m david garcía crespo

55DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES

Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA

Y PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE

David García Crespo

TESIS DOCTORALESN.° 55

DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES

Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE

LA RESISTENCIA GENÉTICA

Y PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE

Memoria presentada por D. David García Crespopara optar al grado de Doctor en Bioquímica por

la Universidad del País Vasco

NEKAZARITZA, ARRANTZAETA ELIKADURA SAILA

DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA,PESCA Y ALIMENTACIÓN

Vitoria-Gasteiz, 2006

Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia

Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco

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GARCÍA CRESPO, DavidDesarrollo de métodos moleculares y su aplicación al estudio de la resistencia genética y patogenia

molecular del Scrapie / memoria presentada por David García Crespo para optar al grado de Doctor enBioquímica. – 1a ed. – Vitoria-Gasteiz : Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia = ServicioCentral de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2006

p. ; cm. – (Tesis doctorales ; 55)Tesis-Universidad del País VascoISBN 84-457-2142-9

1. Encefalopatía espongiforme-Tesis doctorales. I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca yAlimentación. II. Título III. Serie619:616.831:636.3(043)

Edición: 1.a Enero 2006

© Administración de la Comunidad Autónoma del País VascoDepartamento de Agricultura, Pesca y Alimentación

Internet: www.euskadi.net

Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu NagusiaServicio Central de Publicaciones del Gobierno VascoDonostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz

Fotocomposición: Composiciones RALI, S. A.Particular de Costa, 8-10, 7.ª - 48010 Bilbao

Impresión: Lankopi, S. A.Colón de Larreategui, 16 - 48001 Bilbao

ISBN: 84-457-2142-9

D.L.: BI-473-06

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AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS

PARA SU PRESENTACION

Los Dres. Ana Hurtado Esgueva y Ramón A. Juste Jordán

como Directores de la Tesis Doctoral:

Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia

Genética y Patogenia Molecular del Scrapie

realizada en el Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología

por el Doctorando Don. David García Crespo

autorizan la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones

necesarias para su defensa.

En Derio a 7 de Julio de 2005

DIRECTORES DE LA TESIS

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RATIFICACION DEL/LA TUTOR/A

Dr/a. Ramón Cisterna Cancér

como Tutor/a de la Tesis Doctoral del Doctorando Don/ña. David García Crespo

ratifico la autorización del/la Director/a para la presentación de la Tesis Doctoral que

lleva por título Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la

Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie

realizada en el Departamento de Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación

y Desarrollo Agrario (Neiker).

En Leioa a 7 de Julio de 2005

EL/LA TUTOR/A DE LA TESIS

Fdo.: RAMÓN CISTERNA CANCÉR

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CONFORMIDAD DEL DEPARTAMENTO

El Consejo del Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología

en reunión celebrada el día 22 de Abril de 2005 ha acordado dar la conformidad a la

admisión a trámite de presentación de la Tesis Doctoral titulada:

Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia

Genética y Patogenia Molecular del Scrapie

dirigida por el/la Dr/a. Ana Hurtado Esgueva y Ramón A. Juste Jordán

y presentada por Don/ña. David García Crespo

ante este Departamento.

En Leioa a 7 de Julio de 2005

Vº Bº DIRECTOR/A DEL DEPARTAMENTO SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO

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A mis padres, hermanos y a Anita

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AGRADECIMIENTOS

Curiosamente sin darte cuenta te pones a pensar en toda la gente y situaciones que deun modo u otro han contribuido a terminar este trabajo, aportando desde un granito hastamontones de arena. Y más curioso aun es pensar como este fruto maduro y nacido hace cin-co años es más que un conjunto de líneas.

En primer lugar me gustaría agradecer a la directora de este trabajo, la Dra. Ana Hurta-do Esgueva por saber encontrar en todo momento las pautas necesarias para el buen desarro-llo de esta Tesis Doctoral y por algo muy importante, saber enseñar a aprender. Agradecertambién al co-director, el Dr. Ramón A. Juste Jordán por saber discutir, criticar y orientar eltrabajo realizado. Agradecer a ambos el haberme brindado esta oportunidad a pesar de los in-convenientes que hayan podido surgir.

Aunque ya queda un poco lejos, no me gustaría terminar esta tesis sin dar las gracias atodas las personas que he conocido durante mis años en la universidad del País Vasco. Com-pañeros de clase presentes y ausentes, compañeros de laboratorio y a la Dra. Elena VecinoCordero por alimentar esa motivación fundamental en mis primeros años de laboratorio.

También agradecer a Ana García, Jessie Barandika y Nieves Gomez por la incondicio-nal ayuda encontrada en ellos para la obtención de los animales, en las relaciones con los ga-naderos y en acercarme al mundo veterinario. A Wilfred Goldmann y Stewart Burgess delAnimal Health Institute de Edimburgo por ese mes que nunca olvidaré.

A Bea, Dani, Leyre y a los compañeros del laboratorio P3 por su aportación al genoti-pado y en las pruebas rápidas.

A mis compañeros de laboratorio Mara, Josune, Itziar, Jon Imanol, Iratxe, Iker, Vega,Xeider, Olaia, Natalia, Lucía, Idoia, Inés y al resto de compañeros de Neiker.

A Gaskón, Rua, Chamero, Leolo y demás amigos por compartir nuestras vivencias doc-torales y no doctorales en altura y en bajura.

A mis padres por su apoyo y por haberme dado esta gran oportunidad que jamás olvi-daré, sin duda, vuestra mejor herencia. A Elena, Iñaki, Rebeca, Pablo, Mertxe y al pequeñoEder por su compañía.

Agradecer enormemente a la persona de la que he recibido un gran apoyo y que más havivido y sufrido esta última etapa. No solo por aguantar carros y carretas sino también poresos momentos que merecen la pena. De todo corazón, gracias Anita.

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Finalmente terminar agradeciendo al colectivo naranja o precario que no da las graciasa todo aquello que supone trabas injustas en la carrera de los jóvenes investigadores. Por eseesfuerzo en luchar por mejorar la situación de la investigación en general y sobre todo la delos becarios. Porque investigar es trabajar.

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El presente trabajo ha sido desarrollado en el Dpto. de SanidadAnimal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agra-rio (Neiker-Derio). Este trabajo ha sido financiado por el Dpto.de Educación, Universidades e Investigación del GobiernoVasco a través de una beca predoctoral y por los proyectos PI-00-20 y EC2001-3 y por el Dpto. de Agricultura y Pesca delGobierno Vasco.

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ABREVIATURAS

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A: AdeninaACTB: b-actinaBax: Proteína X asociada a Bcl-2Bcl-2: B-cell CLL/lymphoma 2BSA: Seroalbúmina bovinaC: CitosinaCA: Cuantificación absolutaCAPV: Comunidad Autónoma del País

VascoCCD: Sensor de transferencia de carga

(charge coupled device)CDF: Células dendríticas folicularesCR: Cuantificación relativaCt: Ciclo de la PCR a tiempo real (thres-

hold cycle)CV: Coeficiente de variaciónddNTP: dideoxinucleotido 5’-trifosfatoDNA: Ácido desoxiribonucleicodNTP: DeoxinucleotidotrifosfatoE: Eficiencia de la amplificación por PCRE1: Exón 1E2: Exón 2E3: Exón 3ECJ: Enfermedad de Creutzfeldt-JakobEEB: Encefalopatía espongiforme bovinaEET: Encefalopatía espongiforme transmi-

sibleFN: Factor normalizadorFRET: Transferencia de energía fluores-

cente mediante resonanciaG: GuaninaG6PDH: Glucosa 6-fosfato deshidrogena-

saGAPDH: Gliceraldehido 3-fostato deshi-

drogenasa

GFAP: Proteína ácida fibrilar glialGH: Hormona del crecimientoGP: Gen problemaGPI: GlicosilfosfatidilinositolGSS: Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-ScheinkerHK: Constitutivo, endógeno, housekee-

pingHMBS: Hidroximetilbilano sintasaIFF: Insomnio falmiliar fatalIGF-1: Factor de crecimiento similar a la

insulina tipo IIHQ: InmunohistoquímicaKb: KilobaseLCN: Latxa cara negraLCR: Latxa cara rubiaLINE: Elementos largos dispersosM: Parámetro que indica la estabilidad de

un genMcl-1: Myeloid cell leukemia 1MGB: Unión a surco menor MnSOD: Superoxido dismutasa depen-

diente de MnmRNA: Acido ribonucleico mensajeroMRP8: Factor inhibidor de migraciónNBD: 4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazolNCBI: Centro Nacional de Información

BiotecnológicaNGF: Factor de crecimiento neuronalNLM: Nódulo linfático mesentériconPrP: Niveles normalizados de mRNA del

gen PrPOH: Grupo hidroxiloOIE: Oficina Internacional de EpizootiasORF: Marco de lectura abierto

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pb: Pares de basesPCR: Reacción en cadena de la polimerasaPD: Dímero de cebadorPEG: PolietilenglicolPrPc: Proteína prión celularPrPSc: Proteína prión patológicaPS: PolisacáridoQ: Cantidad de mRNAQGP: Cantidad de mRNA del gen proble-

maQHK: Cantidad de mRNA de un gen en-

dógeno de referenciaQR: QuencherR: ReporterRFLP: Polimorfismo el la longitud de los

fragmentos de restricciónRNA: Acido ribonucleicoRNS: Especies reactivas de nitrógeno ROS: Especie reactiva de oxígenoRPL19: Proteína ribosomal L19RT: RetrotranscripciónRT-PCR: Retrotranscripción seguida de la

reacción en cadena de la polimerasa SAF: Fibras asociadas a scrapieSD: Desviación estandar

SDHA: Succinato deshidrogenasaSDS: Dodecil sulfato sódicosECJ: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

esporádicoSINE: Elementos cortos dispersosSNC: Sistema nervioso centralSNP: Polimorfismo de DNA en una baseSOD: Superoxido dismutasa dependiente

de Cu y ZnT: Timina T1: Grupo de riesgo 1T2: Grupo de riesgo 2T3: Grupo de riesgo 3T4: Grupo de riesgo 4T5: Grupo de riesgo 5Ta: Temperatura ambienteTm: Temperatura de disociaciónTNFa: factor de necrosis tumoral a UBC: Ubiquitina CUE: Unión EuropeaUK-NSP: Plan Nacional sobre Scrapie del

Reino UnidoUTR: Región no codificanteUV: UltravioletaYWHAZ: Tirosina 3-monooxygenasa

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Lista de los 20 aminoácidos con sus abreviaturas.

Aminoácido Código Aminoácido Código

Alanina Ala, A Isoleucina Leu, LArginina Arg, R Leucina Ile, IAsparagina Asn, N Lisina Lys, KÁcido Aspártico Asp, D Metionina Met, MCisteína Cys, C Prolina Pro, PFenilalanina Phe, F Serina Ser, SGlutamina Gln, Q Tirosina Tyr, YAcido Glutámínico Glu, E Treonina Thr, TGlicina Gly, G Triptófano Trp, WHistidina His, H Valina Val, V

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Código genético. La combinación de tres bases da lugar a un triplete específico que co-difica para un determinado aminoácido. El triplete AUG es señal de iniciación durante la tra-ducción del mRNA y las señales UAA, UAG, UGA son señales de parada.

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ÍNDICE

Capítulo 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271.1. El scrapie y las EETs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291.2. Etiología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331.3. Cepas priónicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371.4. Síntomas clínicos y diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381.5. Patogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391.6. Transmisión de las EETs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421.7. El gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

1.7.1. Estructura del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431.7.2. Expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451.7.3. Regulación de la expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 461.7.4. Susceptibilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

1.8. La proteína PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501.8.1. Estructura y topología de la PrPc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501.8.2. Funciones biológicas de la PrPc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

1.8.2.1. Función antioxidante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 541.8.2.2. Homeostasis mineral del cobre y del calcio intracelular . . . . . . . . 551.8.2.3. Implicación en el ritmo circadiano y en el sueño . . . . . . . . . . . . . . 551.8.2.4. Señalización celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551.8.2.5. Otras funciones protectoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

1.9. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Capítulo 2. MATERIALES Y MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592.1. Obtención de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

2.1.1. Obtención de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 612.1.1.1. Extracción de DNA a partir de muestras de sangre . . . . . . . . . . . . 612.1.1.2. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido . . . . . . . . . . . . . 612.1.1.3. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido en parafina . . . . 622.1.1.4. Purificación de plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

2.1.2. Obtención de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632.2. Concentración, pureza e integridad de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 642.3. PCR cualitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

2.3.1. Fundamento teórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 652.3.2. Componentes y optimización de la reacción de amplificación . . . . . . . . . . . 66

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2.3.2.1. Calidad del DNA molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 662.3.2.2. Diseño de los cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 662.3.2.3. DNA Polimerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 662.3.2.4. Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 672.3.2.5. Sales de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 672.3.2.6. Temperatura y número de ciclos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

2.3.3. Contaminaciones en la PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 682.3.4. Detección del producto de PCR. Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 682.3.5. Purificación de productos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

2.4. PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 692.4.1. Fundamento teórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 692.4.2. Detección del producto de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

2.4.2.1. Sondas TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 712.4.2.2. SYBR Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

2.4.3. Componentes y optimización de la reacción de amplificación . . . . . . . . . . . 732.4.3.1. Componentes de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 732.4.3.2. Diseño de cebadores, sondas y amplicón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

2.4.4. Parámetros en PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 742.4.5. Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

2.4.5.1. Detección de patógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 762.4.5.2. Detección de SNPs con sondas TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

2.4.6. Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 772.4.6.1. Cuantificación absoluta (CA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 772.4.6.2. Cuantificación relativa (CR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

2.5. PCR-RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 802.6. Clonación de fragmentos de DNA en Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 802.7. Secuenciación automática del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

Capítulo 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLPY PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOSDEL GEN PrP. ANÁLISIS REPRESENTATIVO DE LA POBLACIÓN OVINADE LA CAPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 833.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 853.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 863.3. Puesta a punto de la técnica de genotipado por PCR-RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . 873.4. Puesta a punto de la técnica de genotipado por PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . 903.5. Validación de las técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 933.6. Distribución de genotipos en razas autóctonas de la CAPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 933.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Capítulo 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS ENESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 994.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

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4.2. Selección de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1024.3. Extracción de RNA y síntesis de cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1024.4. Diseño de cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1034.5. PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1064.6. Análisis de la estabilidad de los genes endógenos y selección de genes

para la normalización en tejidos ovinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1084.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Capítulo 5. EXPRESIÓN DEL GEN PrP EN TEJIDOS OVINOS Y SURELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE . . . . . . . . . . . . 1155.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1175.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1185.3. Extracción de RNA, diseño de cebadores y puesta a punto de la RT-PCR . . . . . . . 1185.4. Normalización de la expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1195.5. Análisis estadístico de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1195.6. Expresión normalizada del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1205.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Capítulo 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1256.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1276.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1276.3. Extracción de RNA, diseño de cebadores y puesta a punto de la RT-PCR . . . . . . . 1286.4. Normalización de la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1306.5. Análisis estadístico de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1316.6. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

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Capítulo 1

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

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1.1. EL SCRAPIE Y LAS EETs

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedadesneurodegenerativas del sistema nervioso central que afectan tanto a animales como al hom-bre (Tabla 1.1). Estas enfermedades poseen una serie de características comunes como largosperiodo de incubación, compartir un agente causal transmisible de forma experimental o na-tural, ausencia de respuesta inmune y unas lesiones neurológicas características y letales. Elscrapie, llamado también prurigo lumbar o tembladera, es la EET que afecta a las especiesovinas, caprinas y al muflón, y está extendida prácticamente por todo el mundo.

