HISTORIA DE LA CIENCIA ANIMALES DE LABORATORIO

1900 : Depósitos de animales (galpones ,etc.)1909 : Líneas genéticas endocriadas : Harvard (C57BL/6) C3H, AKR BALB/C C57BL/101935 : Jackson Premio Nobel Sistema de Histocompatibilidad1950 : Centros de Referencia 1947 : LAC1949 : VRP/NIH (USA)1954 : Chales River (USA)1956 : ICLAS (Mundial)1957 : ZFV(Alemania) Agentes patógenos Técnicas SPF/Gnotobiologia1957 : Trexler Aisladores1960 : Diseño de Bioterios en barreras (SPF) con control ambiental Acreditación Monitoreo Sanitario1963 : Guía Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio Jaulas con tapas filtro rudimentaria1970 : Seguridad ocupacional (USA)1972 : Criopreservación de embriones Dietas definidas Buenas Practicas de Laboratorio

Especificaciones del ambiente : Estricto control ambiental – Microaisladores – Flujo Laminar- Rack ventilados.1980 - 2000 : Calidad Total (ISO – 2000)1984 : Gerenciamiento en bioterio (USA)1985 : Principios éticos 3Rs Diseños eficientes Educación formal (FELASA A,B,C,D) Bienestar animal1996 : Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio

CLASIFICACION SANITARIA DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO

a) Gnotobióticos : Axénicos o Germ Free (libres de gérmenes) Gnotoxénicos (1 ó 2 microorganismos conocidos).b) Agnotobióticos : Holoxénicos o convencionales : criados bajo condiciones ambientales

no definidas SPF : Criados bajo condiciones ambientales especiales. Neoholoxénicos : son originariamente Germ Free ó SPF pero

recriados y mantenidos en condiciones ambientales convencionales.

Sistemas de aislamiento a nivel de la jaulaMini o microaisladores (jaulas con tapa filtro) Aisladores contenidas en flujos laminaresAisladores contenidas en cubículosAisladores con ventilación y filtración propia

Clasificación de aisladores

a) Rígidos Ventaja : Esterilización en autoclave Desventaja : Alto costo No pueden modificarseb) Flexibles Ventaja : Gran flexibilidad Transparencia Pueden modificarse Bajo costo Presión de aire Desventaja : No se pueden esterilizar por calor

Expuestos a pinchaduras

Características de un aislador Cámara o contenedor con un espacio interior libre de gérmenesVisor para poder observar desde afuera el interior de la cámara.Puerta para entrada y salida de animales e insumos sin que se altere la condición gnotobiótica interna.Debe contar con sistema de ventilación : presión positiva. Prácticas seguras en bioterio y en el uso de Animales de Laboratorio

Bioterio : conjunto de instalaciones destinadas a mantener y/o producir animales de laboratorio. Usar uniforme y material de contención. No manipular animales sin habilitación para ésta área Informar inmediatamente las mordeduras o trauma físico Mantener en orden área de trabajo No fumar, beber o comer en áreas de animales Mantener las manos limpias

Diseño de BioteriosLa Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio recomienda :- Instalaciones planificadas, construidas y mantenidas apropiadamente.- El tamaño y diseño dependerá de los fines (investigación, producción)

- La necesidad del diseño se justifica por tres razones :- Desde el punto de vista ético.- Estandarización y calidad genética por fines científicos- Por razones económicas (selección de materiales de construcción,

puertas de metal y abrir hacia dentro (1.10 x 2.15m)

Barrera sanitariasEstructuras físicas o métodos, mantiene aislado al animal del ambiente externo produciendo un ambiente especial mas o menos controlado que lo protege de posibles contaminantes no deseados.También se define como el conjunto de medios para minimizar el riesgo de contaminación

Objetivo Obtención de animales SPF (garantizar ensayos experimentales fiables y reproducibles)Ausencia de enfermedades (flora intestinal estable) Tipos de barrerasClase I : de máxima seguridad para animales gnotobióticosClase II : de seguridad alta para animales SPFClase III : de seguridad media para mantener animales sanos de origen SPF en un área convencional limpia.Clase IV : de seguridad mínima para animales convencionales.

