentracin del catalizador o de algn otro factor distinto a la concentracin de las especies moleculares que experimentan la reaccin. Cintica enzimtica: Ecuacin de Michaelis-Menten Los principios generales de la cintica qumica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, pero stas muestran tambin un rasgo caracterstico, que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin con el sustrato. En la figura siguiente vemos el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima.

A una concentracin baja de sustrato, la velocidad inicial de la reaccin o es casi proporcional a la concentracin del sustrato y la reaccin, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccin disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin de sustrato; en esta zona el orden de reaccin es mixto. Con un aumento posterior de la concentracin del sustrato, la velocidad de la reaccin llega a ser esencialmente independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reaccin es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice que la enzima se halla saturada con su sustrato. Todas las enzimas muestran el efecto de saturacin pero varan ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturacin condujo a algunos investigadores a formular la hiptesis de que la enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reaccin catalizada.

L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teora general acerca de la accin y cintica de las enzimas. Esta teora que es fundamental para el anlisis cualitativo de todos los aspectos de la cintica de las enzimas y de la inhibicin, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reaccin en la que slo hay un sustrato.

La teora de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuacin este ltimo se divide en una segunda etapa, para formar la enzima libre y el producto P:

E + S ES

ES E + P

k+1

k-1k+2

k-2 La ecuacin de Michaelis-Menten es la ecuacin de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que slo actan sobre un sustrato, y se formula como sigue:

vo = Vmax [S]KM + [S]

De donde: o = velocidad inicial Vmax = velocidad mxima [S] = concentracin del sustrato KM = constante de Michaelis-Menten De la ecuacin de Michaelis-Menten se deriva una relacin numrica en el caso especial en que la velocidad inicial de la reaccin sea exactamente la mitad de la velocidad mxima; es decir, cuando 0 = Vmax (ver figura anterior) KM = [S].

La constante de Michaelis-Menten de una enzima constituye una caracterstica til e importante, que es fundamental no slo para la descripcin matemtica de la cintica enzimtica, sino tambin para la determinacin cuantitativa de la actividad enzimtica en los tejidos y el anlisis de algunos mecanismos de regulacin enzimtica. Transformaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten La ecuacin de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de las transformaciones ms corrientes se obtiene tomando los recprocos de ambos miembros de la ecuacin de Michaelis-Menten:

1 = KMVmx

1[S]

+ 1Vmxv0

La ecuacin anterior es la ecuacin de Lineweaver-Burk. Cuando 1/0 se representa frente a 1/ [S], se obtiene una lnea recta. La pendiente de la recta es KM/Vmx, y la interseccin sobre el eje 1/0 es 1/Vmx; la interseccin sobre el eje 1/ [S] es -1/KM, como muestra la figura siguiente:

Tal representacin doble recproca tiene la ventaja de que permite una determinacin mucho ms exacta del valor de Vmx, ya que en la representacin sencilla de 0 frente a [S] slo se obtiene su valor aproximado. Otra transformacin til de la ecuacin de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmx, y de un posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuacin:

v0 = -KMv0[S]

+ Vmx

La representacin de 0 frente a 0/ [S], llamada representacin de Eadie-Hofstee, da los valores de Vmx y de KM de una forma sencilla, como muestra la figura siguiente:

Efecto de la concentracin del sustrato sobre la actividad anzimtica Esta relacin para un sustrato, fue estudiada por los seores Michaelis y Menten, quienes al medir la velocidad inicial (Vi) en numerosos experimentos donde se mantena constante la concentracin de la enzima y se iba aumentando la concentracin del sustrato, encontraron que:

A bajas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin dependa proporcionalmente de este, siguiendo una cintica de primer orden: Vi = K [S]; lo que significa que como an la cantidad de enzima presente no ha sido totalmente saturada por el sustrato, a medida que ste aumenta, la enzima acta sobre l, y la velocidad de la reaccin se va incrementado.

A altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin era independiente de su concentracin,

siguiendo una cintica de orden 0: Vi = VM. Ello indica que en condiciones de altas concentracin del sustrato, la enzima se halla saturada por ste, y la reaccin ya ha llegado a su mxima velocidad (VM). Al adicionar ms sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima disponible para ello.

Grficamente, la relacin hallada entre la velocidad de la reaccin y la concentracin del sustrato fue de tipo hiperblico, como describiendo una transicin desde la cintica de primer orden hasta la cintica de orden cero:

Materiales:

Fotocolormetro Celdas del fotocolormetro Tubos de ensayo grandes Mortero Silica gel

Beaker Frasco lavador Centrfuga Lienzo

Reactivos:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH =

6.0

Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa)

Hielo picado

Seccin experimental A. Extraccin de la enzima

f. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2). g. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

h. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

i. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

j. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin

como extracto diluido 10 veces.