A mediados del siglo XVIII se describen en el Reino Unido, las características clínicasde una enfermedad en el ganado ovino a la que se le denominó rickets. Algunos autores pos-tulan que estos primeros casos se debieron a la introducción de animales de raza merina pro-venientes de España en el siglo XV, manera en la que se extendió la enfermedad a otros paí-ses de Europa [212]. Sin embargo, los numerosos focos de la enfermedad descritos en lasdistintas regiones afectadas hicieron pensar en una enfermedad endémica [114]. A partir delaño 1750 se describen un gran número de brotes desencadenando un problema de gran mag-nitud [67]. Curiosamente la enfermedad no afectaba por igual a todas las razas, situación quefue aprovechada a partir de 1810 para emplear machos aparentemente resistentes en un in-tento de frenar su propagación. De esta manera se consiguió mermar la enfermedad pero noerradicarla. Posteriormente, entre los años 1920 y 1950 comenzaron a darse casos en algunasrazas que hasta la fecha no habían presentado la enfermedad.

Las primeras descripciones de esta enfermedad en Europa proceden de Alemania yFrancia y datan de los años 1750 y 1788 respectivamente. En otras zonas del viejo continen-te como Escandinavia, Dinamarca, Bélgica y España, la enfermedad se describe por primeravez a mediados del siglo XX. Fuera del continente Europeo como en la India, Australia, Nue-va Zelanda, América, Sudáfrica y Kenia, se describen casos de scrapie a principios y media-dos del siglo XX por importación de animales procedentes de países con la enfermedad comoFrancia y Reino Unido. En la actualidad, se considera que Australia y Nueva Zelanda son pa-íses libres de scrapie.

Además del scrapie, entre las EETs se incluyen enfermedades de más reciente descrip-ción como son la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la encefalopatía espongiformefelina (EEF), y otras conocidas por décadas y que afectan al hombre, como son la enferme-dad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) y el Kuru.

En noviembre de 1986, en el Reino Unido se describe el primer caso EEB derivandomás adelante en una epidemia a gran escala (Figura 1.1). El primer caso aparecido en la Eu-ropa Continental se declaró en noviembre de 1990 en Suiza, y posteriormente se fueron de-tectando casos en otros países europeos y asiáticos. Parece altamente probable que la epide-mia de la EEB se inició en el Reino Unido por la transmisión del agente del scrapie del ovinoal bovino, a través de la cadena alimentaria mediante el empleo de piensos suplementados conproteínas de origen ovino (harinas de carne y hueso) cuyo proceso de fabricación había sidomodificado poco tiempo antes. Posteriormente, el 22 de marzo de 1996 el Ministro de Sani-

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dad británico anunció que una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ)había sido descubierta por la Unidad de Vigilancia Especializada creada específicamente paracontrolar la posibilidad de infección en humanos. Se sugirió que la vECJ estaba relacionadacon el consumo de carne contaminada con EEB. Este anuncio provocó una crisis alimentarianacional y la prohibición de la exportación de carne y todos los productos cárnicos derivadosincluyendo productos tan diversos como los utilizados en cosmética. Hasta el año 2005, sehan descrito 171 casos de la vECJ (154 en Reino Unido, uno en Irlanda, 11 en Francia, unoen Italia, dos en los Países Bajos, uno en EEUU y uno en Canadá).

DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y...

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Tabla 1.1. Clasificación de las encefalopatías espongiformes transmisibles humanas y animales

Enfermedad Hospedador Descripción

Scrapie

Encefalopatía transmisible delvisón

Enfermedad del desgaste crónico(CWD)

Encefalopatía espongiformebovina (EEB)

Encefalopatía espongiforme felina(EEF)

Encefalopatía de unguladosexóticos (EUE)

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakobiatrogénico (iECJ)

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakobesporádico (sECJ)

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakobfamiliar (fECJ)

Variante de la enfermedad deCreutzfeldt-Jakob (vECJ)

Enfermedad de Gerstmann- Sträussler-Scheinker(GSS)

Insomnio Familiar Fatal (FFI)

Kuru

Ovejas, cabras y muflón

Visón

Ciervo, Venado y Alce

Vaca

Gato

Antílope (Nyala, Oryx& el gran Kudu)

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

EET natural. Transmisible experimentalmentea otras especies

En granjas probablemente como resultado de laingesta de restos contaminados con scrapie

En granjas probablemente como resultado de laingesta de restos contaminados con scrapie

Epidemia de las vacas locas probablementecomo resultado de la ingesta de harinascontaminadas con scrapie

Probablemente como resultado de la ingesta derestos contaminados con scrapie

Probablemente como resultado de la ingesta derestos contaminados con scrapie

Transmisión iatrogénica: neurocirugía,transplante corneal, tratamiento con hormonadel crecimiento

No asociada a mutaciones del gen PrP

Asociado a mutaciones del gen PrP

Asociado a ingesta de carne contaminada conEEB

Enfermedad familiar ligada a mutaciones delgen PrP

Desorden familiar asociado a mutaciones delgen PrP

Enfermedad transmitida por canibalismo.Endémica de Papua Nueva Guinea.

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Desde 1986 el número de casos de EEB en UK sufrió un progresivo aumento hasta lle-gar al máximo histórico de 37.280 casos en 1992, cifra que hubiera sido mucho mayor de noser porque se empleó solamente un sistema de vigilancia pasiva. A partir de esta fecha la epi-demia comenzó a remitir llegando a los 343 casos del año 2004 (Tabla 1.1). En España, eldiagnóstico de la EEB comienza a ser obligatorio en el año 2001 para todos los animales deconsumo y en enero de 2002 se extiende también a los animales muertos en granja (vigilan-cia activa). Los dos primeros casos se diagnosticaron en Galicia a finales de 2000, comuni-dad autónoma donde más casos han aparecido. La mayoría de los casos de EEB se concen-tran en el noroeste de la península y en los animales de raza frisona. Esto es debido a que enesta región se concentra un gran número de animales y además, el ganado lechero en su ma-yoría Frisón, necesita de suplemento alimentario con piensos lo que aumentó el riesgo de con-tacto con el agente de la EET. También existe un número de casos anormalmente alto en Na-varra y Menorca probablemente asociado con distribuidores de piensos específicos. El mayornúmero de casos se registró en el 2003 con la cifra de 167 casos y posteriormente ha ido endisminución hasta los 137 casos en el año 2004 (Figura 1.2). Esta reducción progresiva hasido posible gracias a la prohibición del uso de harinas de carne que comenzó en el año 1996pero que no se hizo totalmente efectiva hasta el año 2001.

Respecto al scrapie en España durante el periodo 2000-2004 se han analizado un totalde 160.380 animales de los que se han detectado 236 animales positivos pertenecientes a 69rebaños. En el año 2003 parece haber un aumento del número de casos probablemente debi-do al aumento del número de animales analizados (Figura 1.3). Los animales sospechosos descrapie son analizados con las mismas pruebas empleadas en la detección de la EEB. Actual-mente, estas pruebas se usan en un programa nacional de muestreo de animales mayores de18 meses sacrificados para consumo humano y de los animales que mueren en explotación.Ante la aparición de un animal positivo ya no se tiende a sacrificar todo el rebaño sino que se

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

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Figura 1.1. Casos de EEB en el Reino Unido. (Datos actualizados según la OIE a 16 de mayo de 2005)

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procede a un sacrificio selectivo en base al riesgo genético de los animales bajo el asesora-miento de los Servicios Veterinarios Oficiales de las Comunidades Autónomas.


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Figura 1.2. Casos de EEB en España. (Datos actualizados según la OIE a 26 de mayo de 2005)

Figura 1.3. Casos de scrapie en España

Dada la importancia del scrapie a nivel de la sanidad animal y quizás también de la sa-lud humana por su posible implicación en la EEB, se hace necesario el conocimiento profun-do de esta enfermedad. Además, la similitud entre las alteraciones neuropatológicas observa-das en el scrapie y las obseradas en las EETs humanas y en otras neuropatologías como elAlzheimer y el Parkinson, hacen de esta enfermedad un buen modelo de estudio.

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1.2. ETIOLOGÍA

Los estudios realizados con infecciones experimentales han sido cruciales en el cono-cimiento de la naturaleza del agente causal de las EETs. Inicialmente, la oveja fue el modeloanimal más utilizado. Con él se conseguía reproducir la enfermedad al cabo de uno o másaños después de la inoculación del agente por medio de homogeneizados de material nervio-so infectado. Posteriormente, el empleo de ratones mejoró y facilitó el trabajo experimentaldebido a la reducción del periodo de incubación que pasó a ser de 70 a 150 días. Los prime-ros estudios realizados para conocer la naturaleza del agente causal hicieron pensar en unagente de tipo viral debido a que la infecciosidad se conservaba después del filtrado especí-fico para virus. Sin embargo, diferentes ensayos demostraron que ni el tratamiento con for-mol [111] ni tratamientos para destruir los ácidos nucleicos como la radiación ionizante y UVafectaban a la infecciosidad del agente [3, 4]. De estos estudios se dedujo que la replicacióndel agente causal del scrapie no dependía de un ácido nucleico. En contraposición, la exis-tencia de distintas cepas de scrapie con patrones lesionales característicos [92], dejaba lapuerta abierta a la existencia de un agente infeccioso con un genoma independiente del hos-pedador. En 1981, diversos estudios realizados por Merz y cols. [190], descubrieron unas es-tructuras filamentosas de 100-1000 mm de longitud en el encéfalo de animales con scrapie yen enfermos de ECJ. A estas estructuras se les denominó fibras asociadas a scrapie (SAF), delinglés scrapie-associated fibrils [190] (Figura 1.4).


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Figura 1.4. Fotocomposición de micrografías electrónicas de las fibras de PrPSc llamadas SAF

Sin embargo, la naturaleza exacta del agente causal de las EETs era aún controvertidapuesto que se desconocía la existencia o no de un agente desencadenante. Para aclarar estacuestión, durante los últimos años, los investigadores han realizado numerosos estudios en-caminados a evaluar las distintas hipótesis, aunque ninguna ha sido probada de manera con-cluyente. Existen por tanto dos hipótesis fundamentales; la primera apoya la idea de que elagente infeccioso no posee ningún ácido nucleico y que está formado exclusivamente por

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proteína (la hipótesis del prión enunciada por Prusiner en 1982) y la segunda, que se decantapor la existencia de un agente viral todavía no descrito (la hipótesis del virino) (Figura 1.5).

La hipótesis del prión postula que el agente infeccioso causante de las EETs consistesolamente en una proteína capaz de autoreplicarse, un fenómeno descrito por primera vez en1967 [116] y posteriormente avalado por Prusiner y colaboradores en 1982 [220]. Según estahipótesis, la causa de estas enfermedades se encuentra en la conversión de forma espontáneao por inducción exógena de una proteína desconocida (con una conformación normal favo-recida energéticamente) a otra conformación anormal. En el año 1982 Stanley Prusiner y suscolaboradores consiguieron un enriquecimiento bioquímico de un extracto de naturaleza pro-teica con una infecciosidad 1.000 veces superior que el encéfalo infectado de partida, al queconsideraron el agente etiológico de la enfermedad. Este enriquecimiento se realizó a travésde una serie de etapas que incluyeron precipitación con polietilenglicol, digestión con nucle-asa de micrococos, digestión parcial con proteinasa K y centrifugación en gradiente de saca-rosa [220, 225]. La mayor actividad infecciosa se encontró en la interfase, entre el 25% y el60% de sacarosa, donde se observaron agregados compuestos de material amorfo y con as-pecto fibrilar que medían 25 nm x 100-200 nm. La infecciosidad del purificado fue inactiva-da con proteinasa K, dietilpirocarbonato, urea, agentes caotrópicos, fenol y SDS, pero no seeliminó con tratamientos de nucleasas o por radiación UV. Estas propiedades fisicoquímicastípicas de proteínas llevaron a Prusiner y sus colaboradores a proponer el nombre de “prión”para definir la partícula infectiva de naturaleza proteica de manera que se distinguiera de vi-rus, bacterias, hongos y otros agentes patógenos conocidos [220]. Posteriormente, observa-ron que dicho extracto contenía una sola proteína que presentaba digestión parcial frente aproteinasa K y un tamaño de 27-30 KDa por SDS-PAGE [29], [225], por lo que la denomi-naron PrPSc (proteína del prión asociada a scrapie), PrP27-30 o PrPres (proteína resistente a la pro-teinasa K). Inmediatamente se pensó que el prión podía ser un producto de la infección, sinembargo, la purificación de la partícula PrP de 27-30 KDa resistente a proteinasa K y la con-firmación de su infecciosidad ofrecía evidencias de su implicación causal en la enfermedad.De forma similar, las estructuras filamentosas descubiertas por primera vez en 1981 por Merzy cols. [190] a partir de encéfalos infectados, presentaban las mismas características de resis-tencia al tratamiento con proteinasa K y presencia del fragmento de 27-30 de la PrP.

La purificación de la PrPSc permitió secuenciar su extremo N-terminal [226] y aislar losclones de cDNA de una librería derivada de hámsters y ratones infectados de scrapie [13, 59,203]. Sorprendentemente, se descubrió que esta proteína no era el producto de un gen viralsino que era codificada por un gen del hospedador [13, 203]. Se determinó que la PrPSc era laforma resistente a proteasas de una isoforma de 33-35 KDa codificada por el hospedador, laPrPc. Sin embargo quedaba por confirmar si realmente se trataba de una isoforma de una pro-teína codificada por el hospedador. Con el fin de demostrar esta hipótesis, se realizaron nu-merosos estudios enfocados a encontrar diferencias fisicoquímicas entre ambas isoformas entérminos de modificaciones post-traduccionales. A partir de estos estudios se demostró queambas isoformas presentaban la misma movilidad electroforética por SDS-PAGE y la mismaantigenicidad [12, 203]. Además, ambas isoformas sufren una escisión del fragmento señalN-terminal [13, 133], glicosilación [56] y unión de glicosilfosfatidilinositol en el extremo


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C-terminal [265]. Sin embargo, a diferencia de la PrPc, la forma patológica PrPSc presentabainsolubilidad en detergentes no desnaturalizantes y resistencia parcial al tratamiento con pro-teasas. De este modo, quedaba demostrado que tanto los animales sanos como los infectadosexpresaban la PrPc. También se encontraron diferencias conformacionales entre ambas iso-formas. Se determinó como la PrPc presentaba un 42% de a–hélice y un 3% de hoja b, mien-tras que la PrPSc presentaba un 30% de a–hélice y un 43% de hoja b [209]. Por otro lado, eldesarrollo del anticuerpo de la PrPSc [22] permitió detectar su presencia consecutivamente enel encéfalo de pacientes con ECJ, GSS y Kuru [27, 42], en el scrapie natural y experimental[245], en la EEB [134], así como en infecciones experimentales en ratón [70]. Estos estudiosdemostraron in vivo la relevancia y especificidad de esta proteína en las EETs a pesar de exis-tir diferencias individuales en la acumulación y localización de la misma.