Clasificación de barrerasI -Instalaciones y otros :

1. Filtración de aire2. Climatización3. Renovaciones de aire4. Sobrepresión5. Filtración y tratamiento de agua6. Zonas de seguridad biológica7. Pasillos (zona limpia y zona contaminada)8. Vestuarios9. Restricción de ropa especifica para trabajos en área determinada10.Ambientes específicos de cuarentena

11.Sistemas de paso de doble puerta12.Dispositivos de captura de insectos13.Restricción de visitantes

II - Equipo

14.Autoclave , luces germicidas etc.15.Lavadero de jaulas y equipos16.Incinerador

1. Filtración de aire : consiste en filtrar el aire que ingresa a la sala de crianza para impedir el ingreso de partículas e insectos voladores.Grado de filtración : depende del grado de protección que se necesite en la crianza de animales,el filtro seleccionado debe tener un pre-filtro que servirán para atrapar partículas mas grandes y que hará mas duradero el filtro de aire.El caudal : cantidad de aire transportada por el ventilador, se expresa en volumen de aire desplazado por unidad de tiempo (m3/hora , m3/minuto).

2. Climatización : condicionará la salud de los animales (control de Tº extremas de la región). Humedad relativa : depende del origen del animal; por ejemplo un animal SPF que ha tenido microclimas con temperaturas entre 21º a 22ºC, lo pasamos a un ambiente entre 20º a 26º C será candidato a sufrir de trastornos respiratorios.

3. Renovaciones de aire : sobredimensionar la necesidad de renovaciones de aire que necesite; se aconseja 15 a 20 renovaciones /hora . La renovación de aire permitirá una cantidad mínima de gases tóxicos (amoníaco, polvo ambiental, calor producido por los animales, etc.) proporcionará suficiente oxígeno - aire fresco.

4. Sobrepresión : barrera a implantar en un bioterio, su eficacia se consigue balanceando correctamente impulsión - aspiración del aire; el orden de sobrepresión será : mayor grado de presión en pasillo limpio, menor grado en salas de crianza e inferior en pasillos contaminados : el

aire circula en dirección de pasillo limpio a pasillo sucio y nunca al revés.

5. Zona de seguridad biológica : se planifica para trabajar con agentes patógenos, ésta zona tiene depresión de aire para evitar salida de contaminantes, debe contener equipos de esterilización y el acceso debe ser restringido.

6. Pasillos : En áreas de crianza “ No debe haber Contaminación Cruzada”.Se recomienda fijar la presión y circulación de aire relativa, la presión más alta en zona limpia y la presión mas baja en zona de mayor contaminación.

7. Tratamiento del agua a) Clorador : concentración de cloro libre residual de 0.5mg/litro, se

obtiene un poder oxidante tanto sobre sustancias orgánicas como inorgánicas.

b) Acidificador : se añade ácido clorhídrico hasta obtener ph de 2.5 aprox.(los patógenos no se multiplican en un medio ácido).

8. Vestuarios : Vestuario de diferente color (zona limpia – contaminada)La barrera mas “viable”dentro de la unidad : ropa. 9. Cuarentena : Todo animal nuevo aunque provengan de bioterio acreditado con su respectivo certificado sanitario debe permanecer aislado bajo control en zona cuarentenaria

10. Deep – Tahk : sirve para pasar materiales atravesando un medio líquido, consta de un depósito situado entre la zona limpia – zona contaminada.

11. Barreras atrapa insectos : lámparas que atrapan insectos voladores.

12. Vaciado sanitario : consiste en retirar todo equipo - implemento de crianza para realizar la limpieza y desinfección general del habitáculo(techos, piso, paredes y puertas).

13. Control de visitas : la curiosidad por ver como viven los animales estropea las barreras implantadas en un bioterio.(no beneficia el objetivo básico de barreras, sobre todo cuando existe la intención de mantener animales genéticamente definidos.

II – Equipos.14. Autoclave : método ideal de esterilización, barreras más eficaz para destruir patógenos. 15. Lavador de jaulas : automático o manual.16. Incinerador : eliminación de residuos biológicos.

Alojamiento Medida básica del cuidado de animales de laboratorio es proporcionar alojamiento ideal (cama seca, espacio suficiente para moverse, disponibilidad de agua, comida, evitar hacinamiento.

