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CENTRO DE INVESTIGACIN Y ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA DE PLANTAS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA Y BIOQUMICA

CAMPUS GUANAJUATO

Caracterizacin molecular de fructanos enAgavey Dasylirion spp.,

identificacin de fructosiltransferasas y su expresin en Pichia pastoris

T E S I S

QUE PRESENTA

M.C. Norma Alejandra Mancilla Margalli

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGA DE PLANTAS

Irapuato, Guanajuato, Mxico, 2006

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Este trabajo titulado Caracterizacin molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp.,

identificacin de fructosiltransferasas y su expresin en Pichia pastorisfue realizado en el

Laboratorio de Qumica de Productos Naturales del Departamento de Biotecnologa y Bioqumica

del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados Campus Guanajuato, bajo la asesora de la

Dra. Mercedes G. Lpez.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mercedes G. Lpez, por su asesora, por e y especialmente por su inmensurable apoyo

(cientfico, moral y econmico). Oportuno que dirigi el

A los sinodales Dr. Luis E. Gonzlez de la Vara, Dr. John Paul Dlano F, Dra. Ana Paulina Barba

de la Rosa y Dr. Edgar Quero Gutirrez, por sus valiosas aportaciones que enriquecieron el

presente trabajo.

Al CONACyT, por apostarle a la ciencia y ayudar econmicamente a estudiantes que desean un

Mxico competitivo.

A todo el personal del Cinvestav-Guanajuato, al rea administrativa (Dora Elia Anguiano), de

intendencia (Daniel y Bertha) y de biblioteca (Mary Carmen Ruz) por su trato amable y su trabajo

siempre oportuno y eficiente.

Al Prof. Sjef Smeekens, de la Universidad de Utrecht, Holanda, por brindarme amablemente la

oportunidad de explorar en su laboratorio un campo cientfico nuevo para m.

A Tita Ritsema por sus finas atenciones y la paciencia con la que comparti y dirigi parte de este

trabajo.

Al Gobierno de los Pases Bajos por el otorgamiento de la Beca Huygens que me permiti realizar

una estancia doctoral en la Universidad de Utrecht.

Al CONACyT por el otorgamiento de una beca mixta, que sin lugar a dudas, fue de bastante

provecho para la calidad de la presente investigacin.

A la Dra. Petra Mischnick de la Universidad Tcnica de Braunschweig, Alemania, por su apoyo y

asesora en la qumica de carbohidratos.

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A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa del Instituto Potosino de Investigaciones Cientficas y

Tecnolgicas, por la oportunidad de hacer mil intentos en su laboratorio.

A mis amigos del laboratorio: Lul Macas, Blanca Aguilar, Mara Luisa Martnez, Tere Carrillo,

Isadora Jimnez, Octavio Carrillo, Claudia y Judith Urias, por su apoyo y entusiasmo contagiante.

A Tita Ritsema, Auke Verhaar, Fatima Rahmani, Anja van Dijken, Marcel Proveniers, Jolanda

Schuurmas, Anika Wiese, Henriette Schluepmann y Bas Dekkers, por su hospitalidad, por

mostrarme las maravillas de su pas y por hacerme sentir como en casa en un lugar con una

cultura diferente

A mis cubanos Lzaro Hernndez, Yanetsi Borroto, Yanet Tambara, Jos Angel y Rolando, porquesu hermandad y cario me han servido de soporte.

A mis amigos de siempre Lorena, Jimmy, Isis, Pedro y Lul, por su longeva amistad.

A mis paps, Jos Trinidad y Norma Ofelia, por su gran cario y apoyo incondicional.

A mis hermanos, Popo, Pity, Betito y Kiko, por toda la vida recorrida.

A mi esposo, Juan, por todo su amor y por los momentos compartidos.

A mis abuelitos, tos y primos.

A la pequea Ana y Caellou, por llenar de alegra nuestras vidas.

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NDICE

PginaI. RESUMEN 1II. INTRODUCCIN 2

III.

OBJETIVOS 5IV. ANTECEDENTESAGAVES Y DASYLIRION1.1. Clasificacin taxonmica 61.1.1.Agavaceae 71.1.2. Nolinaceae 81.2. Distribucin 101.3. Descripcin de los gneros y caractersticas delimitantes de las familias

Agavaceae y Nolinaceae 131.3.1. Agave 141.3.1.1.Agave tequilanaWeber var. azul 15

1.3.1.2.Agave angustifoliaHaworth 151.3.1.3.Agave potatorumZuccarini 161.3.1.4.Agave cantala 161.3.1.5.Agave fourcroydes 161.3.2. Dasylirion 171.4. Importancia econmica y cientfica1.4.1. Usos tradicionales 181.4.2. Usos ornamentales 181.4.3. Obtencin de fibras naturales 181.4.4. Obtencin y caracterizacin de fitoqumicos 191.4.5. Elaboracin de bebidas alcohlicas 191.4.5.1. Bebidas fermentadas 201.4.5.2. Bebidas destiladas 201.4.6. Elaboracin de edulcorantes fructosados 221.4.7. Utilizacin del bagazo 221.4.8. Propagacin in vitro 241.5. Influencia de la zona geogrfica en los agaves 251.6. Adaptacin de los agaves 291.6.1. Adaptacin morfolgica 301.6.1. 1. Hojas 301.6.1.2. Races 311.6.1.3. Tallo 331.6.2. Adaptacin fisiolgica 331.6.2.1. Metabolismo cido de las crassulaceas (CAM) 331.6.2.2. Bioqumica del metabolismo cido de las crassulaceas (CAM) 341.6.2.3. Acumulacin de fructanos 39FRUCTANOS2.1. Estructura 402.1.1. Mtodos analticos 432.1.2. Especificidad estructural 442.2. Metabolismo 45

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2.2.1. Complejidad metablica 502.2.2. Caracterizacin bioqumica 502.2.3. Caracterizacin molecular 552.2.4. Familia GH32 572.3. Fisiologa de los fructanos 60

2.3.1. Carbohidratos de reserva 602.3.2. Desarrollo vegetal 602.3.3. Defoliacin 622.3.4. Descarga apoplstica 642.3.5. Ajuste osmtico 642.3.6. Tolerancia al fro 642.3.7. Tolerancia a sequa 672.3.8. Defensa contra patgenos 692.4. Potencial biotecnolgico de los fructanos 71

V. JUSTIFICACIN 73VI. HIPTESIS 73

VII.

MATERIALES Y MTODOS 74A) Material Biolgico1. Regiones 742. Edad 743. Muestreo 74B) Metodologa1. Comparacin y caracterizacin estructural de carbohidratos de almacn enagaves y dasylirion1.1.Determinacin espectrofotomtrica1.1.1. Extraccin de carbohidratos totales 771.1.2. Determinacin de carbohidratos totales 771.1.3. Determinacin de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 771.1.4. Determinacin de fructanos 791.1.5. Determinacin de almidn 811.2. Extraccin de fructanos 821.3. Caracterizacin de fructanos1.3.1. Cromatografa en capa fina 821.3.2. Cromatografa lquida de alta resolucin 831.3.3. Derivatizacin de fructanos a alditol acetatos parcialmente metilados 841.4. Caracterizacin de fructanos deAgave tequilana 881.4.1. Espectrometra de masas por ionizacin/desorcin por lser asistida por

una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 881.4.2. Resonancia magntica nuclear de carbono 13 881.4.3. Resonancia magntica nuclear de protn 892. Identificacin de actividades enzimticas involucradas en el metabolismo de

fructanos2.1. Extraccin de protenas 892.2. Estrategias de purificacin 892.2.1. Cromatografa de afinidad 902.2.2. Cromatografa de intercambio aninico 90

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2.2.3. Cromatografa de hidroxiapatita 912.2.4. Cromatografa de exclusin en gel 912.3. Cuantificacin de protenas 922.4. Ensayos enzimticos 922.5. Separacin electrofortica 92

3. Identificacin y aislamiento de secuencias codificantes de enzimas delmetabolismo de fructanos de agave y su expresin en Pichia pastoris3.1. Aislamiento e identificacin de secuencias codificantes3.1.1. Extraccin de cido ribonucleico (ARN) 933.1.2. Geles de agarosa 943.1.3. Electroforesis en microchip 943.2. Obtencin de secuencias complementarias por transcripcin reversa 953.2.1. Diseo de oligonucletidos iniciadores 953.2.2. Amplificacin de secuencias complementarias 953.2.3. Elucin y purificacin de cido desoxiribonucleico (ADN) a partir

de bandas de agarosa 97

3.2.4. Preparacin de clulas competentes 973.2.5. Clonacin y transformacin 993.2.6. Purificacin de plsmidos 993.2.7. Confirmacin de la secuencia en el plsmido 1013.2.8. Identificacin de las secuencias 1013.3. Aislamiento de ADNc completo de la secuencia 1013.3.1. Amplificacin rpida del extremo 5 del ADN complementario (5-RACE) 1023.3.2. Amplificacin rpida del extremo 3 del ADN complementario (3-RACE) 1043.3.3. Ligacin y clonacin del ADNc completo 1043.4. Expresin en Pichia pastoris 1043.4.1. Eliminacin del pptido seal y secuencia de terminacin 1063.4.2. Propagacin del vector 1063.4.3. Transformacin de Pichia pastorisy anlisis de expresin 107

VIII. RESULTADOS1. Comparacin y caracterizacin estructural de carbohidratos de almacn en agavesy dasylirion1.1. Patrn de carbohidratos no estructurales 1081.2. Factores ontognicos 1091.3. Influencia del ambiente en el patrn de carbohidratos no estructurales 1101.4. Funcin de los fructanos en la sequa 1131.5. Presencia de almidn 1141.6. Perfil cromatogrfico de fructanos1.6.1. Cromatografa en capa fina 1161.6.2. Cromatografa lquida de alta resolucin 1181.7. Anlisis de enlaces por derivatizacin 1211.7.1. Cuantificacin de los glicosil-derivados 1261.7.2. Significancia de la diversidad estructural de fructanos 1291.8. Caracterizacin de fructanos deA. tequilana 1301.8.1. Espectrometra de masas por ionizacin/desorcin por lser asistida por

una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 1301.8.2. Resonancia magntica nuclear de carbono 13 130

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1.8.3. Resonancia magntica nuclear de protn 1351.9. Estructuras propuestas para fructanos enAgavey Dasylirion 1381.10. Posibles implicaciones de la presencia de fructanos en agaves y dasylirion 139

2. Identificacin de actividades metablicas involucradas en el metabolismo defructanos de agave y dasylirion

2.1. Estrategia Cromatogrfica I 1412.1.1. Cromatografa de afinidad 1412.1.2. Cromatografa de intercambio aninico 1432.1.3. Cromatografa de hidroxiapatita 1452.1.4. Cromatografa de exclusin en gel 1482.1.5. Identificacin putativa de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos 1492.2. Estrategia Cromatogrfica II 1512.2.1. Extracto crudo 1512.2.2. Cromatografa de intercambio aninico 1552.2.3. Cromatografa de afinidad 1602.2.4. Actividades fructosiltransferasas identificadas en agaves y dasylirion 161