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Figura 1.5. Representación gráfica de la hipótesis del prión y del virino. (El prión procede del cam-bio conformacional de una proteína codificada por el hospedador y es capaz de autoreplicarse. El vi-rino es una partícula infecciosa parecida a los viroides de plantas. Está formado por información ge-nética propia, protegida por la PrPSc a modo de envuelta, cuyo precursor es sintetizado por elhospedador. Ilustración tomada de http://coli.usal.es/web/articulos/art17/art17.htm)

La hipótesis del prión sin embargo, requiere una explicación para el proceso por el cualla PrPSc es capaz de autoreplicarse. En este sentido se han descrito dos modelos. El primerollamado “modelo conformacional”, propone que la PrPc y la PrPSc son isómeros conforma-cionales y que el desarrollo de la enfermedad estaría controlado por el cambio conformacio-nal de PrPc a PrPSc. A continuación, una molécula de PrPSc se asociaría a una molécula de PrPc

para producir un heterodímero PrPSc-PrPc el cual se transformaría en dos moléculas de PrPSc.Según este modelo, la formación de PrPSc se realiza de forma autocatalítica con propagaciónexponencial. El “modelo de polimerización nucleada por condensación no covalente” [162]supone que el cambio conformacional está ligado a un equilibrio de asociación, de maneraque ambas conformaciones existen en equilibrio pero la estabilización de la isoforma patoló-gica ocurre a través de la formación de un núcleo que constituye la etapa lenta del proceso.Una vez constituido el núcleo, éste crece por adiciones sucesivas y rápidas de nuevas molé-culas disparándose el proceso. Cabe destacar como diversos estudios genéticos con ratones

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han proporcionado la evidencia más fuerte que apoya la idea de que el agente infeccioso segenera a partir de la PrPc del hospedador. Se ha observado desarrollo y transmisión de la en-fermedad priónica en ratones que expresan la proteína PrPc de humano con la mutaciónP101L característica de pacientes con GSS [136, 137]. Estos resultados parecen indicar quetodos los componentes necesarios para la formación de partículas infecciosas parecen encon-trarse en el propio hospedador por lo que se apoyaría la hipótesis del prión en la que la sínte-sis de novo produce la PrPSc. El empleo de levadura como modelo experimental, cuyos prio-nes son similares a los priones de mamíferos, permitió a dos grupos de investigaciónindependientes [157, 269] establecer de forma convincente que los priones son proteínas yque no dependen de genes o de otros factores para la transmisión de sus características. Bá-sicamente estos ensayos señalan como los priones de levaduras y de mamíferos transmitensus características por medio de interacciones entre proteínas, en las cuales un prión plegadoanormalmente provoca en su isoforma normal una conformación irregular. La existencia decepas de priones podría explicarse exclusivamente por la capacidad que tienen las proteínasde plegarse en más de una conformación y con ello poder dar el salto de la “barrera de espe-cie” [269]. La base experimental consiste en la utilización de distintas temperaturas para in-fluir en el plegamiento in vitro de las proteínas, con este método los investigadores demos-traron que las conformaciones proteicas producidas a diferentes temperaturas se propagabana sí mismas como cepas distintas. De esta forma, un prión con una determinada conformaciónconvierte una proteína normal en infecciosa con una alta eficiencia, dando un tiempo de in-cubación corto, mientras que otro prión con otra conformación lo hace menos eficientemen-te necesitando un mayor tiempo de incubación. De la misma manera, un prión sería atraídocon más facilidad por un cierto tipo de neuronas mientras que otro lo sería por otro tipo, pro-duciendo en ambos casos efectos distintos.

Es muy probable que la conversión de la PrPc a la proteína específica de la enfermedad,PrPSc, sea el proceso clave de la patogénesis de las EETs, sin embargo la naturaleza exacta delagente causal de las EETs es aún controvertida puesto que se desconoce la existencia o no deun agente desencadenante. En el camino hacia la búsqueda del agente causal se demostrócomo además de las preparaciones enriquecidas de SAF, las preparaciones sin filamentos vi-sibles también presentaban infecciosidad [79, 227]. La purificación de estas muestras, per-mitió determinar el límite de infecciosidad en 105 moléculas. Con esta baja infecciosidad, sepensó en la existencia de otros componentes o modificaciones covalentes necesarias para lainfección. En 1992, el estudio de muestras altamente purificadas hizo sugerir la existencia deuna molécula de ácido nucleico mayor de 100 pb por partícula infectiva [152]. Por lo tanto,la demostración de la hipótesis de la proteína prión como único agente infeccioso necesita dela producción de partículas infectivas totalmente libres de DNA. En este sentido surge la hi-pótesis del virino que apoya la existencia de un agente viral. La existencia de múltiples cepasde scrapie sería el argumento principal para sugerir que el agente de las EETs lleva informa-ción genética en un ácido nucleico independiente del hospedador y que codifica para el mí-nimo número de proteínas necesarias para la patogénesis y la replicación [44, 239]. Ademásla existencia de estas variedades o cepas de un mismo agente infeccioso explicaría de mane-ra convincente la variedad en la patogenia de las enfermedades priónicas, a diferencia de la


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hipótesis del prión cuya explicación en base a las diferentes estructuras tridimensionales quepuede adoptar la PrPSc no es tan sólida. Sin embargo, uno de los puntos flojos de la hipótesisdel virino es la ineficacia de la inactivación del agente infeccioso mediante el empleo de re-activos que degradan los ácidos nucleicos. Para solventar este punto, el modelo propone quelos reactivos empleados no tienen acceso al ácido nucleico, quizá por la protección de la PrPSc

que actuaría a modo de envuelta [76] (Figura 1.5). Dicho modelo de agente infeccioso enca-ja con un nicho biológico situado entre los virus (que llevan ácido nucleico que codifica parasus propias proteínas) y los viroides (que no necesitan proteínas), y por eso se ha sugerido lla-marle “virino”.

En base a la radiosensibilidad de varios virus, se ha estimado el tamaño del genoma delagente de las EETs en 1.5 x 106 Da o 0.9 x 106 Da dependiendo de si se trata de cadena dobleo simple [239]. En 2002 Somerville y cols. [263] demostraron como las distintas temperatu-ras de inactivación de una serie de cepas se mantenían tras infecciones experimentales en ra-tones. Estos resultados apoyaron la idea del virino en la que habría información independientedel hospedador.

En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo hasta ahora no han encontrado nin-gún tipo de ácido nucleico, por lo que la hipótesis más aceptada es la hipótesis del prión.

1.3. CEPAS PRIÓNICAS

A comienzos de los 60, cuando el scrapie ovino fue transmitido experimentalmente acabras, se observaron animales con unos síntomas clínicos distintos y bien diferenciados, ani-males con hiperexcitación por un lado y animales con somnolencia por otro [215]. Las dife-rencias encontradas entre los síntomas de estos dos grupos de animales se mantuvieron en in-fecciones consecutivas por lo que se pensó en la existencia de distintas cepas de scrapie. Aestos experimentos les siguieron otros sobre transmisión experimental y pases consecutivosde una gran variedad de material infeccioso en ratones mostrando muchas evidencias de laexistencia de distintas cepas de scrapie. En el Reino Unido existen aproximadamente 20 ce-pas de scrapie biológicamente definidas y caracterizadas.

La identificación de cepas priónicas se fundamenta en un conjunto de características bio-lógicas y fisicoquímicas. La diana exacta, la distribución y gravedad de los cambios patológi-cos asociados con las distintas cepas son algunas de las características más enigmáticas de lapatogenia de las EETs. Sin embargo, todavía no se conocen los mecanismos biológicos quemodulan estas propiedades. Las diferentes cepas pueden además presentar diferencias en el pe-ríodo de incubación, en el perfil de lesiones que provocan en infecciones experimentales conratones y en el patrón de glicosilación de la PrPSc. Estas infecciones se realizan en varios pasescon el fin de demostrar la reproducibilidad del perfil de cada cepa, y cabe destacar que los pe-riodos de incubación en las infecciones experimentales durante los sucesivos pases son alta-mente reproducibles. Sin embargo, hay que tener en cuenta que algunas características de lascepas pueden variar según la línea de ratón con la que se trabaje, la cantidad inoculada y la ruta


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de inoculación [45]. El perfil lesional se determina mediante el estudio histológico de la dis-tribución de las alteraciones neuropatológicas así como del patrón de vacuolización produci-do. El perfil lesional tiene la ventaja añadida sobre el uso del periodo de incubación de que per-mite la discriminación de las cepas de scrapie independientemente de la dosis [45]. El patrónde glicosilación viene dado por la característica de la PrPSc de presentar glicosilación en dosposiciones de modo que se puede distinguir una forma no glicosilada, otra monoglicosilada ypor último la biglicosilada. Estas tres formas de la PrPSc presentan diferente movilidad elec-troforética en un gel de SDS-PAGE [62] e incluso pueden presentarse en distinta proporción.Otro de los parámetros empleados en la tipificación de cepas es la resistencia a la inactivacióntérmica [77] e incluso su susceptibilidad a degradación proteolítica [25].

Estas diferencias entre las cepas permiten diferenciar infecciones por cepas de EEB enovejas y cabras de la infección por scrapie [84, 272] así como las distintas variantes de ECJ[62, 130]. Otra de las aplicaciones del tipado de cepas reside en la diferenciación del scrapieatípico y el scrapie clásico. A diferencia de la forma clásica, el scrapie atípico presenta un per-fil lesional localizado en la capa molecular y granular del cerebelo y una ausencia o escasapresencia de depósitos de PrPSc en la región del tronco del encéfalo. Además el patrón de gli-cosilación de esta cepa, conocida como Nor98, presenta una banda extra de 12 KDa [23]. Elconocimiento de estas diferencias ha permitido detectar cepas con características similares encasos de scrapie procedente de localizaciones geográficas diversas [97, 204].

1.4. SÍNTOMAS CLÍNICOS Y DIAGNÓSTICO

El scrapie, es una enfermedad de desarrollo lento cuyos síntomas clínicos aparecen nor-malmente entre los 2 y 5 años de edad. Las ovejas afectadas pueden vivir entre 1 y 6 mesestras la aparición de los síntomas clínicos pero el desenlace fatal es inevitable. En el scrapiecomo en otras EETs, el SNC es la diana donde el prión desencadena una serie de alteracionesneuropatológicas. La sintomatología puede variar ampliamente entre los animales afectados,posiblemente debido a diferencias en la región cerebral afectada. Los síntomas clínicos mástempranos incluyen cambios en el comportamiento de los animales seguido de movimientosbruscos, rechinar de dientes, nerviosismo, temor y prurigo que provoca en el animal una ten-dencia a rascarse y frotarse contra objetos, aparentemente con el objetivo de aliviar el picordando lugar a la pérdida de lana e inflamación de la piel. También pueden presentarse incor-dinación motora, posturas anormales y temblor, signos que se desencadenan alrededor de2-3 meses antes de la muerte. En estados más avanzados se puede observar pérdida de peso,ataxia severa, parálisis y finalmente la muerte del animal [215].

En muchos casos la sintomatología asociada a esta enfermedad permite realizar un pri-mer diagnóstico clínico de sospecha de scrapie. Sin embargo, otras patologías que afectan alSNC pueden dar lugar a un diagnóstico erróneo, por lo que el diagnóstico diferencial es fun-damental. Hasta el momento, el diagnóstico confirmatorio solo puede hacerse post-morten.Según la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) el diagnóstico de las EETs puede reali-zarse mediante un análisis histopatológico, inmunohistoquímico, bioquímico (Western blot o


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inmunotransferencia) y ultraestructural (SAF). A nivel histopatológico, los cerebros de losanimales infectados parecen normales pero microscópicamente se puede observar astroglio-sis, vacuolización intracelular y pérdida neuronal [19]. También se han descrito alteracionesen el páncreas [302]. La inmunohistoquímica permite mediante el uso de anticuerpos especí-ficos la detección de agregados de PrPSc. Mediante el Western blot y empleando también an-ticuerpos específicos se pueden detectar las tres formas de glicosilacion (isotipos) de la PrPSc

y con ello la tipificación de cepas priónicas. También se han desarrollado tests rápidos basa-dos en la detección de la PrPSc mediante la técnica ELISA tras la digestión de la PrPc con pro-teinasa K y otra método sin digestión basado en la afinidad específica de un ligando. Estostests rápidos están homologados por la UE como método de cribado para la detección de laEEB y se emplean también en la detección del scrapie.

En la actualidad se está realizando un gran esfuerzo en desarrollar métodos de diag-nóstico ante-mortem que puedan dar información acerca del estatus del animal incluso antesde la aparición de los síntomas clínicos. Hoy en día estos métodos permiten la detección dela PrPSc en tejidos linfoides accesibles por biopsia como el tercer párpado, la amígdala o rec-to. Sin embargo, la dificultad de acceder a este tipo de muestras hace que no puedan aplicar-se de manera sistemática a todos los animales destinados al consumo humano como se hacecon los tests rápidos. Es por ello que se están intentando identificar marcadores presentes enmuestras de más fácil acceso como el suero o la sangre [279]. Este es el caso de la proteína14-3-3 cuya presencia elevada en el líquido cefalorraquídeo se asocia, aunque no de maneraexclusiva, con ECJ [54, 113].

1.5. PATOGENIA

Una vez que el prión consigue entrar en el organismo, se desencadenan un conjunto demecanismos patogénicos que culminan tras la llegada del agente al SNC. Estudios de infec-ciones experimentales en ratones con cepas de scrapie, han permitido conocer la evolucióndel prión a través de los diferentes órganos del animal. Así, se ha observado que tras la in-fección por vía oral, antes de la llegada del prión al SNC, se puede detectar infecciosidad enel bazo, en el tracto intestinal y en su sistema linfoide asociado como las placas de Peyer yamígdalas [30, 155]. En el caso de infección por vía intraperitoneal el prión sufre una am-plificación primaria en el bazo, desde donde es capaz de llegar al sistema nervioso de esteórgano, y a través de él infectar el SNC [156]. Otra de las estructuras implicadas en la neu-roinvasión son los nódulos linfáticos en los cuales se ha podido detectar PrPSc [187]. El es-tudio mas detallado de estos órganos infectados permitió determinar la presencia de PrPSc enlas células dendríticas foliculares (CDFs) sugiriendo su implicación en la replicación pri-maria del prión antes de llegar al órgano diana [187, 219, 232]. Estas células serían capacesde replicar el prión e incluso de diseminarlo a otras localizaciones. También se ha mencio-nado la implicación de otros tipos celulares como los linfocitos B y T, macrófagos y célulasM, aunque las CDFs parecen ser las principales responsables en el desarrollo inicial de laenfermedad [20, 151].


