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Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN

Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P. 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA ASIGNATURA:

“LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS” PRIMERA EDICIÓN

AUTORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ BIOL. L. PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL EDITORAS: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ



PRÁCTICA No. 1: MICROSCOPÍA

UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía 1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

• El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo 1.2 Objetivos específicos

• Utilizar correctamente el microscopio compuesto • Realizar la técnica de iluminación de Köhler • Observar preparaciones temporales en el microscopio compuesto

2.- INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos. Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a: Microscopio óptico Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final. El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3. Sistema mecánico. El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar) El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.



El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revólver y portarevólver. Función básica de cada parte del microscopio: a.- Sistema mecánico Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización. Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos. Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular. Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento. Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco. b.- Sistema de iluminación Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, 50-100 W Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación. Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto. c. Sistema óptico Oculares



El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo. Tubo El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total. Objetivos Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente: 1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1) 2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numérica. 4.- El lado inferior la distancia mecánica 5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos 6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (Tabla 2) En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que: Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor, 10= No requiere cubreobjetos ó 0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm. Anillo superior Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

Tabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores

grabados Aumentos Color anillo

superior 1.0X Negro 2.5 X Pardo 4.0 X Rojo 6.3 X Anaranjado 10 X Amarillo 16 X Verde claro 25 X Verde oscuro 40 X Azul claro 63 X Azul oscuro 100X Blanco



Aumentos totales: El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando. Distancia mecánica: Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm. Poder de resolución: El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom. Apertura numérica: Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo. Microscopio de contraste de fase Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis. Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler.

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo Carácter Sustancia Índice de refracción Color del anillo Oil Aceite 1,515 Negro W Agua 1,333 Blanco Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado Metileno Yoduro de metileno 1,740 Amarillo



Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 MATERIAL POR EQUIPO • Microscopio compuesto • Preparaciones fijas de bacterias • Preparaciones en fresco de mohos • Preparaciones en fresco de agua estancada

• Frasco con benzal • Esponja • Papel seda • Lámpara de alcohol

3.2 REACTIVOS • Aceite de inmersión • Atomizador con benzal 3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO • Una muestra de agua estancada • Comida con mohos • Colores 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Cuidado y limpieza del microscopio Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos: a.- Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente. b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar. c.- Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas. Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio. a.- Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos b.- Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica. c.- Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión. 4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN MÉTODO KÖHLER A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador. Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio 1.- Luz amarilla (bajo voltaje)



2.- Ajustar la distancia interpupilar 3.- Ajustar las dioptrías 4.- Abrir el diafragma de campo e iris

4.3 Observación de una preparación temporal a.- Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado con una torunda que contenga alcohol b.- Colocar una gota pequeña del agua estancada con una pipeta Pasteur d.- Cubrir la preparación con el cubreobjetos e.- Observar al microscopio de contraste de fases a 10 y 40 X f.- Observar la preparación temporal realizada en el microscopio compuesto y comparar los resultados obtenidos g.- Realizar esquemas de las preparaciones observadas. 4.4 Observaciones de preparaciones fijas a.- Tomar una preparación fija y enfocarla a 10 y 40 X. b.- Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X c.- Observar la preparación que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biológico d.- Ahora mover la preparación para enfocar la preparación con poca cantidad de muestra. e.- Comparar ambas muestra y concluir



5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1.- Imagen a color de la preparación en fresco de agua estancada con el microscopio óptico a 10X y 40X. 5.2.- Imagen a color de la preparación fija a 40X y 100X, Nombre del microorganismo, Forma y agrupación 5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla: Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones Compuesto Contraste de fase Electrónico Estereoscópico Fluorescencia Interferencia Polarización 5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:

Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece: (mecánico, óptico, iluminación)

Condensador Diafragma de campo Diafragma de iris Filtro azul Lámpara Objetivo Ocular Platina Revólver Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler. 6.2 Ventajas y desventajas de un microscopio compuesto, con respecto a su uso, Tipo de preparación y cantidad de muestra utilizada 6.3 Tamaño de las imágenes observadas en cada aumento 7.- CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada. 8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 8.1 Barrera Escorcia Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V. 8.2. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V. 1991. 139. 8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1° edición, 1985. Ed. Labor S.A. 8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por la Asociación de Químicos del Instituto Nacional de Nutrición, Secretaría de Salud., México..

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN

9 Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.

PRACTICA No. 2 PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO

UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía. TEMA: 1.3 Preparación de un frotis microbiano. 1.3.1 Preparaciones fijas 1.3.2 Preparaciones en fresco 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico por medio de tinciones. I.2 Objetivo específicos 1.2.1 Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos 1.2.2 Realizar tinciones simples, diferenciales y específicas. 1.2.3. Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X 2. INTRODUCCIÓN La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinción diferencial. Tinción simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo básico, se utiliza solamente para incrementar el contraste de la célula que absorberá el colorante y quedará teñido del mismo color. Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen. Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la célula. Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con una asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.



3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO

• Microscopio óptico 3.2 MATERIAL

• Portaobjetos • Cubreobjetos • Pipeta pasteur • Gradilla • 1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm • Asa bacteriológica • Frasco gotero con solución de cristal violeta • Frasco gotero con solución de lugol • Frasco gotero con solución de alcohol – acetona • Frasco gotero con solución de safranina • Frasco gotero con solución de fucsina fenicada • Frasco gotero con solución de alcohol ácido • Frasco gotero con solución de azul de metileno • Frasco gotero con solución de verde de malaquita • Solución salina o agua de la llave • Mechero • Asa y porta asa • Puente de coloración • Gradilla metálica • Lámpara de alcohol

3.3 CEPAS MICROBIANAS

• Staphylococus aureus • Escherichia coli • Sacharomyces cerevisiae • Mohos que se encuentren disponibles

3.4 REACTIVOS

• Atomizador con benzal 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Preparación de Frotis: Método A 4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol. a.- Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.



b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla. d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente.. El calor deseable es aquel que soportamos en el dorso de la mano. Realizar esta operación una vez más Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir. Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis Método B a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero. b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión. c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

4.2 Examen en fresco de una muestra agua estancada 4.2.1 De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos limpio 4.2.2 Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos. 4.2.3 Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rápido para evitar que se formen burbujas. 4.2.4 Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.



4.3 Preparación en fresco de un moho 4.3.1 Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol 4.3.2 Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión 4.3.3 Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas 4.3.4. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Si se requiere que la preparación dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes.

4.4 Tinción simple a) Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado b) Tomar el tiempo por 1 minuto c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua d) Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X. 4.5 Tinciones diferenciales 4.5.1 Tinción de Gram completa: a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus en el puente de coloración. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar los frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave. j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X) 4.6 Tinción de Gram decolorada: a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar los frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.



h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave. j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X. 4.7 Tinción de Gram completa aplicada a una suspensión de microorganismos: a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar el frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar el frotis con agua de la llave. j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100 X. 4.8 Tinción de Ziehl-Neelsen. a) Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración b) Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe. c) Enjuagar con agua de la llave. d) Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto. e) Enjuagar con agua de la llave. f) Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto g) Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión 4.9 Tinción específica 4.9.1 Tinción de Shaeffer–Fulton a) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación. b) Dejar que el frotis se enfríe. c) Lavar con agua de la llave. d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto. e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.



5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco del moho observado. 5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla

5.3 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana? 5.4 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco? 5.5 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra? 5.6 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis? 5.7 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram? 5.8 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos? 5.9 ¿Cuando es recomendable utilizar una tinción simple y que colorante utilizarías? 5.10 ¿Cuál es la finalidad de utilizar el barniz de uñas en las preparaciones en fresco? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir las ventajas y desventajas de las preparaciones en fresco, preparaciones fijas y tipos de tinciones adecuadas para cada una de ellas. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica. 8 BIBLIOGRAFÍA 8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México. 1140 pags.

Aumento Agua estancada

Tinción Simple

Tinción diferencial:

Gram completa

Tinción de Gram:

decoloración

Tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción específica Shaeffer y

Fulton 40X

100X

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN

Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.

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PRACTICA No. 3 ESTERILIZACIÓN

UNIDAD II: Esterilización TEMA: Agentes físicos. Calor húmedo, calor seco Filtración a través de membrana

Prueba de esterilidad (Método de la tira de papel impregnada con esporas) 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general El alumno preparará material de uso en microbiología para su esterilización Utilizará el método adecuado de esterilización de acuerdo al tipo de material I.2 Objetivo específicos Lavar el material a esterilizar para uso en el área microbiológica Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor húmedo Esterilizar el material previamente preparado, por calor seco y calor húmedo. Realizar el proceso de filtración a través de membrana 2. INTRODUCCIÓN La esterilización es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilización se puede realizar a través de métodos físicos y químicos. Para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización. Métodos físicos Calor húmedo: La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las esporas ni a las Arqueobacterias extremófilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de presión. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente. Calor seco: Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 –170 °C durante una h. Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares. Incineración: La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar” diseminándose partículas infectantes. A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.



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Radiaciones ionizante y no ionizante: La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles. Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula. Filtración a través de Membranas Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro). Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o ésteres de celulosa, para la filtración a través de membrana, se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con porosidad de 0.22 µm, como mínimo. Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona) Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de óxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el óxido de etileno residual porque es muy tóxico. La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el óxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena. Indicadores biológicos para el proceso de esterilización En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

Jeringas y portamembranas



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Método de la tira de papel Las esporas de Geobacillus stearothermophilus.- En un proceso de esterilización por calor húmedo, se utilizan tres tiras impregnadas con las esporas del microorganismo, colocando una que se esteriliza previamente y servirá como control negativo; una tira sin esterilizar que fungirá como control positivo y una tira más se coloca en la muestra que se va a esterilizar. Una vez concluido el proceso de esterilización, cada tira se transfiere, bajo condiciones asépticas, a tubos con caldo de un medio enriquecido estéril y se incuban a 55 °C durante 7 días. Al término de la incubación, se observa si hay crecimiento en cada uno de los tubos. Si la tira control positivo no presenta crecimiento o si la tira control negativo presenta crecimiento, se invalida el proceso. Si hay crecimiento solamente en la tira que corresponde al seguimiento del proceso, este se realizó en condiciones incorrectas y no hubo esterilización. Si no hay crecimiento solamente en la tira control negativo y en la tira de la muestra, el proceso se realizó correctamente. Método de la ampolleta: Son ampolletas que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo con púrpura de bromocresol como indicador. Las ampolletas indicadoras se colocan entre el material que se va a esterilizar por calor húmedo. Al término del proceso de esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, la turbidez y la aparición de un color amarillo indica un proceso de esterilización incorrecto. Al mismo tiempo se incuba una ampolleta sin esterilizar como control positivo, la cual debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

OTROS AGENTES ESTERILIZANTES: Para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se esteriliza el material, impregnando con alcohol y poniéndolo a la flama hasta que se apague solo repitiendo el procedimiento tres veces. El método tiene la ventaja de ser rápido pero se produce carbonización y pérdida de filo. Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras. NOTAS: -Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente. -Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en autoclave a 121 oC, 1,05 atm de presión durante 15 minutos - Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposición final ambientalmente responsable. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO

• Autoclave a 121° C • Autoclave a 110 ° C • Horno a 170 ° C • Incubadora a 35° C

• Baño María a 55°C Membranas con porosidad de 0,45 µm de diámetro.

• Termómetros de 150 • Termómetro de 200 °C



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3.2 MATERIAL • Papel aluminio • Papel Kraft • Algodón • 2 cajas de Petri • 2 matraces de 125 ml • 3 pipetas de 2, 5 y 10 mL • Una pinza de disección • Una tijera • Una gradilla • Un cilindro pipetero • Un cilindro para cajas de Petri

• Un mechero Fisher • Un vaso de precipitados de 100 ml • 8 tiras de papel filtro • Ligas • Un sistema Millex–HA • Un portamembranas de filtración • Membranas de 0.45 micrones de porosidad • Escobillones de diferentes tamaños • Una esponja • Un tubo de ensaye 13 X 100 estéril con caldo

nutritivo •

3.3 MEDIOS DE CULTIVO • 4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo • 2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estéril • 2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar


• Tiras controles de esporas • Suspensión microbiana de Escherichia coli

3.5 REACTIVOS

• Agua destilada • Caldo nutritivo

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN 4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aniónicos que no dejan residuos b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. 4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO 4.2.1 TUBOS DE ENSAYO a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor b) Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.



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4.2.2 CAJAS DE PETRI a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETAS a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta. 4.2.4 MATRACES a) Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor. b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón. c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel. 4.2.5 PINZAS Y TIJERAS a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta. b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.2.6 PORTAMEMBRANAS Y MEMBRANAS DE 0.45 MICRONES DE POROSIDAD a) Abrir el portamembranas, revisar que contenga el empaque y con la ayuda de pinzas, colocar una membrana de 0.45 micrones de porosidad, del diámetro adecuado al tamaño del portamembrana, cerrar adecuadamente, envolver en papel Kraft, siguiendo las instrucciones del profesor. 4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO 4.3.1 TUBOS DE ENSAYE a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica. b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape. 4.3.2 CAJAS DE PETRI a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL CONTAMINADO) b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.



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4.3.3 PIPETAS a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado. b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodón, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas. c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas. d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero. 4.3.4 MATRACES a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio. b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble. 4.3.5 PINZAS Y TIJERAS a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera. b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD POR CALOR SECO Y CALOR HÚMEDO 4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA a) Preparar 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar cada uno de ellos como tubo 1 y 2. (Etiqueta con la siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) b) Colocar en el tubo 1, una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, mantener el tubo número 1 sin esterilizar. (Testigo positivo) c) En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocarle una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón, y someterlo a una temperatura de 110 °C durante 10 minutos y una presión de 10 lb/pulg d) Un tercer tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril será nuestro testigo negativo en toda la práctica e) Incubar los tres tubos a 55 oC ± 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. 4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO a) Preparar un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo. b) Colocar en el tubo una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb. c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos positivo y negativo respectivamente. e) Incubar el tubo a 55 oC ± 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. NOTAS: Consideraciones importantes para llevar a cabo el proceso de esterilización adecuado: -Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave. -Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical -Cuando se caliente la olla observar que no salga vapor por la tapa, en caso de suceder cambiar el empaque. -Si se esta utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada. -Observar que el manómetro registre la presión



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4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO a) Precalentar el horno a 170°C, colocar el material preparado para esterilizar y esperar que la temperatura se vuelva a ajustar a 170 oC, en este momento empezar a contar el tiempo de 1 h. b) En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var. niger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material indicado en el inciso a. Esterilizar a 170 oC durante 1 h. En caso de que no se te proporcione la tira impregnada con esporas introduce una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con esporas, etiqueta el tubo con los datos correspondientes de preferencia con un marcador indeleble. c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos d) Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas. e) Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones asépticas, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 mL de caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 ± 2 oC durante 24 – 48 h. Observar diario y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. (esto se hará extraclase) NOTA:-Registrar en su cuaderno de notas la temperatura y el tiempo de esterilización Características de las tiras impregnadas con esporas (uso a nivel industrial). 1.- Colocar estratégicamente las ampolletas No. 1 (12 por m3) y operar el sistema de esterilización. 2.- Una vez concluido el proceso de esterilización, transferir bajo condiciones asépticas,la tira con esporas a la ampolleta No. 2, cortándole en la parte cintada. 3.- Incubar las ampolletas No. 2 de 35 a 37 oC durante 24 –48 h. Testigo positivo.- Sin haber sido esterilizada incubar una tira de esporas con las condiciones anteriores Interpretación Ampolletas con desarrollo.-Proceso de esterilización inadecuado Ampolletas sin desarrollo.- Proceso de esterilización adecuado Testigo positivo.- Deberá mostrar desarrollo La ampolleta tiene un disco con esporas de Bacillus subtilis (niger) con no menos de 5 X 105 esporas. 4.7 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA a) Colocar 1 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable b) Bajo condiciones asépticas, ensamblar la jeringa al portamembrana con la membrana previamente esterilizada c) Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un tubo de ensaye estéril. d) Transferir la membrana con la ayuda de una pinza estéril, a un tubo que contiene 3 mL de caldo nutritivo estéril d) Incubar el filtrado y el tubo que contiene la membrana, a 35 ± 2 oC de 48 a 72 h. e) Colocar la jeringa en un bote de lámina para su esterilización. d) Observar diariamente y anotar en el cuaderno de notas del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez durante 3 días.