3. Aislamiento e identificacin de secuencias codificantes de enzimas del metabolismode fructanos de agave y su expresin en Pichia pastoris3.1. Extraccin de cido ribonucleico 1633.2. Amplificacin de fragmentos de cido desoxiribonucleico complementario (ADNc)

a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 1633.3. Identidad de los fragmentos amplificados 1653.4. Amplificacin del ADNc completo de la fructosiltransferasa de Agave tequilana(atft)3.4.1. Amplificacin de los extremos terminales 3 y 5 1723.4.2. Determinacin de la orientacin de los insertos en el vector 1743.4.3. Ligacin del ADNc completo de atft 1763.5. Anlisis de la secuencia atft 1783.5.1. Uso de codones del ADNc de atft 1803.5.2. Identificacin de la protena madura 1803.5.3. Glicosilhidrolasa 32 1863.6. Expresin heterloga de atft 1883.6.1. Construccin del vector pGAPZC-atft 1883.6.2. Anlisis de expresin 1893.6.3. Identidad de la AtFT 192IX. CONCLUSIONES 195X. PERSPECTIVAS 196XI. APNDICESA.- Preparacin de soluciones 198B.- Anlisis de fragmentacin de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA) 200C.- Desplazamientos qumicos de 13C-fructanos 207D.- Secuencias aisladas 212XII. REFERENCIAS 217

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NDICE DE FIGURAS

PginaFigura 1. Mayahuel 6Figura 2.Clasificacin taxonmica deAgavey Dasylirion 8Figura 3. Caractersticas morfolgicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae 11

Figura 4. Distribucin de las familias Agavaceae y Nolinaceae 12Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel 23Figura 6.Influencia de factores abiticos en la asimilacin de CO2enA. lechuguilla 26Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilacin de CO2enA. tequilana 27Figura 8. reas ptimas, subptimas y marginales para el cultivo deA. tequilanaen Jalisco 28Figura 9.Cambios en la velocidad de respiracin durante sequa en races de lluvia y

establecidas enA. deserti 32Figura 10.Diferencia de temperatura entre el rea foliar (de maz o agave) y el aire circundante 33Figura 11. Metabolismo cido de las crassulaceas 35Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM 38Figura 13.Unidades estructurales de los fructanos 42Figura 14.Rango de grados de polimerizacin (DP) en especies que acumulan fructanos 45

Figura 15.Diferentes vas biosintticas de fructanos en plantas superiores 48Figura 16. Regulacin de la actividad de fructosiltransferasas 54Figura 17. Alineamiento de protenas pertenecientes a las familias GH32 y G68 57Figura 18.Mecanismos catalticos de las glicosilhidrolasas 59Figura 19.Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores 61Figura 20. Efecto de la defoliacin en el metabolismo de fructanos 63Figura 21.Metabolismo de fructanos enAvena sativabajo estrs por fro 66Figura 22.Fructanos en estrs por sequa 68Figura 23.Modelo propuesto de la participacin de fructanos en la resistencia a patgenos 70Figura 24.Esquema general de trabajo 76Figura 25.Programa de elucin utilizado en la separacin cromatogrfica de fructanos

deAgavey Dasylirion 83

Figura 26.Metodologa de derivatizacin de carbohidratos a PMAA 85Figura 27.Diseo de oligonucletidos degenerados 98Figura 28.Vector pGEM-T Easy 100Figura 29.Amplificacin de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE) 102Figura 30. Mapa del vector pGAPZC 105Figura 31.Contenido de carbohidratos no estructurales solubles 109Figura 32. Presencia de almidn en especies deAgavey Dasylirion 115Figura 33.Cromatografa en capa fina de fructanos deAgavey Dasylirion 117Figura 34.Perfil cromatogrfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con

fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos) 119Figura 35. Perfil de elusin, utilizando cromatografa de gases, de fructanos deAgavey

Dasylirionderivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados 122Figura 36.Comparacin de fructanos derivatizados en tres especies vegetales 123Figura 37.Cuantificacin de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas 127Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos deA. tequilana 131Figura 39.Espectro de 13C-RMN de fructanos deA. tequilana 131Figura 40.Espectros de 13C-RMN de fructanos en Asparagales 135Figura 41.Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahilia variabilisyAgave tequilana 136Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes enAgavey Dasylirion 139Figura 43.Cromatografa de afinidad a concanavalina A 142

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Figura 44.Cromatografa de intercambio aninico 144Figura 45.Cromatografa de hidroxiapatita 146Figura 46.Cromatografa de exclusin en gel 148Figura 47.Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante 150Figura 48.Perfil cromatogrfico de fructanos sintetizados por el extracto crudo deA. potatorum 152Figura 49.Cromatografa de intercambio aninico 156

Figura 50.Actividades hidrolticas de la fraccin Q0 157Figura 51.Perfil cromatogrfico de productos del ensayo enzimtico de las fracciones de

intercambio aninico deA. potatorum 158Figura 52.Productos de la accin enzimtica de las fracciones afines a concanavalina A 160Figura 53.Modelo propuesto para la biosntesis de fructanos enAgavey Dasylirion 162Figura 54.Extraccin de ARN 164Figura 55.Amplificacin de fragmentos con oligonucletidos degenerados 165Figura 56. Anlisis de restriccin de productos amplificados con oligonucletidos degenerados 166Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas 168Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados deA. tequilanacon enzimas

relacionadas al metabolismo de fructanos 170Figura 59. Amplificacin rpida de los extremos del DNAc de atftmediado por la ARN ligasa 173

Figura 60. Orientacin de los insertos At5- y At3-RACE en el vector pGEM-T Easy 175Figura 61. Estrategia de clonacin para la obtencin del plsmido pGEM T-atft 177Figura 62.Digestin y anlisis de restriccin 178Figura 63. rbol filogentico sin raz de enzimas del metabolismo de fructanos 179Figura 64.Prediccin del pptido seal en AtFT 182Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT 184Figura 66.Perfil cromatogrfico de productos generados de AtFT excretada al medio

Extracelular 190Figura 67. Perfil cromatogrfico de los productos generados de AtFT contenida en la fraccin

celular 192

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NDICE DE TABLAS

PginaTabla 1. Clasificacin de subgneros y grupos deAgave 9Tabla 2. Composicin del aguamiel y pulque 21Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM 25

Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo deA. tequilanaen Jalisco 29Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a fro extremo 29Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitacin deA. tequilanayA. deserti sometidos a sequa 31Tabla 7. Comparacin de parmetros fisiolgicos de Zea mays yAgave americana 34Tabla 8. Clasificacin taxonmica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas 37Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas 41Tabla 10.Predominancia estructural de fructanos segn la especie 46Tabla 11. Propiedades cinticas de distintas fructosiltransferasas 51Tabla 12.Muestreo de especies deAgavey Dasylirion 75Tabla 13.Determinacin enzimtica de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 78Tabla 14. Secuencia de los oligonucletidos utilizados 96Tabla 15.Identificacin de fructanos eludos en un sistema cromatogrfico intercambio

aninico de alta resolucin (HPAEC-PAD) 120Tabla 16.PMAA en fructanos deAgavey Dasylirion spp., Dahlia variabilisyAllium cepa 125Tabla 17.Contribucin relativa de compuestos derivatizados en los fructanos 128Tabla 18.Correlacin entre diferentes compuestos derivatizados 128Tabla 19.Desplazamientos qumicos de 13C-RMN de fructanos 133Tabla 20.Desplazamientos qumicos de 1H-RMN de fructanos 137Tabla 21.Calibracin de la columna de exclusin y estimacin de pesos moleculares de las

fracciones protenicas 149Tabla 22.Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1-

kestotriosa como sustrato 153Tabla 23.Secuencias de enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 167Tabla 24.Uso de codones en el ADNc de atft 181

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ABREVIATURAS UTILIZADASDEPC Dietil pirocarbonatod.i. Dimetro internodATP Adenosin desoxitrifosfatodCTP Citocin desoxitrifosfatodGTP Guanidin desoxitrifosfatoDMSO Dimetil sulfxidodNTP Mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTPdTTP Tiamin desoxitrifosfatosDTT Ditiotreitole.r.c. Respuesta efectiva de carbono (effective response of carbon)EPI ndice productivo ambiental (environmental productive index)FOS Fructo-oligosacridosGC-FID Cromatografa de gases acoplado a detector de ionizacin en flama (gas

chromatography coupled to flame ionization detector)

GC-MS Cromatografa de gases acoplado a espectrometra de masas (gaschromatography coupled to mass spectrometry)

GH GlicosilhidrolasaHPAEC-PAD Cromatografa de intercambio aninico de alta resolucin acoplado a detector de

pulso amperomtrico (high performance anionic exchange chromatography-pulseamperometric detector)

HPLC Cromatografa lquida de alta resolucin (high performance liquid chromatography)Inv-CW Invertasa de pared celular (invertase-cell wall)Inv-V Invertasa vacuolarIOS Inulo-oligosacridosKD Coeficiente de distribucin de la masa molecularKh Conductividad hidrulica1-KES 1-Kestotriosa (O--D-Glcp-(1-2)-O--D-Fruf-(2-1)--D-Fruf)6-Kes 6-Kestotriosa (O--D-Glcp-(1-2)-O--D-Fruf-(6-2)--D-Fruf)6G-Kes 6-Glucosa-kestotriosa o neokestosa (O--D-Fruf-(2-6)-O--D-Glcp-(1-2)--D-Fruf)6-KES 6-Kestosa exohidrolasaPAHBAH Hidracida del cidop-hidroxibenzoicoPAR Radiacin fotosintticamente activa (photosynthetically active radiation)PCR Reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)PH Process hardinessPMAA Alditol acetato parcialmente metilado (partially methylated alditol acetate)RMN Resonancia magntica nuclear

TAE Buffer Tris-HCl 40 mM, cido actico 20 mM, EDTA 1mMTE Buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0.TFA cido trifluoroactico (Trifluoroacetic Acid)TLC Cromatografa en capa fina (thin layer chromatography)

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I. RESUMEN

Los agaves son parte del 15% de plantas superiores que almacenan fructanos, polmeros de

fructosa sintetizados a partir de la acumulacin de sacarosa en la vacuola. Existen cinco tipos

estructurales de fructanos, segn la manera en que los residuos -D-fructofuranosa son

transferidos por las fructosiltransferasas, enzimas involucradas en su metabolismo. La

acumulacin de algn tipo de fructanos parece depender de la especie, y la presencia de stos se

sugiere importante en la tolerancia a distintos tipos de estrs abitico.

En el presente trabajo se caracteriz la estructura de fructanos y se compar el patrn de

carbohidratos no estructurales en varias especies de agave, crecidas en distintas regiones

climticas; incluyendo, adems, a Dasylirionspp., una especie poco estudiada pero morfolgica y

taxonmicamente relacionada con los agaves. El contenido de fructanos en los tallos de agavefue superior al 60% (peso seco) y dasylirion acumul solo el 17%; mientras que, el almidn en

estas especies no represent ms del 2%. Las diferencias entre especies fueron cuantitativas ms

que cualitativas, encontrndose una correlacin de la concentracin de fructanos y aquellos

involucrados en su metabolismo (fructosa, glucosa, sacarosa) con las condiciones ambientales

donde estas plantas fueron colectadas (por ejemplo, ms fructosa en plantas colectadas en

regiones ridas). La diversidad de fructanos fue evidenciada por tcnicas cromatogrficas (TLC,

HPAEC-PAD) y espectroscpicas de alta resolucin (NMR, MALDI-TOF-MS), que permitieronproponer estructuras complejas, hasta ahora no reportadas, que hemos denominado agavinas.