Características básicas : Cómoda Resistente a la corrosión Esterilizable Fácil acceso : alimento - agua

Aire circule correctamente por su interior Segura Fácil limpieza

Las jaulas : policarbonato, polipropileno ó acero quirúrgico.Cepos o jaulas de sujeción : se usan para inmovilizar animales , sirven para inocular, anestesiar, extraer sangre, administrar fármacos ,etc.Estanterías : fácil limpieza , ventilación adecuada.Comederos: según modelo de jaula.Bebederos: frasco-gotero (gotero de 6-9 mm de diámetro ,con tapa hermética)El tamaño de gota varía según material y diámetro del gotero.Bebederos automáticos : desventaja no se controla el consumo individual Cama: debe ser atóxico, poder absorbente , económico y fácil disponibilidad : coronta molida, viruta de madera blanca.Se cambiará 2 a 3 veces por semana.

Condiciones requeridas por los animales de laboratorio

Las condiciones ambientales en que se crían los animales influyen decisivamente en las respuestas a los diferentes tratamientos. Cuando se buscan respuestas estandarizadas las condiciones en que se mantienen los animales deben ser fijas y comparable al bioterio matriz.Los cambios del ambiente externo son registrados por los receptores externos de los animales que envían la información al sistema neuroendocrino para restaurar desbalances homeostáticos. Cualquier alteración ambiental produce cambios en el modelo animal.Principales factores ambientales que afectan a los animales : Climáticos (temperatura, humedad, ventilación etc.) Físico-quimicos (iluminación , ruido , presencia de contaminantes,

anestésicos, concentración de gases amoniacales) Instalaciones (hacinamiento ) Nutricionales (tipos de dietas , calidad del agua) Microorganismos patógenos para la especie

TemperaturaLos ratones son homeotermos (mantienen su Tº corporal); si se modifica la Tº ambiental abrá :

- Cambios de conducta, alteraciones del grosor de piel, de la circulación periférica

- Pérdida de calor: sudoración, cambios de la morfología (tamaño de cola y orejas)

- Velocidad de crecimiento (tamaño de las camadas)Los animales de laboratorio deben criarse, mantenerse y experimentarse a temperaturas óptimas para la especie y estrictamente controladas a través del sistema de renovación de aire, los ambientes de crianza deben contar con termógrafos para registrar las variaciones durante el día. Temperatura óptima para rata , ratón y hamster : 20 – 25 ºC .HumedadLa humedad relativa es importante en el proceso de termoregulación, condiciones muy secas aumentan la cantidad de polvo y por lo tanto la irritación del tracto respiratorio superior y además se presenta la llamada cola en anillo VentilaciónEs necesario contar con un buen sistema de renovación de aire que elimine los gases (amoniaco)IluminaciónDebemos tener en cuenta que los ratones son de hábitos nocturnos y sus ojos no están adaptados a la luz muy fuerte, cuando la intensidad de la luz es elevada causa cambios degenerativos de la retina sobre todo en los albinos.RuidoEl ruido es un sonido indeseable que provoca stress . El hombre tiene el menor limite superior de frecuencia audible y por ello sonidos que el hombre no oye pueden ser muy estresantes para los animales (griferías goteantes, ruedas de estanterías, timbres telefónicos, chirrido de puertas, teclado de computador etc. El efecto de los ruidos ocasiona cambios de conducta, altera el desarrollo prenatal , sistema neuroendocrino, hipertensión, hipertrofia cardiaca, perdida de peso

Biología y manejo de las especies más usadas

El Ratón : Mus muscullus, especie mas usada en investigación, producción, control de vacunas y biológico etc.Ventaja : bajo costo de mantenimiento, alta prolificidad, precocidad; existen mas de 500 cepas endogámicas , siendo la mas común la cepa Balb C.Manipulación y sujeción : al adulto se sujeta por la piel de la nuca y a las crías rodeándolas con la mano.Para una mejor sujeción : asir el animal por la base de la cola y la piel de la nuca, la cola se puede sujetar con el dedo anular y meñique de la misma mano.

Fisiología : los parámetros fisiológicos dependen de la cepa, edad , factores ambientales y estatus microbiológico; no existen parámetros básicos , cada cepa tiene los suyos y varían con las condiciones enunciadas.Son animales nocturnos, omnívoros ,presentan un par de incisivos muy desarrollados.

Determinación del sexo :Por la distancia ano genital La hembra : poliestrual , precoz ; presenta efecto “Whitten”.(sincronización del ciclo ante presencia del macho)Presenta efecto “Bruce”(no hay implantación por feromonas : orina)Gestación : 21 días, celo post parto.