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NOTAS:-El bioindicador utilizado en los procesos por filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para membranas con un diámetro de poro de 0,22 µm 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Completa el siguiente cuadro indicando presencia o ausencia de turbidez.

Método Reducción de la carga microbiana (110°C/10/´10lb)

Calor seco 170°C/2 h

Calor húmedo 121°C/15´/15lb

Filtración a través de membrana

Testigo - Testigo + Resultado

5.2 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material? 5.3 Explicar porqué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye 5.4. ¿Porque utilizamos el papel Kraft para envolver el material? 5.5 Anota 3 ejemplos de materiales que se esterilicen por calor seco, húmedo y por filtración 5.6 Qué concluyes si al término de la incubación: se observa que la tira control positivo no presenta crecimiento, la tira control negativo presenta crecimiento y en la tira de la muestra, no hay crecimiento. 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRAFÍA



PRACTICA No.4

NUTRICIÓN Y CULTIVO MICROBIANO UNIDAD: III. Nutrición y Cultivo Microbiano TEMA: 3.1 Formulación de medios de cultivo 3.2 Agar, fuentes de carbono y nitrógeno 3.3 Preparación de medios de cultivo 3.4 Cultivo de microorganismos 1.- OBJETIVOS 1.1 Objetivo General. • El alumno cultivará microorganismos en los diferentes medios de cultivo, previa preparación y clasificación con base a sus componentes, uso y consistencia. Objetivos específicos • Determinar las especificaciones mínimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en general de acuerdo a la NOM-065-SSA1-1993 • Preparar y clasificar diversos medios de cultivo en base a sus componentes, complejidad, uso y consistencia. • Cultivar bacterias y hongos en placa y tubo e identificar los requerimientos nutricionales de estos microorganismos. 2.- INTRODUCCIÓN Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos. La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados. Nutrición. A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases: (1) nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer, y (2) nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales. Algunos nutrientes son los “ladrillos” a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.



Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que se obtienen del medio que las rodea. En el laboratorio los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten un buen crecimiento. Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo, formulado con un fin específico, y el cual deberá contener: • Fuente de carbono • Fuente de nitrógeno • Fuente de azufre • Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que no pueden sintetizar) • Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc). • Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o metales pesados. • Indicadores de potencial oxido-reducción. • Agar como el agente gelificante o soporte. Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.Generalidades. Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés. Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros. Medios diferenciales. Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias. Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. Medios de transporte. Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes. Medios para filtración a través de membrana. Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la membrana. Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. En el caso de los hongos, el medio de cultivo descrito por Sabouraud es el que más se utiliza, ya que tiene un pH de 5.6 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar papa y dextrosa para promover la esporulación de hongos filamentos y para recuento, se acidifica con



ácido tartárico al 0.1 M hasta un pH de 4.5 El agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico. Otros medios de cultivo que pueden ser utilizados son los siguientes: Medios especiales para cultivo de protozoarios. Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos. En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, sino también el tipo de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificación. Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los medios de cultivo como son: a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales) b. Los materiales y utensilios que deben encontrase en condiciones de limpieza (libres de otras sustancias o reactivos que interfieran en la formulación original) c. Si se debe añadir calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional. d) pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante o fórmula estandarizada. e) Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren. Cultivo microbiano. Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos, etcétera se encuentran asociados, y en raras ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio sólido, en medio semisólido y en medio líquido. Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por punto si se trata de hongos filamentosos. Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo proveniente de una placa. Existen dos variedades de cultivo en tubo: a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie inclinada del agar. b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente. La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en el medio líquido agitando suavemente el asa. a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con agar inclinado b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un sedimento, una película superficial, o combinados. c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo Cabe señalar que la identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras pruebas bioquímicas, fiosiológicas e inmunológicas. Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas características son



útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los microorganismos. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesión I

Sesión II ♦ Incubadora a 28° C ♦ Incubadora a 37° C 3.2 MATERIAL POR EQUIPO Sesión I 1 mechero Fisher ● 1 espátula ● 6 matraz Erlenmeyer de 250 mL ● 7 tubos de ensaye de 16 x 150 mm ● 2 matraces de 125 mL ● 6 cajas Petri

5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm ● 1 gradilla metálica ● 1 probeta de 100 mL ● 1 termómetro ● 1 pipeta de 10 mL

Sesión II ♦ 3 tubos con 3 ml de medio SIM ♦ 3 cajas con agar EMB ♦ 3 tubos con agar PDA ♦ 3 tubos con agar nutritivo

♦ 3 cajas con agar nutritivo ♦ 1 matraz con 150 ml de caldo glucosa sales ♦ 1 matraz con 150 ml de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS 150 mL de caldo glucosa sales ● 100 mL de agar nutritivo ● 75 mL de agar EMB ● 25 mL de PDA ● 25 mL de medio SIM ● Glucosa

(NH4) 2SO4 ● K2HPO4 ● MgSO4 7H2O ● MnSO4 4H2O ● 6 g de agar bacteriológico ● Agua destilada

3.4 CEPAS Escherichia coli Bacillus sp.

Penicillum sp. Aspergillus sp.

Balanza granataria ● Autoclave ● Horno 170° C ● Potenciómetro

Algodón ● Gasa ● Papel Kraft ● Refrigerador



4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL SESIÓN I

• Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo. • Preparar los volúmenes de cada medio que se han de utilizar en el período recomendado para su empleo. • Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes. • Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta) • En el caso de medios deshidratados, el medio debe de guardarse en su frasco y en lugares frescos. • Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la proyección en

el momento de la ebullición. • Añadir un pequeño volumen de agua para permitir la disolución completa y después completar el volumen

total. • En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que se

derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten. • El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y con el medio a una temperatura de 25° C. • Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de

materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio. • Antes de inocular un medio debe comprobarse la esterilidad de cada lote, incubando un 3-4% del total

durante 3 días a 37° C. • Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y protegidos

de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de color o de consistencia etc.

• Un medio contenido en un matraz no puede ser esterilizado una segunda ocasión. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales)

• Preparar la cantidad de caldo o agar en tubo o en matraz según lo que el profesor indique. • Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:

Glucosa 5.0 g (NH4) 2SO4 2.0 g KH2PO4 0.05 g K2HPO4 0.05 g MgSO4 7H2O 0.25 g MnSO4 4H2O 0.001 g Agua destilada 1000 mL

Nota: Para el medio sólido adicionar 1.5 g de agar bacteriológico/ 100mL de medio. • Disolver los componentes en un matraz de 250 mL, calentar si es necesario y ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2. • Una vez disueltos los componentes transferir 30 mL a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer de 125 mL

limpios y taparlos con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar los matraces perfectamente. Si es necesario agregarle agar bacteriológico tal que la concentración sea de 1.5 %

• Calentar a ebullición hasta disolución en el caso de haber preparado agar.

Formulación g/L



• Si se requiere preparar tubos con agar una vez que se haya disuelto el agar agregar 3 mL a cada uno de los tubos, agregar el agar rápidamente antes de que solidifique, una vez agregado el agar tapar los tubos con tapo de algodón y colocarlos en un bote de lámina para su esterilización.

• Para el caso de matraz tapar el matraz con un tapón de algodón- gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar el matraz.

• Esterilizar los tubos, el matraz con caldo glucosa y el matraz de agar glucosa en autoclave a 121° C durante 15 minutos a 15 libras de presión.

• Una vez que se ha llevado a cabo la esterilización dejar a temperatura ambiente los matraces y tubos durante 24 horas como prueba de esterilidad.

• En condiciones de esterilidad transferir de 15 a 20 mL de cada medio a las cajas de Petri estériles y dejar que se solidifiquen a temperatura ambiente.

• Tomar una muestra representativa de las cajas y dejarlas a temperatura ambiente colocándolas en posición invertida durante 24 horas para prueba de esterilidad.

4.3 MEDIO COMPLEJO ( agar nutritivo )

• Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor (a) ya sea para tubos de ensaye o cajas petri.

• Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. • Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. • Vaciar 3 mL de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios, taparlos con un tapón

de algodón-gasa y gorro de papel Kraft. • Tapar el matraz que contiene el medio restante con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft. • Etiquetar los tubos y el matraz. • Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso es de

121° C durante 15 minutos y 15 libras de presión). • Enfriar el matraz hasta 45° C, por debajo de esta temperatura el agar solidificará. • En condiciones asépticas, transferir del matraz de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estériles y

permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. • Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con

marcador indeleble. • Colocar los tubos con agar nutritivo en una superficie inclinada y permitir que solidifiquen Incubar una placa

y un tubo a 37° C durante 24 horas como prueba de esterilidad. 4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

• Pesar cuidadosamente la cantidad que indica del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. • Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria. • Calentar suavemente hasta disolución completa. • Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft. • Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso a 121° C

durante 15 min). • Enfriar hasta 45° C. • En condiciones asépticas transferir de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estériles y dejar que

solidifiquen a la temperatura ambiente. Etiquetar en la base de la caja. • Dejar una placa a 35º C durante 24 horas para prueba de esterilidad, incubar en posición invertida.



4.5 MEDIO SELECTIVO ( Agar Papa y Dextrosa )

• Pesar cuidadosamente la cantidad que se indica en la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.

• Colocar el medio en un matraz de y adicionarle agua necesaria. • Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. • Tapar el matraz con tapón de algodón y papel Kraft. • Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121° C durante 15

minutos). • Al medio de cultivo preparado enfriarlo hasta una temperatura de aproximadamente 45ºC y agregarle 1.8

mL de ácido tartárico al 10% estéril por cada 100 mL de medio preparado y homogeneizar. • Vaciar el medio de cultivo antes que solidifique en placas de Petri estériles, dejar solidificar y etiquetar en la

base de las cajas. • Dejar una placa a 35ºC durante 3 a 5 días para prueba de esterilidad, incubar en posición invertida

4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).

• Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.

• Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria. • Calentar suavemente hasta disolución completa vaciar en tubos de ensaye de 13 x 100 mm 3 mL del medio. • Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121° C durante 15

minutos). • Colocar los tubos en una gradilla y dejar que estos solidifiquen a temperatura ambiente en posición vertical.

NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN (II) QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS, POR CONSIGUIENTE DEBERÁN MANTENERSE EN REFRIGERACIÓN Y BIEN ETIQUETADOS. SESIÓN II 4.7 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA Se utilizarán cajas con agar nutritivo ó EMB.

• Tomar el asa de platino ó acero y quemarla al rojo vivo en la flama del mechero para esterilizarla. • Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero. • Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo. • Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón. • Destapar la caja Petri con agar nutritivo o EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se

indica en el esquema 1 • Quemar el asa cada vez que se realiza una estría. • Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas. • Observar el crecimiento a las 24 horas y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo ya sea

agar nutritivo o EMB NOTA: Se recomienda practicar en papel con lápiz o pluma en su cuaderno.



Esquema 1. Aislamiento por estría cruzada 4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinados. (Un tubo por alumno de c/u de los medios)

• Tomar una asada de la bacteria previamente aislada y sembrar por estría en “S” la superficie del medio inclinado de agar nutritivo.

• Para hongos tomar el inóculo (micelio y esporas) con el asa micológica y sembrar por punto en la parte central.

• Quemar el asa una vez realizada la siembra. • Incubar los tubos sembrados a 37° C para bacterias y a 28° C para hongos, durante 24 y 48

horas respectivamente. • Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.

4.8 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales.

• Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste “agitándolo” en las paredes del tubo con caldo nutritivo y glucosa sales a fin de evitar la formación de grumos

• Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y sembrarlo en el matraz o en tubo según sea el caso con caldo nutritivo y glucosa sales, procurando tomar esporas y micelio para disgregarlo en el medio de cultivo.

• Quemar el asa una vez realizada la siembra. • Incubar los tubos con bacterias a 35° C, durante 24 horas y el matraz con hongos a 28° C durante 48 horas

en agitación (se sugiere 120 rpm). • Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características observadas. • Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz inoculado con un moho sin agitación.

4.9 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO Se emplearán tubos con medio SIM

• Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.



• Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio).

• Quemar el asa una vez realizada la siembra. • Incubar los tubos a 37° C durante 24 horas. • Observar los cultivos a las 24 horas y anotar las características del cultivo.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el aspecto final del medio y cual es su clasificación en base a su consistencia y composición. Medio de cultivo Condiciones de

esterilización Aspecto final del medio

Clasificación por su consistencia

Clasificación por su composición

Caldo Glucosa sales

Agar Glucosa sales Agar Nutritivo EMB PDA 5.2 ¿Qué precauciones deben tomarse en cuenta para la preparación de medios de cultivo? 5.3 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de petri? 5.4- Clasificar los siguientes medios de acuerdo a su composición, selectividad y complejidad. Mencionar que componentes les confieren la capacidad diferencial o selectiva y qué tipos de microorganismos crecen en ellos. a) Agar Nutritivo b) Agar Rosa de Bengala c) Agar Papa Dextrosa d) Agar Soya y Tripticaseína 5.5 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo? 5.6 ¿Cuál es la fuente de carbono de cada uno de los medios utilizados? 5.7 ¿Por qué es recomendable llenar los tubos con medio líquido y luego esterilizarlos. ¿Por qué en las cajas de Petri, primero se esteriliza el medio y posteriormente se transfiere a cajas de Petri estériles?



5.8 De los medios utilizados indica cuáles son específicos para hongos y cuáles para bacterias y ¿por qué? 5.9 ¿Los medios de cultivo tienen fecha de caducidad? ¿Qué pasa si la fecha esta vencida? 5.10 Cuando se siembran hongos filamentosos (mohos) en medio líquido, describa cómo es el crecimiento con y sin agitación. 5.11 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar? 5.12 Realiza un esquema indicando la forma correcta de sembrar a bacterias y mohos en medio sólido inclinado. 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS El análisis y la discusión se basarán en relación a: La clasificación de los medios según la Norma Oficial Mexicana. Las características de la morfología colonial ( macroscópica ) para cada especie microbiana según los medios utilizados. El crecimiento en placa con el crecimiento en agar inclinado La componentes de los medios de cultivo, fuente de Carbono, fuente de Nitrógeno, fuente de Azufre, etc. . 7.- CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la bibliografía consultada y al objetivo de la práctica. 8.- BIBLIOGRAFÍA Enlistar la bibliografía que utilizaste para el informe de esta práctica. 9.-BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA 8.1 Manual de medios de cultivo Bioxón 8.2 Norma Oficial Mexicana Nom-065-SSA1-1993, Bienes y Servicios.