La diversidad estructural coincidi perfectamente con las diferentes actividades fructosiltransferasa

identificadas en un extracto protenico de Agave tequilana, que utilizando sacarosa como nico

sustrato, produjo un perfil de fructanos semejante a lo observado in vivo. A travs de distintos

pasos cromatogrficos se lleg a un enriquecimiento de la actividad de enzimas involucradas en

el metabolismo de fructanos en agaves.

Finalmente, se aisl un ADNc de Agave tequilana con una mayor homologa a la enzima

fructan:fructan-6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) reportada en esprrago y cebolla; sin

embargo, su expresin en el sistema de expresin de Pichia pastoris, evidenci una principal

actividad de 1-fructan:fructan fructosiltransferasa (1-FFT). ste constituye el primer ADNc aislado

en la importante familia Agavaceae y el primer 1-FFT del orden Asparagales.

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II. INTRODUCCIN

Los fructanos son carbohidratos de reserva sintetizados por solo el 15% de las plantas superiores,

y aunque han sido tpico de investigacin desde hace 200 aos aproximadamente, hay aspectos

estructurales, fisiolgicos y evolutivos que an faltan por ser elucidados. La presencia de fructanos

en agaves es reportada desde la dcada de los aos 50 y 70; sin embargo, estos estudios son

limitados aAgave vera cruz, una especie que crece en la regin de Asia y actualmente est casi

extinta. Solo recientemente, la investigacin de fructanos en agave ha resurgido, enfocndose

principalmente aAgave tequilana, especie de gran relevancia industrial en nuestro pas, debido a

que la hidrlisis de sus fructanos constituye el sustrato fermentable en la produccin de tequila.

Los fructanos son polmeros de fructosa que se sintetizan en la vacuola como respuesta a una

acumulacin de sacarosa en este organelo. Las fructosiltransferasas (FT), enzimas que participanen su metabolismo, adicionan residuos de -D-fructofuranosa a una unidad de sacarosa utilizada

como aceptor inicial. Los cinco tipos estructurales de fructanos descritos hasta ahora, son

resultado de las distintas formas en que las diversas enzimas transfieren los residuos de fructosa.

La 1-sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa (1-SST), es la enzima inicial que transfiere una unidad

de fructosa de una molcula de sacarosa a otra. La 1-kestotriosa as formada (G-F-F), es el

metabolito central utilizado por las dems FT en la sntesis de fructanos superiores. La 1-

fructan:fructan-fructosil-transferasa (1-FFT) elonga el polmero mediante enlaces (2-1),generando el fructano conocido como inulina; la 6-SFT sintetiza levanos, esto es, polmeros

lineales con enlaces (2-6) o introduce este tipo de enlace en una molcula de inulina existente,

produciendo los graminanos o fructanos ramificados; por su parte, la fructan:fructan-6-glucosa-

fructosiltransferasa (6G-FFT) transfiere residuos de fructosa al carbono 6 de la glucosa, generando

los denominados neofructanos (inulina- o levano-neoserie, dependiendo del enlace),

caracterizados por tener una unidad de glucosa entre dos molculas de fructosa. Finalmente, en el

metabolismo de estas biomolculas, adems participan la fructan exohidrolasa (FEH) y la

invertasa vacuolar (Inv-V). La primera enzima degrada los polmeros hidrolizando la fructosa

localizada en un extremo; mientras que el papel de la Inv-V es controversial en el anlisis

metablico de estos carbohidratos, ya que es capaz de sintetizar o hidrolizar algunos fructanos

dependiendo de las condiciones de reaccin.

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La acumulacin de un tipo especfico de fructanos parece seguir un patrn que depende de la

especie, por lo que se ha sugerido que la determinacin estructural de fructanos puede utilizarse

como criterio adicional en la clasificacin taxonmica de las especies. Por otra parte, aunque no

hay un mecanismo completamente entendido, existen evidencias experimentales que sugieren la

importancia de los fructanos en la tolerancia de algunas especies a distintos tipos de estrs

abitico, como sequa, fro o salinidad, o en una mayor resistencia contra organismos patgenos,

como los hongos Thyphula incarnata, T. ishikariensisyMicrodochimm nivale.

Las implicaciones evolutivas de los fructanos y de su diversidad estructural estn lejos de ser

claras; sin embargo, algunos autores coinciden que la disponibilidad limitada de agua, fue el

principal factor climtico que dio origen a las plantas que acumulan este tipo de carbohidratos. El

orden Asparagales, donde se incluye a las familias Agavaceae y Nolinaceae, contiene especies

sintetizadoras de fructanos ampliamente distribuidas en distintos ecosistemas. Este orden no esconsiderado altamente evolucionado, como los dems rdenes que almacenan fructanos.

Adicionalmente, los restos ms antiguos de plantas que sintetizan estos polmeros, corresponden

a una flora que parece ser el ancestro de los agaves actuales.

La sorprendente capacidad de los agaves para desarrollarse en ambientes hostiles, adems de las

caractersticas morfolgicas (hojas suculentas) y fisiolgicas (metabolismo CAM) especializadas

para la supervivencia en condiciones de sequa, permite la especulacin de que el metabolismo

de fructanos pudo haber sido un factor adicional importante en la adaptacin de la flora ancestral,

y que actualmente sigue jugando un papel destacado en el desarrollo de los agaves en ambientes

ridos, caracterizados por una limitacin importante de agua.

En el intento de lograr un mejor entendimiento de la fisiologa de los fructanos y su implicacin en

el mecanismo de tolerancia al estrs abitico de la sequa en agaves, en el presente trabajo se

determinaron las caractersticas estructurales de los fructanos almacenados por cinco especies de

agave crecidas en distintas regiones geogrficas de la Repblica Mexicana, con la finalidad de

encontrar una posible correlacin entre la concentracin y tipo de fructanos con las caractersticas

climticas donde se establecen las especies estudiadas. Se incluy adems, especies silvestres

de Dasylirion(de la familia Nolinaceae), para buscar una posible distincin estructural debida a la

diferencia de gneros. De acuerdo a nuestro conocimiento, es la primera vez que la presencia y

caracterizacin de fructanos en Dasylirion spp. es analizada a profundidad. As mismo, se

identificaron las principales actividades enzimticas involucradas en la sntesis de fructanos y se

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aisl el ADNc de una fructosiltransferasa, en el primer intento de encaminar las futuras

investigaciones al estudio de la regulacin del metabolismo de fructanos en Agavaceae.

Un mejor conocimiento de la estructura de fructanos y la regulacin de su metabolismo enAgavey

Dasylirion, pueden generar perspectivas en el conocimiento cientfico y en sus aplicaciones

biotecnolgicas.

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III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar los fructanos presentes en especies de Agave y Dasylirion spp,, identificar las

principales enzimas involucradas en su metabolismo y aislar sus secuencias codificantes.

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Caracterizar y comparar la estructura de carbohidratos de almacn en cinco especies de

Agavey Dasylirion spp.y correlacionarla con las caractersticas climticas de las regionesdonde crecieron las plantas.

2. Identificar las principales actividades enzimticas involucradas en el metabolismo de

fructanos en estas especies.

3. Aislar el ADNc de las principales enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos de

Agave tequilanaWeber var. azul.

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IV. ANTECEDENTES

1.- AGAVES Y DASYLIRION

Los agaves y algunos miembros de la familia Nolinaceae, como Dasylirion spp., son plantas que

han acompaado al hombre a lo largo de su historia y evolucin, desde los primeros pobladores

mesoamericanos hasta la actualidad. En tiempos prehispnicos, metl (agave en nhuatl, que

tambin incluye a Dasylirion y especies relacionadas, Gentry, 1998) fue considerado como un

regalo de los dioses, la primera planta que stos haban creado y su importancia para estas

sociedades, es evidente en su legado de cdices y pinturas rupestres, donde Mayahuel, la diosa

del agave, es fcilmente identificable por sus pencas, su inflorescencia estilizada y el espumoso

pulque sobre su cabello o en una vasija entre sus manos (Figura 1) (Gentry, 1998). Agave y

Dasylirion han sido cultivos claves, componentes primarios de productividad en virtualmentecualquier tipo de zona agrcola, desde tierras altas, productivas y de alta humedad, hasta aquellas

zonas secas e infrtiles donde en ocasiones son cultivos dominantes o exclusivos (Parsons y

Darling, 2000).

1.1. CLASIFICACIN TAXONMICA

Los miembros de las familias Agavaceae y Nolinaceae presentan un alto grado de convergencia

morfolgica, lo que dificulta el estudio de su evolucin y taxonoma (Eguiarte, 1995).

Figura 1. Mayahuel. Representacin prehispnica de la deidad del agave. Mayahuel representa lafertilidad, una diosa que alimenta con sus 400 pechos a sus 400 hijos, todos ellos dioses de laembriaguez.

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La divergencia evolutiva de los agaves parece haber sucedido hace 60 millones de aos, durante

el Eoceno; mientras que la separacin entre Agavaceaesensu strictoy Nolinaceae habr ocurrido

hace 47 millones de aos, se calcula que su dispersin fue hace 35 millones de aos, y que sus

tallos y hojas suculentas son caractersticas ms recientemente adquiridas (Eguiarte, 1995; Nobel,

1998).

1.1.1. AGAVACEAE

Carlos Linneo estableci el gnero Agave en 1753 describiendo cuatro especies:A. americana,A.

vivipara, A. foetida(ahora en el gnero Furchraea) yA. virginica(ahora en el gnero Manfreda)

(Gentry, 1998). La familia Agavaceae fue creada en 1836 por el botnico australiano Stephen

Endlicher incluyendo el gnero Agavey Furcraea. Richard A. Salisbury en 1866 dividi la familia

en dos secciones: agaves con ovario spero donde el gnero Yuccaestaba incluido y aquellos conovario nfero, donde se incluyeron a los gneros Agavaea, Furcraea, Littaea, Manfreda y

Polianthes. Sin embargo, como lo manifest en 1871 Joseph Hooker, la familia ha sido difcil de

clasificar, dada la amplia distribucin, presencia de hbridos, tardanza de la emergencia floral (8-50

aos) y variabilidad de estas especies dependiendo de la geografa y el clima (Pea-lvarez et al.,

2004). Una discrepancia en la clasificacin esta dada por la semejanza en la estructura floral,

propiedades de tejido y compuestos qumicos con algunos miembros de la familia Amaryllidaceae

(sbila), Alliaceae (cebolla) y Asparagaceae (esprrago) (Nobel, 1998).

Actualmente, la clasificacin reportada por Dahlgren, Clifford y Jeo (1985) es la ms aceptada. En

un anlisis de monocotiledneas basado en el nmero cromosomal, anlisis anatmico, qumico,

biogeogrfico y cladsitico, proponen al orden Asparagales con 30 familias, incluyendo Agavaceae,

Nolinaceae, Asparagaceae, Dracaenaceae, Alliaceae y Amarallidaceae (Figura 2). Describen a la

familia Agavaceae como restringida al continente americano y dividida en dos subfamilias:

Yuccoideae, con ovario spero (Yucca y Hesperale) y Agavoideae con ovario nfero (Agave,

Beschorneria, Furcraea, Manfreda, Polianthesy Prochnyanthes). Esta clasificacin es apoyada por

anlisis palinolgicos y secuencias del ADN cloroplstico del gen rbcL (subunidad grande de la

Rubisco) (Ojeda y Ludlow, 1995; Eguiarte, 1995).