B. Medida de la actividad enzimtica a. Prepare una solucin blanco mezclando:

1.0 mL del extracto enzimtico 3.0 mL de buffer pH = 6.0 1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1.0 mL de extracto de enzima 3.5 mL de buffer pH = 6.0 0.5 mL de solucin de L-metildopa

d. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y

lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la

siguiente manera:

Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimtico.

Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mL de la solucin de L-metildopa.

Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6 Absorbancia

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos organicos no halogenados

Resultados

b. Con los resultados obtenidos, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial (Vi), para cada concentracin de sustrato [S].

c. Calcule la nueva concentracin de sustrato aplicando la frmula general de dilucin:

[S]f = v1 [S]i

v2 Donde: [S]f = concentracin final del sustrato [S]i = concentracin inicial del sustrato (0.03M) v2 = volumen final de la solucin (5 mL) v1 = volumen adicionado de sustrato

d. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi 1 2 3 4 5 6

e. Haga una grfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/ [S] y de estas determine los valores de KM y Vmax. f. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos y determine cual es el ms apropiado,

explique. Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.

PRACTICA 5

TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad mxima Objetivos

15. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentracin del sustrato (L-metildopa) en presencia de NaCN como inhibidor.

16. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el mtodo de la curva hiperblica de MichaelisMenten y la ecuacin de los inversos o de LineweaverBurk en presencia de un inhibidor.

17. Determinar el tipo del inhibidor y su constante.

Aspectos tericos Inhibicin de las enzimas Las enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimticos se encuentren entre los agentes farmacuticos ms importantes. Por ejemplo, la aspirina (cido acetilsaliclico) inhibe la enzima que cataliza el primer paso de la sntesis de prostaglandinas. El estudio de los inhibidores enzimticos ha proporcionado informacin sobre mecanismos enzimticos y ha ayudado a definir algunas rutas metablicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimticos: reversibles e irreversibles. Un tipo de inhibicin reversible comn es la que se denomina competitiva, como muestra la siguiente figura:

Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima pero la reaccin no tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la fijacin del sustrato. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se una de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competicin a favor del sustrato aadiendo ms de ste. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molcula de inhibidor por lo que la reaccin muestra una Vmx normal. No obstante, la [S] a la cual Vo = Vmx, la KM, aumenta en presencia del inhibidor. Este efecto sobre la Vmx es diagnstico de inhibicin competitiva, y se pone de manifiesto fcilmente en una grfica de LineweaverBurk. La constante de equilibrio para la fijacin del inhibidor, KI, puede obtenerse a partir de la misma grfica.

La inhibicin competitiva se utiliza en teraputica para pacientes que han ingerido metanol, un componente del los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol se convierte en formaldehdo por accin de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehdo lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un resultado frecuente debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera efectiva con el metanol como sustrato de la alcohol deshidrogenada. La terapia para el envenenamiento por metanol es la infusin intravenosa de etanol, la cual hace que la formacin de formaldehdo sea suficientemente lenta para que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina. Otros dos tipos de inhibicin reversible, la no competitiva y la acompetitiva, que a menudo se definen aplicados a enzimas con un solo sustrato pero que en la prctica slo se observan con enzimas que actan con dos o ms sustratos. Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato, como se muestra en la siguiente figura:

La fijacin del inhibidor no bloquea la fijacin del sustrato (y viceversa). La enzima se inactiva cuando est fijado el inhibidor tanto si el sustrato est presente como si no lo est. El inhibidor disminuye de manera efectiva la concentracin de la enzima activa por lo que decrece la Vmx. Frecuentemente el efecto sobre KM es nulo En la inhibicin no competitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia de lneas que se muestran en la figura siguiente, que tienen una interseccin comn en el eje de 1/ [S]. Esto indica que KM para el sustrato no es alterada por el inhibidor no competitivo mientras que Vmx disminuye.

En la inhibicin acompetitiva el inhibidor no se combina con la enzima libre ni afecta su reaccin con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo ES para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, el cual no experimenta su transformacin posterior en el producto habitual de la reaccin:

Lo caracterstico de la inhibicin acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al aumentar la concentracin del inhibidor, pero la Vmax decrece.

Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo de la enzima que es esencial para su actividad o lo destruyen. Es frecuente la formacin de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y una enzima. En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk, 1/V0 frente a 1/ [S].

Materiales:

Fotocolormetro Celdas del fotocolormetro Tubos de ensayo grandes Mortero Slica gel

Beaker Frasco lavador Centrfuga Lienzo

Sustancias:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH =

6.0

Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa)

Hielo picado Solucin de NaCN 0.1M

Seccin experimental

Extraccin de la enzima k. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2). l. Adicione unos 3 gramos de slica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

m. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

n. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

o. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin

como extracto diluido 10 veces.