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS- UPIBI.IPN


PRACTICA No 5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS UNIDAD IV : Ubicuidad y aislamiento de microorganismos TEMA: 4.2. Aislamiento 4.2.1 Por estría cruzada 4.2.2 Diluciones 4.2.3 Vaciado en placa 4.2.4 Extensión con varilla 1. OBJETIVO GENERAL: El alumno aplicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Aplicar las técnicas de aislamiento de microorganismos por estría cruzada, extensión con varilla, vaciado en placa, dilución en tubo. • Correlacionar las normas oficiales mexicanas con las técnicas de aislamiento. 2. INTRODUCCIÓN Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en una muestra. No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios de cultivo, es el caso de los organismos biotróficos (parásitos obligados), sólo se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (viroides, virus, rickettsias, hongos). Las técnicas de aislamiento más frecuente usadas son: Estría cruzada en placa: Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas sobre la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias separadas que generalmente corresponden a un *cultivo puro. En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y luego su posterior identificación (familia, género, especie). *Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula (clona). En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denominan cepas. Diluciones La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.



La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dilución primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo. Vaciado en placa: El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores. Después de inocular las diluciones de las muestras en las cajas Petri estériles y vacías, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que esta a una temperatura aproximada de 45°C, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta y en la interpretación. Si hay mas colonias que las indicadas, en la última dilución realizada, hacer más diluciones hasta que se tenga este rango del número de colonias. Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células. Extensión con varilla Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie de las placas de agar cuenta estándar o el agar que se vaya a utilizar. Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. Si el inóculo esta bien distribuido con la varilla de vidrio se podrán contar las colonias que hay crecido sobre la superficie del medio. 3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 3.1 MATERIAL POR EQUIPO 4 Cajas de Petri esteriles 3 Cajas de Petri con ACS 3 Cajas de Petri con EMB 3 Cajas de Petri con Agar Nutritivo



Matraz con 100 mL de Agar Cuenta Estandar 4 Tubos de 16 X 150 con 9 mL de solución salina al 0.85% Asa bacteriológica 1 Frasco con Benzal 1 Esponja Cilindro con pipetas de 1 mL estériles Balanza granataria 3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Muestra de queso, jugo natural, etc. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

• Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor ( figura 1) 4.1Diluciones A partir de muestras líquidas: a) Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.). b) Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. c) Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). d) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra si es muestra líquida y /o 1 g si es muestra sólida y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones asépticas). (Ver figura 1). e) Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

1g o 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10 –1 10-2 10-3 10-4 Figura 1

9 mL de diluyente sol. Salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1%



f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 4.2 técnica de vaciado en placa. a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas para la técnica de vaciado en placa. b) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en la base de la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. c) Se inocula 1 mL de las dos últimas diluciones según las diluciones que se hayan realizado en las cajas Petri, estériles, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado que es agar cuenta estándar, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; ([Fig. 2), cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

Figura 2

d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad. e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. g) Para mohos 27°C por 48 a 72 horas para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas. h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, se sigue lo siguiente: j) Entre 250 y 450 colonias contar la mitad de la caja k) Entre 451 y 750 colonias contar un cuarto de la caja l) Si es mayor de 750 colonias, contar 9 cuadros al azar, hacer un promedio y multiplicar por 65, cuando se utilizan cajas que en su base mide 91 mm de diámetro, si se usan cajas con diámetro diferente, obtener el área para saber el factor por multiplicar. 4.3 Técnica de extensión en placa a) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.



b) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. c) Se inocula 0.1 mL de las dos ultimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio de cultivo a utilizar. d) Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero. e) Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del medio de cultivo Agar nutritivo. (Fig. 3). f) Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. g) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. h) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. i) Para bacterias 37°C 24 a 48 horas. j) Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en placa.

Figura 3

0.1 mLVarilla en forma de L

4.4 Aislamiento por estría cruzada a) Este sistema de siembra en estría en placas de Petri con medios sólidos es el procedimiento habitual para aislar bacterias en cultivos puros. b) Se extiende el inóculo sobre una pequeña zona de la placa de Petri. c) Se esteriliza el asa para trazar dos estrías a partir del inóculo depositado. Una de ellas se hace sólo hasta el centro de la placa de Petri. d) Se vuelve a esterilizar el asa y se realizan una serie de estrías paralelas a las dos primeras. e) Luego de esterilizar el asa nuevamente, se hacen una serie de estrías perpendiculares a las dos primeras, pero comenzando desde el lado opuesto al depósito y sin llegar a tocarlo (ver figura 4). f) Cuando el medio no es selectivo y la carga microbiana es alta el asa se quema entre estría y estría. g) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y/o microorganismo de que se trate. h) Para mohos 27°C por 48 a 72 horas. i) Para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.



Figura 4

5. RESULTADOS 5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa: 5.1.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C 5.2 Informe de resultados de la técnica de Extensión en placa: 5.2.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estandar, incubadas: ______________horas a _______________°C. 6 CUESTIONARIO: 6.1 ¿En que casos aplicarías la técnica de estría cruzada? 6.2 ¿La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias? 6.3 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa? 6.4 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa? 6.5 Escribe 3 ventajas y 3 desventajas de la técnica de vaciado en placa y de la técnica de extensión en placa 6.6 ¿En que casos aplicarías utilizar diluciones? 6.7 De los medios utilizados clasifícalos de acuerdo a su uso y composición 7 . ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. 7.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de aislamiento. 7.2 Analizar los resultados obtenidos en cada una de las técnicas. 8. CONCLUSIONES 8.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración si se cumplieron los objetivos de la práctica y los resultados obtenidos. 9. BIBLIOGRAFÍA -NOM-092-SSA-1994 Bienes y Servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. -Mac Faddin, Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Edit. Medica Panamericana, 2002. -Koneman, Diagnóstico Microbiológico 3ra. Edición, Edit. Panamericana 2003

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS- UPIBI-IPN

Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P 41

PRÁCTICA No 6

CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS UNIDAD: III Nutrición y cultivo microbiano TEMA: 3.5 Métodos de conservación de microorganismos 3.6 Resiembra en arena, glicerol, congelación y liofilización 1.- Objetivo General El alumno aplicará algunos métodos para la conservación de microorganismos. 1.1 Objetivos específicos: Aplicar métodos de conservación para bacterias y hongos a corto plazo Comprobar la viabilidad de los microorganismos a los que se les aplicó algún método de conservación . 2.- INTRODUCCIÓN Los microorganismos que son seleccionados por producir algún metabolito importante industrialmente no deben de sufrir cambios metabólicos, por lo que es importante conservarlos, el método elegido debe ser el adecuado para que no varíen sus características genéticas. Existen varios métodos para la conservación de microorganismos donde la elección del método estará encaminada a retener las características de la cepa, estas técnicas se mencionan a continuación así como algunas diferencias entre ellas. (Cada uno de estos métodos presenta dos o más variaciones): Durante un programa de aislamiento y selección han demostrado tener y mantener las características requeridas por la industria, se deben someter a un estudio estricto acerca de los cambios que pueden sufrir cuando se someten a algún procedimiento de conservación; así pues, el método de conservación elegido juega un papel importante en la industria de fermentación.

Parámetros para observar el funcionamiento del microorganismo. Criterios generales para seleccionar el medio:

- Tiempo. - Tipo de microorganismo - Forma de reproducción del microorganismo Conservación a Corto plazo

Resiembra en serie en tubos inclinados y en medio líquido en refrigeración con una duración de 15 a 20 días de almacenamiento. Tapa de aceite mineral, tapa de cera, con una duración de 12 a 36 meses de almacenamiento.

a) Cultivos profundos en agar – extracto de suelo, este es un método adecuado para el mantenimiento de microorganismos anaerobios los cuales han sido aislados de suelo.

b) Mantenimiento de cultivos en tubos inclinados de agar y en medios líquidos. Este es un método de conservación muy empleado en cultivos que se emplean continuamente (cultivos de trabajo).



Por otro lado las resiembras sucesivas y continuas aunadas a los cambios que sufre el medio propiciarán cambios genéticos indeseables en los cultivos, lo cual se reflejará en los rendimientos de la cepa. Aunque este método es el mas usado y normalmente se aplica a hongos, bacterias, levaduras actinomyces y algas. c) Cultivos en tubos inclinados con agar adicionado de aceite mineral. A los cultivos preservados por el

método anterior, se les puede adicionar un aceite mineral como Amerol o Nugol, con esto se disminuyen las posibilidades de contaminación, de tal forma que los cultivos pueden mantenerse por más tiempo, aunque no se elimina el problema de los cambios genéticos que pueden sufrir la cepa. Los cultivos mantenidos en agar inclinado ya sea con o sin aceite mineral deben ser protegidos con capuchón métalico o de papel parafina.

Mantenimiento de cultivos por congelamiento. En muchas ocasiones es mas conveniente mantener un cultivo usando técnicas menos convencionales, de tal forma que una de las empleadas es por congelamiento del cultivo este método tiene el inconveniente de que la velocidad de muerte del microorganismo será mayor cuando menos baja sea la temperatura de mantenimiento, además también durante el proceso de congelamiento algunas células mueren. En la conservación de cultivos por este procedimiento, se requiere equipo capaz de mantener temperatura de enfriamiento bastantes bajas, esto puede lograrse con el uso de nitrógeno líquido. Congelación (a -20 ° C en glicerol) se mezcla con el microorganismo. Este tipo de conservación es utilizada en la práctica común, para trabajo continuo, mantiene un ritmo elevado de metabolismo, no es recomendable para trabajos largos ya que provoca mucho estrés al microorganismo, porque la reactivación es muy rápida. Conservación de microorganismos a mediano plazo Para este tipo de conservación se utiliza un soporte sólido para atenuar el metabolismo. Mantenimiento de cultivos en suelo estéril. Este es un método simple y muy empleado Principalmente para microorganismos que esporulen. Aunque el método originalmente uso suelo estéril, también se pueden usar otros soportes como: Arena estéril, papel filtro, esferas de plástico o perlas en vidrio.

Conservación de microorganismos a largo plazo

Mantenimiento de microorganismos por secado en frío (Liofilización).

• Liofilización coloca al microorganismo en un soporte leche descremada, carbonatos, lactosa, para darle

protección por los cambios del proceso. Este proceso puede durar de 15 a 20 años ó más de almacenamiento.

• Tierra fértil estéril: el microorganismo esta con sustrato, el microorganismo se coloca en un recipiente al vacío, esto es perfecto para el microorganismo que esporula.

• Criogenia: sumergir en gases líquidos como N2 liquido a 80 ° C, se requiere un equipo muy grande, instalaciones especiales, es muy utilizado para microorganismos que no esporulan.

• Otros gases O2, He - 220 ° C, Argón, se usa un soporte Ej. Polvo de cal. • Virus se conserva en tejido o se inserta a un hospedero) o en estado atenuado en cultivo de células

anímales, embriones de pollo.



En algunas ocasiones la industria fermentativa tiene frecuentes pérdidas por degeneración de las cepas de trabajo; las causas primordiales que cusan estas pérdidas de los cultivos que se mantienen bajo determinadas condiciones se mencionan a continuación:

a) Contaminación por otros microorganismos b) Contaminación por fagos c) Problemas de mutación y selección natural. d) Personal mal entrenado.

El objetivo fundamental de mantener la viabilidad en los microorganismos es: conservar todas las funciones metabólicas, reproducible y que transmitan todas sus características a sus descendientes, con replicaciones bajas, capaces de reproducirse. Para la reactivación del microorganismo se pueden utilizar solución salina, agua peptonada en general medio de cultivo líquido; esto para cuidar la osmolaridad. La reactivación también depende del medio que se utiliza par realizar la conservación, el H2O no se utiliza porque deben de ser soluciones con concentraciones osmóticas y el H2O no cumple pero para esporas si se puede utilizar. Cuidar que no haya mucho estrés y que se reactive en condiciones iguales a donde se conserva:

1. Medio de cultivo. 2. Temperatura 3. Componentes de nutrición.

Los pasos a seguir para la recuperación del microorganismo son: • Reactivar • Rehidratar • Inocular en medio del cultivo. • Vaciado en placa el más común. • Extensión con varilla. • Resuspender en líquido se retendrá una alícuota y sirve como fuente de propagación del microorganismo.

La comprobación de la viabilidad nos dará a reconocer tres aspectos fundamentales: a) El número de células sobrevivientes después del proceso de conservación. b) El posible grado de contaminación c) El grado de uniformidad en el crecimiento y esporulación del cultivo generado. Evaluación ∗ Siempre se utiliza un cultivo sumergido (medio líquido). ∗ Realizar cinética. ∗ Se realiza de una forma que se pueda comparar antes y después. ∗ En la industria se le deben de hacer todas las pruebas necesarias porque influirán en una nueva producción. La compañía que certifica es la World International Directories Culture Cultive

• Centros con Cepas certificadas: • Puebla • Biomédicas • ATCC tiene el monopolio de certificación de cepas (American Type Culture Collection) • NIA Instituto de Agricultura Norteamericana



• GSCC Alemana Standar Culture Cultive Los datos que debe de tener el microorganismo aislado son: I.-Nombre del microorganismo II.-Fuente de obtención (aislado en el laboratorio o proporcionado por alguna institución) III.-Nombre del Instituto y de la persona que proporcionó la cepa. IV.-Número de catálogo o de colección V.-Localización de la fuente de aislamiento VI.-Requerimientos especiales (Medio de mantenimiento, temperatura óptima de crecimiento, y de producción, pH óptimo, nutrientes específicos etc.) VII.-Productos principales y rendimientos aproximados. VIII.-Número de cultivos en existencia en el lote preservado IX.-En caso de cepas patentadas dar la referencia. Los datos que debe de tener el microorganismo que va a ser reactivado son:

• Distribución de tiempo, cada cuando se va ha realizar la reactivación. • Información sobre el microorganismo (características, ficha de identificación). • Forma de evaluación. • Hojas de registro (fecha, responsable, resultados, medios, lotes). • Seleccionar el método de conservación (considerando tiempo de conservación, tipo de microorganismo,

forma de reproducción). En el laboratorio se trabaja con dos cultivos del mismo microorganismo a los cuales se les, llama “Cultivos Stock”, a éstos se les divide en “Cultivos Stock Primario” y “Cultivos Stock de Trabajo”, los primeros se usan como cultivos de referencia y de reserva, los cultivos de trabajo son usados para la preparación del inóculo que se usará en el proceso de fermentación. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1. MATERIAL • Mechero Fisher • 6 tubos de ensaye de 16 X 150 mm • 2 tubos de 16x 150 mm con 9 mL de solución salina fisiológica (0.85%) • 1 gradilla metálica • 1 Pipetero con pipetas estériles de 1 mL • 1 puente de coloración • 4 pipetas de 1 mL • 1 caja de Petri con varilla en forma de “ V ”, con un porta y un cubreobjetos • 1 asa micológica y bacteriológica • 1 bisturí • Algodón • Gasa



• Papel Kraft • Colorantes para la tinción de Gram • Azul de metileno 3.2. EQUIPO • 1 autoclave • 1 incubadora 28° C • 1 incubadora 35 ± 2 ° C • 1 microscopio • 1 horno a 170°C • 1 balanza digital 3.3 MEDIOS DE CULTIVO • Agar Soya tripticaseína. • Agar Papa y Dextrosa. • Caldo Nutritivo. 3.4 REACTIVOS • Aceite mineral • Arena estéril • Solución salina fisiológica 3.5 Cepas de bacterias, mohos y levaduras a conservar Serán los obtenidos de la práctica de aislamiento de microorganismos y en la práctica de aislamiento de mohos y levaduras. 4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 MANTENIMIENTO DE MICROORGANISMOS 4.1.1 Realizar un examen microscópico de los microorganismos que se quieren conservar. 4.1.2 Previamente se deberá realizar una tinción de Gram para bacterias y una preparación en fresco para mohos y tinción simple para levaduras. 4.1.3 Si el cultivo es puro, se deben preparar tubos con medio para conservarlo. 4.1.4 Preparar tubos inclinados con 5 mL de medio agar soya tripticaseína, para bacterias y actinomicetos, agar papa dextrosa para mohos y levaduras, también se pueden usar los medios de cultivo en los que se haya aislado o bien el que recomiende la bibliografía que se haya consultado. 4.1.5 Rotular los cultivos con los siguientes datos:

• Nombre del microorganismo



• Lugar y fuente de donde se aisló (aislado en el laboratorio o proporcionado por alguna institución) • Requerimientos especiales (Medio de mantenimiento, temperatura óptima de crecimiento, y de producción,

pH óptimo, nutrientes específicos etc.) • Nombre del metabolito (si lo produce).