Recién nacidos : rosados, carecen de pelo, aprox. 10 días : totalmente cubiertas de pelo y sus ojos están bien abiertos.Conducta : son nocturnos, se acicalan entre sí y ejercen dominancia.

Datos fisiológicos del ratón :La temperatura corporal es : 35.8 a 37.4 ºC Frecuencia cardiaca : 328 a 780 por minutoFrecuencia respiratoria : 90 a 220 por minutoPeso del ratón adulto : 25 a 40 gramosPeso de recién nacido : 1 gramoConsumo de agua : 4 a 7 ml o 1.5 ml por cada 10 gr. de peso /díaConsumo de alimento : 3 a 6 gramos Inicio de consumo de : 10 a 12 díasalimentosHeces : tienen forma de tamaño de granos de arroz de color marrón oscuroOrina : tiene olor muy fuerte , es transparente de color amarilla, orinan pequeñas cantidades frecuentemente.Tiempo de vida : 12 a 18 mesesMadurez sexual : 40 a 60 días de edadCiclo estrual : 4 a 5 díasDuración del estro : 10 horasGestación : 21 díasVida reproductiva : 8 mesesTamaño de camada : 6 a 10 crías

Canibalismo : es posible que se presente cuando no hay buen manejo(si es necesario manipular las crías : previamente untar la cama)Destete : 21 días Método de identificación : perforación de la orejaCepa mas común : Balb C

La Rata : mas usada Rattus Norvegicus; la primera rata albina fue desarrollada por el lab. Wistar de USA.Es usada para estudios de nutrición, toxicidad y comportamiento.Es la segunda especie después del ratónAnatomía y fisiología semejante al ratón , es mas dócilNo posee vesícula biliarCuando la humedad relativa disminuye hasta 40% desarrollan cola anilladaCobayo : de pelaje corto es el único usado en investigación médica, se usa para control de vacunas, sueros.También se usa en estudios de reacciones inmunológicas (complemento-plasmático de alto poder de actividad,}En estudios nutricionales de vitamina CSon herbívoros, coprófagos, muy nerviosos Temperatura elevada (mas de 28ºC y 70% de humedad )es factor limitanteEs necesario suplementar vitamina C en el agua de bebida

ConejosPertenecen a la familia lagomorfos, son omnivoros Uso : pruebas de toxicidad, pirógenos, producción de sueros hiperinmunes, irritación dérmica y ocularEs coprófago (digestión : diurna – nocturna)La orina : color amarilla a marrón rojizoEl macho se diferencia por presencia de bolsas testiculares

Nutrición de los animales de laboratorioLos alimentos para animales varían en el contenido calórico totalCarbohidratos : 4.1 Kcal/gramoProteínas : 5.6 Kcal/gramoGrasas : 9.4 Kcal/gramoLa dieta balanceada debe contener equilibrio de los nutrientes requeridos para el sustento de cada especie.Alimentos se presentan : molidos, granulado, extrusado, semihumedo, enlatado.Tipos de alimentos comerciables : Alimentos normales : generalmente presentan la etiqueta con los

ingredientes e información relacionada con el análisis garantizado. Alimento certificado para análisis : es similar a otro alimento , pero el

fabricante certifica el análisis de los nutrientes y mide los contaminantes (por debajo del nivel particular)

Alimento para animales esterilizable con autoclave e irradiado : (para animales libres de gérmenes) éste alimento a sido formulado tomando en cuenta el efecto de la esterilización en que se pierden ciertos nutrientes.

Alimentos purificados : elaborados a base de nutrientes purificados tales como: almidón, glucosa, sacarosa, caseína(proteína de leche), se usan en estudios nutricionales.

Buenas Prácticas de FabricaciónEs la guía de Normas de correcta fabricación de medicamentos, cada país tiene sus propias Guías Normativas para la Elaboración de Medicamentos.

Entre las asociaciones ó instituciones internacionales encargadas de regular las GMP destacan : OMS, OPS, ISO (International Organization for standardization: Ginebra)PIC (Pharmaceutical Inspection Convention : Union Europea)ICH (International Convention for Harmonization)Las empresas pueden, si lo desean adherirse a alguna de éstas asociaciones sometiendose a cumplir con las Normativas y especificaciones para la producción, siendo periódicamente controlada y auditada ; una vez aprobada contará con la Certificación de Calidad correspondiente.Según el nivel de exigencia de la asociación de control, mayor será el nivel de prestigio de la Certificación del producto registrado y de su marca.