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Por lo tanto, la vía de entrada de los priones en el organismo tiene lugar a nivel intesti-nal donde se produce una primera replicación del prión en el tejido linfoide asociado para in-fectar posteriormente otros tejidos linfoides como nódulos linfoides, bazo y amígdalas (Fi-gura 1.6). Esta primera etapa suele coincidir con la fase pre-clínica asintomática del scrapie.Después de la replicación en el sistema linfoide y a través de nervios periféricos tiene lugarla invasión del SNC. También se ha descrito invasión axonal directa a través del nervio vago[41] e incluso dada la infecciosidad de la sangre, también se ha sugerido su implicación comovía de diseminación del prión. De cualquier modo, hay que tener en cuenta que el tipo decepa, la dosis de PrPSc y el hospedador son factores cruciales que pueden dar lugar a distintasformas de neuroinvasión.


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Figura 1.6. Esquema de los mecanismos de neuroinvasión. Aguzzi y cols. [2]

Cuando el prión llega al SNC continúa su replicación en el tronco del encéfalo, concre-tamente en la región del obex, para luego diseminarse por el resto de las regiones encefálicasdando lugar a la sintomatología nerviosa anteriormente mencionada. A nivel microscópico seobserva una astrocitosis y una vacuolización del tejido nervioso como consecuencia de la neu-rodegeneración. La apoptosis constituye el principal tipo de muerte neuronal que tiene lugaren las EETs [89, 103]. A nivel molecular se puede observar una alteración en la expresión degenes relacionados con el estrés oxidativo, activación de la glía y la apoptosis [65, 301]. Exis-te una respuesta glial en forma de astrocitosis y secreción de factores derivados de la glía re-activa como citoquinas. Esta activación glial parece tener un papel muy importante en la muer-te neuronal y se ha observado como su distribución precede a la muerte por apoptosis [102,297]. Existen numerosos estímulos que desencadenan la muerte por apoptosis y a su vez otrosfactores que protegen de la apoptosis (Figura 1.7). En las EETs se ha observado la implicaciónde numerosos factores pro-apoptóticos y anti-apoptóticos, sin embargo, existe una gran con-troversia acerca de qué factores son fundamentales y cual es la ruta que siguen las neuronasafectadas con PrPSc. La presencia de PrPSc en el tejido nervioso también provoca un daño oxi-

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dativo a través de la formación de especies reactivas del oxigeno (ROS) y nitrógeno (RNS).Esto se traduce en un daño oxidativo directo sobre lípidos, proteínas, DNA y RNA que desen-cadenan procesos de muerte neuronal por necrosis o por apoptosis [261]. También se ha ob-servado un cambio en el metabolismo del hierro traducido en una mayor concentración de hie-rro total que posiblemente favorezca el proceso de neurodegeneración [154].


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Uno de los aspectos de la patogenia de las EETs todavía sin resolver es conocer conexactitud los factores que determinan los patrones y la distribución de los depósitos de PrPSc

así como la razón por la que se producen las lesiones características. En el caso de sECJ lasalteraciones morfológicas parecen depender de las características fisicoquímicas de la PrPSc ydel perfil genético del individuo [210]. Otro factor a tener en cuenta sería la sensibilidad delas neuronas ante la PrPSc. Esta sensibilidad podría estar determinada por el nivel de expre-sión de la PrPc [185], sin embargo existen evidencias que demuestran como neuronas con al-tos niveles de PrPc muestran resistencia a la infección [104]. También hay que tener presentela existencia de distintas cepas de priones que pueden dar lugar a distintos patrones lesiona-les [43, 104]. En resumen, los depósitos de PrPSc y el daño tisular están probablemente in-fluenciados por factores propios del hospedador como el genotipo, la distinta vulnerabilidadde cada tipo celular, así como por la cepa de PrPSc

Figura 1.7. Esquema de distintos factores implicación en la apoptosis

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1.6. TRANSMISIÓN DE LAS EETs

La primera demostración de la transmisibilidad de las EETs data del año 1938 [64]. Mástarde, un rebaño completo quedó infectado tras ser vacunado contra el virus Louping ill de-bido a que dicha vacuna procedía de extractos de cerebros de ovejas infectadas de scrapie[111]. A continuación y basándose en las similitudes neuropatológicas entre el scrapie y lasencefalopatías humanas (Kuru y ECJ) [119, 159], se realizaron ensayos de transmisión delKuru y la ECJ a chimpancés [95, 101]. Estos trabajos describieron como el periodo de incu-bación en la transmisión primaria era más lento que en las sucesivas transmisiones horizon-tales, e incluso como se podía transmitir la enfermedad a partir de material del SNC o tejidosviscerales por inoculación intracerebral o periférica.

En lo que respecta al scrapie, la transmisión horizontal se produce por vía oral por la in-gesta del prión contenido en pastos, pienso, y sobre todo en la placenta de ovejas positivas[115, 213, 230]. La presencia de PrPSc en heces y orina también puede actuar como foco de lainfección [259]. Tampoco hay que olvidar la posible existencia de reservorios en la naturale-za que podrían intervenir en la transmisión del scrapie actuando a su vez como vectores de lainfección. Se ha postulado la infecciosidad de algunos ectoparásitos como los ácaros [53, 179,299].

La vía de transmisión materna (transmisión vertical) de las EETs no está del todo es-clarecida. Se cree que esta forma de infección en la EEB sucede a niveles muy bajos pero nose ha comprobado [294, 295]. Tampoco se ha podido demostrar en casos de ECJ [24]. Sin em-bargo, existen numerosos estudios epidemiológicos sobre scrapie que apoyan la existencia detransmisión vertical, indicando un mayor riesgo de infección para los fetos cuyas madres tie-nen scrapie que para los que provienen de madres libres de scrapie [85, 132]. La infecciosi-dad de la placenta procedente de ovejas y cabras con scrapie ha sido demostrada mediantebioensayos en ratones [205, 214]. Sin embargo, parece que la transmisión vertical no se da enel útero sino en el momento del parto a través de tejidos placentarios, y que el genotipo delfeto está implicado, de manera que fetos portadores del alelo ARR no acumulan PrPSc [7, 299].

Numerosos trabajos han puesto de manifiesto la transmisibilidad de las EETs entre unaamplia variedad de especies lo cual indica que es posible el salto de la “barrera de especie”.Esta infecciosidad entre especies se caracteriza por un prolongado periodo de incubación de-rivado de la existencia de diferencias en la secuencia de la PrPc del hospedador y la secuen-cia de la PrPSc inoculada [28]. A nivel molecular, estas diferencias se traducen en una menoreficiencia de la replicación de novo del agente en presencia de una PrPc distinta de la cual de-riva, por lo que cuanto más similares sean las secuencias aminoacídicas de ambas formas me-nor efecto de barrera de especie. Este hecho parece explicar porque las vacas inglesas desa-rrollaron EEB por consumo de tejidos de ovejas afectadas de scrapie: las proteínas PrPc deambas especies únicamente difieren en 7 aminoácidos. En cambio, la PrPc de la vaca y elhombre difieren en más de 30 de los 254 aminoácidos totales. Es quizás por ello, por lo quela transmisión de la vaca al hombre en forma de vECJ se produce con menor frecuencia.


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1.7. EL GEN PrP

1.7.1. Estructura del gen PrP

La proteína del prión está codificada por un gen de copia única [59, 203] que se en-cuentra localizado en el cromosoma 20 del hombre, 2 del ratón y en el cromosoma 13 de laoveja. El gen PrP se ha identificado en numerosas especies de mamíferos y se ha visto quese encuentra altamente conservado. A pesar de existir pequeñas diferencias en la longitud delgen prión dentro de una misma especie, podemos definir en unas 35.500 bases la longitud deeste gen para la especie humana, 38.400 bases para el ratón y 31.400 bases para la oveja. Ge-neralmente está compuesto por dos exones (E1 y E2) separados por un intrón de unas 2 kb,que tras splicing quedan unidos al exón 3 (E3) que contiene la región codificante de aproxi-madamente 750 pb (Figura 1.8).


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Figura 1.8. Estructura esquematizada del gen PrP en el humano (a), murino (b), vacuno (c) y ovino (d).(E1, exón 1; E2, exón 2; E3, exón 3)

El análisis de la secuencia del gen PrP ha permitido encontrar una serie de mutacionesligadas a diversas patologías hereditarias [224] así como la descripción de una gran variedadde mutaciones silentes y numerosas posiciones polimórficas [172, 229]. Asimismo ha permi-tido estudiar diferencias estructurales del gen PrP en distintas especies y las relaciones filo-genéticas entre estas. Muchos de los trabajos realizados acerca de la estructura del gen PrPse han basado en el análisis exhaustivo tanto de las regiones codificantes como de las no co-dificantes (UTR). En el gen PrP el marco de lectura abierto (ORF) que dará lugar a la prote-ína se encuentra íntegramente en el exón 3. Éste, incluye además en su extremo 5’, una re-gión UTR de 10 pb previas al codón de inicio ATG y que se muestra muy bien conservada al

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comparar las secuencias del hámster, ratón y oveja. Aproximadamente las primeras 170 pbdel ORF presentan una alta proporción de bases GC y codifican para las repeticiones de oc-tapéptidos/nonapéptidos ricas en glicina características de la región N-terminal de todas lasPrPc. En estas repeticiones se encuentra la base molecular de las funciones fundamentales dela PrPc que se explicarán con más detalle en el apartado 1.8.1. Cabe destacar la existencia demúltiples regiones ORF con un marco de lectura en sentido opuesto al ORF de la PrP deno-minadas antisense reading frame [106]. Estudios filogenéticos realizados en numerosas es-pecies de mamíferos han revelado una gran conservación de estos ORF. Este fenómeno no esnovedoso ya que también se ha descrito en numerosos genes como los de la proteasa Hsp70de bacterias y mamíferos [241]. Sin embargo, no se han encontrado mRNA anti-PrP al menosen ratones.

Con relación a las regiones intrónicas, el tamaño del intrón 1 presenta una alta simili-tud en todas las especies y una longitud que en general oscila entre 2 y 2.4 Kb a excepcióndel hombre donde el intrón 1 posee aproximadamente 12.7 Kb (asumiendo ausencia del exónhomologo 2, ver Figura 1.8). A diferencia del intrón 1, la longitud del intrón 2 varía entre lasespecies e incluso dentro la especie murina se han observado grandes diferencias . Duranteun tiempo se pensó que las diferencias en tamaño del intrón 2 del ratón se debía a una dele-ción, sin embargo, estudios posteriores han determinado que esta diferencia se debe a la exis-tencia de una estructura típica de transposón [172]. Este elemento transponible está flanque-ado por duplicaciones del motivo AAGCTT y presenta una gran similitud con el transposónde partículas retrovirales defectivas (IAP) diferenciándose principalmente en una pequeñadeleción del gen de la polimerasa. En cualquier caso, dicho elemento transponible presentauna estructura LTR-gag-pol-env-LTR. En relación al intrón de mayor tamaño del gen PrP hu-mano, existe una secuencia análoga al exón 2 de los genes de ratón y de oveja a la que se hallamado exón 2-like. Este análogo del exón 2 esta flanqueado por secuencias consenso ca-racterísticas de splicing, sin embargo, queda por establecer hasta que punto este exón, E2-like,está incluido en algún subconjunto de los mRNAs de la PrP humana. Estos datos sugieren quela organización inicial y ancestral del gen PrP, previa a la evolución de los mamíferos, fue de3 exones.

En el caso del gen ovino, la región 3’ UTR correspondiente al intrón 2 es particular-mente larga debido a la presencia de regiones transponibles. Mayoritariamente se debe a lapresencia de un trasposón fósil de tipo mariner de 1.2 Kb, ausente en los genes de ratón y dehumano [172]. La inestabilidad cromosómica asociada a la presencia de elementos de tipomariner en el cromosoma 17 humano sugiere que las posiciones adyacentes al gen PrP ovi-no y, por similitud en el bovino, son compatibles con reorganizaciones del DNA. El elemen-to fósil transponible mariner contiene siete u ocho frameshifts (mutación, deleción o inser-ción de una o dos pb) y cinco codones stop lo que sugiere que la inserción es relativamenteancestral y probablemente es compartida por todos los rumiantes. También podemos encon-trar otro tipo de secuencias transponibles como elementos LINE (elementos largos dispersos)y SINE (elementos cortos dispersos). En la Tabla 1.2 se resumen los distintos tipos de se-cuencias transponibles presentes en el gen PrP de humano, ratón, vaca y oveja, así como elporcentaje de pb que las forman respecto al total de la secuencia analizada.


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1.7.2. Expresión del gen PrP

El tamaño del mRNA del gen PrP puede variar según la especie entre 2.1 y 2.4 Kb enhámster, humano y ratón, hasta 4.6 Kb en ovino y vacuno. Sin embargo, la alta homología delORF localizada en un solo exón (E3) da lugar a una proteína de unos 250 aminoácidos. Laexpresión del mRNA y la proteína para la que codifica, está regulada durante el desarrollo ysegún el tipo celular.

En ovino existen dos transcritos del gen PrP de distinta longitud (2.1 y 4.6 Kb) produ-cidos por poliadenilación alternativa en vez de splicing alternativo [110]. Curiosamente, estapoliadenilación parece ser exclusiva de rumiantes ya que no se ha observado ni en el hombreni en ratón. A diferencia del transcrito de 2.1 Kb, el mRNA de 4.6 Kb contiene unas 2 Kb desecuencias LINE, SINE [172]. La proporción de ambos transcritos varía según el tejido en-contrándose los mayores niveles del mRNA de 4.6 Kb en tejidos del SNC y los mayores ni-veles del mRNA de 2.1 en el bazo. El transcrito de 4.6 Kb parece estar presente en todos lostejidos ovinos y no así el de 2.1 Kb, de manera que nunca se ha observado la presencia únicadel de 2.1 Kb. Sin embargo, existe una amplia distribución y una alta expresión del transcri-to de 2.1 Kb en ovino y en caprino, mientras que en los tejidos bovinos se expresa a nivelesmarginales. Se ha especulado que la presencia del transcrito de 2.1 Kb en tejidos periféricosse relaciona con una menor expresión de la proteína PrP debido a una menor estabilidad, gra-do de eficiencia de la traducción o a una regulación de la traducción en estos tejidos [110].Por lo tanto, parece que la proporción de ambos transcritos es específica de cada tejido.