Medida de la actividad enzimtica

p. Prepare una solucin blanco mezclando:

1.0 mL del extracto enzimtico 3.3 mL de buffer pH = 6.0 4 gotas (0.2 mL) de solucin de NaCN 0.5 mL de agua destilada.

q. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

r. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1.0 mL de extracto de enzima 4 gotas de solucin de NaCN 3.3 mL de buffer pH = 6.0 0.5 mL de solucin de L-metildopa

s. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y

lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. t. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

u. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la

siguiente manera:

Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimtico. 4 gotas de solucin de NaCN Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1.0, 1.5, 2.0,

2.5 y 3.0 mL de la solucin de L-metildopa. Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

v. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6 Absorbancia

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos no halogenados

Resultados

g. Con los resultados obtenidos, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial (Vi), para cada concentracin de sustrato [S].

h. Calcule la nueva concentracin de sustrato aplicando la frmula general de dilucin:

[S]f = v1 [S]i

v2 Donde: [S]f = concentracin final del sustrato [S]i = concentracin inicial del sustrato (0.03M) v2 = volumen final de la solucin (5 mL) v1 = volumen adicionado de sustrato

i. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi 1 2 3 4 5 6

j. Haga una grfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de estas determine los valores de KM y Vmax. k. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos y con los obtenidos en ausencia de

inhibidor (sesin anterior); determine el tipo de inhibidor.

l. Calcule el valor de KI dependiendo del tipo de inhibidor, utilizando las ecuaciones correspondientes (ver grficos y tabla en la parte terica).

Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.

PRACTICA 6

HIDRLISIS ENZIMTICA DE PROTENAS Objetivo Determinar la actividad de las proteasas al hidrolizar una solucin de protenas Aspectos tericos Las protenas son hidrolizadas en presencia de enzimas proteolticas o proteasas, las cuales actan sobre los enlaces peptdicos. Esta hidrlisis puede ocurrir en diferentes sitios de la protena; cuando ocurre en las posiciones terminales, las proteasas se denominan exopeptidasas (aminopeptidasas o carboxipeptidasas) y endopeptidasas cuando la hidrlisis se realiza en las posiciones internas, como se muestra la siguiente figura:

H2N

HN

NH

HN

NH

OH

R1

O R2

O R3

O R4

O R5

O

AminopeptidasaEndopeptidasas

Carboxipeptidasa

H2O/Proteasas

H2NH2N

H2NH2N

H2NOH

R1

O R2

O R3

O R4

O R5

O

OHOH

OHOH

++

++

Las endopeptidasas son especficas a la clase de aminocido implicado en el enlace peptdico. Entre las endopeptidasas ms comunes se destacan: la tripsina, la pepsina, la quimiotripsina y la termolisina (ver figura).

Escisin Especfica de Cadenas Polipeptdicas

N

H

C C N

H

R1 O

C

H

C

R2

H O

Aminocido 1 Aminocido 2

Mtodo

Enlaces Pptidicos escindidos

Tripsina Aminocido 1 = lisina o arginina Quimotripsina Aminocido 1 = fenilalanina, triptfano o tirosina Pepsina Aminocido 1 = fenilalanina, triptfano, tirosina y otros Termolisina Aminocido 2 = leucina, isoleucina o valina Bromuro de ciangeno

Aminocido 1 = metionina

La tripsina es una enzima digestiva secretada por el pncreas al intestino delgado, en forma de su precursor, el tripsingeno. La tripsina es muy especfica, slo cataliza la hidrlisis de aquellos enlaces peptdicos en que la

funcin carbonilo es aportada por el resto de lisina o por el de arginina, con independencia de la longitud o la secuencia de aminocidos de la cadena. La termolisina, que es una proteasa bacteriana termoestable, puede hidrolizar enlaces peptdicos en los que la funcin amino es aportada por los aminocidos no polares, leucina, isoleucina y valina. Es especialmente til para la hidrlisis parcial de polipptidos que no contienen arginina o lisina y son, por lo tanto, resistentes al ataque por la tripsina. La cuantificacin de los aminocidos liberados se realiza neutralizando previamente los grupos alfa amino libres por adicin de formaldehdo, como se indica en la siguiente figura:

H2N CH

R

C

O

OH + CH H

O

HN CH

R

C

O

OHHOH2C

N-monometilol

N CH

R

C

O

OHH2C

N-metileno

N CH

R

C

O

OHHOH2C

N,N-dimetilol

CH H

O

CH2OH

Los grupos carboxilo se valoran cuantitativamente utilizando NaOH 0.05N Materiales:

Erlenmeyers Bureta Bao mara

Soporte universal Pinza y nuez

Reactivos:

Solucin de protena (gelatina 5%) Solucin de pancreatina al 0.5% en buffer de

borato pH = 8.4 Solucin de NaOH 0.05N

Fenolftalena al 1% Solucin concentrada de

formaldehdo

Seccin Experimental

a. Mida 25 mL de solucin de protena y colquelos en un erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL de la solucin de pancreatina (tomar este tiempo como tiempo cero, t0) y ponga la mezcla en un bao mara a 37C.

b. Transfiera 5 mL de la mezcla anterior a un erlenmeyer y caliente hasta ebullicin. Esperar 2 minutos y

enfriarla.

c. Adicione 7.5 mL de solucin de formaldehdo y 3 gotas de fenolftalena.

d. Titule esta solucin con NaOH 0.05N hasta obtener un color rosa plido permanente. Anote el volumen utilizado.

e. A partir del tiempo cero contar 15, 30, 45 y 60 minutos y medir en cada intervalo 5 mL de la mezcla

original y repetir el procedimiento descrito en los numerales (b), (c) y (d).

Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos

Dispngalos por el desague

Resultados y preguntas

a. Grafique los equivalente-gramo de NaOH utilizados vs tiempo. La pendiente de esta grfica corresponde a la actividad en equivalentes de aminocidos hidrolizados por minuto y por mL de solucin proteica.

b. Compare el resultado obtenido con el dato reportado (400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1mol de sustrato/minute, en condiciones estndar 25 oC y pH optimo.

c. Cul(es) es (son) la (s) proteasa (s) contenidas en la pancreatina? Cuales enlaces peptdicos son

hidrolizados?

d. Qu otros enlaces peptdicos puede hidrolizar la pepsina fuera de aquellos que contienen los aminocidos de Phe, Trp y Tyr?

PRCTICA 7

ACCIN CATALITICA DE LA LIPASA PANCRETICA Objetivos

18. Determinar la actividad enzimtica de la lipasa pancretica al catalizar por hidrlisis una muestra de triacilglicrido.

19. Analizar el efecto activador del ion calcio (Ca2+), sobre la lipasa. Aspectos tericos La lipasa es una enzima especfica para los steres en la posicin del glicerol y prefiere cidos grasos de cadena larga con ms de 10 tomos de carbono. La accin cataltica de la lipasa pancretica tiene lugar en la interfase agua-lpido de las partculas emulsionadas micelas. La presencia de los cidos biliares que si bien constituyen a la formacin de las micelas, presentan una fuerte inhibicin sobre la enzima, la cual es superada por la adicin de una protena que forma un complejo estabilizador con la lipasa. Esta protena es denominada colipasa. La hidrlisis de los triacilglicridos por accin de la lipasa, se presenta a continuacin:

C O CH

CH2

CH2

O

O C

C R1

O

R3

OR2

O

+ 2 H2O LipasaC O CH

CH2

CH2

OH

OH

R2

O

HO

HO C

C R1

O

R3

O

+

+

Los factores que afectan la velocidad de hidrlisis son:

a. El pH: Generalmente las lipasas actan a pH alcalino. b. La temperatura: La temperatura de accin ms efectiva est entre los 30 y 40C. c. Activadores: El ion calcio (Ca2+) aumenta la estabilidad de la lipasa y produce sales de calcio, las cuales

precipitan e impulsan la reaccin en sentido directo. Los cloruros (Cl-) y los bromuros (Br-) tambin actan como activadores.

d. Inhibidores: Algunos aniones entre ellos el nitrato (NO3-), el fluoruro (F-) y agentes oxidantes como el agua oxigenada (H2O2) actan como inhibidores de la lipasa.

Materiales:

Tubos de ensayo Bureta Erlenmeyers

Soporte universal Pinza y nuez Bao mara

Sustancias:

Buffer de borato (pH = 8.4) Aceite vegetal Solucin enzimtica (utilizando 2 pastillas de

creoflat)2

Solucin de hidrxido de sodio (NaOH) 0.02N

Solucin de CaCl2 10% Fenolftalena

2 La solucin enzimtica se prepara macerando 2 pastillas de pancreoflat, que no contengan sales biliares, en 50 mL de buffer a pH = 8.4 y conserve la solucin en bao Maria a 37C

Seccin Experimental

a. Solucin blanco: adicione a un tubo de ensayo grande los siguientes componentes:

10 mL de agua 5 gotas de aceite 5 mL de solucin enzimtica

Caliente el tubo de ensayo por 1 minuto en agua a ebullicin, deje enfriar, transvase el contenido a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftalena y titule con NaOH 0.02N hasta obtener un color rosado plido.

b. Disponga de 6 tubos de ensayo y prepare en cada uno las siguientes soluciones como se indican en la

tabla siguiente:

Tubo Aceite (gotas)

Sln. CaCl2 (mL) H2O (mL) Fenolftalena (gotas)

1 5 - 10 3 2 5 - 10 3 3 5 - 10 3 4 5 0.5 9.5 3 5 5 0.5 9.5 3 6 5 0.5 9.5 3

c. Adicione, gota a gota, NaOH 0.02N a cada uno de los tubos hasta obtener un color rosado plido igual

al blanco. d. Coloque los tubos en un bao de agua a 37C y adicione 5 mL de solucin enzimtica a cada uno.