4.2 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN TUBOS CON AGAR INCLINADO. 4.2.1 Por este método se recomienda sembrar bacterias, levaduras y mohos 4.2.2 Se siembra por triplicado cada uno de los microorganismos que se van a conservar. 4.2.3 Incubar los tubos a 35 ± 2°C durante 24 horas si se trata de bacterias y levaduras y a 28°C durante 48 horas si se trata de mohos durante cinco días. 4.2.4 Se verifica el crecimiento adecuado y se conservan los tubos en refrigeración a una temperatura aproximada de 4°C 4.3 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN TUBOS CON AGAR INCLINADO Y ACEITE MINERAL. 4.3.1 Por este método se recomienda que se conserven bacterias y levaduras. 4.3.2 Se colocan 100 mL de aceite mineral en un matraz Erlenmeyer y se esteriliza por calor seco a 170°C durante una hora. 4.3.3. Al tubo inclinado que se sembró en el punto 4.2 se le adiciona el aceite mineral hasta que cubra el agar, sellar con papel parafilm y guardar el tubo en el cuarto frió a una temperatura aproximada a 4ºC (figura 1).

TAPON DE ALGODON TAPON METALICO

ACEITE MINERAL MEDIO DE CULTIVO SOLIDO



FIGURA 1. 4.4 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN ARENA ESTÉRIL. 4.4.1 Este método se recomienda para conservar mohos y microorganismos esporulados. 4.4.2 Se esterilizan 3 tubos de ensaye con tapón de rosca que contienen arena y se esterilizan por calor seco 170°C durante 1 hora. 4.4.3 El tubo que tiene el moho que se va a conservar se le adicionan 5 mL de solución salina estéril, se homogeniza hasta que se vea una suspensión y se adiciona lentamente al tubo que contiene el suelo de tal manera que la arena solo se humedezca. 4.4.4 Se sella el tubo con papel parafilm y se conserva en refrigeración. * Nota: Para evaluar la viabilidad del cultivo conservado se realiza lo siguiente

∗ Se siembran los microorganismos en caldo nutritivo incubando 24 horas para bacterias y levaduras a 37ºC y para mohos 48 horas a 28ºC

∗ Realizar cinética. ∗ Sembrar pruebas bioquímicas para verificar que no hay variación en el metabolismo de los

microorganismos. ∗ Se realiza de una forma que se pueda comparar los resultados antes y después de la conservación. ∗ En la industria se le deben de hacer todas las pruebas necesarias porque influirán en una nueva producción.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

1. ¿Qué les pasa a los tubos con agar inclinado si se mantienen en refrigeración por más de 6 meses? 2. ¿Menciona otros métodos de conservación de microorganismos? 3. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de suelo estéril? 4. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de tubos inclinados? 5. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método con aceite mineral? 6. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de congelación? 7. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de liofilización? 8. ¿Tendrán variación genética transferencias masivas? 9. ¿A que se le llama cultivo patrón? 10. ¿A que se le llama cultivo probado? 11. ¿Se considera la edad fisiológica del microorganismo para conservarlo? 12. ¿En que fase del crecimiento se siembra un microorganismo?

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir con los resultados obtenidos y con los objetivos propuesto. 7.- CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 8.- BIBLIOGRAFÍA Enumerar la bibliografía consultada para la elaboración del reporte de la práctica 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.



-Koneman, E.W. & Morrison; Micología, diagnóstico de laboratorio; Ed. Médico Panamericana: 1991. -Tortora J. Gerard; Introducción a la microbiología; Ed. Acribia; 1993.



PRACTICA No.7

CRECIMIENTO MICROBIANO

UNIDAD V: Crecimiento Microbiano TEMA: 5.1 Crecimiento microbiano 5.2 Técnicas para cuantificar el crecimiento microbiano 1.3 Curva de crecimiento 1. OBJETIVO GENERAL El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular. 1.2 Objetivos Específicos

• Realizar un cultivo sumergido con agitación (fermentación) a nivel matraz de Escherichia coli por 24 horas. • Cuantificar el número de microorganismos viables como unidades formadoras de colonias (UFC), a través

de la técnica por vaciado en placa • Estimar el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría y comparación con el nefelómetro de

McFarland. • Cuantificar el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de conteo en cámara de

Neubauer. 2. INTRODUCCIÓN Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones de miles de millones. Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente. El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido. Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. Los métodos recomendados para medir la población son: • Recuento en placa • Diluciones seriadas.



• Siembra por vaciado en placa. • Siembra por extensión con varilla. • Filtración. • Método del número más probable. • Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer). Hay otros 3 métodos llamados indirectos. • Turbidimetría. • Actividad metabólica. • Peso seco. Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de conteo celular, por ejemplo la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de conteo celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.

Existen numerosos modelos de cámaras de para contar células, adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio. Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares. Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empiezan a crecer y/o a producir algunos metabolitos. Fase del crecimiento En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente. Parámetros de la curva de crecimiento Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.



La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = Xmax

- X0

La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega µ en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X

0 y X

t en los tiempos t

0 y t, en la fase de crecimiento exponencial según

µ = ln Xt – ln X0 t – t

0

El tiempo de duplicación es td = ln 2 / µ

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido. Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1.- MATERIAL Por corrimiento (una sección del laboratorio): • 1matraz nefelométrico con 50 mL de caldo nutritivo estéril (matraz semilla) • 11 Matraces de 125mL con 25 mL de caldo nutritivo estéril (matraces de crecimiento) • 1 matraz de 1 L con 600 mL de agar cuenta estándar (para el vaciado en placa) • 1 juego de nefelómetro de Mac Farland • 2 celdas y un portaceldas • 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 mL de solución salina (para las diluciones)

• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles • 40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa) 3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO • NaCI ó peptona • Caldo nutritivo • Agar cuenta estándar



3.3.- EQUIPO • Espectrofotómetro • Autoclave • Horno • Incubadora a 37° C • Contador de colonias • Cámaras de Neubauer 3.4.- CEPAS: Cepa de Escherichia coli Cepa de Saccharomyces cerevisiae 4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA 4.1.1 Inocular en condiciones de esterilidad un matraz nefelométrico conteniendo 50 mL de caldo nutritivo estéril con 2.5 mL de una suspensión de Escherichia coli ó Saccharomyces cerevisiae ajustado al tubo 3 del nefelómetro de Mac Farland (aproximadamente 3x106 de células de E. coli). 4.1.2 Incubar a 35° C por 24 horas en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla. NOTAS A.- El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez en el espectrofotómetro. B.- De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de nuestro matraz semilla. C.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo nutritivo del matraz de cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle papel parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura). 4.2 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA 4.2.1 Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar una muestra de 2.5 mL de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo nutritivo para la cinética (de 250 mL) y homogeneizarlos. 4.2.2 Con una pipeta de 5 ml tomar inmediatamente la primera muestra de 4 mL en condiciones estériles, esta será la muestra de tiempo cero (t

0), 3 mL se ocupan para la técnica de turbidimetría, 1 mL para hacer las diluciones, y un

par de gotas para llenar la cámara de Neubauer. Después coloca el matraz en agitación aproximadamente a 120 rpm. 4.2.3. Cada hora, o según los tiempos establecidos, en condiciones de esterilidad se toma una muestra de 4 mL para determinar el crecimiento por los tres métodos señalados. Recuerda que inmediatamente después de tomar la muestra debes regresar el matraz a la agitadora. 4.3 DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO POR TURBIDIMETRIA 4.3.1 Prender el espectrofotómetro con el paso de luz bloqueado y ajustar a 100% de transmitancia y cero de absorbancia con la celda que contiene el caldo nutritivo (blanco) a una longitud de onda de 540 nanómetros (seguir indicaciones y recomendaciones de uso de los profesores). 4.3.2 Tomar 3 mL de muestra de cada una de los matraces desde el tiempo cero hasta el tiempo final en condiciones de esterilidad y colocarla en la celda espectrofotométrica. Tapar la celda con papel parafilm, y leer en el espectrofotómetro para registrar la absorbancia; esta lectura corresponde a la turbidimetría adquirida por aparición de células a lo largo de la cinética. 4.3.3 Después de obtener la lectura desecha el contenido en benzal, y enjuaga la celda con benzal, para posteriormente enjuagarlo con agua, junto al espectro tenemos los frascos de desecho.



4.4 CONTEO DIRECTO CON CÁMARA DE NEUBAUER 4.4.1 Coloca sobre la cámara de Neubauer el cubreobjetos, cubriendo las dos cámaras de conteo. 4.4.2 Con una pipeta coloca la muestra del cultivo, tomada en condiciones de esterilidad, entre la cámara y el portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, realízalo en ambas cámaras. La cámara de Neubauer es una cámara de conteo adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

4.4.3 Enfocar con objetivo seco fuerte (nunca uses el objetivo de inmersión) y contabilizar las células que se observan en toda la cuadrícula central (marcada con la letra M), la cual a su vez se encuentra subdividida en 25 cuadros, cada uno dividido en 16 cuadros. Si el número de células es muy grande, selecciona al menos cinco de los 25 cuadros y cuenta las células, y obtén un promedio. Este promedio multiplícalo por 25 que es el número total de cuadros. 4.4.4 Calcular el número de células totales por mililitro de cultivo, siguiendo la siguiente fórmula. Concentración en la suspensión (células/ mL) = # de células contadas X 10,000 4.4.5 Retira el cubreobjetos con una torunda de algodón impregnada con alcohol y con una pinza que contenga



también una torunda impregnada con alcohol, limpia la cámara con mucho cuidado procurando no frotar demasiado para evitar rayar la cámara y la torunda utilizada colócala en un frasco que contenga benzal. 4.5 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA 4.5.1 La muestra se toma en condiciones de esterilidad, toma un mililitro del matraz cinética y colocalo en un tubo que contenga 9 mL de solución salina, para realizar la dilución 10-1. Mezcla el tubo y toma un mililitro y colócalo en otro tubo con 9 mL de solución salina para obtener la dilución 10-2. 4.5.2 El número de diluciones que realices dependerá del crecimiento que encuentres por turbidimetría o en el conteo directo anterior, si el conteo es del orden de 1x106, entonces realiza hasta las diluciones 10-6 y 10-7. Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de conteo.

4.6 DETERMINACIÓN DE CUENTA VIABLE POR VACIADO EN PLACA 4.6.1 De las ultimas 2 diluciones realizadas tomar 1 mL y colocarlo en una caja Petri estéril previamente etiquetada, (técnica, dilución, equipo y tiempo) 4.6.2 Adicionar aproximadamente 15 mL de agar cuenta estándar a una temperatura de 45° C, recordar las recomendaciones de la técnica de vaciado en placa. 4.6.3 Homogeneizar por rotación en la superficie de la mesa y dejar enfriar hasta que solidifique el agar e incubar a 37° C durante 24 horas. 4.6.4 Contar las colonias de cada placa, considerando únicamente las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. 4.6.5 Calcula el número de bacterias viables por mL de cultivo, multiplicando por el inverso de la dilución.



5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Turbidimetría: anota los resultados obtenidos de lecturas de absorbancia en los tiempos correspondientes.

MUESTRA TIEMPO (min) ABSORBANCIA (nm) T

0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10

T11

5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de colonias que se desarrollaron en las cajas petri con agar cuenta estándar. Microorganismo:

MUESTRA TIEMPO (min) DILUCIÓN No. de UFC/mL T

0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10



5.3 Cuenta directa por cámara de Neubauer:

MUESTRA TIEMPO (min) No de células/mL T

0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10

5.3.1 Anota el número de células totales que se contabilizaron en cada uno de los tiempos de la cinética. 5.3.2 ¿Cuál es el fundamento del número total de células? 5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas? 5.4. Con los resultados obtenidos del método de cuenta viable determina el número de unidades formadoras de colonias en los 25 mL del medio de cultivo. 5.5. Menciona el fundamento de la técnica de cuenta viable. 5.6. Construye una gráfica del número de UFC/mL vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de crecimiento. 5.7. Construye una gráfica del número de UFC/mL vs Tiempo (horas). 5.8. Construye una gráfica del log del número de UFC/mL vs Abosrbancia. 5.9. Determina la velocidad específica de crecimiento máxima. 5.10. Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada. 5.11. Define el término crecimiento microbiano 5.12. Define el término Velocidad Específica de Crecimiento 5.13. Menciona los factores de que depende la fase de muerte 5.14. Explica fisiológicamente qué sucede en la fase lag. 5.15. ¿Por qué es importante la cinética microbiana? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados. 6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los resultados obtenidos en esta práctica. 6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de trubidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué podrá servir. 7. CONCLUSIONES



Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRAFÍA Enlistar la bibliografía consultada para el reporte de esta practica. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS. 9.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág. 9.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pág. 9.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice Hall, España. 956 pág. 9.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs. 9.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de células :cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de 2003. http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/imagenes_de_neubauer.htm



PRÁCTICA No. 8

PRODUCCIÓN DE UN METABOLITO (Ácidos orgánicos) UNIDAD V: Crecimiento microbiano TEMA: Producción de ácido láctico 1. OBJETIVOS GENERAL El alumno realizará la producción de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano I.2 Objetivos específicos Determinar cuantitativamente el metabolito producido. Establecer la correlación entre el crecimiento microbiano y la producción de un metabolito primario. 2. INTRODUCCIÓN Por biotecnología se entiende “Toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos”, según la definición de la ONU. Desde los inicios de la civilización, la humanidad ha hecho uso de los microorganismos para obtener productos específicos como pan, cerveza, vino, yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnología tradicional o de primera generación. En la década de los 40´s, se emplearon las herramientas de la bioquímica y la microbiología en el uso y manipulación de organismos para la obtención de metabolitos (aminoácidos, antibióticos, enzimas), como biotecnología de segunda generación. Actualmente, la biotecnología de tercera generación hace uso de las herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética para la producción de compuestos, enzimas, vacunas, anticuerpos, etc. Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el ácido láctico, obtenido generalmente a partir de bacterias lácticas homofermentativas. Fue el primer ácido orgánico producido mediante fermentación microbiana industrial en 1880. Se emplea en medicina para estabilización hemodinámica, en cosmética como queratinolítico, para curtir pieles en peletería, y como acaricida en el ganado. El ácido láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria alimentaria como aditivo y conservante en productos cárnicos y lácteos, en industria derivada de cereales y en numerosas industrias de bebidas. De hecho el yogurt se produce por la fermentación de la lactosa de la leche hasta ácido láctico, cuya acidez genera la precipitación de la caseína, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen otros alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido láctico, tales como la leche búlgara, el yakult, el jocoque, etc. En la producción de saeukrut (col fermentada), la primera fase del proceso incluye la fermentación láctica. La producción sólo del ácido es de 20,000 toneladas anuales. El ácido láctico se produce a través de la degradación de lactosa ó glucosa por la ruta de Embden –Meyerhoff –Parnas o glicólisis, hasta producir piruvato, el cuál es reducido por la Lacato deshidrogenada (LDH) a L – (+) Lactato. El lactato es un ácido carboxílico, y la acidez que genera, la cuál llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los microorganismos, lo que da fin al proceso fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la contaminación por otros microorganismos Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la producción de lactato (sal sódica del ácido láctico, y que es la forma como se comercializa) son principalmente las del grupo I de lactobacilos (homofermentativos), como son Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos microorganismos son anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentación se puede llevar a cabo en condiciones parcialmente anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos son heterofermentativos (grupo III), y además de producir lactato, producen acético, etanol u otros productos, por lo que no son útiles para la producción. L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y lactis si pueden fermentar la lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentación, y el resto por síntesis química.