En la subfamilia Agavoideae, el gnero Agave es el ms importante y fue dividido por Gentry

(1982) en dos subgneros y grupos de acuerdo a su inflorescencia (Tabla 1): Littaea, con un

rgano floral espigado yAgave, cuya inflorescencia es paniculada y con ramificaciones (Figura 3).

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1.1.2. NOLINACEAE

La familia Nolinaceae fue propuesta en 1936 por el botnico japons Takenoshin Nakai, pero sta

no fue aceptada hasta 1985, cuando Dahlgren y col. reconocieron dicha separacin e incluyeron

en la familia Nolinaceae a los gneros Beaucarnea, Calibanus, Dasylirion y Nolina (Figura 2),

todos ellos con ovario spero y al parecer, sta es una familia de origen monofiltico, actualmente

con 55 especies y 60 taxa.

DIVISIN Angisoperma

CLASE Liliopsida Magnoliopsida(Monocotiledonae) (Dicotiledonae)

RDEN Asparagales Otros rdenes

FAMILIA Agavaceae Nolinaceae Otras 28 familias*

SUBFAMILIA Agavoideae Yuccoideae

GNERO Beschorneria Yucca BeucarneaFurcraea Hesperale CalibanusManfreda NolinaPolianthes DasylirionProchynathes

Agave

SUBGNERO Littaea(8 secciones) Agave(12 secciones)

Figura 2. Clasificacin taxonmica de Agave y Dasylirion. Clasificacin propuesta porDahlgren, Clifford y Jeo en 1995. *Alliaceae, Amaryllidaceae, Anthericaceae, Aphyllanthaceae,Asparagaceae, Asphodelaceae, Asteliaceae, Blandfordiaceae, Calectasiaceae, Convallariaceae,Cyanastraceae, Dasypogonaceae, Dracaenaceae, Doryanthaceae, Eriospermaceae, Funkiaceae,Hanguanaceae, Hemerocallidaceae, Herreriaceae, Hyacinthaceae, Hypoxidaceae, Ixioliriaceae,Luzuriagaceae, Philesaciae, Phormiaceae, Ruscaceae, Tecophilaeaceae, Xanthorrhoeaceae.

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Tabla 1. Clasificacin de subgneros y grupos deAgave.Subgnero Grupos Caractersticas No.

especiesEjemplos

Littaea Amolae* acaulescentes 8 attenuata, bakeri,pedunculifera, chrysoglossa,ocahui, vilmoriniana,

yuccaefoliaChoritepalae* especies pequeas,

tepalos separados3 bracteosa, ellemeetiana,

guiengolaFiliferae* hojas largas filferas,

limitados a la Sierra MadreOccidental

7 colimana, felgeri, filifera,geminiflora,multifilifera, ornithobroma,schidigera

Marginatae pequeas flores, largostepalos

21 albomarginata, ensifera,ghiesbreghtii, horrida,kerchovei, lechuguilla,lophanta, pelona, pumilla

Parviflorae pequeas flores altamenteespecializadaalto contenido desapogeninas

4 parviflora, polianthiflora,schotti, toumeyana

Polycephalae* hojas y flores de suavesuculencia,dientes pequeos

5 celsii, chiapensis, pendula,polyacantha,warelliana

Striatae* hojas aserradas, flores ytepalos pequeos

3 dasyliroides, striata, stricta

Urcerolate tamao pequeo, florespequeas enforma de urna

2 arizonica, utahensis

Agave Americanae flores amarillas de pedicelolargo

6 americana, franzosini, lurida,oroensis, scabra,scaposa

Campaniflorae* rosetas cortas, hojaslargas verdes

3 aurea, capensis, promontorii

Crenatae mrgenes mamilados,pancula estrecha

7 bovicornuta, calodonta,cupreata, hookeri,inaequidens, jaiboli,maximiliana

Deserticolae hojas rgidas fibrosas,lanceoladas, ydientes dbiles, panculadelgada

10 avellanidensis, cerulata,deserti, gigantensis,margaritae, mckelveyana,moranni, sobria

Ditepalae pancula abierta, tepaloscortos dimrficos

10 applanata, chrysantha,colorata,flexispina, fortiflora, murpheyi,

palmeri

Hiemiflorae flores agrupadas en formaesfrica en una panculadelgada

12 atrovirens, congesta,hiemiflora, hurteri,lagunae, pachycentra,

potatorum

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Marmoratae* pocas hojas escabrosas,espina pequea

4 gypsophila, marmorata,nayaritensis, zebra

Parryanae roseta globosa, compacta,hojas cortas, anchas,dientes conspicuos haciala hoja

6 gracilipes, guadalajarana,havardiana,neomexicana, parrasana,

parryi

Rigidade hojas delgadas rgidas,dispuestas en espiral,bracteas pequeas,abiertas poco ramificadas

12 aktites, angustifolia, cantala,fourcroydeskarwinskii, macroacantha,tequilana

Salmianae largas rosetas verdessuculentas forma piramidalen la base de la pancula

5 macroculmis, mapisaga,salmiana, tecta,ragusae

Sisalanae hojas lanceoladas,carnosas, verdes

5 desmettiana, kewensis,neglecta, sisalana, weberi,

Umbelliflorae Pancula umbeladasostenida por un tallosuculento

2 shawii, sebastiana

Clasificacin propuesta por Gentry (1982), * grupos endmicos de Mxico de acuerdo a Garca-Mendoza (1992).

1.2. DISTRIBUCIN

Los agaves son de gran significancia para Mxico, pues ste se considera centro de origen,

evolucin y diversificacin del gnero. Aproximadamente el 87% (272) de las especies descritas,

se encuentran ampliamente adaptadas y distribuidas en los diversos ecosistemas de nuestro

territorio; adems de la presencia de especies menos evolucionadas y endmicas (Lpez et al.;

2003). La familia Agavaceae se distribuye desde el sur de Canad, Estados Unidos, Mxico,Centroamrica y norte de Sudamrica, siguiendo la cadena montaosa de los Andes, hasta

Bolivia, Paraguay e islas del Caribe (Figura 4) (Garca-Mendoza y Galvn, 1995).A pesar de que

estas plantas son nativas de regiones ridas y semiridas, crecen en distintas elevaciones, desde

el nivel del mar hasta ms de 2100 m, y en habitats tan variados como bosques, colinas secas,

planicies ridas y a la orilla del mar (Irish, 2000). La distribucin de los gneros Beschcorneria,

Furcraea, Polianthes y Prochnyanthes est restringida a Mxico (Ojeda y Ludlow, 1995). La

presencia de algunos agaves en Asia y en el Mediterrneo se considera como dispersin de laespecie por la mano del hombre.

Por su parte, la distribucin de Nolinaceae es an ms restringida. Sus cuatro gneros son

endmicos del sur de Norteamrica (Carolina, Georgia, Florida, Colorado, Texas), Mxico y parte

de Centroamrica (Guatemala, Belice, Honduras). De aproximadamente 55 especies, en Mxico

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Figura 3. Caractersticas morfolgicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae.

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Figura 4. Distribucin de las familias Agavaceae y Nolinaceae.Modificada de Garca-Mendozay Galvn 1995.

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se encuentran 49 (89%) (Figura 4) (Garca-Mendoza y Galvn, 1995), siendo la distribucin de

Beaucarnearestringida en nuestro pas (Ojeda y Ludlow, 1995).

1.3. DESCRIPCIN DE LOS GNEROS Y CARACTERSTICAS DELIMITANTES DE LAS

FAMILIAS AGAVACEA Y NOLINACEAE

Las familias Agavaceae y Nolinaceae son monocotiledneas con similitud entre ellas y con otros

miembros del orden Asparagales, en el crecimiento de sus hojas en forma de roseta, nmero de

hojas de 20 hasta ms de 200, ramilletes florales de seis flores con 6 estambres y 6 tepalos (este

ltimo trmino refiere a la combinacin de 3 ptalos y 3 spalos indistinguibles uno de otro).

Cuando las plantas alcanzan su madurez, la inflorescencia emerge de la roseta con ovarios

segmentados en tres cmaras. A pesar de dichas similitudes, estas familias difieren en algunos

puntos.Anlisis citolgicos de los agaves han determinado un nmero cromosomal x = 30 y unahaploida que oscila entre diplode y hexaplode (tequilana, 2x = 60) (Ruvalcaba-Ruiz y Rodrguez-

Garay, 2002), con 5 cromosomas largos y 25 cortos. En contraste, la familia Nolinaceae tiene 19

cromosomas, todos del mismo tamao. Los agaves tienen flores perfectas, es decir, la parte

masculina y femenina se encuentran en la misma planta; mientras que las de Nolinaceae son

dioicas, las flores masculinas y femeninas se encuentran en distintas plantas. Las flores de las

Agavaceae son de colores y tamaos variados (al menos de 2.5 cm de largo), mientras que las

Nolinaceae son invariablemente de color crema y pequeas (menores de 2.5 mm) (Figura 3). En

las de Agavaceae, algunos gneros como Agave y Furcraea son monocrpicas, es decir, las

rosetas mueren despus de florecer; mientras que las de Nolinaceae son policrpicas y sus

rosetas producen inflorescencia en mltiples aos. Con algunas excepciones, los frutos de las

Agavaceae son dehiscentes con mltiples semillas planas y negras (con fitomelanos) contenidas

en lculos de tres cavidades que se dispersan en la madurez; mientras que los frutos de las

Nolinaceae son indehiscentes con 1 a 6 semillas redondas y cafs (sin fitomelanos) que

permanecen en el fruto (Garca-Mendoza, 1992). A pesar de esto, es importante mencionar que

dada las similitudes compartidas entre estos dos gneros, muchas veces DasylirionyAgaveson

comparadas e incluso estudiadas juntas.

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1.3.1. AGAVE

Los agaves se consideran plantas perennes, pues su ciclo de crecimiento y floracin toma ms de

una estacin de crecimiento. Sus hojas generalmente son duras y rgidas (Figura 3), aunque

tambin hay especies de hojas laxas. Muchos agaves, en sus hojas contienen una espina terminal

y/o prominentes dientes marginales rectos o curveados, minsculos o largos y planos o

redondeados, siendo todas estas caractersticas tiles en la clasificacin taxonmica; aunque el

color de los dientes y las espinas pueden variar con la edad, medioambiente o condicin fisiolgica

de la planta (Gentry, 1998; Irish, 2000). Sus tallos generalmente son pequeos, muchas veces son

slo una base escondida entre la masa de hojas que de ste emergen, y son raras las especies

que forman troncos de tamao considerable. La inflorescencia emerge del tallo de manera

espectacular cuando la planta llega a la madurez, alcanzando 1.8 m en especies pequeas y

hasta 12 m en las ms grandes. sta tarda en emerger dependiendo de la especie: A. tequilanatoma de 8 a 10 aos,A. fourcroydeslo hace alrededor de 15 aos y en A. desertisucede cuando

la planta alcanza la edad aproximada de 55 aos (Nobel, 1987). El largo tiempo en que la planta

comienza a florecer favorece que la propagacin de la especie sea principalmente asexual a

travs de la generacin de rizomas o hijuelos. Sin embargo, la edad y frecuencia con que los

agaves comienzan a producir hijuelos tambin es variable: a A. tequilana le toma 3 aos y A.

deserti los produce despus de los 13 aos (Nobel y Quero, 1986). Por otro lado, algunas

especies producen rizomas de manera prolfica, mientras que otros llegan a producir uno o dos

rizomas en toda su vida. Las flores establecidas comienzan a abrir desde la base hasta la punta

del tallo floral; sus 6 tpalos son duros, sostenidos en dos grupos de tres, en algunos casos con

una disposicin de ramillete o fusionados con el tejido ovrico. Las flores de las formas

paniculadas son ms resistentes y duraderas que las formas espigadas, influyendo esto en el tipo

de animales que las polinizan, siendo murcilagos y pjaros en el primer caso y pequeos

insectos en el segundo (Figura 3).