Anote el tiempo de inicio de la reaccin.

e. Transcurridos los primeros 15 minutos, caliente los tubos 1 y 4 en agua hirviendo durante un minuto. Dejelos enfriar, trasvselos a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftalena a cada uno y titule con NaOH 0.02N. Anote los mL de NaOH utilizados.

f. Transcurridos 30 minutos, efecte con los tubos 2 y 5, el mismo procedimiento anterior.

g. Transcurridos 45 minutos, efecta con los tubos 3 y 6, el mismo procedimiento descrito en (e).

Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos dispngalos por el desage

Resultados

m. Con los resultados obtenidos calcule los equivalentes-gramo de NaOH consumidos de la

siguiente manera:

Eq-gNaOH = 0.02 (V Vb) Donde: V = volumen gastado de NaOH en cada titulacin Vb = volumen gastado de NaOH en la titulacin del blanco n. Tabule los resultados obtenidos en el numeral anterior y el tiempo registrado en la tabla

siguiente:

Tubo Eq-gNaOH Tiempo (min) 1 15 2 30 3 45 4 15 5 30 6 45

o. Haga una grfica de Eq-gNaOH vs tiempo para los tubos sin ion calcio, Ca2+ (tubos: 1, 2 y 3) y

para los tubos con ion calcio (tubos: 4, 5 y 6). p. Calcule la actividad (la pendiente de la curva) en Eq-g/min de cidos graso hidrolizados.

q. Compare las actividades sin ion calcio, con ion calcio y con el dato reportado*.

* Actividad enzimtica de la proteasa: 400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1mol de sustrato/minute, en condiciones estndar 25 oC y pH ptimo.

PRCTICA 8

GLICLISIS ANAEROBIA (FERMENTACIN ALCOHLICA) Objetivos

20. Determinar las diferentes velocidades en la fermentacin de mono, di y polisacridos. 21. Determinar el efecto de la concentracin en el proceso de fermentacin. 22. Comprobar la inhibicin de la ruta metablica ocasionada por el NaF.

Aspectos tericos El metabolismo: Es el conjunto de reacciones y procesos fsico-qumicos que ocurren en una clula. Estos procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular, y permiten las diversas actividades de las clulas: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estmulos, etc. El metabolismo se divide en dos procesos conjugados: catabolismo y anabolismo. Las reacciones catablicas liberan energa; un ejemplo es la gluclisis, un proceso de degradacin de compuestos como la glucosa, cuya reaccin resulta en la liberacin de la energa retenida en sus enlaces qumicos. Las reacciones anablicas, en cambio, utilizan esta energa liberada para recomponer enlaces qumicos y construir componentes de las clulas como lo son las protenas y los cidos nucleicos. El catabolismo y el anabolismo son procesos acoplados que hacen al metabolismo en conjunto, puesto que cada uno depende del otro

La glucolisis: Es la va metablica encargada de oxidar la glucosa y as obtener energa para la clula. sta consiste de 10 reacciones enzimticas que convierten a la glucosa en dos molculas de piruvato, la cual es capaz de seguir otras vas metablicas y as continuar entregando energa al organismo. En la gluclisis, se metaboliza la glucosa en la parte fluida del citoplasma en dos molculas de piruvato y se generan dos molculas netas de ATP de ganancia. Durante este proceso, se activa la molcula de glucosa por adicin de fosfatos provenientes de dos molculas de ATP para formar bisfostato de fructosa. Este compuesto se descompone, mediante una serie de reacciones, en dos molculas de piruvato. Estas reacciones producen cuatro molculas de ATP y dos transportadores de electrones, N ADH. Debido a que se consumieron dos ATP en las etapas de activacin, el rendimiento neto de la gluclisis es de dos ATP y dos NADH. La gluclisis, adems de proporcionar un pequeo rendimiento de ATP, consume NAD+ para producir NADH. Una vez, que la provisin de NAD+ de la clula se ha consumido, la gluclisis se detiene.

La reaccin global de la gluclisis es:

Glucosa + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2 Piruvato + 2NADH + 2ATP + 2H+ + 2H2O Los productos de esta reaccin, mostrados arriba, son utilizados por la clula en muchas funciones:

El ATP (Adenosn trifosfato) es la fuente de energa universal de la clula. NADH y H+, otorgan la capacidad de reducir otros compuestos pertenecientes a otras vas metablicas,

o bien para sintetizar ATP.