La expresión del gen PrP es crucial para el desarrollo y la transmisión del scrapie. Ladetección del mRNA del gen PrP en el cerebro de la oveja a un tercio de la gestación juntocon la detección de transcritos en la placenta, tejidos fetales, supone un riesgo de infecciónen estadios tempranos [110]. El empleo de diferentes técnicas de análisis del mRNA ha per-mitido detectar y cuantificar con mayor o menor precisión la presencia de transcritos de PrPen diferentes tipos tisulares. Los mayores niveles de mRNA en roedores se presentan en elencéfalo y los niveles intermedios en tejidos periféricos como el corazón, pulmón y riñón.Los niveles más bajos se corresponden al bazo e hígado [55, 203, 236]. Asimismo en ovejalos mayores niveles se encuentran en tejidos del SNC llegando a presentar hasta 5 veces másque el riñón [110]. En vacuno, el empleo de la técnica de cuantificación absoluta por PCR atiempo real ha determinado los mayores niveles de expresión del gen PrP en las regiones del


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Tabla 1.2. Resumen de los elementos transponibles contenidos en el gen PrP humano, murino, bovi-no y ovino

Especie Pb analizadas SINE (%) LINE (%) LTR (%) DNA (%) TOTAL (%)

Humano 15241 4.6 40.7 0 0.9 46.2Murino 28471 5.6 4 46.6 0 56.2Bovino 20230 5 15.2 4.9 6.1 31.2Ovino 20630 4.2 13.6 6.4 5.9 30.1

SINE, elementos cortos dispersos; LINE, elementos largos dispersos; LTR, retrotrasposón; DNA, DNA trasposón.

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encéfalo junto con tejidos linfoides como el bazo, nódulo linfático y timo [274]. En el encé-falo del hámster, las regiones del cortex cerebral, hipocampo y núcleo estriado, se corres-ponden con los mayores niveles de expresión de la PrPc [252], en el cerebelo los mayores ni-veles se detectan en células de Purkinje [71] y neuronas del septum y tálamo [184]. Por otrolado, existen zonas del encéfalo donde hay poca o incluso nula inmunoreactividad a PrPc.Además, muchas neuronas pueden presentar mRNA del gen PrP y luego no presentarPrPc, lo cual indica que existe una regulación de la traducción dependiente del tipo celular.También existen diferencias en la velocidad de degradación del mRNA entre las distintas po-blaciones neuronales [184]. Sin embargo, cabe destacar que estas diferencias en la detecciónde mRNA y no de PrPc podrían también deberse a problemas en la sensibilidad de las técni-cas empleadas. También se ha detectado mRNA en otras localizaciones no neuronales comolas células de la glía, en células epiteliales, eritrocitos, linfocitos B y T [55, 194].

La síntesis de mRNA del gen PrP ocurre constitutivamente en estadios adultos, perodurante el desarrollo se encuentra bajo un control riguroso [59, 203]. En el septum, los nive-les de los mRNA del gen PrP y de acetilcolinesterasa durante el desarrollo, aumentan para-lelamente [192]. Los niveles más altos de PrPc se encuentran en cerebro, particularmente enel hipocampo, existiendo niveles significativos en corazón y músculo esquelético y, más ba-jos en la mayoría de los órganos restantes excepto en hígado y en páncreas.

1.7.3. Regulación de la expresión del gen PrP

Aunque no se conocen todos los factores que regulan la transcripción del gen PrP, al-gunos estudios han revelado como algunos factores son capaces de alterar la expresión de estegen. De este modo, el factor de crecimiento neuronal (NGF) provoca una sobreexpresión delgen PrP in vitro [166] e in vivo [192]. También se ha visto un aumento de los niveles demRNA del gen PrP por efecto de la hormona de crecimiento (GH) recombinante y por el fac-tor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-1) [166]. De igual manera se ha observa-do sobreexpresión de este gen en ausencia de proliferación celular y en respuesta ante unaproteína relacionada con el factor inhibidor de migración (MRP8), lo que sugiere un papelpotencial de la PrPc en la parada del crecimiento y diferenciación celular [161].

Existen evidencias para sugerir que los elementos que controlan la transcripción del genPrP residen en la región upstream del exón 1 y en los intrones. Cabe destacar un ensayo rea-lizado con un ratón transgénico sin el intrón 2 del gen PrP en el que se observó una expre-sión normal del gen PrP en el encéfalo, pero no en las células de Purkinje del cerebelo don-de fue indetectable [90], sugiriendo que el intrón 2 contiene secuencias requeridas para laexpresión específica de ese tipo celular. Análisis posteriores de los intrones 1 y 2 del gen PrPmurino, han descrito la presencia de dos elementos promotores inmediatamente antes de losexones 1 y 2 y un elemento supresor dentro del intrón 2 [16]. De forma similar, una deleciónde unas 700 pb en el intrón 1 bovino tiene un efecto atenuante de la actividad del promotor invitro [148]. Otros estudios han revelado la existencia de múltiples regiones de unión a facto-res de transcripción conservadas entre las especies. En el caso del ratón, mediante el análisis


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de la secuencia de los intrones murinos 1 y 2, se han descrito regiones potenciales de unión alos factores de transcripción AP1 y AP2 [16]. También se han encontrado regiones potencia-les de unión a otros factores de transcripción como Sp1, AP1 y AP2 en la región promotorade otras especies [13, 16, 288]. Recientemente, la comparación de las secuencias del gen PrPhumano, de ratón, ovino, bovino y del canguro, ha permitido describir hasta 51 regiones cor-tas conservadas con una función potencial reguladora, de las cuales 18 se encuentran en elpromotor y 33 en los intrones [218]. En este estudio se han observado a su vez posibles sitiosde unión a los factores MZF-1, MEF2, Oct-1, MyT1 y NFAT, altamente conservados entre lassecuencias analizadas. Finalmente, respecto a la secuencia del promotor del gen PrP, pre-senta alto contenido en GC (83%) y no presenta la TATA-box. Estas características junto conla demostración de la existencia de múltiples puntos de transcripción indicarían que el genPrP se ajusta a la categoría de gen constitutivo o housekeeping [288].

Diversos estudios encaminados a conocer los posibles cambios en la expresión del genPrP durante la infección, han revelado resultados contradictorios. Por un lado se ha observa-do expresión constitutiva del gen PrP [65, 170] y por el otro se ha descrito un aumento de losniveles de mRNA del gen PrP en ratones infectados con scrapie [176].

1.7.4. Susceptibilidad genética

La primera evidencia de la influencia genética en esta enfermedad fue descrita en 1964por Dickinson y cols. [74] al observar como la infección experimental en una línea de rato-nes (VM/Dk) daba lugar a periodos de incubación diferentes. Estas diferencias fueron obser-vadas mediante estudios de genética clásica y por cruzamientos y fueron atribuidas a un gendenominado Sinc que controlaba el periodo de incubación [75]. Posteriores infecciones ex-perimentales en ratón y análisis del DNA por RFLP, determinaron que el gen del ratón quecontrolaba el periodo de incubación (Prn-i) presentaba dos alelos, uno responsable de perio-dos cortos de incubación y otro alelo correspondiente a periodos largos. Más adelante este genfue asociado al gen que codifica la proteína PrPc [52, 145]. El mismo principio fue usado enla especie ovina, donde se observó que un gen denominado Sip y sus dos alelos sA y pA te-nían relación directa con el periodo de incubación [141]. Tanto el gen Sinc, como el Prn-i yel Sip correspondían al mismo gen, el PrP [142, 289].

La secuenciación y posterior comparación del gen PrP de ovejas sanas y enfermas re-veló la existencia de tres posiciones polimórficas o SNPs en los codones 136, 154 y 171 [107,108, 142]. Estas posiciones polimórficas dan lugar a cambios en los aminoácidos 136 (AÆV),154 (RÆH) y 171 (QÆR), y la presencia de cuatro haplotipos: VRQ, ARR, AHQ y ARQ.Además se encontró diferente distribución de genotipos entre animales sanos y enfermos. Elhaplotipo VRQ se encontró con mayor frecuencia entre los animales que desarrollaban la en-fermedad que en aquellos que no presentaban sintomatología. Más adelante se comprobó queésto se debía a que los animales homozigotos VRQ presentaban un menor tiempo de incuba-ción que los animales VRQ/ARR y VRQ/AHQ, de manera que la presencia de V en la posi-ción 136 parecía estar asociada a la susceptibilidad. Posteriormente, se encontró una asocia-


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ción entre el aminoácido Q en la posición 171 y la susceptibilidad a scrapie, mientras que elaminoácido R parecía conferir resistencia [61, 109, 290]. Aunque no estaba aún muy bien de-finido, la presencia de H en la posición 154 parecía estar asociada a resistencia.

En 1995, se encontró otro polimorfismo para el codón 171 que daba lugar al aminoáci-do H con el que se describieron hasta 5 haplotipos para el gen PrP ovino de los cuales el ARRcorrespondía a la mayor resistencia y el VRQ a la mayor sensibilidad frente a scrapie [21],(Tabla 1.3).


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Tabla 1.3. Secuencias de los alelos identificados para el gen PrP

Alelo Codón 136 Codón 154 Codón 171

ARR GCC CGT CGGAHQ GCC CAT CAGARH GCC CGT CATARQ GCC CGT CAGVRQ GTC CGT CAG

El continuo estudio de la secuencia del gen PrP en distintas razas ovinas reveló un ma-yor número de posiciones polimórficas: 101 (Q→R),112 (M→T), 136 (A→V, A→T), 137(M→T, S→A), 138 (M→T), 141 (L→F), 143 (H→R), 151 (R→C, R→G), 154 (R→H), 171(Q→R, Q→H, Q→K), 172 (Y→D), 175 (Q→E), 176 (N→K), 211 (R→Q) y 127 (G→S), [1,86, 277]. Sin embargo, para la mayoría de ellas no se ha encontrado ninguna asociación conla susceptibilidad al scrapie. Respecto a las posiciones 136, 154 y 171, el alelo ARQ es el ha-plotipo salvaje.

En 1997 Elsen y cols. [86] recomiendan una selección genética en función de los poli-morfismos del gen PrP para intentar erradicar el scrapie favoreciendo los genotipos resisten-tes. Sin embargo, no se puede asegurar que los animales resistentes a scrapie no puedan ac-tuar como portadores asintomáticos y representar por tanto un riesgo de infección. Tampocose puede asegurar que la sensibilidad de los polimorfismos sea extensible a todas las razas. Apesar de estos posibles inconvenientes y basándose en los polimorfismos asociados al perio-do de incubación del scrapie (codones 136, 154 y 171), en 1998 se sugiere de forma más de-tallada la selección genética de los animales en base a su genotipo [68]. Este trabajo agrupalos genotipos del gen PrP en cinco grupos de riesgo con diferente grado de susceptibilidad(Tabla 1.4).

A partir de este momento se comenzó el genotipado masivo de las distintas razas ovinascon el fin de establecer el riesgo potencial de padecer la enfermedad, revelando diferencias enla distribución de los genotipos según la raza. El primer trabajo que describe la distribución degenotipos en una raza española fue realizado en el año 2002 por Hurtado y cols. [147], en laraza Latxa. En la actualidad, el genotipado de la cabaña ovina está muy extendido como mé-todo para establecer el riesgo a sufrir scrapie, y el genotipo se ha incorporado en distinto gra-do a la mayoría de los programas de selección y mejora genética. Esta selección genética se

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basa en aumentar la proporción de los animales resistentes ARR/ARR en detrimento de los ani-males susceptibles y en los casos más extremos, en obtener un rebaño formado exclusivamen-te por animales ARR/ARR. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la selección a favor delos animales ARR/ARR podría limitar la variabilidad genética sobre todo en aquellas razas enlas que la proporción de animales ARR/ARR sea limitada. Con esta selección se podrían per-der caracteres de alto valor comercial debido a una asociación causal o de ligamiento entre elgen PrP y algún gen o genes responsables del carácter de interés. Sin embargo, diversos tra-bajos han puesto de manifiesto la falta de asociación entre el genotipo de los animales y los ca-racteres productivos como la producción de leche y de carne [69, 174, 237].


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Tabla 1.4. Agrupación de genotipos según Dawson y cols. en 1998 [68]

Descripción Grupo de riesgo Genotipos

Muy bajo riesgo a scrapie en el individuo y en la progenie R1 ARR/ARR

Bajo riesgo a scrapie en el individuo y en la progenie R2 ARR/AHQAHQ/AHQ

Bajo riesgo a scrapie en el individuo; el riesgo de la progenie depende R3 ARR/ARQdel otro progenitor ARR/ARH

ARQ/AHQAHQ/ARH

Riesgo ocasional a scrapie individual y en la progenie R4 ARH/ARHARQ/ARHARQ/ARQARR/VRQAHQ/VRQ

Alto riesgo individual y en la progenie R5 ARH/VRQARQ/VRQVRQ/VRQ

Los grupos de riesgo y los genotipos aparecen ordenados de mayor a menor resistencia frente a scrapie, del R1 al R5 y delgenotipo ARR/ARR al VRQ/VRQ.

Aunque en menor medida que en los genotipos susceptibles, recientemente se han des-crito casos de scrapie en animales con genotipos clasificados como de muy bajo (ARR/ARR)o bajo riesgo (ARR/ARQ y AHQ/AHQ) [23, 47, 206], como consecuencia de lo cual se hapuesto en entredicho el uso del genotipado como la mejor forma de erradicar el scrapie [18].Algunos de estos casos están asociados con una nueva cepa de scrapie (Nor98) implicada enlo que se conoce como scrapie atípico [23]. Como se ha mencionado en el apartado 1.3, elperfil lesional de estos animales difiere del scrapie típico en que los mayores depósitos dePrPSc y las lesiones celulares aparecen en la capa molecular del cerebelo y no en el obex comoocurre con el scrapie clásico. Cabe destacar como el alelo H en la posición 154 parece tenercierta asociación con esta nueva forma clínica [197].

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En la actualidad y según el Plan Nacional sobre Scrapie del Reino Unido (UK-NSP),existe una nueva clasificación más ajustada a la realidad en base a los continuos estudios re-alizados acerca de la susceptibilidad genética frente a scrapie [72], (Tabla 1.5).


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Tabla 1.5. Agrupación de genotipos según el UK National Scrapie Plan, 2003 [72]

Descripción Tipo Genotipos

Animales genéticamente muy resistentes a scrapie 1 ARR/ARR

Animales genéticamente resistentes a scrapie sujetos a selección para 2 ARR/AHQsu empleo como reproductores ARR/ARH

ARR/ARQ

Animales con poca resistencia genética a scrapie sujetos a selección 3 AHQ/AHQgenética cuando sean empleados como reproductores AHQ/ARH

AHQ/ARQARH/ARHARH/ARQARQ/ARQ

Animales genéticamente susceptibles a scrapie que no deben ser usados 4 ARR/VRQcomo reproductores excepto en situaciones especiales

Animales con alto riesgo a scrapie que no deben ser empleados para 5 AHQ/VRQreproducción ARH/VRQ

ARQ/VRQVRQ/VRQ

Los grupos de riesgo y los genotipos aparecen ordenados de mayor a menor resistencia frente a scrapie, del Tipo 1 al Tipo 5y del genotipo ARR/ARR al VRQ/VRQ.