Variedades distintas de agave tienen diferentes propiedades y caractersticas; algunas por

ejemplo, son mejores productoras de savia, otras son mejores en la obtencin de fibras y otras

tantas se desarrollan mejor en suelos con ciertas caractersticas. El orgen para la diversidad

botnica de estas especies se sugiere como resultado de una seleccin prehistrica humana con

el fin de incrementar cualidades especficas, aumentando as el sistema productivo del agave

diversificado y especializado (Parsons y Darling, 2000).

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1.3.1.1.Agave tequilanaWeber var. azul

A. tequilana es una planta suculenta de tallo grueso y corto que alcanza de 30 a 50 cm en la

madurez. El rgano floral mide de 5 a 6 m y es densamente ramificado con 20 a 25 umbelas

largas con flores verdes de 68 a 75 mm de largo, sostenidas sobre pequeos pedicelos

bracteolados. Las pencas se extienden radialmente con una longitud de 90 a 120 cm de largo por

8 a 12 cm de ancho, son lanceoladas, acuminadas, fibrosas, cncavas, ms anchas en medio,

volvindose angostas y ms gruesas hacia la base; presentan un color azul verdoso que le da

nombre a su variedad, con un margen regularmente dentado y espinas aplanadas de 1 a 2 cm de

largo.A. tequilanaalcanza su madurez fisiolgica entre los 8 y 12 aos. Para fines comerciales, la

inflorescencia se corta cuando comienza a emerger; de esta manera los carbohidratos destinados

a la emergencia floral son ahora acumulados en el tallo.

1.3.1.2.Agave angustifoliaHaworth

El tamao y forma de A. angustifoliaes altamente variable, su roseta puede ser de 1 a 1.5 m de

alto y de 2 a 2.4 m de ancho; la formas varigatas son mucho ms pequeas. Las plantas producen

numerosos hijuelos, por lo que raramente son plantas solitarias. Sus hojas lanceoladas son

numerosas y rgidas, de 2.5 a 10 cm de ancho y de 0.6 a 1.2 m de largo, planas en la superficie,

convexas hacia la punta, angostas y gruesas hacia la base. El color de sus pencas vara de verde

a verde grisceo, con pequeos dientes curveados y espaciados cada 1.3 a 3.8 cm y una espina

terminal corta, generalmente color caf o de color granate o negro. La inflorescencia paniculada de

A. angustifoliaes de 3 a 5 m de largo con 10 a 20 ramificaciones con flores verdes a amarillas.

Esta es la especie ms ampliamente distribuida en Norteamrica. Generalmente se le encuentra

cerca del litoral, sabana tropical, bosques de espinas y bosques tropicales caducos; se distribuye

en elevaciones que van desde el nivel del mar (desierto sonorense con precipitacin media anual

de 250 mm) hasta los 1500 msnm o ms (zona montaosa de bosque de encino de Uruapan,

Mich. con precipitacin anual de 1680 mm) (Gentry, 1998). La especie tolera cualquier condicin y

tipo de suelo (Irish, 2000), aunque durante su establecimiento la plntula es sensible a altas

temperaturas del suelo, por lo que generalmente requiere una planta nodriza como arbustos o

rboles para crecer bajo su sombra.

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1.3.1.3.Agave potatorum Zuccarini

A. potatorum, tobala o papalometles una especie pequea y solitaria. Existen aproximadamente

33 variedades de acuerdo a las caractersticas de sus hojas, las cuales se encuentran entre 30 y

80, dispuestas simtricamente alrededor de un tallo pequeo para formar una roseta abierta. Las

hojas varan en forma y color, desde ovaladas, cuadriculadas o cortas lanceoladas, de 9 a 18 cm

de ancho y de 25 a 40 cm de largo y de color verde grisceo hasta blanca. El margen de las hojas

presentan protuberancias (margen mamilado), as como dientes de 0.6 a 1.3 cm de largo y

espaciados por 1.3 a 2.5 cm, con una espina terminal afilada de 2.5 a 4.4 cm de largo y de forma

sinuosa o torcida. La inflorescencia de A. potatorumpuede ser un racimo o una pancula de 3 a 6

m de largo, con flores verde-amarillo y matices rojos; su reproduccin es por semillas. Esta planta

se distribuye principalmente en tierras altas y semiridas de Oaxaca y Puebla a elevaciones entre

1350 y 2250 msnm (Irish, 2000).

1.3.1.4.Agave cantala

A. cantala presenta rosetas verdes de 2 a 2.5 m de largo; hojas de 1.5 a 2 m, acuminadas,

redondeadas hacia la base, de color verde claro u oscuro, orilla lisa en la punta, rugosa en la base,

dientes cafs pequeos de 3 a 4 mm de largo con frecuencia cada 2 o 3 cm y espina terminal

pequea de 5 a 15 mm de largo. La pancula es de 6 a 8 m de largo, bulbfera con alrededor de 20

umbelas difusas en la parte superior, flores verdosas con tintes morados o rojizos de 70 a 85 mm

de largo; ovario fusiforme de 32 a 42 mm de largo (Gentry, 1998).

1.3.1.5.Agave fourcroydes

A. fourcroydeso henequn desarrolla un tronco de 1 a 1.7 m de largo. Sus hojas largas, delgadas,

angostas y lanceoladas son de color verde grisceo, de 8 a 13 cm de ancho y de 1.2 a 1.8 m de

largo; con espinas oscuras espaciadas y una espina terminal redondeada de 2 a 2.5 cm de largo.

El ciclo de esta especie toma de 20 a 25 aos y al final del mismo, se forma la inflorescencia

panculada de 5 a 6 m de largo con 10 a 18 ramificaciones. En sus flores verdes o amarillas, se

han observado malformaciones genticas en sus gametos, adjudicadas a su naturaleza

pentaploide (5x = 30), por lo que los granos de polen son estriles o de baja fertilidad y su

propagacin es principalmente por rizomas o bulbillos. Sin embargo, en el Centro de Investigacin

Cientfica de Yucatn (CICY) se determin que el potencial germinativo puede ser de hasta el

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93%, abriendo con esto una alternativa para favorecer la variabilidad gentica de esta poblacin

(Barredo-Pool et al., 2004). La distribucin de A. fourcroydeses comn en Yucatn, Veracruz y

Tamaulipas. Es una especie susceptible al fro, una temperatura de -2 C ocasiona serios daos a

las hojas (Irish, 2000).

1.3.2. DASYLIRION

Dasylirion, de los vocablos griegos dasys, grueso y lily, lirio es la palabra propuesta por Zuccarini

(1838) para describir la forma de penacho de uno de los gneros predominantes del desierto

Chihuahuense (Figura 3). Cuando las plantas de Dasylirion son pequeas, su crecimiento en

roseta es similar a los agaves; sin embargo cuando las plantas maduran, el tallo se vuelve

prominente, tomando forma de tronco que raramente alcanza 1 m de altura, siendo D.

quadrangulatum una excepcin notable al presentar un tronco de hasta 5 m al envejecer. Lashojas de Dasylirionson largas, lineales, flexibles y su color vara entre verde amarillento, verde

oscuro o azul-grisceo. Su margen es rayado con largos dientes pequeos, ganchudos,

apuntando hacia la base y de color amarillo a caf. Entre los espacios de estos dientes se

encuentran otros diminutos, formando as un margen serrado.

Una de las especies ms abundantes es D. wheelericonocida tambin como sotol o cuchara del

desierto, dado que sus hojas largas, hasta 1 m de longitud, delgadas y fibrosas se ensanchan

hacia la base (de 0.9 a 3 cm) dando una forma de cuchara. A diferencia de los agaves, las hojas

de Dasylirionson suaves y deshiladas formando un follaje azul verdoso que se torna oscuro al

madurar. Las flores masculinas de Dasylirion presentan estambres amarillos protuberantes,

mientras que las femeninas son blanco-verdoso, seguidas por semillas en el interior de cpsulas

aladas. La madurez de la planta, la disponibilidad de agua y probablemente la longitud del da, son

factores que inducen la formacin del tallo floral, que llega a tener dimensiones entre 1.8 y 5.2 m.

Dasyliriones una planta bien adaptada a condiciones ridas, temperaturas extremas y tambin a

cualquier tipo de suelo. No hay evidencias cientficas que indiquen el tiempo de vida de Dasylirion

pero hay quienes sugieren que 150 aos es una edad posible.

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1.4. IMPORTANCIA ECONMICA Y CIENTFICA

1.4.1. USOS TRADICIONALES

Algunas comunidades, en la actualidad, emplean los agaves como lo hacan las antiguas

civilizaciones: sus races, tallos, pencas y espinas se utilizan en la obtencin de hilos, fibras,

material para construccin, jabn, calzado, vestimenta, alimentos, medicinas, bebidas alcohlicas

tnicas, ornamentos y miel (Gentry, 1998).

1.4.2. USOS ORNAMENTALES

La belleza, mltiples formas y variedades de los agaves, as como su endemismo regional, las han

hecho ser consideradas como plantas exticas que llegan a cotizarse a precios elevados. Este

hecho ha favorecido la dispersin del gnero desde tiempos de la conquista. Al parecer los

espaoles y portugueses llevaron algunas especies comoA. americanaa Azores e Islas Canarias;A. angustifolia, A. cantalay otras especies fueron llevadas a Asia y frica; A. americana, A. lurida

y otras especies se dispersaron en las costas del Mediterrneo, alcanzando su esplendor en el

siglo XIX, cuando los agaves se volvieron populares como especies ornamentales y exticas en

los jardines pblicos y privados de Europa (Gentry, 1998).

1.4.3. OBTENCIN DE FIBRAS NATURALES

Indicios arqueobotnicos en Oaxaca (cueva de Gil Naquitz) sugieren que el hombre utilizaba las

fibras de agave desde 10800 a.C., inicindose el trabajo textil hacia los aos 1300 a 800 a.C.

(Palma, 2000). Despus de la conquista, algunas especies como A. angustifolia,A. fourcroydesy

A.sisalanafueron introducidas en reas tropicales como Indonesia, Tanzania, Filipinas y algunos

pases africanos para la produccin comercial de fibras (Irish, 2000; Jin et al., 2004). En Mxico,

para la obtencin de fibra se utilizan A. fourcroydesyA. sisalana, especies cultivadas en el Golfo

de Mxico y Pennsula de Yucatn. En algunas regiones de Oaxaca, la elaboracin de productos

basados en fibras de agave es la segunda actividad agroindustrial ms importante (Palma, 2000).