Los fabricantes ponen especial interés en la selección de las condiciones adecuadas de cultivo para lograr altas tazas de producción del ácido. En la producción se puede emplear glucosa o lactosa como fuentes de carbono, pero se prefiere la glucosa por el precio. Además de la glucosa y de la fuente de nitrógeno, generalmente fosfato de amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras, o adicionar una fuente rica en ellas, como el extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3 para mantener el pH alto y evitar que la fermentación se detenga. La fermentación típica dura 72 horas y debe mantenerse una temperatura entre 30 -35° C. En los últimos tiempos, se han desarrollado procesos para la obtención a partir del suero lácteo desproteineizado que es un subproducto de queserías, con lo cuál se disminuyen costos, además de evitar contaminación por su desecho. Este suero contiene un 5% aprox. de lactosa que funciona como fuente de carbono. También se emplea la melaza del azúcar, dando un uso alternativo de la caña de azúcar. Un proceso típico de fermentación “batch”, consiste en la preparación del inóculo, la inoculación del fermentador semilla, la fermentación en el tanque de producción y la etapa de purificación del metabolito. El estudio cinético de un proceso fermentativo para la obtención de un metabolito consiste en la determinación y análisis de los componentes del sistema que nos permitan establecer las mejores condiciones de producción y tener control sobre ellas, como son: determinación del crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o de la fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P). La determinación de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso húmedo, ó por cuenta directa. La determinación del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza de éste, y y existen varias técnicas espectrofotométricas para ello. La técnica elegida para la determinación del metabolito producido, también depende de la naturaleza de este. Dado que el ácido es un metabolito asociado al crecimiento, la medición de la biomasa producida, puede ser indicativa de la producción de láctico en un cultivo “batch”. En este caso la determinación de la acidez del medio nos permitirá determinar su producción. 3. MATERIAL Y REACTIVOS

3.1 EQUIPO Y MATERIAL • Estufa de incubación a 40 ºC • Microscopio óptico • Balanza analítica • Refrigerador con congelador • Mechero Bunsen. • Matraces Erlenmeyer de 125 mL. • Matraces Erlenmeyer de 250 mL. • Pipetas serológicas graduadas de 1, 5 y 10 mL estériles. • Tiras de papel pH • Cámara de Newbauer • Equipo Swinex de filtración. • Membranas Millipore de 0.45 µm de poro y 25mm de diámetro • Jeringa de 5 mL. • Pinzas de disección • Tubos de ensaye de 13 X 100 mm • Vaso de precipitados de 30 mL • Bureta graduada

3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO • Cepa: Lactobacillus delbrueckii sub. lactis en tubos inclinados de medio MRS • Medios de cultivo:

Medio Suero



Extracto de levadura 2.0 g Peptona tripticaseína 1.0 g. Suero de leche desproteinizado cbp 100.0 mL Ajustar pH a 6.0 con NH4OH. Esterilizar a 121ºC / 15 minutos

Medio Glucosa

Glucosa 9.0 g Extracto de levadura 2.0 g Fosfato de amonio 1.5 g Agua cbp 100.0 mL Ajustar pH a 6.0 con NH4OH. Esterilizar a 121ºC / 15 minutos

• Solución salina isotónica estéril • Colorantes para tinción de Gram • NaOH 0.1 N • Solución de fenolftaleína

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

PRIMERA SESIÓN A PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y MATRAZ SEMILLA. 4.1 Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 mL de solución

salina isotónica. 4.2 Homogeneizar perfectamente para formar la suspensión celular. 4.3 Inocular un matraz conteniendo 25 mL de medio de cultivo con 2.0 mL de la suspensión celular (el

profesor indicará cuál le toca a cada equipo). A fin de verificar la pureza de éste matraz semilla, se realizará una tinción de Gram (ver apartado C) y se revisará en el microscopio, antes de inocular el matraz de producción.

4.4 Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitación.

SEGUNDA, TERCERA y CUARTA SESIÓN: (algunas de estas sesiones son extraclase).

B CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ACIDO LÁCTICO. 4.5 Inocular el matraz de producción conteniendo 150 mL del mismo medio de cultivo que se haya asignado,

con 15 mL provenientes del matraz semilla incubado durante 48 horas (verificar que tenga crecimiento abundante).

4.6 Tomar en condiciones asépticas e inmediatamente después de inocularlo, una alícuota de 3 mL de cada matraz (tiempo 0) y filtrarlo mediante swinex colocar el filtrado en un tubo de ensaye de 13 x 100 mm.

4.7 Determinar el pH de este filtrado con tira reactiva. 4.8 También realizar el conteo de células en cámara de Neubauer, como se indica en el apartado D. 4.9 Llevar el matraz a incubar a una temperatura de 40º C, sin agitación. 4.10 Posteriormente a las 24, 48 y 72 horas de incubación se tomará del matraz y en condiciones asépticas,

otras alícuotas de 3 mL y se tratarán como marcan los puntos 4.7, 4.8 y 4.9. Todos los tubos se rotularán debidamente con el tiempo a que correspondan y se guardarán a 4ºC para su procesamiento posterior para la determinación de: Número de células, como se indica mas adelante en el apartado D.

4.11 Para Monitorear la Pureza del Cultivo se realizarán observaciones al microscopio de preparaciones teñidas con Gram al inicio y al final de la fermentación, como marca el apartado C.



C MONITOREO DE LA PUREZA DE LA CEPA 4.12 Tomar una gota de la alícuota inmediatamente después de tomarla (dejar caer la gota con la misma pipeta

con la que se tomó) y colocarla en un portaobjetos. 4.13 Dejar secar la muestra y fijala con calor, pasando varias veces el portaobjetos por el mechero, hasta calor

que resista el dorso de la mano. 4.14 Gotear colorante de cristal violeta y dejar actuar 1 minuto, se enjuaga con agua, se gotea lugol, se deja 30

segundos y se enjuaga, se gotea alcohol-acetona 15 segundos y se enjuaga y al final se gotea colorante de safranina 1 minuto y se enjuaga.

4.15 Observar al microscopio (Inmersión). Lactobacillus es un bacilo largo Gram + .

D DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR. 4.16 Tomar una gota de la alícuota inmediatamente después de tomarla (dejar caer la gota con la misma pipeta

con la que se tomó) y colocarla en la Cámara de Neubauer. 4.17 Colocar la cámara en el microscopio y enfocar a 10X, eligiendo el campo de la cuadricula. 4.18 Cambiar a 40X y realizar el conteo de bacterias en cinco cuadrantes. Registrarlas para el cálculo posterior

del número de células.

E. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE ACIDEZ. 4.19 Tal como se mencionó en el paso 4.7, se determinó el pH del medio a cada tiempo. Esto será indicativo de

la producción de ácido láctico. Para verificar la producción total se realizará una titulación con NaOH 0.1 N al final de la fermentación, es decir a las 72 horas.

4.20 Para ello, después de las 72 horas se filtrarán a través de Millipore15 mL del medio y se colocarán en un vaso de precipitados de 30 mL.

4.21 Se adicionarán 5 gotas de fenolftaleína y se mezclará bien. 4.22 Titular con NaOH 0.1 N gota a gota hasta el vire estable del indicador. 4.23 Registrar el volumen de álcali gastado, para calcular los moles de ácido orgánico láctico. 5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS. 5.1 Anotar en la tabla 5.1 los resultados de sus observaciones al microscopio para verificar la pureza de la cepa

empleada: Tabla 5.1

Tiempo (horas) Forma Gram Matraz semilla

48 72

5.2 Anotar en la tabla 5.2 sus resultados de número de células producidas (que es un indicativo de la biomasa

producida). Los resultados obtenidos serán utilizados para elaborar la gráfica de la cinética de producción de lactato.

Tabla 5.2. Determinación de biomasa producida

Tiempo No. de células por cuadrante Promedio de 5 cuadrantes Total de 25

cuadrantes. 0

24

48



72

5.3 Anotar en la tabla 5.3 los resultados del valor de pH determinado con tira reactiva, a los diferentes tiempos.

Tabla 5.3 Tiempo (horas)

Valor de pH

0 24

48

72

5.4 Ahora anotar el gasto en mL de NaOH con la muestra de tiempo 72 horas, y con ello calcular los moles de ácido

láctico producido. Para ello primero se calculan los moles de sosa consumidos en la titulación, con la siguiente fórmula:

Moles de NaOH = mL de NaOH gastados x 0.1 moles / 1000 mL*

* la solución de sosa es 0.1N, lo que equivale a 0.1 moles / L Después se calculan los moles de lactatos presentes en la muestra:

Moles de lactato = moles de NaOH_ x 1000 mL 15 mL

5.5 ¿Cuántos moles de lactato se produjo en el matraz que se corrió? Comparar la cantidad de lactato producido en

los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cuál es más conveniente para la producción de lactato. 5.6 Con los resultados anteriores de pH, y número de células, elaborar una gráfica, de tiempo contra crecimiento y

pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una gráfica donde se muestre como se comporta el cultivo con respecto al pH. Recuerda que es una so0la gráfica para pH y número de células.

5.7 Escribir la vía metabólica utilizada en la fermentación para la producción de ácido láctico. 5.8 Explicar porque se eligió esta cepa para la producción de lactato. 5.9 Mencionar dos usos del ácido láctico. 5.10 Elaborar el diagrama de flujo (en bloques) de la producción de lactato. 5.11 DISCUTIR LOS RESULTADOS OBTENIDOS en función del medio empleado y la cantidad de lactato producido

en cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios. 6. BIBLIOGRAFIA 6.1 Crueger,D y Crueger, A. Biotecnología: Un texto de microbiología industrial. 2da. Edición. Ed. Omega.

Barcelona. 1994. 6.2 Jakymec, M.; Moran, H.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. 2001. “Cinética de la producción de

ácido láctico por fermentación sumergida con lactosuero como sustrato”. Rev. Cient., FCV-LUZ. XI(1): 53-59.

6.3 Rodríguez Pascual, L. y Martínez Zúñiga R.1999. Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica Microbiana. UPIBI-IPN. México.



6.4 Río de Janeiro. Convenio de Diversidad Biológica. Secretariat of the Convention on Biological Diversity. UNEP. 1992. Disponible en WEB como [ref. marzo de 2007] http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml

Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN

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PRÁCTICA No. 9 CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

UNIDAD V: Crecimiento microbiano TEMA: 5.2.3 Método del Número Más Probable (NMP) 1.-OBJETIVOS GENERAL

• El alumno utilizará la técnica del Número Más Probable.para cuantificar bacterias coliformes •

1.1 Objetivos específicos: • Aplicar la Técnica del Número Más Probable para cuantificar organismos coliformes totales en muestras

de agua y alimentos. • Aplicar la Técnica de Número Más Probable para cuantificar de organismos coliformes fecales en

muestras de agua y alimentos. 2.- INTRODUCCIÓN Esta técnica está basada en la estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en una muestra. Se basa en la presunción de que las bacterias se hallan normalmente distribuidas en un medio líquido, esto es, en las muestras repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, debe esperarse contengan el mismo número de microorganismos como promedio; naturalmente, algunas de las muestras pueden contener algunos gérmenes mas o menos. La cifra media es el número más probable (Numero Más Probable o MPN). La Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México, establece el método microbiológico para estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP). Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaría. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mínimo de una bacteria en 10 mL de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido. Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. La técnica NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos en placa y se considera en general, que posee una menor exactitud y precisión; es sin embargo, incomparablemente más sensible ya que estima la presencia de unos cuantos microorganismos o uno solo, en un gran volumen de muestra (teóricamente litros). Por esta razón encuentra aplicación en el análisis de agua, por ejemplo, en donde la presencia de 2 organismos coliformes en 100 mL, ya reclama atención especial en un sistema de abastecimiento. Para este propósito deberá usarse también un recuento por vaciado en placa. Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el ensayo se extiende a dos o más estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos positivos pueden ser el resultado de la actividad del microorganismos en cuestión, o también de otros con comportamiento similar e incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a ser la prueba presuntiva en la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de la muestra en tubos de fermentación


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con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan fácilmente fermentando la lactosa y liberando anhídrido carbónico que en gran cantidad se acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que metaboliza estos ácidos generando el gas aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram positivas también pueden, aunque en menor grado producir gas a partir de la lactosa. se hace por ello indispensable efectuar un segundo ensayo, llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos positivos serán inhibidos por la presencia de sustancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de confirmación. Otras pruebas para determinar la presencia de bacterias coliformes: Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.

Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en características pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen cuatro géneros que son: E. coli, Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y MUESTRAS 3.1 MEDIOS DE CULTIVO 3 Tubos con 9 mL de Agua peptonada al 0.1 %. 9 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham. 9 tubos con 10 mL de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham. 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado de doble concentración con campana Durham 2 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham 7 tubos con 10 mL de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham. 9 tubos con 10 mL de Caldo EC con campana de Durham. 9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% con campana de Durham. 3.2 MATERIAL 1 pipetero metálico 4 pipetas de 2 mL 4 pipetas de 10 mL 3.3 REACTIVOS Benzal 3.4 EQUIPO 1 autoclave. 1 balanza granataria. 1 incubadora a 35°C. 1 horno a 180°C.