El piruvato es la molcula que seguir oxidandose en el ciclo de Krebs, como parte de la respiracin aerbica, donde dar origen a ms molculas NADH, que podrn pasar a sintetizar ATP en la mitocondria

La gluclisis se divide en dos partes principales y diez reacciones enzimticas, las que se describen a

continuacin.

1. La primera reaccin de la gluclisis es la fosforilacin de la glucosa, para activarla (aumentar su energa) y as poder utilizarla en otros procesos cuando sea necesario. Esta activacin ocurre por la transferencia de un grupo fosfato del ATP, una reaccin catalizada por la enzima hexoquinasa, la cual puede fosforilar (aadir un grupo fosfato) a molculas similares a la glucosa, como la fructosa y manosa.

OHO

HO

OH

OH

OH

OHO

HO

OH

OH

OP

HO

OHO

OP HO

OH

HO

OHO

OP PO

OHCOH

CHOH

CH2OP

CH2OH

C

CH2OP

O

GA3P

D3P

COOP

CHOH

CH2OP

1-3PGlicerato

COOH

COP

CH2

COOH

C

CH3

O

ACIDOPIRUVICO

ATP ADP

Pi 1 2Glucosa

Glucosa 6P Fructosa 6P

ATP ADP

Pi 3

Fructosa 1-6P

NAD

NADH.H

Pi

ADPATP

PEP

6

910

Mg2+Mg2+

COO-

CHOH

CH2OP

ADPATP

7

Mg2+COO-

CHOP

CH2OH

Fosfogliceratomutasa

54

8

3PGlicerato2PGlicerato

Enolasa

Piruvatoquinasa Fosfogliceratoquinasa

Glicesraldehido3P-deshidrogenasa

Aldolasa

Fosfotriosaisomerasa

Fosfofructoquinasa

Fosfohexosaisomerasa

Glucoquinasa

2. En esta reaccin, la glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6-fosfato, mediante la enzima fosfohexosa isomerasa. La isomerizacin ocurre en una reaccin de 4 pasos, que implica la apertura del anillo y un traspaso de protones. 3. Fosforilacin de la fructosa 6-fosfato en el carbono 1, con gasto de un ATP, a travs de la enzima fosfofructoquinasa-1 (PFK1). Tambin este fosfato tendr una baja energa de hidrlisis. Por el mismo motivo que en la primera reaccin, el proceso es irreversible. El nuevo producto se denominar fructosa-1,6-Bisfosfato.

4. La enzima aldolasa (Fructosa-1,6-bifosfato aldolasa), mediante una condensacin aldlica reversible, rompe la fructosa-1,6-bifosfato en dos molculas de tres carbonos (triosas): dihidroxiacetona fosfato y Gliceraldehdo-3-fosfato. 5. Puesto que slo el gliceraldehdo-3-fosfato puede seguir los pasos restantes de la gluclisis, la otra molcula generada por la reaccin anterior (dihidroxiacetona-fosfato) es isomerizada (convertida) en gliceraldehdo-3-fosfato. sta reaccin posee una energa libre en condiciones estandar positiva, lo cual implicara un proceso no favorecido, sin embargo al igual que para la reaccin 4, considerando las concentraciones intracelulares reales del reactante y el producto, se encuentra que la Energa Libre total es negativa, por lo que la direccin favorecida es hacia la formacin de G3P.

6. Se utiliza un fosfato inorgnico y una molcula de NAD+ para producir 1,3-bifosfoglicerato y una molcula de NADH + H+. Esta reaccin la cataliza la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa o GAP-deshidrogenasa. Llama la atencin que el fosfato se ha introducido sin utilizar ATP, sino aprovechando la energa producida por la reaccin redox. Ahora, el fosfato que se ha introducido tiene una alta energa por lo que se podr transferir al ATP. Esto se conoce como fosforilacin a nivel de sustrato.

7. Se desfosforiliza el 1,3-bifosfoglicerato gracias a la fosfoglicerato quinasa, formndose una molcula de ATP por cada una de 1,3-BPG y dando lugar al 3-fosfoglicerato.

8. Se isomeriza el 3-fosfoglicerato procedente de la reaccin anterior dando 2-fosfoglicerato, la enzima que cataliza esta reaccin es la fosfoglicerato mutasa. Lo nico que pasa aqu es el cambio de posicin del fosfato del C3 al C2. Son energas similares y por tanto reversibles, con una variacin de energa libre cercana a cero.

9. La enzima enolasa propicia la formacin de un doble enlace en el 2-fosfoglicerato, eliminando una molcula de agua formada por el hidrgeno del C2 y el OH del C3. El resultado es el fosfoenolpiruvato.

10. Desfosforilacin del fosfoenolpiruvato, obtenindose piruvato y ATP. Reaccin irreversible mediada por la Piruvato quinasa.