Otras especies productoras de fibra son A. lechuguillayA.peacockiiencontradas en el Valle de

Mezquital y el Valle de Tehuacn, respectivamente. Por la composicin qumica de las fibras, con

alto contenido de celulosa y bajo porcentaje de hemicelulosa, son poco asimilables a los

microorganismos y por lo tanto ms durables; mientras que el elevado contenido de lignina,

permite que las fibras soporten la accin mecnica a las que se someten durante procesos de

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tensin (Palma, 2000). El auge de su comercializacin y exportacin se dio a principios del siglo

XX; sin embargo, la competencia de las fibras sintticas ha cambiado la perspectiva econmica de

las zonas desrticas donde se cultivan este tipo de agaves.

Las fibras obtenidas de Dasylirion tambin han sido utilizadas en la elaboracin de canastas,

marcos, muecas y brochas. En la fiesta folklrica del norte de Mxico conocida como la flor del

sotol, se hacen creaciones artsticas a partir de la fibra para la decoracin de postes, crucifijos,

arcos de iglesias, tumbas y cementerios (Irish, 2000).

1.4.4. OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE FITOQUMICOS

Investigaciones realizadas en algunas especies de agave, han demostrado que estas plantas son

fuente natural de sapogeninas (hecogenina, smilagenina, tiogeninas), saponinas (clorogenina),

esteroles, terpenos, vitaminas y otros principios medicinales. En los aos 50 varias compaasfarmacuticas y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), cuantificaron el

contenido de sapogeninas en algunas especies, encontrndose niveles entre 0.5 y 4.5% en

especies comoA. vilmoriana, A. cerulata, A. lechuguilla, A. lophanta, A. colimaniyA. schidigera;

mientras que las especies con alto contenido de fibra como A. sisalana, A. fourcroydes y A.

angustifoliapresentan menor cantidad (de 0 a 0.5%; Gentry, 1998).

En la medicina tradicional mexicana, por ejemplo, se han hecho uso de A. lechuguilla como

antirreumtico, antiinflamatorio, desinfectante en mordeduras de vboras y remocin de cogulos

sanguneos;A. intermixta, se utiliza como antiartrtico, antituberculoso y anticarcingeno (Senz,

et al., 2000); las pencas deA. americanayA. salmianase utilizan como expectorante, cicatrizante,

diurtico, para dolores estomacales, cardiacos y escorbuto; A. vilmoriana se usa como

antiinflamatorio y antifngico, y de esta especie, recientemente, se caracterizaron dos esteroles

denominados agamensido y agavegenina (Jin et al., 2004). D. wheeleritambin presenta algunas

propiedades medicinales como antitusivo y en tratamientos de cefaleas (Gioanetto y Franco,

2004).

1.4.5. ELABORACIN DE BEBIDAS ALCOHLICAS

Las diversas variedades de agave encontradas en territorio mexicano, se han usado desde

tiempos inmemoriales en la elaboracin de bebidas alcohlicas. Los factores que afectan las

caractersticas de los agaves, como temperatura, humedad, ciclo natural y precipitacin pluvial,

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hacen que los productos obtenidos en cada regin sean de propiedades nicas (Iiguez-

Covarrubias et al., 2001a). De acuerdo al proceso, las bebidas alcohlicas pueden ser

fermentadas o destiladas.

1.4.5.1. BEBIDAS FERMENTADAS

El pulque es la bebida fermentada ms conocida. Algunos cdices mexicanos manifiestan que los

Aztecas elaboraban el pulque (octli) durante su migracin al Valle de Mxico entre 1172 y 1291

d.C. y era un componente importante en ritos religiosos y ceremoniales (Gentry, 1998). Esta

bebida se prepara de la savia que emana del agave, que al llegar a la madurez y antes de que

emerja la inflorescencia, se le hace una incisin. El drenado conocido como aguamiel es dulce y

cuando se fermenta, produce el pulque. Esta bebida se hace a partir de un nmero limitado de

especies como A.salmiana, A. mapisaga, A. atrovirens, A. hookeri y A. americana (Irish, 2000),cuyos jugos muchas veces son mezclados y fermentados por un complejo de levaduras y

bacterias (Bacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus, Diplobacter,

Bacillus, Saccharomyces y Pichia, entre otros) que producen etanol y otros compuestos qumicos

que dan sabor y consistencia viscosa a la bebida (Gentry, 1998). El pulque es fuente importante

de hierro (hasta 1.1 mg/mL) y cido ascrbico (60 mg/L). Adicionalmente, en esta bebida se han

identificado riboflavina y otras vitaminas B (Tabla 2), as como saponinas biolgicamente activas

(Backstrand, et al., 2002).

1.4.5.2. BEBIDAS DESTILADAS

Dentro de las bebidas destiladas, destaca el tequila, smbolo de fusin cultural, pues fueron los

espaoles quienes a su arribo, introdujeron la prctica de destilacin al proceso de fermentacin

que ya practicaban las culturas prehispnicas (Mancilla-Margalli, 2000). Esta bebida ha pasado

por un proceso histrico, cultural, econmico, social y tecnolgico, hasta llegar a la actualidad en

la que se le considera como bebida representativa de Mxico, con reconocimiento mundial y

protegido por una denominacin de origen.

El tequila se produce exclusivamente con A. tequilanaWeber var. azul, cuyos tallos cortados en

mitad son cocidos y su jugo es extrado por desgarramiento de la pulpa. Si el tequila es mixto, se

le adiciona hasta un 49% de azcares de otras fuentes (caa o melaza) o solo los azcares

propios del agave si la bebida es 100%. Para la fermentacin, se inocula la levadura

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Saccharomyces cerevisiae (20 a 50 106 clulas/ mL) y posteriormente el mosto obtenido, es

destilado una primera vez (destrozamiento) en alambiques de cobre para separar las vinazas

(levaduras, azcares no fermentables, minerales, slidos) de otros compuestos, y una segunda

vez (rectificacin), para concentrar los alcoholes en el cuerpo del destilado (45 a 50 GL) y separar

las cabezas y colas. Este producto es envasado como tequila blanco o puede ser reposado en

barriles de roble blanco o encino por un ao o ms para producir respectivamente, el tequila

reposado o aejo (Cedeo, 1995; Bautista-Justo et al., 2001; Lpez y Dufour, 2001).

Otras bebidas alcohlicas provenientes del destilado de jugos de agaves fermentados, incluyen

mezcal, bacanora, sotol y, recientemente, henequn. El bacanora se produce en un lugar de

Sonora del cual deriva su nombre. A. angustifolia y A. palmeri son las especies que ms se

utilizan. Para la elaboracin del mezcal, las especies ms usadas son A. angustifolia, A.

potatorum, A. cantala y A. karwinskii. Por su parte, el sotol se produce principalmente enChihuahua a partir de plantas silvestres del gnero Dasylirion; mientras que, la produccin del

henequn se realiza a partir deA. fourcroydes.

Tabla 2.Composicin de aguamiel y pulque.

nr, no reportado. Los valores indicados corresponden a aquellos encontrados en una muestra.Datos tomados de Gentry, 1998.

Compuesto Aguamiel PulqueAgua (g/100 g) 94.0 98.3Cenizas (g/100 g) 0.4 0.2Protenas (g/100 g) 0.30 0.37Extracto no-nitrogenoso (g/100 g) 5.30 1.13

Ca (mg/100 g) 20 11P (mg/ 100 g) 9 6Fe (mg/100 g) nr 0.70Tiamina (mg/100 g) 0.02 0.02Riboflavina (mg/100 g) 0.03 0.03Niacina (mg/100 g) 0.40 0.35cido ascrbico (mg/100 g) 6.7 5.1N (g/100 mL) nr 0.14Lisina (g/100 mL) nr 16.2Triptofano (g/100 mL) nr 2.7Histidina (g/100 mL) nr 4.7Fenilalanina (g/100 mL) nr 11.2

Leucina (g/100 mL) nr 10.5Tirosina (g/100 mL) nr 6.4Metionina (g/100 mL) nr 0.7Valina (g/100 mL) nr 6.6Arginina (g/100 mL) nr 10.9

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El proceso de elaboracin de estas bebidas es similar al tequila (cosecha, cocimiento, molienda,

fermentacin, destilacin y envasado), pero el proceso de elaboracin es ms rudimentario. Las

pias se cocen en hornos rsticos consistentes en hoyos en el suelo cubiertos de carbn, piedras

refractarias y bagazo de pias. La molienda se realiza con una tahona, molino rstico que consiste

en una piedra plana redonda jalada por un caballo o por maceracin con un mazo de madera. A la

botella de mezcal generalmente se le adiciona un gusano (Hypopta agavis), que naturalmente

ataca a la planta, dndole un sabor distintivo a la bebida. Esta bebida est en un proceso de

crecimiento y consolidacin en el mercado nacional e internacional (Gentry, 1998). Actualmente se

reconoce con una denominacin de origen que autoriza a seis estados de la repblica para su

explotacin, incluyendo Oaxaca, Guerrero, Zacatecas, Durango, San Luis Potos y Tamaulipas.

Por otra parte, la gran aceptacin del sotol en la regin norte del pas, ha encaminado los

esfuerzos de industriales y productores para lograr la denominacin de origen de esa bebida endicha regin.

1.4.6. ELABORACIN DE EDULCORANTES FRUCTOSADOS

Un hecho importante de destacar, es el otorgamiento de una patente a investigadores de la

Universidad de Guadalajara, quienes desarrollaron un procedimiento para la produccin de

jarabes fructosados a partir de plantas de agave. Dicho proceso consiste en la aplicacin de una

inulinasa comercial (1 a 1.5 g/L) a un extracto de agave, rico en fructanos y libre de material slido.

La hidrlisis enzimtica de los fructanos se lleva a cabo de 4 a 5 h en un rango de temperatura de

40 a 50 C, produciendo un jarabe rico en fructosa. Este producto ha empezado a comercializarse

en tiendas naturistas de Mxico bajo el nombre de Naturel o Sweetrel (Figura 5) por la

Industrializadora Integral de Agave, S.A. de C.V. (productora de Tequila Orendain). Naturel es un

producto que presenta un 68% (w/v) de fructosa y 5% de glucosa (Lpez-Mungua, 2004), y

constituye una alternativa edulcorante saludable con algunas ventajas sobre la sacarosa.

1.4.7. UTILIZACIN DE BAGAZO

Durante la molienda de pias para la obtencin del jugo que ser fermentado, se genera el

bagazo, producto de desecho que representa hasta el 40% del peso de las pias. Este material

altamente fibroso, se deja en los campos o de manera emprica, se mezcla con arcilla en la

elaboracin de ladrillos o se seca al sol para la obtencin de material de empaque. Ante el

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reconocimiento internacional del tequila, la Universidad de Guadalajara, visionando un problema

ecolgico creciente, realiz una investigacin encaminada al uso de este material (Iiguez-

Covarrubias et al., 2001a y b). Se mostr que la alimentacin de borregos Pelibuey con una dieta

basada en bagazo de agave, tiene la misma eficiencia en ganancia de peso que el rastrojo de

maz comnmente utilizado, con la ventaja que el bagazo esta disponible cualquier poca del ao

(Iiguez-Covarrubias et al., 2001a). Por otra parte, tablas fabricadas con bagazo de agave, son

ms resistentes a la humedad que aquellas fabricadas de lamo, adems de presentar una

resistencia mecnica superior a lo establecido por las normas de calidad (Iiguez-Covarrubias et

al., 2001a). Tambin se ha ensayado el uso del bagazo en la elaboracin de aglomerados, billetes

bancarios, filtros, absorbentes, geotextiles y junto con la copra de coco para la elaboracin de

sustratos sin suelo en la siembra de cultivos como maz.

Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel. Elaborado a partir de la hidrlisis de fructanos enagave, ofrece ventajas saludables sobre el consumo de sacarosa. Tomada de Lpez-Mungua,2004.

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1.4.8. PROPAGACIN in vitro

A pesar de la generacin de una gran cantidad de semillas durante la reproduccin sexual de los

agaves (de 7,000 a 30,000 semillas/inflorescencia), el gran porcentaje de depredacin y en

ocasiones las inadecuadas condiciones de germinacin, hacen que la manera ms comn de

propagacin de estas plantas sea asexual, a travs de hijuelos que son cortados por el hombre y

sembrados en nuevos campos. Esta manera de reproduccin pone en riesgo la variabilidad

gentica de estos cultivos (Gil-Vega et al., 2001) y los expone a una gran devastacin en el caso

de plagas o enfermedades.

Otro tipo de propagacin vegetativa es a travs de bulbillos, hijuelos pequeos que emergen del

quiote; sin embargo adems de su menor incidencia, tambin presentan bajos ndices de

supervivencia (Nikam et al., 2003). Una alternativa viable ha sido la propagacin in vitro, y

actualmente existen numerosos reportes en donde utilizando segmentos de tallos, rizomas,bulbillos, fragmentos de semillas, callos y explantes de hojas, han logrado la propagacin y

regeneracin de agaves de importancia comercial como A. sisalanao agaves amenazados como

A. victoria-reginae (Nikam et al., 2003). Aunque esta tcnica pone en riesgo la variabilidad

gentica de las plantas, entre sus ventajas destaca la obtencin de un gran nmero de plntulas

homogneas de caractersticas genotpicas deseables, aceleramiento de la propagacin

vegetativa, aseguramiento de la calidad y certificacin de que las plntulas que se llevan al campo

estn sanas. Esto ha sido de gran significancia en el caso de A. tequilana, que con la gran

demanda mundial del tequila a finales de los aos 90 propici escasez de plantas, aunado a que

las enfermedades propias del cultivo empezaban a devastar grandes extensiones de cultivo. El

reto de propagacin in vitro a nivel industrial fue superado con creces, produciendo 2 y 4.5

millones de plntulas en el 2002 y 2003, respectivamente. Actualmente, en el campo hay ms de

500 mil plantas de A. tequilana propagadas, con un desempeo agronmico sobresaliente,

superando incluso, al mejor material de siembra tradicional (Bosch-Guha, 2004).

La propagacin in vitrode A. fourcroydestambin logr rendimientos superiores a la propagacin

por rizomas; los agaves crecen ms rpido y producen mayor cantidad de hojas grandes (Herrera

et al., 2004). Para A. potatorum, A. cupreata y A. parrasana, la propagacin in vitro es

especialmente valiosa, ya que estas plantas no forman rizomas y su reproduccin sexual o por

bulbillos es ineficiente (Santacruz-Ruvalcaba et al., 1999; Salazar et al., 2004).

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1.5. INFLUENCIA DE LA ZONA GEOGRFICA EN LOS AGAVES

El rendimiento de los agaves, el tiempo en que llegan a su madurez, contenido de carbohidratos y

sus caractersticas morfolgicas, son altamente influenciadas por factores abiticos como tipo de

suelo, temperatura, humedad y elevacin. En algunos agaves comoA. deserti,A. salmiana(Nobel

y Meyer, 1985),A.lechuguilla(Nobel y Quero, 1986) yA. tequilana(Ruiz-Corral et al., 2002), se ha

determinado un valor denominado ndice productivo medioambiental (EPI), que correlaciona tres

factores ambientales: estatus hdrico, temperatura y radiacin fotosintticamente activa (PAR) con

la fijacin de CO2por parte de la planta, medida como ganancia en peso seco (donde un valor de

1 indica condiciones no limitantes (Figura 6).

EnA. lechuguillase observ que el EPI tiene una mayor relacin con el estatus hdrico del suelo

(r2=0.97), seguido del ndice PAR (r2= 0.25) y que la temperatura no tiene efecto (r2=0.00) sobre

la productividad. Un valor EPI de 0.38 kg m2 ao-1para esta especie sembrada en campo, esbajo comparado con cultivos agrcolas de alto rendimiento como trigo y maz (1-2 kg m2ao-1);

sin embargo, este valor es cuatro veces mayor cuando se compara con otras plantas que viven en

ecosistemas desrticos (0.1 kg m2ao-1) (Nobel y Meyer, 1985). La medicin mensual del EPI

se correlaciona con el nmero mensual de hojas nuevas y estima la productividad de la planta

(Figura 6D y Tabla 3) (Quero y Nobel, 1987), pudiendo dar una idea confiable sobre los meses

mas favorables para la cosecha y factores ambientales que influyen sobre dicha productividad

(Nobel, 1984).

Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM.

Especie Productividad(kg/m-2ao-1)

A. deserti 1.06A. fourcroydes 1.60*A. salmiana 1.05A. lechuguilla 0.38Opuntia ficus-indica 1.36*

Ananas comosus 1.2*

*, productividad reportada en cultivos comerciales bajo condiciones donde el agua no es factorlimitante. Para efectos de comparacin, se reporta un rango de productividad de 3 a 7 kg/m 2/aoen cultivos como alfalfa, caa y de 1 a 2 kg/m2/ao para trigo y maz en condiciones no limitantes.Datos tomados de Nobel y Meyer, 1985.

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Figura 6. Influencia de factores abiticos en la asimilacin de CO2 en A. lechuguilla.Recuadros sombreados indican tiempo de oscuridad (noche)., potencial hdrico. A) Estatushdrico: las plantas fueron regadas semanalmente (--, suelo -0.5 MPa) o sometidas a sequa(suelo

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que la actividad fotosinttica se favorece con un bajo ndice PAR, bajo contenido de humedad en

el suelo y temperaturas nocturnas frescas (12 a 16 C). En base a lo anterior se estableci para el

estado de Jalisco, regiones ptimas, subptimas y marginales para este cultivo (Figura 8 y Tabla

4), considerndose como ptimas, regiones con una elevacin entre 1100 y 2800 msnm y climas

subtropical templado y subtropical semiclido (Ruiz-Corral et al., 2002). A. tequilanacultivado en

zonas ptimas y manejo agrcola adecuado, presenta tasas de fotosntesis comparable a plantas

C3 y C4 (921 mmol CO2m-2 da-1en clima subtropical templado y 763 mmol CO2 m-2 da-1en clima

subtropical semiclido), pero con una menor velocidad de transpiracin. Esto no slo significa

mayor cantidad de CO2 fijado, sino que un aumento en la superficie cultivada con esta planta

puede representar efectos ecolgicos benficos, dada su capacidad de secuestrar carbono, en

tiempos de larga sequa cuando pocas plantas con metabolismo C3 o C4 lo pueden hacer

(Pimienta-Barrios et al., 2001 y 2004).

Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilacin de CO2enA. tequilana. La fijacin deCO2fue negativa en la mayor parte del da, incrementndose al final del da. La fijacin mximanocturna fue de 17 mol m-2 s-1(267 mmol m-2 d-1) para plantas en un rgimen de temperatura de25C/15C, 14 mol m-2 s-1(298 mmo m-2 d-1) en temperaturas de 15C/5C y slo 6 mol m-2 s-1(84 mmol m-2 d-1) cuando las plantas tienen ciclos de 35C/25C. Modificada de Nobel et al., 1998.

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Figura 8. reas ptimas, subptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en elestado de Jalisco. Se indica el rea potencial para el cultivo de esta planta, que corresponde acasi 10 veces el rea cultivada actualmente. Los municipios valorados son indicados en losnmeros superiores. Tomada de Ruz-Corral et al., 2002.

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1.6. ADAPTACIN DE LOS AGAVES

El adjetivo noble o admirable con que Linneo describi a las plantas de agave, refiere a su

capacidad para crecer en ambientes hostiles y soportar temperaturas extremas, que van desde -

20C hasta ms de 38C (Tabla 5). Esta capacidad puede ser resultado de las adaptaciones

morfolgicas y fisiolgicas que presentan estas plantas.

Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo deA. tequilanaen Jalisco.Variable ptima Subptima Marginal

Temperatura nocturna (C) 10 a 16 5 a 10 16 a 25 25

Temperatura diurna (C) 15 a 25 10 a 15 25 a 35 35

Probabilidad de heladas < 0.10 - >0.10

Tomada de Ruz-Corral et al., 2002.

Tabla 5.Tolerancia de agaves y dasylirion a fro extremo.Especie Temperatura Especie Temperatura

A. americana - 9 C A. parryi - 29 CA. angustifolia - 4 C A. parviflora - 12 CA. attenuata - 2 C A. pelona - 7 CA. bovicornuta - 7 C A. salmiana - 15 CA. cerulata - 12 C A. scabra - 12 CA. chrysantha - 8 C A. schidigera - 9 CA. datylio - 4 C A. schotti - 12 C

A. deserti - 9 C A. shawii - 4 CA. desmettiana - 4 C A. sisalana - 4 CA. filifera - 8 C A. striata - 9 CA. fourcroydes - 4 C A. tequilana - 4 CA. geminiflora - 4 C A. toumeyana - 12 CA. havardiana - 23 C A. utahensis - 23 CA. lechuguilla - 18 C A. victoriae-reginae - 12 CA. lophantha - 12 C A. vilmoriana - 6 CA. macrocantha - 4 C A. weberi - 11 CA. marmorata - 4 C A. zebra - 7 CA. murpheyi - 12 C D. acrotriche - 9 CA. neomexicana - 29 C D. leiophyllum - 18 CA. ocahui - 9 C D. quadrangulatum - 9 CA. palmeri - 12 C D. texanum - 15 CA. parrasana - 9 C D. wheeleri - 18 C

Tomada de Irish, 2000.

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1.6.1. ADAPTACIN MORFOLGICA

1.6.1.1. HOJAS

La suculencia de sus pencas es una de las caractersticas ms peculiares de los agaves; stas

contienen un parnquima esponjoso especializado de paredes delgadas, gran cantidad de

cloroplastos y vacuolas prominentes. Estas clulas almacenan agua y ayudan a amortiguar los

cambios de disponibilidad de agua en el suelo. Por su gran capacidad de almacenamiento, la

longevidad de las pencas (hasta 15 aos o muchas veces durante toda la vida de la planta) le

confiere al agave la ventaja de contener suficientes provisiones para el florecimiento (Irish, 2000).

La proporcin volumen:rea foliar es un ndice til que indica la capacidad de almacenar agua en

las hojas; pencas con gran volumen y pequea rea foliar tienen ms agua disponible para la

transpiracin. As, el distintivo tamao de los agaves influye en el uso eficiente de agua (ganancia

de peso seco por unidad de transpiracin) que finalmente afecta su distribucin: los agaves demayor tamao se encuentran en la regin sur-centro de Mxico, zona con mayor humedad que la

regin norte (Woodhouse et al., 1983; Linton y Nobel, 2001).