1.8. LA PROTEÍNA PrP

1.8.1. Estructura y topología de la PrPc

La longitud de la estructura primaria de la PrPc puede variar levemente según la espe-cie entorno a los 250 aminoácidos (aa); en el caso de la oveja presenta 256 aa. En la cadenaaminoacídica se pueden distinguir una secuencia señal hidrofóbica N-terminal de 22 residuos(PS), una serie de repeticiones de un octapéptido PHGGGWGQ [13], cuatro segmentos alta-mente conservados, dos señales de localización nuclear (NLS I y II) [118] y una región hi-drofóbica C-terminal [222, 254]. Esta cadena sufre un complejo proceso de maduración co-valente que supone la escisión proteolítica del péptido señal PS, la adición C-terminal de unglicosilfosfatidilinositol (GPI), la formación de un enlace disulfuro intramolecular entre dosresiduos de cisteína y, por último, una doble glicosilación en dos residuos de asparagina[221], (Figura 1.9).

Las diferencias existentes en la secuencia de la PrPc de diferentes organismos se re-flejan en diferencias de interacción entre la PrPc y la PrPSc. Esta interacción es óptima cuan-

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Figura 1.9. Esquema de la secuencia de PrPc. (PS, péptido señal hidrofóbico; NLS-I, señal de loca-lización nuclear I; RO, repeticiones de octapéptidos; NLS-II, señal de localización nuclear II; STE,secuencia efectora de la parada de la transferencia; TM, dominio transmembrana; S-S, puente disul-furo; G, glicosilación; GPI, glicosilfosfatidilinositol)

Figura 1.10. Alineamiento de la estructura primaria de la secuencia aminoacídica de PrPc de distin-tos organismos: Humano, gorila, rata, ratón, hámster, vaca, cabra y oveja. (Se puede apreciar alto gra-do de homología entre las secuencias alineadas)

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do las secuencias de las dos isoformas son idénticas como ocurre en la transmisión homó-loga dentro de una misma especie [228]. La transmisión heteróloga entre distintas especiesrequiere un salto de la barrera de especie cuando las secuencias de las dos isoformas sondiferentes [258]. El alto grado de similitud entre los ungulados parece indicar que podríaexistir una facilidad de transmisión del prión ovino al ganado vacuno y viceversa [293],(Figura 1.10).

La presencia del gen PrP en multitud de organismos, desde el hombre hasta el pez pa-sando por el ratón y el pollo, indica que el gen PrP existe antes de la aparición de los mamí-feros. Existe una alta homología (90%) en el ORF del gen PrP que se traduce en una alta ho-mología en la secuencia aminoacídica, que en el caso de los primates es mayor del 95% [254].Esta homología en los primates va disminuyendo a medida que se compara con organismosseparados filogenéticamente como los marsupiales (70%) [298] o incluso menor respecto ala PrPc del pollo (30%) [94].

La estructura secundaria de la PrPc solubilizada en detergentes y en ausencia de catio-nes es mayoritariamente helicoidal (40% a-hélice), mientras que la formación de la isofor-ma patológica conlleva un aumento del contenido en estructuras extendidas (45% lámina-by 30% a-hélice) [209], (Figura 1.11). Estudios espectroscópicos de alta resolución con for-mas recombinantes en ausencia de ligando (Cu) han puesto de manifiesto que la PrPc estáconstituida por dos dominios, el N-terminal altamente desestructurado y el C-terminal glo-bular [80, 234].


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Figura 1.11. Modelo estructural de la proteína prión celular (PrPc) y proteína prión patológica (PrPSc).(En color verde se indican las estructuras α-hélice y en azul las lámina-β)

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Con relación a la localización celular de la PrPc, diversos estudios de translocación invitro han identificado la existencia de tres formas topológicas: una forma de secreción (coin-cidente con la anclada por GPI) y dos formas transmembranas que difieren en su orientación,la N-terminal luminal y la C-terminal luminal [122], distribuidas en la membrana plasmáti-ca, en endosomas y en el aparato de Golgi [91, 164]. La forma libre secretada es transporta-da en vesículas de secreción a la superficie exterior celular donde queda anclada a la mem-brana citoplasmática por unión GPI en dominios particulares [266, 270]. Una vez allí, algunasmoléculas de PrPc son liberadas al espacio extracelular por escisión del GPI mientras que lamayoría quedan internalizadas en el compartimento endocítico [260]. Estas últimas puedenser recicladas hacia la superficie celular o bien pueden sufrir una ruptura proteolítica en la mi-tad del N-terminal y sus productos son expulsados al exterior celular [260]. El metabolismode las formas transmembrana no se conoce con exactitud, pero la acumulación por encima deun umbral de las formas con el C-terminal luminal se correlaciona con la aparición de neuro-patologías [122]. También se ha descrito la presencia de PrPc en el citosol de subpoblacionesneuronales del SNC [191].

Las propiedades bioquímicas de la PrPc así como su cantidad pueden variar entre los te-jidos de un mismo individuo. Un estudio realizado en ovino ha descrito como la mayor can-tidad de PrPc se localiza en el encéfalo, seguido del pulmón, músculo esquelético, corazón,útero, timo y lengua, tejidos que presentan entre 20 y 50 veces menos cantidad que el SNC[195]. El tejido con menor contenido de PrPc fue el hígado con un rango de 546-16.000 vecesmenos que el SNC y el tejido linfoide presentó una concentración de PrPc con 3 ordenes demagnitud menos que el SNC [195]. Asimismo, este estudio apoya la idea de que los tejidoscuya infecciosidad es alta (amígdala, timo, intestino y bazo) no presentan más PrPc que los te-jidos considerados con escasa infecciosidad (músculo esquelético y corazón) [66, 120]. Cabedestacar que la distribución de las tres formas de la PrPc (bi-, mono- y a-glicosilada) es espe-cífica de tejido, e incluso para una misma forma puede existir diferente movilidad electrofo-rética dependiendo del tejido [195].

1.8.2. Funciones biológicas de la PrPc

La PrPc está altamente conservada entre las especies, una conservación evolutiva quesugiere un papel fundamental en el metabolismo celular. Esta idea estaría también apoyadapor las características housekeeping del gen PrP, su amplia distribución en tejidos y tipos ce-lulares así como su regulación durante el desarrollo. La PrPc se localiza fundamentalmente entejidos del sistema nervioso. Su presencia en las zonas de sinapsis hizo pensar en una funciónreguladora de la transmisión sináptica [125]. Sin embargo, estudios posteriores demostraroncomo la PrPc presentaba otras localizaciones celulares sin tener preferencia por las sinapsis[164, 191]. En la actualidad existen numerosos trabajos que describen variadas funcionespara la PrPc que pueden resumirse en adhesión celular, señalización celular, funciones meta-bólicas y neuroprotección.


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1.8.2.1. Función antioxidante

El papel antioxidante de la PrPc se surgirió cuando al tratar cultivos de células del ce-rebelo y de la corteza de ratones PrP-/- con xantina oxidasa éstas presentaron mayor sus-ceptibilidad que las células PrP+/+ [37, 38]. La adición posterior del antioxidante VitaminaE aumentó la supervivencia de las células PrP-/- indicando que las células que expresan PrPc

son más resistentes al daño celular provocado por estrés oxidativo. La función primaria dela superóxido dismuta (SOD) es convertir al radical libre superóxido, O

2,en peróxido de hi-

drógeno, un radical libre menos dañino que puede degradarse por mediación de la peroxi-dasa. La actividad citosólica superóxido dismutasa dependiente de Cu y zinc (Zn) (Cu/Zn-SOD) y la actividad mitocondrial superóxido dismutasa dependiente de manganeso(MnSOD) fue mayor en los cultivos de células PrP+/+ tratadas con xantina oxidasa. Por elcontrario las células PrP-/- solo mostraron aumento de la MnSOD, sugiriendo que la PrPc

puede tener actividad Cu/ZnSOD. De este modo la falta de PrPc, y con ello la falta de acti-vidad Cu/ZnSOD ante estrés oxidativo, inducen el aumento de actividad MnSOD con el finde compensar esa carencia. De hecho diversos estudios [158, 300] han revelado como lafalta de PrPc desencadena una serie de alteraciones relacionadas con el estrés oxidativocomo la oxidación de lípidos y proteínas en todas las estructuras celulares estudiadas.Brown y Besinger [37] postularon y demostraron que si la PrPc podía actuar como trans-portador de Cu al citosol, entonces la disminución de la actividad de Cu/ZnSOD sería unefecto directo de la falta de PrPc. Por lo tanto la actividad de esta enzima estaba directa-mente relacionada con los niveles de PrPc. Trabajos posteriores han aportado resultados si-milares de los que cabe destacar como la actividad reguladora de la Cu/ZnSOD se encuen-tra localizada en una repetición de un octapéptido (residuos 51-90 de la PrPc murina) y enuna región hidrofóbica (residuos 112-145 de la PrPc murina) [251]. También se ha obser-vado actividad SOD propia de la PrPc, sin embargo se trata de una actividad un 10% menorque la Cu/ZnSOD [39].

La capacidad de la PrPc de regular el contenido del Cu citosólico tiene un doble efectoantioxidante. Por un lado puede actuar sobre la actividad de la Cu/ZnSOD como se acaba deexplicar, y por otro lado puede actuar además a nivel de la eliminación de especies reactivasde oxígeno (ROS). Este segundo mecanismo antioxidante se basa en la oxidación catalíticadel Cu (Figura 1.12).


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Figura 1.12. Generación de ROS por el cobre. (El Cu+ puede oxidarse para producir dos formas re-activas del oxígeno, el radical superóxido y el peróxido de hidrógeno)

Cu+ + O2

⇔ Cu++ + O2

–

2O2

– + 2H+ ⇔ O2+ H

2O

2

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1.8.2.2. Homeostasis mineral del cobre y del calcio intracelular

La relación de la PrPc con el cobre y su posible implicación en la regulación del calcio(Ca) intracelular, indican una implicación reguladora de la homeostasis de estos dos mine-rales. Un estudio realizado con sinaptosomas de rata reveló un aumento del Ca intracelularen presencia de PrPc recombinante [291]. Dicho efecto fue anulado por el bloqueo de los ca-nales voltaje-dependientes de Ca sugiriendo la existencia de interacción entre la PrPc con es-tos canales para regular activamente la entrada de calcio libre a la célula. Sin embargo, pa-rece poco probable que la PrPc interactúe con el Ca del mismo modo que lo puede hacer conel cobre.

1.8.2.3. Implicación en el ritmo circadiano y en el sueño

El análisis de los cambios fenotípicos de dos líneas de ratones deficientes de PrPc (líneaIFMB y NPU), ha puesto de manifiesto cambios en el ritmo circadiano y en el sueño de estosanimales. Por un lado, el ritmo circadiano de los animales PrP-/- fue menor que en los ratonesPrP+/+ y por otro lado, el sueño de los PrP-/- se alteró en el sentido de un aumento en el núme-ro de veces que se despertaban, en la disminución de los movimientos oculares durante el sue-ño y en la menor movilidad durante el sueño [276]. Estas alteraciones desaparecían cuandose restablece la PrPc por transgénesis. Por lo tanto, aunque el proceso que regula ambas fun-ciones es muy complejo y es poco probable que esté controlado por un único gen, la obser-vación del mismo fenotipo en dos líneas de ratones diferentes sugiere que la PrPc está impli-cada en el ritmo circadiano y en el mantenimiento e intensidad del sueño. Cabe destacar queestas alteraciones fenotípicas también se han descrito en el insomnio familiar fatal (IFF). Ladiana de actuación de la PrPc para controlar ambas funciones se localizaría en el núcleo su-praquiasmático del hipotálamo.

1.8.2.4. Señalización celular

Dado que la localización de la PrPc en la membrana citoplasmática se realiza a través dela unión GPI, se ha propuesto como en otras proteínas con unión de membrana GPI, una fun-ción transductora de señales celulares [149]. En este sentido se ha observado interacción con latirosín-quinasa Fyn y con el receptor de laminina, ambos implicados en el crecimiento dendrí-tico [57, 112, 196]. También se ha observado interacción entre la PrPc y la sinapsina Ib, una pro-teína cuya implicación en la formación de sinapsis y en la regulación de la liberación de los neu-rotrasmisores promueve la supervivencia [264]. Asimismo, se ha observado interacción con laproteína Grb2, una proteína que media receptores de factores de crecimiento y que también estáimplicada en la supervivencia neuronal [264]. Con estos resultados parece posible que la im-plicación de la PrPc en la señalización celular esté enfocada a la supervivencia neuronal a travésdel mantenimiento de la transmisión sináptica. Sin embargo, hay cierta controversia respecto ala alteración de la sinapsis en ratones knock-out para el gen PrP [63, 177, 183, 292].


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Aparte de la neuroprotección a través del mantenimiento de la sinapsis neuronal seha descrito activación de señales transductoras de protección en neuronas granulares delcerebelo de ratón crecidas sobre placas de cultivo con PrPc. Esta activación incluye prote-ínas como la PKA, tirosín-quinasas relacionadas con Src, fosfatidilinositol kinasa 3/Akt yquinasas MAPK/ERK [57]. También se ha observado interacción con el factor pro-apop-tótico Proteína X asociada a Bcl-2 (Bax) y con el anti-apoptótico B-cell CLL/lymphoma2 (Bcl-2) [244].

1.8.2.5. Otras funciones protectoras

En los apartados anteriores se han descrito varios mecanismos protectores de la PrPc,el efecto antioxidante y la neuroprotección mediada por la transducción de señales desdela membrana celular. Además de estos mecanismos defensivos, existen numerosos estu-dios que han descrito otras vías mediante las cuales la PrPc puede mantener la integridadneuronal.

La proteína Doppel se expresa específicamente en las células de Purkinje donde su so-breexpresión en ratones knock-out del gen PrP causa muerte celular y ataxia [6, 98, 193]. Enel año 2004, Anderson y cols. [6] demostraron mediante transgénesis como el daño neuronalprovocado por la sobreexpresión de Doppel puede ser atenuado por la co-expresión de la PrPc,indicando de este modo una función neuroprotectora frente a Doppel.