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4.- PROCEDIMIENTO 4.1 Organismos coliformes totales en alimentos (queso, embutido, crema) Pesar cuidadosamente 10 g de la muestra y licuarla en condiciones asépticas durante 5 minutos, con ayuda de 90 mL de agua peptonada al 0.1% estéril (dilución 10 -1). Transferir 1 ml de la dilución 10-1 a otro tubo que contenga 9 mL de agua peptonada al 0.1% estéril (dilución 10-2) Prueba presuntiva

• Inocular 1 mL de la dilución 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo lactosado concentración sencilla (0.1 g)

• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 0.1 ml de la dilución 10-1. (0.01g)

• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 0.1 ml de la dilución 10-2 (0.001g)

• Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas. • Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las

48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa. No olvidar que cada vez que se quita el tapón, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe de emplear una pipeta estéril. Prueba confirmativa

• Ordenar los tubos de acuerdo a la dilución. • Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva. • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo lactosa bilis verde brillante. • Incubar a 35°C durante 48 horas. • Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad. • Determinar el número de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente

tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. • Informar: Número más probable de coliformes por gramo de muestra NMP. • Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le

corresponda.


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DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES POR LA TÉCNICA DEL NMP ENALIMENTOS Muestra: Agregar 1 mL ó 1 g de muestra Prueba presuntiva Prueba confirmatoria ↓ ↓

9mL*10 –1 1 mL c/u 10mL 1 mL Caldo lactosado Caldo bilis verde brillante

9mL*10 –2 1 mL c/u 10mL 1 mL Caldo lactosado Caldo bilis verde brillante

9mL*10 –3 1 mL c/u 10mL Caldo lactosado Caldo bilis verde brillante Incubar a 35°C, 24-48 horas Incubar a 35°C, 24-48 horas Solución diluyente: *Agua peptonada al 0.1%


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4.2 Organismos coliformes totales en agua y helado (Agua de la red municipal, agua embotellada, hielo, helados procesados, pulque) En el caso del hielo y del helado dejar fundir completamente la muestra, homogenizarla Si se realizan simultáneamente las determinaciones de organismos coliformes totales y fecales, traer una muestra de 200 mL. Prueba presuntiva

• Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lactosado doble concentración

• Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 1 ml de la muestra directa

• Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa. • Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas. • Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las


• Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva. • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante. • Incubar a 35°C durante 48 horas. • Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad. • Determinar el número de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente

tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. • Informar: Número más probable de organismos coliformes totales por 100 mL de muestra NMP • Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le

corresponda.


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ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES PARA AGUA POTABLE, AGUA EMBOTELLADA Y HIELO Muestra: Se deben de traer 100 mL de muestra Prueba presuntiva Prueba confirmatoria ↓ ↓

10 mL c/tubo 100 mL de muestra 20 mL de Caldo Lactosado 10 mL de Caldo bilis de doble concentración verde brillante 1 mL

0.1 mL 10 mL de Caldo Lactosado 10 mL de Caldo bilis de concentración sencilla verde brillante

10 mL de Caldo Lactosado 10 mL de Caldo bilis de concentración sencilla verde brillante Incubar a 35°C, 24-48 horas Incubar a 35°C, 24-48 horas


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4.3 Organismos coliformes fecales en alimentos (queso, embutido, crema) Pesar cuidadosamente 10 g de la muestra y licuarla en condiciones asépticas durante 5 minutos, con ayuda de 90 mL de agua peptonada al 0.1% estéril (dilución 10 -1). Transferir 1 ml de la dilución 10-1 a otro tubo que contenga 9 mL de agua peptonada al 0.1% estéril (dilución 10-2) Prueba presuntiva

• Inocular 1 mL de la dilución 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo Lauril triptosa sulfat (CLTS) (0.1 g)

• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilución 10-1. (0.01g) • Inocular otra serie de tres tubos con caldo llauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilución 10-2 (0.001g) • Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas. • Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las


• Ordenar los tubos de acuerdo a la dilución. • Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba

presuntiva. • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo EC. • Incubar a 44.5°C durante 48 horas. • Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad. • Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente

tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. • Informar: Número más probable de organismos coliformes fecales por gramo de muestra NMP. • Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le

corresponda.


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4.2 Organismos coliformes fecales en agua y helado (Agua de la red municipal, agua embotellada, hielo, helados procesados, pulque) En el caso del hielo y del helado dejar fundir completamente la muestra, homogenizarla Si se realizan simultáneamente las determinaciones de organismos coliformes totales y fecales, traer una muestra de 200 mL. Prueba presuntiva

• Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato doble concentración

• Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lauril triptosa sulfato de concentración sencilla con 1 ml de la muestra directa

• Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa. • Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas. • Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las


• Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba presuntiva.

• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante. • Incubar a 44.5°C durante 48 horas. • Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad. • Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente

tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. • Informar: Número más probable de organismos coliformes fecales por 100 mL de muestra • Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le

corresponda.


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5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro. Equipo

Muestra Organismos coliformes totales

por NMP Organismos coliformes fecales

por NMP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.-¿Qué son los organismos coliformes Totales? 2.-Cual es el fundamento de la técnica del número más probable (NMP). 3.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos. 4.- ¿Por que se usa caldo lactosado de doble concentración para análisis de agua? 5.-Anota todos los componentes del caldo lactosa bilis verde brillante y menciona la función de cada uno de ellos. 6.-Anota todos los componentes del caldo lauiril sulfato triptosa y del caldo EC, menciona la función de cada uno de ellos. 7.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos. 8.-¿Qué son los organismos Coliformes Fecales? 9.- ¿Cuál es la diferencia de usar la técnica para coliformes fecales y coniformes totales? 10.- ¿Por qué se les llama indicadores sanitarios a los microorganismos coliformes? 11.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos. 12.- ¿En qué Norma Oficial Mexicana se basa este análisis? 13.- ¿Cuáles son las principales géneros que conforman el grupo coliforme?


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6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Analice la Técnica del Número Más Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en muestras de agua, así como el uso de las tablas. 7.- CONCLUSIONES Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica. 8.- BIBLIOGRAFÍA Anota la bibliografía consultada para el reporte de esta práctica. 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS -American Public Health association 1998. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Ed. Marvin L. Speck. E.U.A. -Fernández Escartín E. 1981. Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Vol 1. Universidad de Guadalajara. ANUIES-SEP. México. -NOM-109-SSA-1994 Bienes y Servicios Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México. -NOM-110-SSA-1994 Bienes y Servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México. -NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México. -IPN. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Departamento de Microbiología. 2004 Manual de Laboratorio de Microbiología Sanitaria. 3ª Edición.



PRÁCTICA No 10 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

UNIDAD: VI Identificación de microorganismos TEMA: 6.2 Identificación de bacterias por pruebas bioquímicas 1.-OBJETIVOS 1.1 Objetivo general El alumno utilizará las pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias. 1.2 Objetivos específicos Determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono. Determinar la actividad enzimática en la hidrólisis de aminoácidos y proteínas Determinar la actividad de los microorganismos en los procesos de óxido-reducción. 2.- INTRODUCCIÓN El término metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos químicos que tienen lugar dentro de una célula. Los elementos químicos básicos que utiliza una célula provienen del medio ambiente y estos elementos químicos son transformados por la célula en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía. Las células pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energía: luz, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera energía. Este proceso se denomina catabolismo. Las células también necesitan energía para otras funciones celulares como es la movilidad celular y transporte de nutrientes. Los microorganismos son capaces de efectuar reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según el sustrato que emplean: a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera). Los carbohidratos almacenan gran cantidad de energía, la capacidad de fermentar depende de las enzimas del microorganismo. Los carbohidratos más simples se definen como polihidroxialdehìdos (aldosas, p.e. glucosa, galactosa, ribosa y manosa) y polihidroxicetosas (cetosas, p.e. ribulosa y xilulosa) los cuales se denominan como monosacáridos, estos se pueden unir entre sí para dar lugar a los disacáridos (p.e. sacarosa, lactosa y maltosa) si se une más de un monosacáridos se le puede denominar oligosacárido (p.e. rafinosa) y si se unen un gran número de estos monosacáridos se le llama polisacárido (p.e. almidón, celulosa y glucógeno). Derivados de carbohidratos también son usados como fuente de energía por los microorganismos, como son el caso de ácidos (p.e. ácido glucónico y glucorónico) y alcoholes (p.e. sorbitol, manitol e inositol). Al producto final de la degradación de los azúcares se le conoce como fermentación y la realizan los microorganismos principalmente en condiciones anaerobias.



Existen distintas clases de fermentación producidas por las bacterias y cada una depende de los productos finales característicos formados. Según la mayoría de los autores los grupos más importantes de bacterias muestran uno de los cinco tipos principales de formas de fermentación. 1.Fermentación alcohólica. 2.Fermentación del ácido láctico. 3.Fermentación del ácido propiónico. 4.Fermentación del ácido mixta. 5.Fermentación del alcohol butílico. b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea). c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina) Las proteínas son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños.El catabolismo de las proteinas es realizada por las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, llamadas gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas en aminoácidos individuales La capacidad enzimatica de un microorganismo de descarboxilar es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especificas atacan los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dióxido de carbono: R-CH-NH2-COOH R-CH2-NH2+CO2 Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos,, anaerobios facultativos y

anaerobios estrictos). La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada especie. En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia bien aislada a una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan los cambios de pH o la presencia de un subproducto. Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los microorganismos, ya que generalmente tendremos un cultivo mixto, de esta manera lograremos tenerlos aislados y podemos conocer su morfología colonial (una vez teniendo el cultivo puro lo pasamos a un medio de cultivo en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura de crecimiento, cuando tenemos el cultivo puro procederemos a realizar la tinción de Gram para saber a que grupo pertenece G+ ó G- Además en la morfología microscópica podemos conocer la forma del microorganismo ( bacilo, coco, coma, etc). La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 mL de solución salina fisiológica 0.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas.



LAS SIGUIENTES PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARA BACTERIAS ESTÁN AGRUPADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS Pruebas bioquímicas recomendadas para bacterias Gram negativas

Fermentación de carbohidratos ( glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)

TSI (fermentación de la glucosa, producción de ácido sulfhídrico, producción de gas) LIA ( descarboxilación de la lisisna) MIO (movilidad, descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Rojo de metilo Produción de urea Reacción de Voges Proskauer Utilización deMalonato Utilización del citrato Licuefacción de la gelatina Crecimiento en caldo CN Utilización de la esculina Utilización del gluconato Requerimientos de oxígeno Catalasa Oxidasa Reducción de nitratos Fermentación O/F

Pruebas bioquímicas recomendadas para bacterias Gram positivas

Fermentación de carbohidratos ( glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina,

adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentación de la glucosa, producción de ácido sulfhídrico, producción de gas) LIA ( descarboxilación de la lisisna) MIO (movilidad, descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Catalasa Oxidasa Reducicón de nitratos Hemólisis Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Licuefacción del a gelatina Hidrólisis de la esculina Voges - Proskauer



Prueba de la fosfatas Prueba de la DNAsa Incubación a 10 y 45 ª C Reducción con azul de metileno Hidrólisis del hipurato Formación de cápsula Hidrólisis del almidón

A continuación se describen los fundamentos de las pruebas de identificación que se realizarán en el laboratorio. A.- UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Fundamento: Determinar la capacidad de un microorganismos para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón en moléculas mas pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo. FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL MANITOL Y LACTOSA Fundamento: Determinar la capacidad de unos organismos de fermentar unos carbohidratos incorporado a un medio, produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol FERMENTACION DE AZUCARES EN MEDIO TSI. Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI). Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro. PRUEBA DE ROJO DE METILO Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6.0 8 amarillo) y 4.4 (rojo), esta prueba es cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48 -72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER Fundamento: La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo α - naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo. B.- UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS



UTILIZACIÓN DE CITRATO DE SIMMMONS Fundamento: Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de l fermentación o producción de ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay producción de lactato y los productos son CO2 ácido formica y ácido acético. UTILIZACIÓN DE MALONATO DE SODIO Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico, inhibiendo la acción catalítica de ka enzima succínico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibición competitiva. El ácido malonico ( malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un cloqueo en la oxidación del ácido succínico. El medio se inocula por asada y se incuba a 35 ° C durante 24. HIDRÓLISIS DE UREA Fundamento: La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: el amoníaco reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio. C.- HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS: LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (método del tubo) Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteo líticas que, a su vez son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente . Estas enzima que son capaces de gelatinólisis, se denominan gelatinazas. Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. PRUEBA EN MEDIO MIO Es un medio semisólido, se siembra por picadura y se incuba 24 horas a 35 ª C. Sirve para leer la movilidad, producción de Indol y descarboxilación de la ornitina. La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil .



La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molécula de triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina “ triptofanasa ” . La prueba de la descarboxilación de la ornitina sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal. El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina . PRUEBA EN MEDIO SIM El medio se inocula por picadura, se incuba a 35 ° C durante 24 horas, para leer la prueba de Indol agregar de 3 a 4 gotas del reactivo de Kovac’s. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis. D.- DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS Fundamento: La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la identificación y diferenciación de muchas especies. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α - naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - α - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los reactivos. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON Fundamento: Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación mas sensible, como el medio OF.



Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente: a.- la concentración de proteína 8 peptonas ) ha disminuido del 1 5 al 0.2 %. b.- la concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0.5 % al 1 %. c.- La concentración de agar está disminuida de 1.5 a 0.25, con lo cual su consistencia es semisólida.

La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO

Fundamento: Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor de hidrógeno final, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático. PRUEBA DE CITOCROMO OXIDASA

Fundamento: Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria, transfiriendo electrones ( hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas ) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas) Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actua como aceptor final de electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citicromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol. La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son: 1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que se han desarrollado en la placa. 2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y, 3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos. En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. PRODUCCIÓN DE LA CATALASA Fundamento: Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo.



La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno en agua. 3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1.- EQUIPO

• 1 incubadora a 35°C • 1 microscopio • 1 refrigerador • 1 autoclave • 1 horno

3.2.- MATERIAL

• 1 Mechero Fisher • 2 cajas de Petri • portaobjetos • 65 tubos de ensaye de 13 x 100 mm • 1 gradilla metálica • 1 pipetero con pipetas estériles de 1 mL • 1 frasco con alcohol • 8 campanas de Durham • Algodón • Gasa • Papel Kraft • Asas bacteriológicas • cilindro de acero inoxidable para cajas Petri

3.3.- MEDIOS DE CULTIVO:

• 1 tubo con 9 mL de solución salina • 1 caja con 20 mL de agar almidón • 4 tubos con 3 mL de caldo rojo de fenol manitol con campana de Durham • 4 tubos con 3 mL de caldo rojo de fenol lactosa con campana de Durham • 4 tubos con 3 mL de medio TSI • 4 tubos con 3 mL de caldo rojo de metilo • 4 tubos con 3 mL de caldo Voges Proskauer • 4 tubos con 3 mL de agar citrato de Simmons • 4 tubos con 3 mL de caldo malonato • 4 tubos con 3 mL de caldo urea • 4 tubos con 3 mL de gelatina nutritiva • 4 tubos con 3 mL de medio SIM • 4 tubos con 3 mL de medio MIO



• 4 tubos con 3 mL de medio LIA • 4 tubos con 3 mL de caldo nitrato • 4 tubos con 3 mL de medio Hugh Leifson • 4 tubos con 3 mL de medio cianuro de potasio

3.4 .-REACTIVOS:

• Solución de rojo de metilo • Solución de α naftol • Solución de KOH • Reactivo de Kovac’s o Erlich • Solución de ácido sulfanilico • Solución de α naftilamina • Aceite mineral • Solución de peroxido de hidrogeno al 1 % • Reactivo N,N,N,N-tetrametil-p-feniléndiamina • Reactivos para tinción de Gram • Reactivos para tinción de esporas • Benzal

3.5.-BACTERIAS: • Bacterias Gram + y Gram – cultivadas en la práctica de Aislamiento o bacterias control

disponibles en el laboratorio 4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL: 4.1 Anotar el nombre del medio de cultivo en el que describiste la morfología colonial de la cepa aislada de la práctica de aislamiento, así como la morfología microscópica y el resultados de la tinción de Gram. 4.2 Realizar una suspensión de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solución salina estéril. 4.3 Inocular en este orden las pruebas bioquímicas.