Por otra parte, la disposicin en roseta de las hojas, le permiten a los agaves colectar el agua de

lluvia hacia el tallo; adems que la sombra formada por las mismas, reduce la evaporacin y

protege el rgano floral (Gentry, 1998). El nmero de estomas en la epidermis es 10 veces inferior

a las dicotiledneas e incluso a otras monocotiledneas. Aunque esto disminuye la frecuencia de

intercambio gaseoso, tambin decrece la prdida de agua por transpiracin (Nobel, 1988). La

cutcula cerosa que cubre las pencas, es otra adaptacin para prevenir la prdida excesiva de

agua. Otro tipo de adaptacin morfolgica de los agaves es el pequeo dimetro de sus vasos

conductores y su baja densidad en las hojas, confirindole la caracterstica de baja conductancia

hidrulica (Kh) (6 mmol m-2 da-1enA. desertivs33-94 mmol m-2 da-1en rboles leosos) y mayor

susceptibilidad a la cavitacin, es decir, al bloqueo de los vasos del xilema con aire o vapor de

agua. Este fenmeno disminuye la Khy el potencial hdrico de la planta, que finalmente provoca el

cierre estomatal y disminucin en la prdida de agua (Linton y Nobel, 2001). En un experimento de

estrs hdrico por 100 das en A. tequilana y A. deserti, se evidenci que la primera es ms

susceptible a la cavitacin (Tabla 6), observada como un mayor decremento en la Kh. Esto fue

explicado por una menor proporcin volumen:rea foliar (2.3 vs3.3), traducido como hojas ms

delgadas, mayor velocidad de transpiracin y un subsecuente decremento mayor de su potencial

hdrico foliar (foliar). Como en otras especies, en este caso tambin existe una correlacin entre la

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Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitacin deA. tequilanayA. desertisometidos a 100 das desequa.Sequa(das)

1suelo(MPa)

foliar(MPa)

A.tequilana

Decrementoen 2Kh (%)

A. tequilana

Transpiracin(mol m-2da-1)A. tequilana

foliar(MPa)

A. deserti

Decrementoen Kh (%)

A. deserti

Transpiracin(mol m-2da-1)A. deserti

0 -0.02 -0.58 0 11.6 -0.64 0 6.220 3nr -0.76 10 2.4 -0.76 2 1.640 Nr -1.62 43 0.8 -0.83 nr 0.560 Nr -2.28 60 nd -1.09 21 4nd80 Nr -2.90 84 0.4 -1.58 32 0.4

100 -4.00 -3.42 85 0.3 -1.96 41 0.31, potencial hdrico; 2Kh, conductancia hidrulica foliar; 3nr, no reportado; 4nd, no determinado..Datos tomados de Linton y Nobel, 2001.

vulnerabilidad a la cavitacin, tolerancia a sequa y caractersticas ambientales: A. deserti es

predominante en el noreste del desierto de Sonora con un promedio pluvial anual de 240 mm,mientras queA. tequilanaen la regin de Jalisco, recibe un promedio anual de 1000 mm (Linton y

Nobel, 2001).

1.6.1.2. RACES

Las caractersticas de las races en los agaves tambin resultan de importancia para la

supervivencia de estas especies en lugares secos. Sus clulas epidermales contienen un

parnquima lignificado que reduce la prdida de agua (Palta y Nobel, 1989). Aunque menos

estudiada, la morfologa de la raz de Dasylirion, tambin se ha observado en estas especies, un

sistema radicular fibroso con una endodermis esclerificada rodeada por una corteza gruesa de

clulas parenquimatosas. Las plantas jvenes presentan de 2 a 3 races fusiformes contrctiles,

mientras que las mayores presentan un sistema radicular densamente disperso (Bogler, 1995).

Al igual que otras plantas desrticas perennes, y en una estrategia para eficientar la presencia de

agua, cuando hay indicios de humedad en el suelo, A..deserti produce races finas (races de

lluvia) en forma de ramificaciones sobre un sistema radicular establecido. Estas races de lluvia

incrementan el rea de absorcin y la captura de agua y nutrientes, haciendo un contacto efectivode suelo-raz. Sin embargo, durante sequas, el potencial hdrico del suelo decrece por debajo del

de las races y las races de agua son eliminadas, probablemente por un costo respiratorio y

conductividad hidrulica mayor a las races establecidas (Figura 9).

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Figura 9. Cambios en la velocidad de respiracin durante sequa en races de lluvia yestablecidas en A. deserti.Smbolos blancos indican la velocidad medida durante el da y lossmbolos oscuros denotan los datos obtenidos durante la noche. En condiciones iniciales, lavelocidad de respiracin para las races establecidas fue de 2.15 mol CO2kg-1s-1y 4.55 molCO2 kg-1s-1durante la noche y el da, respectivamente; mientras que para las races de lluvia fuede 6.20 mol CO2 kg-1 s-1 y 14.5 mol CO2 kg-1 s-1para la noche y el da respectivamente. Seobserv un decremento mayor y ms rpido en las races de lluvia alcanzando un valor 0 a los 6

das (suelo= -0.9 MPa), condicin que solo caus una reduccin en la respiracin para las racesestablecidas. Modificada de Palta y Nobel, 1989.

El encogimiento de las pequeas races en sequa provoca en el suelo huecos que disminuyen la

conductividad hidrulica y aumenta la resistencia de la raz a movimientos de agua (hasta 100

veces, segn clculos) (Schulte y Nobel, 1989). Las races de lluvia, adems, no se recuperan

despus de una rehidratacin, probablemente por diferencias en la presin osmtica y una menor

conductividad hidrulica de las races establecidas que son capaces de mantener una respiracin

basal asuelo= -1.3 MPa. Esto minimiza la prdida de agua y ayuda a prevenir la muerte de las

races establecidas, cuya recuperacin es completa despus de que cesa la sequa (Palta y Nobel,

1989).

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1.6.1.3. TALLO

Durante tiempos de sequas severas, los tallos llegan a encogerse, provocando delgadas fisuras

en el suelo alrededor de la base de la planta. Esto incrementa la utilidad de la forma de roseta al

canalizar el agua cuando llueve (Irish, 2000).

1.6.2. ADAPTACIN FISIOLGICA

1.6.2.1. METABOLISMO CIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)

Indudablemente uno de los factores fisiolgicos de mayor importancia para el desarrollo de los

agaves en ambientes ridos, es el uso del metabolismo fotosinttico del cido de las crassulaceas,

conocido como metabolismo CAM. Tan notable caracterstica fue descrita para A. americana a

finales de los 60 (Iiguez-Covarrubias et al., 2001). Parte de los resultados reportados por Ehrler

(1969) se muestran en la Figura 10 y Tabla 7, donde se compara el comportamiento fisiolgico delmaz y A. americana, y se evidencia que esta especie sigue un patrn tpico de plantas con

metabolismo CAM.

Figura 10. Diferencia de temperatura entre el rea foliar (de maz o agave) y el airecircundante. Los recuadros indican tiempo de oscuridad en la medicin realizada en invernadero.La diferencia de temperatura durante el da marca una respuesta distinta de ambas plantas a unamisma condicin ambiental. Durante la noche, la menor diferencia de temperatura entre las hojasde agave y el aire, indica una apertura estomatal nocturna. Modificado de Ehrler, 1969.

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

Hora

DiferenciadeTemperatura(C)

Agave americana

Zea mays

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Tabla 7. Comparacin de parmetros fisiolgicos de Zea maysyAgave americana.Zea mays Agave americana

Transpiracin (g m-2h-1) 5.96 90.0 30.0 14.6Resistencia foliar a difusin (scm-1)

93.0 7.1 17.1 239.0

Frecuencia estomatal(estomas cm-2)

Epidermisinferior9247

Epidermissuperior

5077

Epidermisinferior3717

Epidermissuperior

4850Prdida de agua (g)* 9407 2228Ganancia de peso seco (g)* 69.4 34.4Eficiencia de uso de agua(ganancia enpeso/transpiracin)*

0.007 0.015

El patrn de transpiracin y resistencia foliar es inverso en ambas especies, indicando un tiempode apertura estomatal diferente. Los valores indican el promedio de la medicin de tres plantasindependientes. El smbolo * representa la medicin en un perodo de 10 semanas. El cuadro

rayado indica tiempo de oscuridad. Modificado de Ehrler, 1969.

En contraste al metabolismo C3 y C4, las plantas CAM reducen la prdida de agua por

transpiracin, al abrir los estomas para la asimilacin de CO2 durante la noche, cuando la

diferencia de concentracin de vapor de agua entre el tejido foliar y el ambiente circundante es

menor (Lpez et al., 2003). La prdida de agua por parte de la planta sucede a una velocidad dos

veces mayor que la toma de agua; sin embargo, se alcanza un balance positivo porque la prdida

de agua por transpiracin sucede por la noche, mientras que la toma de agua a travs de las

races ocurre durante las 24 h del da (Nobel, 1997).

1.6.2.2. BIOQUMICA DEL METABOLISMO CIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)

En general, el metabolismo CAM se caracteriza por una movilizacin masiva de carbohidratos

durante el perodo de oscuridad (Figura 11), que a travs de la gliclisis produce fosfoenolpiruvato

(PEP). Este compuesto se carboxila por la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (PEPC, E.C. 4.1.1.31)

usando bicarbonato (HCO3-) como sustrato (Trpodi y Podest, 1997). El oxaloacetato formado de

esta reaccin, se reduce rpidamente a malato por una NAD(P)-malato deshidrogenasa de origen

citoslico y/o mitocondrial (Hopkins, 1995). El malato-2 formado se mueve pasivamente hacia lavacuola a travs de un canal especfico, acoplado a un transporte activo de protones (una bomba

H+-ATPasa vacuolar) (Dood et al., 2002). En A. deserti la acumulacin nocturna de cidos en la

vacuola del clornquima, aumenta el potencial osmtico y genera un gradiente que favorece la

adquisicin de agua por el tejido parenquimatoso.

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Figura 11. Metabolismo cido de las crasulceas. Durante el perodo de oscuridad, los estomasabiertos permiten la asimilacin de CO2mediante la produccin de malato que es almacenado enla vacuola. Durante el da, el cierre de los estomas reduce la prdida de agua, mientras que elmalato es descarboxilado y fosforilado en el citoplasma para la sntesis de carbohidratos en elciclo de Calvin. T-P, triosa-fosfato; OAA, cido oxalactico; MAL, malato; PEP, fosfoenolpiruvato;

PYR, piruvato; a, PEP-carboxilasa; b, malato deshidrogenasa; c, enzima descarboxilasa.Modificado de Hopkins, 1995.

Existe la controversia, si estos cambios osmticos son suficientes para la adquisicin de agua del

suelo; sin embargo, son significativos para mantener el turgor de las clulas del clornquima y la

apertura de los estomas durante tiempos de sequa (Schulte y Nobel, 1989). La actividad de la

PEPC es regulada por una fosforilacin reversible a un residuo de serina mediada por la PEP

carboxilasa cinasa (PPCK), cuya expresin responde a un ritmo circadiano o al estatus de carbono

indicado por la concentracin de ma