La estructura de la PrPc presenta ciertas similitudes con la familia de proteínas Bcl-2.La región correspondiente con las repeticiones de octapéptidos en la región N-terminal dela PrPc resulta muy similar al dominio BH2 de la familia de proteínas Bcl-2 por lo que seha sugerido que la PrPc podría actuar como una proteína de la familia Bcl-2 [171]. El do-minio BH2 del Bcl-2 es fundamental en la función protectora frente a la muerte por apop-tosis mediada por Bax y también en su interacción con Bax, una proteína inductora de laapoptosis [304]. En la PrPc, al igual que el dominio BH2, la región de octapéptidos es rele-vante en la función anti-apoptótica. La deleción de cuatro repeticiones de octapéptidos, lamutación D178N asociada al IFF y la mutación T183A ligada a la encefalopatía espongi-forme familiar atípica eliminan parcial o completamente las propiedades protectoras fren-te a Bax [34, 201]. En un grupo de estudios relacionados con la privación de suero en cul-tivos neuronales, se observó como neuronas PrP-/- aumentaban su sensibilidad a la apoptosiscon respecto a las neuronas PrP+/+, y como la transfección de Bcl-2 y PrPc hacía recobrar lasupervivencia de las células PrP-/- [153, 163]. La falta de PrPc y suero, inducían un aumen-to de proteínas pro-apoptóticas (p53, Bax y caspase-3) así como un aumento del citocromoC citosólico y una disminución del potencial de membrana de la mitocondria [153]. Estosresultados apoyaron por tanto la función protectora de la PrPc frente a la apoptosis y en con-creto la apoptosis iniciada en la mitocondria. La maduración de la PrPc a través del apara-to de Golgi es fundamental para su función anti-apoptótica, sin embargo la unión GPI noes necesaria manteniéndose la propiedad anti-Bax de la PrPc citosólica [243]. Estos resul-tados son consistentes con los hallazgos obtenidos en 1999 por Kuwahara y cols. [163]. Sin


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embargo, esta protección frente a Bax no puede extenderse a todas las líneas celulares yaque resulta ineficaz en las líneas celulares SK-N-SH, BE(2)-M17, N2a y la línea celular293 de riñón [242].

La función anti-apoptótica de la PrPc también se ha descrito en células no nerviosas. Untrabajo realizado con dos líneas celulares de cáncer de pecho MCF-7, unas sensibles y otrasresistentes al factor de necrosis tumoral a (TNFa), reveló como las células resistentes pre-sentaron un incremento de la PrPc endógena 10 veces superior a la línea celular sensible aTNFa [73]. Posteriormente, la introducción de PrPc en las células sensibles a TNFa a travésde un vector viral las transformó en células resistentes. Por lo tanto, de este trabajo se con-cluyó que la PrPc protege frente a la muerte por TNFa al menos en su acción sobre el meca-nismo que induce la liberación de citocromo C de la mitocondria y sobre la condensación nu-clear [73].

Todos los trabajos realizados in vitro e in vivo sugieren que este efecto anti-apoptóti-co de la PrPc tiene lugar a nivel de la muerte celular mediada por Bax iniciada en la mito-condria, previniendo la permeabilidad de su membrana. La diana molecular de la PrPc no seconoce pero se sabe que puede interaccionar con Bax directamente a través de su forma ci-tosólica o a través de señales enviadas al citosol por mediación de la PrPc anclada a la su-perficie celular [244]. En las enfermedades por priones, Roucou y cols. [244] han sugeridoque estas funciones de la PrPc desaparecerían por la conversión a PrPSc, de modo que la pro-tección frente al daño producido por Bax quedaría relegada únicamente al efecto anti-apop-tótico de Bcl-2.

Hasta ahora se han descrito las propiedades protectoras de la PrPc, sin embargo existenevidencias que muestran como en determinadas circunstancias la PrPc puede resultar tóxica.En este sentido, se ha descrito como la sobreexpresión de PrPc tiene un efecto tóxico en la lí-nea celular embrionaria 293 de riñón, en células epiteliales de conejo Rov9 y en células cor-ticales TSM1 de ratón. La toxicidad se presenta como una susceptibilidad a apoptosis indu-cida por estaurosporina [207, 208]. Estos trabajos contrastan con la demostrada protecciónanti-apoptótica de la PrPc en células cultivadas sin suero, sin embargo, este efecto contradic-torio podría tener explicación. En primer lugar la sobreexpresión de la PrPc podría interferiren la síntesis de otras proteínas debido a la saturación de la maquinaria de síntesis proteica[244]. En segundo lugar, la sobreexpresión de PrPc podría dar lugar a la formación de formasde PrPc tóxicas [180]. En tercer lugar, el efecto de la PrPc podría ser diferente según el tipocelular. Por último, puesto que la PrPc posee un sitio para la acción de la caspasa-3, al igualque Bcl-2, la PrPc podría dar lugar a formas tóxicas mediante lísis proteica mediada por la cas-pasa-3 [60].


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1.9. OBJETIVOS

La finalidad del presente trabajo se puede dividir en dos partes fundamentales. Por unlado la correspondiente a la investigación aplicada al desarrollo de métodos de tipado gené-tico de scrapie y su posterior aplicación a la raza Latxa. Por otro lado, tres objetivos de in-vestigación básica encaminados a aumentar el conocimiento de las bases moleculares delscrapie y con ello, contribuir al conocimiento general de las encefalopatías espongiformestransmisibles. A continuación se describen de forma más concreta los objetivos específicosde esta Tesis Doctoral.

Objetivo 1

Estudiar la susceptibilidad genética frente a scrapie en las razas ovinas de la Comuni-dad Autónoma del País Vasco (CAPV). Para ello se desarrollarán métodos moleculares quepermitan la determinación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 de gen PrP yse aplicarán a una muestra representativa de la cabaña ovina de la CAPV.

Objetivo 2

Obtener un método de RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa que permita me-dir la expresión génica de forma reproducible, fiable y ajustada a la realidad. Se evaluará laestabilidad de la expresión de genes endógenos en seis tejidos ovinos de animales sanos y deanimales con scrapie clínico con el fin de encontrar los mejores genes de referencia en cadasituación.

Objetivo 3

Evaluar una posible explicación a la susceptibilidad genética frente a scrapie. La hipó-tesis de partida se basa en que la susceptibilidad genética tiene una relación directa con la ex-presión del gen PrP, de tal forma que los animales susceptibles presentarían mayor expresióndel gen PrP y con ello mayor predisposición al scrapie por presentar más proteína PrPc pre-cursora de PrPSc. Para evaluar esta hipótesis se cuantificarán los niveles de mRNA del gen PrPen seis tejidos de animales sanos con distinta susceptibilidad genética a scrapie por medio RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa utilizando como referencia los genes endógenosseleccionadas en el objetivo anterior.

Objetivo 4

Analizar la patogenia del scrapie a nivel molecular. Se estudiarán las posibles altera-ciones en los niveles de expresión de nueve genes implicados en diversos aspectos de la pa-togenia del scrapie en tres regiones del SNC de animales sanos y animales enfermos. Se ana-lizarán genes asociados a la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis y laapoptosis, así como el gen PrP mediante RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa.


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Capítulo 2

MATERIALES Y MÉTODOS

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2.1. OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2.1.1. Obtención de DNA

Dado que todas las células de un ser vivo comparten la misma secuencia de DNA, cual-quier parte de un organismo puede ser útil para la obtención de su DNA. La sangre es una de lasmuestras más usada dada su fácil obtención y procesado. En este trabajo se han utilizado mues-tras de sangre principalmente, además de tejidos frescos y tejidos incluidos en parafina. A lahora de trabajar con DNA hemos de extremar las precauciones para evitar contaminaciones quepuedan interferir en su posterior análisis. Para ello trabajaremos con guantes, material estéril yautoclavado si es posible, libre de DNasas (enzimas que degradan el DNA) y puntas con filtro.

2.1.1.1. Extracción de DNA a partir de muestras de sangre

La sangre ha de recogerse directamente del animal en tubos estériles con anticoagulan-te. En caso de no ser procesada inmediatamente puede conservarse a 4°C varios días, a -20°Cpor unos meses o incluso a -80°C por años manteniendo de esta forma el DNA en las condi-ciones óptimas necesarias para su posterior análisis. La extracción del DNA se ha realizadoempleando el kit Nucleospin®96 Blood (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Se trata de unkit adaptado a su automatización con el robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, CA, USA)que permite la extracción de 96 muestras en 2 horas (Tabla 2.1). Las fases principales de di-cho protocolo consisten en una lísis celular y proteica con un tampón de lísis y proteinasa K,la unión por adsorción del DNA a una matriz sólida en una placa de 96 columnas, lavados su-cesivos del DNA unido a la matriz y posterior liberación del DNA.

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Tabla 2.1. Extracción de DNA de sangre

1. Añadir 25 µl de solución de proteinasa K (20mg/ml) a 200 µl de sangre2. Añadir 200 µl de tampón de lísis BQ1 e incubar 10 min a temperatura ambiente (Ta)3. Añadir 200 µl etanol (70%)4. Añadir 300 µl de tampón de dilución B55. Aplicar la mezcla anterior a las columnas6. Aplicar vacío7. Lavar las columnas con 600 µl de tampón de lavado BW y aplicar vacío8. Lavar las columnas con 900 µl de tampón de lavado B5 y aplicar vacío9. Lavar las columnas con 900 µl de tampón de lavado B5 y aplicar vacío

10. Añadir 50 µl de tampón de elución BE e incubar 5 min a Ta11. Aplicar vacío para obtener el DNA12. Guardar a -20°C

2.1.1.2. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido

En determinadas circunstancias la disponibilidad de sangre para la extracción del DNAes un problema, como alternativa se puede extraer DNA a partir de muestras de tejido. La ex-

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tracción del DNA de tejidos puede hacerse mediante protocolos caseros o mediante kits deextracción de tejidos. Para la extracción de DNA de tejido fresco se ha empleado el DNeasytissue kit (Qiagen, Hilden, Alemania) (Tabla 2.2).


62

Tabla 2.2. Extracción de DNA de muestras de tejido fresco

1. Obtener 25 mg de tejido y cortarlo en pequeños trozos2. Añadir 180 µl de tampón de lísis ATL y 20 ml de proteinasa K (0.35 mg). Incubar 1 h a 55°C agitando

cada 15 min3. Añadir 200 µl de tampón de dilución AL e incubar 10 min a 70°C4. Añadir 200 µl de etanol (100%) y mezclar con vortex5. Añadir la mezcla anterior sobre una columna y centrifugar 1 min a 6000 g6. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW1 y centrifugar 1 min a 6000 g7. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW2 y centrifugar 3 min a 13000 g8. Añadir 50 µl de tampón de elución AE y centrifugar 1 min a 6000 g para recuperar el DNA en dilución9. Guardar a -20°C

2.1.1.3. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido en parafina

En el caso de muestras de tejido en parafina la extracción se realiza de forma manualusando un protocolo convencional basado en fenol-cloroformo (Tabla 2.3).

Tabla 2.3. Extracción de DNA de muestras de tejido en parafina

1. Obtener 30 µm de cortes de parafina (3 x 10 mm) como material de partida 2. Añadir 400 µl de TE (10mM Tris-HCl 1, mM EDTA pH 8.0) para rehidratar el tejido3. Añadir 45 µl SDS (10%) más 12 µl de proteinasa K (20mg/ml) y agitar con vortex 4. Incubar durante 1 h a 56°C 5. Incubar durante 10 min a 96°C 6. Añadir 400 µl fenol:cloroformo:alcohol-isoamílico 25:24:1 y emulsionar con vortex7. Centrifugar a 9000 g 10 min y recoger la fase acuosa8. Añadir 400 µl de cloroformo:alcohol-isoamílico 24:1 a la fase acuosa y centrifugar a 9000 g durante 10

min9. Añadir 45 µl de acetato sódico 3M y 1 ml etanol (100%) a la fase acuosa, voltear y mantener a -20°C toda

la noche o un mínimo de 1.5 h10. Centrifugar 15 min a 9000 g y eliminar el sobrenadante11. Lavar el pellet con 1 ml de etanol (70%)12. Centrifugar 15 min a 9000 g y eliminar el sobrenadante13. Secar entre 30 min y 1 h14. Resuspender en 50 µl de TE (10 mM Trs-HCl, 1 mM EDTA, ph 8.0) o H

2O

15. Guardar a -20°C

2.1.1.4. Purificación de plásmidos

Se ha empleado el FastPlasmid Mini kit (Epperdorf, Amburgo, Alemania) basado en unsistema de columnas formadas por una matriz sólida con afinidad por los plásmidos y poste-rior lavado y elución de los mismos (Tabla 2.4).

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2.1.2. Obtención de RNA

La molécula de RNA es muy estable, sin embargo, la presencia de RNasas (enzimas quedegradan el RNA) hacen que su integridad se vea seriamente dañada hasta el punto de inuti-lizarla para su análisis. Por lo tanto, el problema viene dado por la presencia de RNasas. Es-tas enzimas pueden estar presentes en todo el material en contacto con las muestras de RNA,pero la principal contaminación con estas enzimas proviene de la propia muestra a procesar.En este sentido y además de las precauciones que se toman cuando se trabaja con DNA, lamanipulación del RNA requiere unas condiciones adicionales para evitar la presencia deRNasas. Para eliminar la posible contaminación en pipetas, botellas y en la mesa de trabajobastará con limpiar las superficies con SDS 1%. Deben usarse guantes a lo largo de todo elproceso y reducir al máximo el tiempo de manipulación, con el fin de evitar la degradacióndel RNA durante el proceso. La contaminación del agua, puntas y viales se soluciona con elempleo de reactivos “libres de RNasa” certificado por la casa comercial. Con el fin de obte-ner los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Comoalternativa, las muestras pueden ser congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80°C.Una vez que las muestras han sido homogeneizadas en el tampón de lísis, pueden ser alma-cenadas a -80°C sin necesidad de congelación en nitrógeno líquido. Alternativamente, y paraguardar tejido de una forma eficaz previo a su extracción, se recomienda usar RNA later(Ambion, TX, USA), producto que permite el almacenamiento de muestras a 4°C por una se-mana o un mes a -20°C.

La extracción del RNA puede realizarse mediante procedimientos clásicos o mediantekits comerciales. En nuestro caso se ha empleado el RNasy Protect Mini kit (Qiagen, Hilden,Germany). Este kit se basa en una lísis tisular seguida de la unión por adsorción del RNA to-tal a una matriz sólida y posterior lavado y elución del RNA (Tabla 2.5). Es importante utili-zar RNA purificado recientemente o en su defecto RNA guardado a -80°C.

Las trazas de DNA genómico extraído junto con el RNA pueden dar lugar a falsos po-sitivos en RT-PCR por la amplificación del propio DNA genómico o incluso de pseudogenes.Por ello, el análisis del RNA requiere en muchos casos partir de un RNA libre de DNA ge-nómico, lo cual se consigue con el uso de DNasas (Tabla 2.6). En este estudio se ha emplea-do la nucleasa DNase I (Ambion, TX, USA).