Destino del piruvato El piruvato formado en la gluclisis puede tomar tres rutas catablicas alternativas como se muestra en la siguiente figura:

En condiciones anaerbicas el piruvato se convierte a dos molculas de lactato (fermentacin lctica que se realiza en el msculo), y en condiciones aerbicas el piruvato se convierte a dos molculas de acetil-CoA que luego ingresa al ciclo del cido ctrico (realizado en la mitocondria) y se degrada a CO2 y H2O. Siguiendo esta va, donde el aceptor final es el oxgeno, se obtendrn 30 32 ATP, los cuales sern usados por la clula como fuente de energa para las funciones normales de la clula, como la proliferacin, el crecimiento y metabolismo. Por otro lado, el piruvato bajo condiciones anaerbicas se convierte en etanol y dos molculas de dixido de carbono, ruta conocida como fermentacin alcohlica.

Fermentacin alcohlica: gluclisis anaerobia Es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de oxgeno, originado por la actividad de algunos microorganismos, como las levaduras, que procesan los carbohidratos para obtener como productos finales: etanol, dixido de carbono y dos molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El proceso se muestra en la siguiente figura:

Glucosa

O

-O

CH3

O

Piruvato

H+ CO2

H

CH3

O

Acetaldehido

NADH + H+ NAD+

CH3CH2OH

Alcoholdeshidrogenasa

Piruvatodescarboxilasa

Glucolisis

OHO

HO

OH

OH

OH

Etanol

Despus de la formacin del piruvato en la glucolisis, este se descarboxila (pierde CO2), convirtindose en acetaldehdo por accin del enzima piruvato descarboxilasa. El proceso se complementa con la reaccin que genera el etanol y el agente oxidante (NAD+), requerido por la levadura para continuar haciendo gluclisis y disponer de ATP. Esta reaccin es promovida por la enzima etanol deshidrogenada, distribuida en todos los organismos.

Desde el punto de vista energtico, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la respiracin aerobia, ya que a partir de una molcula de glucosa slo se obtienen 2 molculas de ATP, mientras que en la respiracin se producen 38. Esto se debe a la oxidacin del NADH, que en lugar de penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgnicos con poco poder oxidante.

La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados.

El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.

Es necesario anotar que se denomina gluclisis al proceso que lleva desde la glucosa al piruvato, sin embargo, en algunas reacciones intermedias de este proceso es posible el ingreso de otros monosacridos diferentes a la glucosa, como fructosa, manosa o galactosa, casos en los cuales se habla de gliclisis. En la prctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y polisacridos), midiendo la cantidad de CO2 que se va generando en el tiempo:

reaccin = d(cant. CO2)/dt

Materiales:

Tubos de ensayo Beaker Bao mara Regla Tapones

Agujas de jeringa Manguera con 0.35 cm de dimetro y

3m de largo Solucin coloreada (azul de metileno o

violeta de genciana)

Sustancias:

Levadura fresca al 5%3 Glucosa 1% y 10% Fructosa al 10% Sacarosa al 10%

Almidn 1 % NaF 0.1M Agua destilada

Seccin Experimental

f. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura y 2mL de solucin de glucosa al 10%. g. Tape el tubo de ensayo con un tapn de caucho, agite y atraviese el tapn con una aguja de jeringa

desechable.

h. Tome una manguera para fermentacin, adicinele 1mL de solucin coloreada, colquela a presin en la boca de la aguja y fjela a la mesa de trabajo con cinta. Tanto el tapn como la manguera deben quedar bien hermticos de tal forma que no hayan fugas. Procure que la manguera quede lo mas lineal posible.

i. Ponga el sistema en un beaker que contenga agua entre 37-40C. Tenga cuidado que la manguera no quede en contacto con alguna superficie caliente y la solucin coloreada no est a ms de 50 cm del tubo.

j. Marque la manguera donde se encuentra la solucin coloreada.

3 Esta solucin se prepara en un buffer de acetato pH = 5.5

k. A penas comience a moverse la solucin coloreada cuente dos minutos y vuelva a marcar la posicin donde se encuentra esta solucin.

l. Siga marcando cada dos minutos durante doce minutos.

m. Desconecte la manguera y mida con una regla la distancia recorrida por la solucin coloreada cada dos minutos.

n. Repita los pasos (a) hasta (h) con: glucosa al 1%, fructosa al 10%, sacarosa al 10% y almidn al 1%.

o. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa al 10% y 1mL de agua destilada.

p. Repita los pasos (b) hasta (h)

q. Por ltimo, coloque en un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa al 10% y 1mL de la solucin de NaF y repita los pasos (b) hasta (h).

r. Anote los datos en la siguiente tabla: Carbohidrato Glucosa

1% Glucosa 10%

Glucosa 10%

con NaF Fructosa

10% Sacarosa

10% Almidn

1% Tiempo (min) Longitud (cm)

2 4 6 8 10

Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos Dispngalos por el desague

Resultados

e. Con los datos obtenidos en el numeral anterior calcule la velocidad de la reaccin para cada carbohidrato y complete la tabla.