Prueba bioquímica Utilización de carbohidratos Medio de cultivo Forma de inocular

Hidrólisis de almidón Agar almidón Por estría simple Utilización de citrato de sodio Citrato de Simmmons Por estría Fermentación de carbohidratos Caldo rojo fenol con lactosa Por asada Fermentación de carbohidratos Caldo rojo fenol con manitol Por asada Prueba de rojo de metilo Rojo de metilo Por asada Prueba de Voges-Proskauer Voges Proskauer Por asada Utilización de sales orgánicas Utilización de malonato de sodio Caldo malonato por asada Hidrólisis de urea Caldo urea por asada



Reducción de nitratos a nitritos Caldo nitrato Por asada Prueba del cianuro de potasio Cianuro de potasio Por asada Hidrólisis de Proteínas y aminoácidos Licuefacción de la gelatina Gelatina nutritiva Por picadura SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Medio SIM Por picadura

MIO (movilidad, indol y ornitina) Medio MIO Por picadura Metabolismo Oxidativo y/o fermentativo

Determinación del metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa Medio OF (Inocular dos tubos)

Por picadura y a un tubo agregar 0.2 mL de aceite mineral

Desaminación y descarboxilación de aminoácidos

LIA

por picadura y estría

Fermentación de carbohidratos (glucosa, lasctosa) TSI Por picadura y estría

Prueba de citocromo oxidasa Realizar después de incubar las pruebas anteriores En portaobjetos

Prueba de la catalasa Realizar después de incubar las pruebas anteriores En portaobjetos

4.4 Incubar las pruebas a 35° C durante 24 horas e incubar una serie de pruebas bioquímicas sin inocular para observar las reacciones por cambios de coloración. 5.- RESULTADOS: Y CUESTIONARIO 5.1 Leer todas las pruebas bioquímicas en este orden y anotar los resultados teóricos.



FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO

Hidrólisis de almidón Agregar lugol sobre la estría + Positiva- Si se forma un halo claro alrededor de la estría. - Negativa- No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fermentación de manitol

+Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana esta llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de lactosa

+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana esta llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio. Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio. Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo. Producción de H2S ( - ): sin coloración. Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.

Prueba de rojo de metilo

Agregar 2 gotas de rojo de metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol). -Negativa: No hay cambio en el color

Prueba de Voges-Proskauer

agregar 6 gotas de α naftol y 2 gotas de KOH +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. - Negativa: El cultivo no cambia de color

UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS Utilización de citrato de sodio

+ Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso - Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Utilización de malonato de sodio

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul). Negativa: No hay desarrollo (medio de

Hidrólisis de urea Producción de ureasa + Positiva: Color rosa fucsia en el medio. - Negativa: Sin cambio de color en el medio

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS Licuefacción de la gelatina

Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco minutos. + Positivo: licuefacción de la gelatina. - Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar, descartar la prueba negativa hasta los 14 días.

MIO (movilidad, indol y ornitina)

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura. Descarboxilación de la ornitina:



+ Positiva: Color púrpura del medio. - Negativa: Color amarillo del medio. Después de leer las dos pruebas se agregan 3 ó 4 gotas de reactivo de kovacs y se observa: - Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo - Negativo: No se forma el anillo.

SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s. Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura. Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

LIA (Desaminación y descarboxilación de aminoácidos)

Desaminación de aminoácidos: + Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino. - Negativa: La superficie no tiene cambios. Descarboxilación de aminoácidos + Positiva: El fondo del tubo es de color purpura. - Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.

METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO Reducción de nitratos a nitritos

Agregar 3 gotas de α naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico. + Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos - Negativa: Sin cambio de color.

Determinación de metab. oxidativo y/o fermentativo de la glucosa (OF)

TUBO SIN SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios. TUBO CON SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

Prueba del cianuro de potasio

+ Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez) - Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Prueba de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina). + Positiva: aparición de un color azul violeta. - Negativa: No hay cambio de color.

Prueba de la catalasa Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.

+ Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno. - Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.



5.2 Con los resultados obtenidos consulta las tablas que serán proporcionadas por el profesor, para la identificación de su microorganismo. 5.3 NOMBRE DE LA BACTERIA:_______________________ 5.4 ¿Qué pasaría si las pruebas bioquímicas se dejaran más de 24 horas? 5.5 ¿Por qué siempre que se identifica una bacteria se pone una serie de pruebas bioquímicas sin inocular? 5.6.Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las pruebas de hidrólisis del almidón 5. 7.¿Qué microorganismos hidrolizan el almidón? 5.8 Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cual es su rango de sensibilidad. 5. 9 ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares? 5. 10 ¿Qué significa TSI y que es lo que podemos observar con esta prueba? 5. 11 ¿Cuál es el fundamento de las pruebas de utilización de citrato y malonato y cual es el indicador de pH que se emplea en estas pruebas bioquímicas? 5.12 ¿Cuál es el fundamento de la prueba de hidrólisis de la urea? 5.13 Explicar cual es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos? 5.14 ¿Qué microorganismos licuan la gelatina? 5.15 ¿Qué significa SIM y cual es el fundamento de esta prueba ? 5.16 ¿Qué significa MIO y cual es el fundamento de esta prueba? 5. 17 ¿Qué significa LIA y cual es el fundamento de esta prueba? 5.18 ¿Cuál es el fundamento de la prueba reducción de nitratos a nitritos? 5.19 ¿Cómo se determina el metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa? 5.20 ¿Cuál es el fundamento de la prueba del cianuro de potasio? 5.21 ¿Cuál es el fundamento de la prueba de citocromo oxidasa?



5.22 ¿Cuál es el fundamento de la prueba de la catalasa? 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir la importancia de un buen aislamiento para la identificación de microorganismos. 6.2 Discutir la importancia de la morfología microscópica y de la morfología colonial. 6.3 Analizar la importancia de las pruebas bioquímicas en cuanto a fermentación de azúcares, utilización de sales inorgánicas, hidrólisis de proteínas y aminoácidos, metabolismo oxidativo – fermentativo realizadas para la identificación de microorganismos. 6.4 Discutir la importancia de utilizar otras pruebas bioquímicas. 6.5 Discutir la importancia del buen uso de las tablas para identificar a los microorganismos. 7.- CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.2 Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas. 8.- BIBLIOGRAFÍA Enumerar la bibliografía consultada para la elaboración del reporte de la práctica 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS -Koneman. E: W Allen, S.D., Dowell, VR., Sommers, H.M. Diagnóstico Microbiológico. Traducción: Wasserman. A. V. Editorial Médica Panamericana. México. 1984. - Mac Faddin. J.F., Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Traducción Lorenzo, I., Editorial Médica Panamericana, México. 1984.

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS – UPIBI. IPN


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PRACTICA No. 11

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

Unidad VII: Mohos y Levaduras TEMA: 7.1 Aislamiento e identificación de mohos y levaduras 7.2 Identificación de mohos y levaduras 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo general: 1.1.1 El alumno identificará y cuantificará mohos filamentosos y levaduras en productos de interés biotecnológico. 1.2 Objetivos específicos: 1.2.1 El alumno aislará de una muestra de interés un moho filamentoso y una levadura por la técnica de vaciado en

placa. 1.2.2 El alumno cuantificará mohos filamentosos y levaduras aislados. 1.2.3 El alumno describirá la morfología microscópica de los mohos filamentosos y levaduras aislados. 1.2.4 El alumno describirá la morfología macroscópica de los mohos filamentosos y levaduras aislados. 1.2.5 El alumno identificará un moho filamentoso por medio de la técnica Ridell (Microcultivo). 2. INTRODUCCIÓN

Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos. Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura. En el área de la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a partir del género Penicillium . En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos, etc.

Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina. También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos. MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS

Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos. Los mohos microscópicos pueden ser: 1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras. 2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células. Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples, membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular. Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de quitina o mananas. Además la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos. El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto que presentan las



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colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en: 1) Mohos con micelio cenocítico : son los que carecen de septos o tabicaciones 2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células. Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones mas delgadas o anchas. El diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible. En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos: 1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas. 2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen estructuras de

reproducción. Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37ºC en el cuerpo humano, se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25ºC presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales. REPRODUCCIÓN

Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio ambiente, sin embargo son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A continuación se muestran la clasificación de estas esporas: Artrosporas Talosporas Blastosporas

Clamidosporas

Reproducción Microconidias

Asexual Conidiosporas Macroconidias

Esporangiosporas Zigosporas Reproducción Ascosporas Sexual Basidiosporas

Oosporas Esporas asexuales:



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I.- Talosporas: a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares con doble pared gruesa. b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio. c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que les confiere gran resistencia. II.- Conidiosporas. Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas, llamadas conidioforos.

a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan en una variedad de tamaños, formas y colores. Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo en el punto de unión.

b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La forma de estas estructuras varía, según el género.

III.- Esporangiosporas. Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo. Esporas sexuales I.- Cigosporas o Zigosporas: Esta espora surge cuando las puntas de dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos, desarrollándose así grandes cuerpos de paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos). II.- Ascosporas. De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho ascosporas. III.- Basidiosporas De la fusión de los gamento masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios. IV.- Oosporas Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio (gameto femenino), y que van a producir una sola oospora. FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.

Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general tienen requerimientos



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nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de biosíntesis los llevan acabo por las vías mas comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones más severas que otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc. El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero también resisten la falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30ºC. Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorqando carne a 0ºC (mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos). Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo. De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas cuando poseen con color café oscuro 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL • Pipetas de 1 mL • Bisturi • Caja de Petri con varilla en forma de “V” • con un porta y cubreobjetos • Asa micológica 3.2 EQUIPO • Autoclave • Incubadora a 28°C • Incubadora a 35°C • Mechero • Horno a 170°C 3.3 MEDIOS DE CULTIVO • Tubos con 9 mL de agua peptonada al 0.1% estéril • Matraz con 200 mL de Agar Papa Dextrosa • Tubos con 6 mL de Agar Papa Dextrosa • Tubos con 6 mL de Agar Dextrosa Saboraud • Cajas de Petri con agar Rosa de Bengala • Cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (para microcultivo) • Matraz con 50 mL de Glicerol al 10% estéril • Matraz con 50 ml de formaldehido al 10% • Matraz con 50 mL de ácido tartárico estéril al 10% • Tubos de ensayo de 16x 150 con campana de Durham con los azúcares siguientes: (Un juego de tubos por equipo) • Glucosa al 10% • Lactosa al 10%



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• Maltosa al 10% • Sacarosa al 10% • Rafinosa al 10% • Matraces con Agar Dextrosa sabouraud para 4 placas por equipo • Ácido tartárico al 10% 3.4 CEPAS DE MOHOS • Penicillium sp • Aspergillus níger • Muestra de interés biotecnológico 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 CUANTIFICACIÓN DE MOHOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS 4.1.1 Colocar 1 gramo de la muestra (pan, tortilla, verdura, tierra, etc) que contenga mohos, en un tubo que contiene

9 mL de agua peptonada al 1% con una pinza estéril y en condiciones de esterilidad. 4.1.2 Homogenizar y esperar a que se sedimente. 4.1.3 Realizar diluciones decimales de 10-1 hasta 10-4 en tubos que contienen 9 mL de agua peptonada al 1%. 4.1.4 Realizar la técnica de vaciado en placa, colocando 1 mL de la dilución 10-2 hasta la dilución 10-4 a una caja de

Petri estéril. 4.1.5 Vaciar a la caja aproximadamente 20 mL de agar papa dextrosa previamente acidificado y a una temperatura

adecuada. 4.1.6 Homogenizar perfectamente con movimientos circulares dejar solidificar. 4.1.7 Realizar la técnica por duplicado. 4.1.8 Incubar una serie de placas a 25°C durante 5 días para mohos y otra serie a 35°C durante 48 horas para

levaduras. 4.1.9 Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer los recuentos correspondientes donde las colonias estén bien

aisladas. 4.1.10 Realizar los cálculos y reportar el número de UFC/mL o g 4.2. MORFOLOGIA COLONIAL DE MOHOS 4.2.1 Observar la morfología colonial de los mohos aislados y reportar tamaño, forma, aspecto, color del micelio

vegetativo y reproductor, además de observar si hay pigmento difusible. 4.3 RESIEMBRA DEL MOHO AISLADO 4.3.1 Elegir una colonia de moho bien aislada y sembrarlo por punto en tubos con PDA y ADS y en cajas con agar

Rosa de bengala y ADS. 4.3.2 Incubar los tubos y las cajas a28°C durante 48 horas 4.3.3 Una vez terminado el tiempo de incubación anotar las diferencias de morfología colonial en los diferentes

medios de cultivo. 4.4 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (Microcultivo) 4.4.1 De una caja de Petri con agar PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril.



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4.4.2 Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (todo esto previamente esterilizado). Tomar con el asa el inoculo del moho al cual se quiere identificar. 4.4.3 Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar. 4.4.4 Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera este al medio. 4.4.5 Adicionar a la caja 5 mL de glicerol al 10%. 4.4.6 Cerrar la caja Petri e incubarla a 28°C durante 48 horas. 4.4.7 Realizar observaciones mínimo cada 12 horas para identificar los cuerpos fructíferos 4.4.8 Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, quitar el glicerol con una pipeta pasteur. 4.4.9 Adicionar 5 mL de formaldehido para inactivar el moho, esto es durante 15 minutos. 4.4.10 Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente. 4.4.11 Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón ahora colocar un cubreobjetos y sellar nuevamente la preparación con barniz de uñas trasparente. 4.4.12 Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10X y 40X. 4.4.13 Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras reproductivas e

identificar el moho. 4.5 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS 4.5.1 De la placa de PDA que se incubo a 28°C seleccionar una colonia de levadura. 4.5.2 Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria. 4.5.3 Teñir la preparación con azul de metileno o cualquier otro colorante durante un minuto. 4.5.4 Lavar la preparación dejar secar. 4.5.5 Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10X y 40X. 4.5.6 Dibujar la levadura que se observó. 4.6 Zimograma Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en su capacidad de fermentar azúcares. 4.6.1 Tomar una colonia de levadura aislada e inocular cada tubo que contiene diferentes azúcares con las levaduras a estudiar, una concentración aproximada a la del tubo número 1 de la escala de Mc Farland, incubar 72 horas y observar la fermentación de carbohidratos y comparar con la tabla.

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DEL GENERO CANDIDA Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa C. albicans + + - + - + C. tropicales + - + + - + C. glabrata + - - - - + C. guilliermondii + - + + - + C. parapsilosis + - - + - + C. krusei + - - - - - C. kefyr + - + + + + C. lipolytica + - - - - -



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C. zeylanoides +* - - - - - 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO. 5.1 Anotar el número de UFC/mL o g de mohos y levaduras de las diluciones correspondientes en la siguiente tabla.

DILUCION MOHOS UFC/mL o g LEVADURAS UFC/mL o g 10-2 10-3 10-4

5.2 Dibujar la levadura observada al microscopio 5.3 Dibujar las estructuras de reproducción del moho. 5.4 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial del moho.