Buenas Prácticas de Laboratorio para estudios de laboratorio no clínicos (GLP)- Conjunto de estándares que definen el sistema organizativo y las condiciones bajo las cuales los estudios con animales y de otro tipo (no clínicos) son planeados, realizados, registrados, reportados y archivados.- Fuerte requerimiento de documentación y rendición de cuentas sobre procedimientos, eventos y sobre datos y resultados obtenidos.- Objetivo : demostrar seguridad de los artículos no incluye investigaciones básicas- Estudios monitoreados por un grupo independiente de garantía de calidad para asegurar que todo se desarrolla según el protocolo de estudio y lo establecido en los procedimientos, también audita reporte final.- El cumplimiento de las Buenas Practicas de Laboratorio está sujeto a inspecciones de autoridades regulatorias.- Tratan de : Organización y personal, Operaciones, Artículos de Ensayo, Protocolos, Registros y Reportes, Descalificación- 58.43 : Instalaciones cuidado de animales- 58.45 : Instalaciones, insumos para animales- 58.81 : Procedimientos estándar escrito (Preparación de salas, Cuidado de Animales)

- 58.90 : Cuidado de animales (Cuarentena; Evaluación de salud; Estar libre de enfermedad ó condición que interfiera; Si contraen enfermedad ó condición, tratarlos si no interfiere en estudio.- 58.120 : Protocolo = Contiene proveedor- 58.185 : Reporte = Proveedor de animales, Circunstancias que puedan haber afectado calidad ó integridad

Consideraciones generales anestésicas para roedores

- Gran variación en la respuesta a una dosis en la misma especie (causas genéticas y/o ambientales)

- Pequeño tamaño , masa muscular reducida y pocas venas periféricas accesibles (vía intraperitoneal)

- Tendencia a la hipotermia y deshidratación.- Ayuno no mayor de 12 horas (facilita administración IP de drogas,

facilita respiración diafragmática;para evitar la pérdida de peso, se administra vía oral solución glucosada al 10 %).

Consideraciones para anestesia inhalatoria en roedores- Peso corporal reducido- Dificultad en la intubación endotraqueal- Altas frecuencias respiratorias- Alta resistencia en las vías aéreas superiores

Monitoreo anestésico(signos clínicos)- Reflejo de enderezamiento- Reflejo podal (de poco valor en cobayos)- Reflejo corneal (de poco valor en conejos)- Movimiento de mandíbula, orejas y vibrisas- Evaluación del dolor : reacción del animal a la compresión : cola,

pata, piel y modificaciones en el tipo respiratorio en respuesta al dolor)

- Color de las mucosas- Frecuencia respiratoria y cardiaca- Presencia de exoftalmia (rata y ratón : en plano anestésico

profundo)

- Temperatura corporal (anestésico deprime el centro termorregulador)

Anestésico general Sustancia que produce ausencia de la percepción de estímulos, permite producir pérdida de la conciencia, analgesia y relajación muscular suficiente para realizar procedimiento quirúrgico.Clasificación :

- Inyectables (depresores no selectivos : barbitúricos y disociativos : ketamina)

- Inhalatorios (eter, halothano)Premedicación :a) Anticolinérgicos : usados para evitar efectos adversos como bradicardia, sialorrea etc. Ejemplo : sulfato de atropina (0.1 a 3mg/kg, V.P); las dosis son mas elevadas en algunas cepas de roedores y conejos por la atropinesterasa.b) Tranquilizantes : facilitan el manejo del animal y su contención; se usan para reducir la dosis anestésica.

EutanasiaActo de sacrificar animales por métodos que inducen rápidamente a la pérdida de la conciencia evitando el dolor.Requisitos :

- Muerte sin signos de dolor- Rápida pérdida de la conciencia- Seguro para el operador- Económico

Métodos :- Ampliamente aceptados : Barbitúricos, CO2, dislocación cervical,

decapitación- No aceptados : Estricnina , agentes curariformes, sulfato de

magnesio.

Medidas de Bioseguridad en el manejo de animales de investigación

Las medidas de bioseguridad y salud ocupacional para el personal involucrado en investigación y uso de animales de laboratorio se dan de

acuerdo a las medidas especificas determinadas por su Comité Interno de Bioseguridad.