Carbohidrato reaccin Glucosa 1% Glucosa 10% Glucosa 10% con NaF Fructosa 10% Sacarosa 10% Almidn 1%

Nota: el volumen de CO2 producido se calcula con la frmula del volumen de un cilindro: V = r2 h, donde: r , es el radio de la manguera (0.17cm) y h es el promedio de las longitudes medidas (haga esta operacin con los valores que sean ms homogneos)

a. Escriba la reaccin neta balanceada de la fermentacin de cada uno de los carbohidratos.

b. Segn las ecuaciones del numeral anterior, Dnde ocurrira la mayor produccin de CO2? Est ello de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente?

c. Segn la experiencia cual es el orden de los carbohidratos segn la rapidez en la fermentacin? Cmo

se podra justificar?

d. Cmo interpretara el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentacin?.

Preguntas e. En que consiste la fermentacin lctica y glicrica? En que diferencian de la fermentacin etanlica?

f. El arsenato (AsO42-) es qumicamente similar al fosfato inorgnico (PO42-) y algunas enzimas que

utilizan fosfato inorgnico pueden utilizar tambin el arsenato. La produccin de ATP en la glucolisis es inhibida por el arsenato. Identifique las enzimas que pueden ser afectadas.

g. Adems de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis. Cules son?

h. Enumere algunos inhibidores de la gliclisis

PRACTICA 9 DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUNEO

Objetivos 1. Cuantificar el contenido de glucosa en suero sanguneo 2. Comparar el resultado obtenido con los datos reportados y determinar el estado de salud del paciente Aspectos Tericos Metabolismo de los glcidos. La digestin de los polisacridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidn para dar dextrinas y maltosa. En el estmago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH ms alcalino, actan las enzimas procedentes del pncreas como la amilasa pancretica. Finalmente, enzimas de la mucosa intestinal concluyen la degradacin (disacaridasas). Posteriormente los monosacridos, principalmente la glucosa, son absorbidos a travs de la pared intestinal hacia el torrente sanguneo y llevados al hgado por medio de la circulacin portal. La glucosa es la principal fuente de energa en los seres vivos. Por tal razn es un metabolito fundamental en los procesos biolgicos. La glucosa tras su degradacin por la va glucoltica se obtiene una gran cantidad de energa en forma de ATP. Alteraciones en el metabolismo de la glucosa conducen a estados de hipoglucemia o hiperglucemia (diabetes) que producen unos trastornos clnicos que en algunos casos pueden resultar fatales. La determinacin del contenido de glucosa en el suero fisiolgico es una prueba indicativa del estado de salud del individuo y resulta necesaria en los casos de alteraciones metablicas u hormonales (deficiencia en insulina, glucagn, etc). Alteraciones del metabolismo glucdico, la diabetes Aunque las patologas relacionadas con alteraciones del metabolismo glucdico son muy diversas, vamos a centrarnos en los trastornos en la regulacin del nivel de la glucosa en sangre. Cuando la homeostasis de la glucosa se rompe por disfuncin de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los sndromes hiper o hipoglucmicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminucin (

Cmo se detecta la Diabetes? El estudio de diabetes se realiza mediante la medicin de la glucosa en sangre y en ayunas (glucemia basal) y se recomienda en las siguientes circunstancias: En todos los individuos mayores de 45 aos, y repetir cada 3 aos mientras sea normal. En poblacin ms joven cuando existan factores de riesgo. Cuando aparezcan sntomas o signos que sugieran diabetes:

- Poliuria (orinar mucho). - Polifagia (aumento del apetito). - Polidipsia (beber mucho por sed). - Prdida de peso. - Retinopata. - Proteinuria. - Infecciones urinarias de repeticin. - Infecciones cutneas de repeticin,...

Cuando el nivel de glucosa plasmtica en ayunas est entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si persiste, realizar un test de Tolerancia Oral (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en 3-5 minutos). Pacientes con antecedentes de Hipertensin arterial o trastornos del colesterol. Determinacin de glucosa: para el diagnstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero cmo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra?, Los mtodos para determinar la concentracin de glucosa se clasifican en dos grandes grupos: a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la o-toluidina) b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa, hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos mtodos que vamos a citar se pueden utilizar para determinar la glucosa en muestras de suero, orina y lquido cefalorraqudeo. b.1.) Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de referencia y consiste en dos reacciones acopladas:

Glucosa + ATP Hexoquinasa, Mg++ G-6-PO4 + ADP

G-6-PO4G-6-PD

6-fosfogluconato NADPH H+NADP++ + + En la primera reaccin (especfica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formndose glucos