Características PDA ADS ARB Tamaño Forma Aspecto Color del micelio vegetativo Pigmento difusible

Anota el nombre del moho identificado ____________________________________________. 5.5 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial de la levadura en el medio PDA.

Tamaño Aspecto Color Consistencia

Anota el nombre de la levadura identificada ____________________________________________. 5.6 Anota la composición y utilidad de los medios de cultivo: Sabouraud, agar Papa Dextrosa y Agar Rosa de Bengala. 5.7 Describe la técnica de microcultivo. 5.8 ¿Por que se inocula con esporas y micelio un medio de cultivo? 5.9 ¿Por que se utiliza la técnica de punto para sembrar mohos? 5.10 ¿Porque es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos? 5.11 ¿Cuál es la función del glicerol y el formaldehido en un microcultivo? 5.12 ¿Como identificarías un moho contaminante de un producto biológico? 5.13 ¿ Que otras técnicas se utilizan para la identificación de levaduras?



93

6. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la naturaleza. 6.2 Discutir la relación que guarda el crecimiento de los mohos en los diferentes medios de cultivo. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la practica, los resultados obtenidos y la

bibliografía consultada. 8. BIBLIOGRAFIA 8.1 Enumera la bibliografía consultada para la elaboración del reporte. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS -Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana 1991. -Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993

Aspergillus níger Aspergillus flavus

Rhizopus oligosporus Trichoderma viride



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Saccharomyces cerevisiae Penicillium

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS-UPIBI.IPN


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PRÁCTICA No. 12 FACTORES AMBIENTALES

UNIDAD VIII : Factores ambientales TEMA: 8.1 Factores que afectan el crecimiento en el medio de cultivo 8.2 Efecto de los factores físicos y químicos 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general 1.1.1 El alumno determinará la influencia de algunos factores ambientales que modifican el crecimiento de los

microorganismos que identificó en prácticas anteriores. 1.2 Objetivo específicos 1.2.1 El alumno determinará la temperatura óptima, el punto térmico mortal (PTM) y el tiempo térmico mortal

(TTM) de algunos microorganismos. 1.2.2 El alumno determinará el efecto de la presión osmótica y del pH sobre el crecimiento de los

microorganismos. 1.2.3 El alumno determinará el efecto de algunos metales pesados y halógenos sobre el crecimiento de los

microorganismos. 1.2.4 El alumno determinará la sensibilidad de algunas bacterias ante el efecto de los antibióticos. 1.2.5 El alumno realizará una pasteurización como una aplicación de un proceso térmico. 1.2.6 El alumno evaluará la resistencia bacteriana ante un antibiótico. 2.-INTRODUCCIÓN La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano, el crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que se clasifican en psicrofílicos: (0°C a 20ºC), los mesofílicos crecen entre 20 y 40ºC y los termofílicos: crecen entre 40 y 80ºC. La forma mas común de determinar la sensibilidad a calor de un organismo es por medio de su Punto Térmico Mortal (PTM), que es la temperatura mínima necesaria para que todos los organismos de una población mueran en 10 minutos y el Tiempo Térmico Mortal (TTM), es el tiempo mínimo en el cual muere una población a una temperatura dada. La elevada concentración de solutos en la célula genera una presión interna que recibe el nombre de presión osmótica; las bacterias poseen paredes celulares rígidas y por lo general no presentan cambios muy pronunciados de forma y tamaño cuando experimentan plasmolisis o plasmoptisis. Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentración de solutos y reciben el nombre de osmofilicos, como son los halofílicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacarofílicos, que crecen en altas concentraciones de azúcar. El pH optimo de crecimiento de los microorganismos pueden afectar el crecimiento y se clasifican en acidófilos, neutrófilos, basófilos, la degradación de las proteínas y otras substancias nitrogenadas, la fermentación de azucares produce ácidos, por lo tanto, la naturaleza del microorganismo y el sustrato determinara si el medio se alcaliniza o acidifica.



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Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actúan generalmente por medio de la precipitación de enzimas o de otras proteínas esenciales para la célula o interfieren con algunas funciones celulares, el mercurio, la plata, el arsénico, el zinc y el cobre son los más utilizados, se utilizan en bajas concentraciones ya que tienen buena actividad antimicrobiana. Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actúan como oxidantes de los constituyentes celulares, como las proteínas. Los antibióticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas concentraciones inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de acción, los antibióticos se pueden clasificar como bactericidas, bacteriostáticos, macrólidos, polipéptidos y grupo misceláneo. La pasteurización es un proceso térmico en el que se aplica un calentamiento moderado seguido de un enfriamiento brusco, con la finalidad de reducir la carga microbiana presente en productos que son termo sensibles, este proceso no es un método de esterilización, puesto que existen microorganismos que resisten la pasteurización, a los cuales se le conoce con el nombre de termodúricos; ejemplo de ellos son algunas especies de los géneros: Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Arthrocabter, Bacillus y Clostridium. 3. EQUIPO, MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS 3.1.- MATERIAL

• Pipetas de 1,2,5 y 10mL estériles. • Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo • Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo Placas con agar nutritivo • 20 mL de leche de establo • Tubos con 9 rnL de agua peptonada al 0. 1% • Matraz de 1 50 mL con Agar bilis rojo violeta • Cajas Petri con Agar cuenta estándar • Caja con agar Luria • Caja con agar Luria + ampicilina (50�g/mL) • Tubo con 5 mL de caldo Luria inoculado con una cepa de Esccherichia coli, con crecimiento de 24

horas. • Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 3. 5 • Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 5 • Tubos de 13x l00 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 7.0 • Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 9.0 • Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio • Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 3% de cloruro de sodio • Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio • Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro • Cajas de Petri estériles • Pinzas de disección • Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio



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• Discos de papel filtro impregnados con yodo • Sensidiscos con diferentes antibioticos

3.1 EQUIP0

• 1 termómetro • 1 refrigerador a 4°C • 1 incubadora a 25°C • 1 incubadora a 35°C • 1 baño María a 50°C • 1 baño María a 60°C • 1 baño María a 70°C • 1 baño María a 80°C • 1 baño María a 92°C • 1 autoclave • Probetas • Horno


• Bacillus sp. • Saccharomyces cerevisiae • Pseudomonas sp. • Escherichia coli • Aspergillus niger • Micrococcus luteus

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO 4.1.1 Hacer una suspensión del microorganismo, cada equipo utilizará el mismo microorganismo en todos sus experimentos. 4.1.2 Etiquetar 4 tubos con 3 mL de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y con las siguientes temperaturas, 5°C, 28°C, 35°C y 55°C. 4.1.3 Inocular cada uno de los tubos con 0.1 mL de la suspensión microbiana, dejar un tubo sin inocular que servirá como testigo. 4.1.4 Incubar los tubos a la temperatura correspondiente durante 24 horas. 4.1.5 Después de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo de cuanta turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-). 4.2 DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)



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4.2.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con las siguientes temperaturas: 35°, 50°, 60°, 70°, 80° y 92° C y un tubo que se mantendrá a temperatura ambiente, 4.2.2 Inocular cada tubo con 0. 1 mL de la suspensión microbiana. 4.2.3 Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a baño María. 4.2.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 6 partes y marcar con 35°, 50°, 60°, 70°, 80°, 92°C y el testigo. 4.2.5 Sembrar por estría simple sobre el agar en su correspondiente temperatura. 4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25°C si se sembró a mohos y a 35°C, 24 horas si se trata de bacterias y levaduras. 4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de las temperaturas. 4.3 DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM) 4.3.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con los siguientes tiempos 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente. 4.3.2 Inocular cada tubo con 0, 1 mL de la suspensión microbiana 4.3.3 Calentar los tubos a 70ºC en un baño María durante los tiempos indicados 4.3.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes y marcar con 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente. 4.2. 5 Sembrar por estría simple sobre el agar en su correspondiente tiempo. 4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25° C si se sembró a mohos y a 35°C, 24 horas si se trata de bacterias y levaduras. 4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de los tiempos.

TIEMPO TÉRMICO MORTAL Y PUNTO TÉRMICO MORTAL 4.4.-PASTEURIZACIÓN

5’ 10’

15’

30’ 25’

20’ Te

0’

35 50

60

9280

70Te

Tºamb



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Leche sin pasteurizar: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos coliformes (OC). Para organismos coliformes. 4.4.1 Realizar diluciones hasta 10-2 en agua peptonada al 0.1 %. 4.4.2 Sembrar por duplicado la dilución 10-1 para organismos coliformes. 4.4.3 Sembrar por duplicado utilizando agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar y agregar una capa de agar, solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas. 4.4.4 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación. Para organismos mesofílicos aerobios. 4.4.5 Sembrar por duplicado la dilución 10-2 utilizando agar cuenta estándar o agar nutritivo. 4.4.6 Dejar solidificar e incubar a 35°C 24 horas. 4.4.7 Contar y reportar el número de colonias como unidades formadoras de colonias. 4.4.8 Pasteurizar la leche pasteurizada: adicionar 10 mL de leche bronca en un tubo estéril, en un baño María a 70° C durante 30 minutos, enfriar rápidamente en baño de hielo y determinar organismos mesofílicos y organismos coliformes. 4.5 Leche pasteurizada: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos coliformes (OC). Para organismos coliformes. 4.5.1 Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo. 4.5.2 Sembrar por duplicado la leche, adicionar agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar, agregar una capa de agar, dejar solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas. 4.4.3 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación. Para organismos mesofílicos aerobios. 4.4.4 Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo y OMA. 4.4.5 Adicionar 1 mL de leche a cada caja, adicionar agar cuenta estándar, homogenizar, dejar solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas.



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4.4.6 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación. 4.4.7 Contar y reportar el número de colonias como unidades formadoras de colonias.

DIAGRAMA DE LECHE PASTEURIZADA Y SIN PASTEURIZAR 10 mL Leche de establo sin Pasteurizar Pasteurizar esta leche a 70°C durante 30 min ∗ 10 –1 10-2

∂ Coliformes ø Organismos mesofilicos ∂Coliformes ø Organismos (OC) Aerobios (OMA) (OC) mesofílicos aerobios (OMA) ∂ Utilizar agar bilis rojo violeta ø Utilizar agar nutritivo o agar cuenta estándar ∗ Utilizar agua peptonada al 0.1% para la dilución EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUIMICOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR 4.5- EFECTO DEL pH 4.5.1 Marcar los 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH con: el nombre de la cepa, grupo, equipo. 4.5.2 Inocular con 0.1 mL de la suspensión cada uno de los tubos.

ABRV ACS ABRV

ACS



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4.5.3 Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para mohos. 4.5.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los diferentes pH. 4.6-EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA SOBRE EL CRECIMIENTO 4.6.1 Etiquetar los tubos que contienen 3 mL de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de sodio (1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo. 4.6.2 Inocular con 0.1 mL de la suspensión cada uno de los tubos. 4.6.3 Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para mohos. 4.6.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los diferentes pH. 4.7- METALES PESADOS 4.7.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4 4.7.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal. 4.7.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa. 4.7.4 Incubar la placa a 35 ° C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para mohos. 4.7.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados. 4.8 COMPUESTOS HALOGENADOS 4.8.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo. 4.8.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal. 4.8.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa. 4.8.4 Incubar la placa a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para mohos.

AgNO3 CuSO4AgNO3 CuSO4



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4.8.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados. 4.9 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO 4.9.1 Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo, equipo. 4.9.2 Sembrar la placa por estría masiva con el microorganismo proporcionado. 4.9.3 Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas. 4.9.4 Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en contacto el antibiótico con la cepa 4.9.5 Incubar las placas a 35°C durante 24 horas. 4.9.6 Después del tiempo de incubación medir el diámetro del los halos de inhibición del crecimiento producido y anotar los resultados. 4.9.1 RESISTENCIA BACTERIANA A UN ANTIBIÓTICO 4.9.1.1 Tomar 1 mL del cultivo de Escherichia coli e inocularlo en cada una de las cajas con agar luria y agar luria + ampicilina (50�g/mL). Incubar a 35°C durante 24 horas, marcar correctamente las cajas. 4.9.1.2 Contar el número de colonias desarrolladas en cada caja.

IodoHipoclorito de sodio Iodo Hipoclorito de sodio

Penicilina Eritromicina Penicilina Eritromicina



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4.9.1.3 Guardar la placa con colonias desarrolladas en presencia del antibiótico en el refrigerador para la práctica siguiente. 4.9.1.4 Calcular la frecuencia de bacterias resistentes al antibiótico, como UFC en presencia de antibiótico/UFC sin antibiótico (número de bacterias resistentes / cuenta total). 5. RESULTADOS 5.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA

TEMPERATURA 5°C 28°C 37°C 55°C CRECIMIENTO UFC/mL

5.2 PUNTO TÉRMICO MORTAL

TEMPERATURA 37°C 50°C 60°C 70°C 80°C 92°C CRECIMIENTO UFC/mL

5.3 TIEMPO TÉRMICO MORTAL

TIEMPO 5´

10´

15´

20´

25´

30´

CRECIMIENTO UFC/mL 5.4 PASTEURIZACIÓN

LECHE SIN PASTEURIZADA LECHE PASTEURIZADA

UFC/mL UFC/mL ORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS

ORGANISMOS COLIFORMES

5.5 EFECTOS DEL pH

EFECTO DEL pH 3.5 5.0 7.0 9.0 CRECIMIENTO

5.6 EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA



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CONCENTRACIÓN DE NaCl 1% 3% 5% CRECIMIENTO

5.7 EFECTO DE METALES PESADOS

METAL AgNO3 CuSO4 BaCl DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN (mm)

5.8 EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS

HALÓGENO CLORO YODO DIÁMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm)

5.9 EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS

ANTIBIOTICO DIÁMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm)

5.9 RESISTENCIA A UN ANTIBIÓTICO

UFC en presencia de antibiótico UFC sin antibiótico

Número de bacterias resistentes / cuenta total = ___________________ CUESTIONARIO 5.1 Dá tres ejemplos de microorganismso psicrofílicos, 3 de mesofílicos y 3 de termofílicos 5.2 Define el término termodúrico 5.3.-Da 3 ejemplos de microorganismos cuyo pH óptimo de crecimiento sea ácido, 3 de pH alcalino y 3 de pH neutro. 5.4 -Da la diferencia en la composición y estructura de la pared celular de un organismo mesofílico y un termodúrico. 5.5 ¿Qué significa actividad de un antibiótico? 5.6.¿Cómo actúan los antibióticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste? 5.7 ¿A qué se debe la resistencia a un antibiótico? 5.8 ¿Cuál es la importancia en salud y en biotecnología de este tipo de cepas? 5.9 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriostático, fungicida y fungistático.



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5.10 ¿Explica la diferencia como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio. 5.11 Explica la relación que existe entre la concentración del agente químico y el tiempo de exposición 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los resultados obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los factores estudiados y la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los microorganismos. 7.-CONCLUSIONES. 7.1 Elaborar las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la practica. 8.-BIBLIOGRAFÍA Escriba la bibliografía consultada para el reporte de esta práctica, 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS. -Atlas, R. Mycrobiology, 2d Edition, Maxweil-MacNfillan Co. 1990 -Brock, T.D, microbiología, 4'. Edición, Pranticc-Hali Hispanoamerica, México, D:F: 1995

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