2. MATERIALES Y MÉTODOS

63

Tabla 2.4. Purificación de plásmidos

1. Obtener un cultivo bacteriano de 1.5 ml y centrifugar 1 min a 12000 g 2. Añadir 400 µl del tampón de lísis al decantado de bacterias y mezclar con vortex durante 30 seg3. Incubar durante 3 min a Ta4. Transferir la mezcla a una columna y centrifugar 1 min a 13000 g5. Añadir a la columna 400 ml de tampón de lavado y centrifugar 1 min a 13000 g6. Añadir a la columna 50 ml de tampón de elución sobre la columna7. Guardar a –20°C

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2.2. CONCENTRACIÓN, PUREZA E INTEGRIDAD DE ÁCIDOS NUCLEICOS

En determinados casos el análisis de los ácidos nucleicos requiere conocer la cantidady calidad de los mismos. Dada las características fisicoquímicas de la molécula de DNA yRNA, éstas pueden absorber luz cuando se encuentran en disolución. Esta propiedad permi-te aplicar la ecuación de la Ley de Lambert-Beer que en el caso de ácidos nucleicos queda ex-presada según la Ecuación 1. La concentración de ácidos nucleicos (ng/ml) se calcula multi-plicando la absorbancia a 260nm (A

260) por el coeficiente de extinción molar C, que en el caso

del DNA en solución acuosa es 50 y de 40 para el RNA [253].

La calidad o pureza se puede estimar mediante el ratio de absorbancia 260/280nm. Lasproteínas por su composición pueden absorber a 280nm, propiedad que viene dada principal-mente por los aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina). Se considera unapureza alta cuando el ratio es de 1.8 para DNA y de 2.0 para RNA. Ratios menores indicanpresencia de proteínas, fenol u otros contaminantes.

Ecuación 1[Ac. Nucleicos] = A260

x C


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Tabla 2.5. Extracción de RNA total de tejido

1. Pesar 30 mg de tejido y añadir 600 µl del tampón de lísis RLT2. Homogeneizar el tejido mecánicamente con el equipo Rybolyser (Hybaid, Ashford, UK): 3 pulsos de 20

seg a intensidad 4.5. Reposar 2 min a Ta entre pulso y pulso. 3. Reposar 2 min a Ta para que se desnaturalicen todos los complejos proteicos4. Centrifugar 3 min a 9000 g5. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En tejidos con alto contenido en grasas (SNC) evitar la capa

superficial de lípidos. 6. Añadir 1 volumen de etanol (70%) y mezclar con la pipeta7. Añadir el sobrenadante sobre la columna y centrifugar 1 min a 9000 g8. Añadir 700 µl de tampón de lavado RW1 y centrifugar 1 min a 9000 g9. Añadir 500 µl de tampón de lavado RPE y centrifugar 1 min a 9000 g10. Añadir 500 µl de tampón de lavado RPE y centrifugar 1 min a 9000 g11. Eliminar restos de RPE con una centrifugación de 1 min a 9000 g12. Añadir 35 µl de H

2O dejando incubar de 5-10 min a Ta.

13. Centrifugar 1 min a 9000 g14. Guardar el RNA a -80°C

Tabla 2.6. Tratamiento del DNA genómico

1. Partir de 50 µl de RNA contaminado con DNA2. Añadir 2 unidades de DNase I y 5 ml del tampón de digestión3. Incubar 30 min a 37°C4. Añadir 5 µl de tampón de inactivación de DNase I y centrifugar 1 min a 9000 g5. Guardar el sobrenadante a –80°C

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También podemos conocer la integridad de los ácidos nucleicos mediante su separaciónen geles de agarosa y posterior visualización UV. De este modo, una muestra degradada pre-senta un fondo característico de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos. En el caso demuestras de DNA debe aparecer una sola banda mientras que para el RNA deben aparecer dosbandas bien nítidas correspondientes al RNA ribosómico 18S y 28S en el caso de RNA eu-cariótico y 16S y 23S para procariotas.

2.3. PCR CUALITATIVA

2.3.1. Fundamento teórico

La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR fue inventada por Kary Mullis a me-diados de los 80 [198], una técnica para la síntesis in vitro de secuencias de DNA. Con estatécnica la escasez de cantidad de DNA ya no es un problema en los procedimientos de Bio-logía Molecular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA. Así,la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la in-vestigación (clonación de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA fósil),medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de indivi-duos), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas,pureza de razas) y medicina (diagnóstico de enfermedades humanas).

La técnica se basa en la replicación del DNA realizada por la DNA polimerasa. Esta en-zima realiza la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5’→ 3’ usandoun molde de cadena sencilla a partir de un fragmento de doble cadena. Para iniciar la reac-ción se usan los denominados iniciadores, también llamados cebadores o primers. Son unapareja de oligonucleótidos (fragmentos de DNA de cadena sencilla de entre 15 y 30 pb) com-plementarios a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se desea amplificar. Par-tiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:1ª Desnaturalización del DNA de doble cadena, 2ª Hibridación de los cebadores a las zonascomplementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar y 3ª Extensión de lahebra complementaria por la DNA polimerasa, obteniéndose así un fragmento de doble ca-dena. La amplificación del fragmento de DNA sigue una progresión geométrica de forma queal final de “n” ciclos se obtienen 2n copias hasta el momento en que se alcanza el efectomeseta.

Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando las muestras de unbaño María a otro según la temperatura requerida en cada etapa y añadiendo DNA polimera-sa continuamente. El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil alcanzar las tempera-turas y los tiempos correctos. Sin embargo, la comercialización de la enzima Taq polimerasa[249] que es una enzima termoestable, junto con la aparición en el mercado de los primerostermocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente en los tiemposy temperaturas programadas de forma exacta, permitió el uso de la PCR como herramienta delaboratorio.


65

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2.3.2. Componentes y optimización de la reacción de amplificación

2.3.2.1. Calidad del DNA molde

Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en lareacción:

– Integridad del DNA: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo quequeremos amplificar.

– Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe tener determinadosfactores sanguíneos, fenol, detergentes, etc., que inhiben la actividad de la polimerasa.

– Cantidad de la muestra: la cantidad de DNA necesaria varía según el número de co-pias del gen diana. Si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de DNAgenómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng, mientras que en el casode zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng o a incluso picogramos.

2.3.2.2. Diseño de los cebadores

Para la elección de los cebadores, existen una serie de normas que nos pueden ayudar,aunque hay que indicar también que existen programas informáticos que nos facilitan esta ta-rea (DNAsis, Primer3, Primer Express, Vector NTI, etc.).

– El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%.

– No se deben seleccionar cebadores que en su extremo 3’ tengan una importante es-tructura secundaria.

– Se recomienda que en los extremos las últimas bases sean G o C.

– Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de cebadores. Si ésta existe en-tre los extremos 3’ existe la posibilidad de que se formen dímeros de cebadores (PD).

– Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 nucleótidos.

– La temperatura de disociación (Tm), definida como la temperatura a la cual la mitadde las moléculas de DNA están disociadas, deberá ser similar en ambos cebadores.La Tm depende de la secuencia de los cebadores y generalmente oscila entre los 45y 60°C. La Tm se puede calcular mediante los programas anteriormente menciona-dos o de manera menos exacta según la formula Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T), siendo G,C, T y A, el número de cada una de las bases que forman cada uno de los cebadores.

2.3.2.3. DNA Polimerasa

Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del DNA. Sepueden clasificar en termolábiles (Tª óptima de 37-42°C, se desnaturalizan con el calor) y ter-


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moestables (Tª óptima de 74°C, resiste durante 40-50min a 96°C). Habitualmente se utiliza laTaq polimerasa, una enzima termoestable aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus.

2.3.2.4. Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)

Los cuatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) se deben añadir en la solución de la re-acción en concentraciones que normalmente oscilan entre los 20 y los 200 mM cada uno.

2.3.2.5. Sales de la reacción

Es necesaria la existencia de un tampón que amortigüe la reacción, por lo general estáformado por 10 mM tris-HCl (pH=8.4), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl

2. Al-

gunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la práctica a aumen-tar la especificidad y fidelidad de la reacción. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al tampónde la reacción en un 10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del DNA.También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón, que ayudana estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), gli-cerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no son imprescindibles.

Otro aspecto importante es la presencia y concentración de dos cationes, el K+ y el Mg++.El cloruro potásico (KCl) influye en la desnaturalización del DNA. Elevadas concentracionesdel ión K+ favorecen la desnaturalización de secuencias cortas de DNA, mientras que concen-traciones bajas ayudan a la desnaturalización de secuencias largas de DNA. El cloruro de mag-nesio (MgCl

2) aumenta la temperatura de hibridación del DNA. La presencia de Mg++ es im-

prescindible para la actividad de la Taq polimerasa y su concentración resulta fundamentalpara la optimización de la reacción. Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especifici-dad de la reacción, bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción.

2.3.2.6. Temperatura y número de ciclos

Como se ha explicado anteriormente la PCR se realiza en tres etapas que constituyenun ciclo, que se repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura yel número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto, mo-dificándolos podemos optimizar la reacción.

– Desnaturalización: Se recomiendan temperaturas de 94°C durante 30 segundos a 1minuto. Si el DNA molde tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo ola temperatura necesarios. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad dela DNA polimerasa decrece de manera muy rápida a partir de los 95°C, por lo que aestas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. Enla práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ci-


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clos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de DNA. Esta eta-pa suele ser de 5 min a 94°C.

– Hibridación: la temperatura y el tiempo van a depender de tres factores relacionados conlos cebadores: la composición de bases, el tamaño y la concentración. En la práctica, latemperatura de hibridación se establece a 4-5°C por debajo de la Tm de los cebadorespudiendo oscilar entre 45-65°C, y un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minu-to. Un aumento de temperatura o una disminución del tiempo favorecen la especificidadya que disminuye las uniones inespecíficas de los cebadores con la hebra molde.

– Extensión: El tiempo de extensión depende del tamaño del fragmento a amplificar.Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb. En la mayoría de las re-acciones, la etapa de extensión se realiza a 72°C. Teóricamente esta temperatura pue-de variar entre 68-72°C.

El número de ciclos depende de la cantidad de DNA diana que existe en la muestra unavez que el resto de factores han sido optimizados. Es importante no realizar un número altode ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados debido a hibri-daciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una en-zima que sufre el efecto meseta.

Una vez seleccionadas de manera teórica las condiciones de reacción teniendo en cuen-ta todos los factores mencionados anteriormente, las condiciones seleccionadas deben de eva-luarse de manera empírica para poder determinar las condiciones óptimas.

2.3.3. Contaminaciones en la PCR

La PCR es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contami-naciones, ya que es posible que el DNA no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muypequeña) se amplifique y obtengamos un resultado erróneo. Vemos que una de las mayoresventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una seriede normas que ayudan a evitar las contaminaciones. Neiker dispone de un lugar físico exclu-sivo para realizar la mezcla de los reactivos de PCR, otro para la adición del DNA molde yun tercero donde se encuentran los termocicladores, perfectamente separadas de las áreasdonde se trabaja con DNA amplificado. Además las salas de preparación de la PCR se irra-dian con UV antes y después de su uso. Todo el instrumental que se utiliza es de uso exclusi-vo para la PCR. También se utilizan reactivos y tubos estériles, guantes y controles negativos(se añade agua en lugar de DNA y por tanto no debe existir amplificación).

2.3.4. Detección del producto de PCR. Electroforesis

La detección del producto de PCR se realiza normalmente mediante electroforesis delos productos de la reacción en geles. El fundamento de esta separación está basado en que


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las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tam-pón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo posi-tivo de éste a través del gel a velocidades que dependen de sus tamaños.

Un gel es una malla compleja de moléculas poliméricas formada por agarosa o polia-crilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el ran-go desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20.000 pares de bases. La poliacrila-mida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos. Elpolímero empleado, su concentración, el tiempo, y el voltaje determinan la resolución de laelectroforesis. La agarosa es el polímero más empleado dada su inocuidad y sus prestaciones.La posterior visualización se puede realizar mediante tinción con bromuro de etidio, tinciónde plata, fluorescencia o radioactividad.

2.3.5. Purificación de productos de PCR

La presencia de sales, enzimas, nucleótidos, cebadores y otros componentes derivados dela amplificación por PCR pueden interferir en procesos posteriores como son la secuenciacióndel DNA o la clonación. Por lo tanto se requiere partir de un producto de PCR de alta pureza ycalidad. En el caso en que el producto de partida esté limpio, es decir, la muestra no presenta am-plificaciones inespecíficas, la purificación puede hacerse directamente a partir de la muestra dePCR en solución. En caso contrario habrá que proceder a la separación del fragmento a purifi-car en un gel de agarosa, la escisión del la banda y la posterior purificación del DNA a partir dela banda. En este trabajo se ha empleado el GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) basado en un sistema de columnas formadaspor una matriz sólida con afinidad por el DNA, posterior lavado y elución del mismo (Tabla 2.7).


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Tabla 2.7. Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa

1. Obtener un taco de agarosa que contenga el fragmento de PCR que se desea purificar 2. Añadir 10 µl del tampón de captura por cada 10 mg de gel 3. Incubar durante 1 min a Ta4. Transferir la solución a una columna y centrifugar 30 seg a 13000 g5. Añadir a la columna 500 µl de tampón de lavado y centrifugar 30 seg a 13000 g6. Añadir a la columna 50 µl de tampón de elución y centrifugar 30 seg a 13000 g7. Guardar el DNA a -20°C

2.4. PCR A TIEMPO REAL

2.4.1. Fundamento teórico

A diferencia de la PCR convencional, la PCR a tiempo real permite monitorizar eltranscurso completo de la reacción de PCR mediante la lectura de la fluorescencia emitida

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durante la reacción, la cual es indicativa de la producción del amplicón en cada ciclo de laPCR [128, 129]. Esta técnica ofrece una gran variedad de aplicaciones al ser capaz de cuan-tificar de manera absoluta o relativa moléculas de DNA o RNA. Esta cuantificación se re-aliza de forma precisa y reproducible gracias a la medición de la fluorescencia generada du-rante la fase de crecimiento exponencial del producto de PCR en lugar de utilizar medidasde punto final. De este modo, la PCR a tiempo real se emplea para determinar la carga ví-rica y el título de gérmenes en alimentos, sangre u otro tipo de muestras, la expresión gé-nica en distintos tejidos, seguimiento de tratamientos o estadios del desarrollo, la discrimi-nación alélica, y la deleción o el grado de amplificación de los genes, la respuesta amedicamentos en cánceres humanos, el perfil de citoquinas en la respuesta inmune, la de-tección de polimorfismos, y la validación de los resultados de experimentos con microa-rrays de DNA, entre otras aplicaciones. Con la PCR a tiempo real, el empleo de geles deagarosa queda eliminado lo cual, unido a que se han desarrollado termocicladores capacesde procesar 386 muestras y el continuo desarrollo de equipos más rápidos, hacen de estatécnica una sofisticada herramienta para estudios de DNA que requieran un elevado proce-sado de muestras.

Para la detección y cuantificación de la fluorescencia emitida durante la amplifica-ción, el equipo consta de un termociclador convencional al que se le ha acoplado una cá-mara CCD capaz de registrar en todo momento la fluorescencia que se va produciendo encada pocillo (Figura 2.1). La detección de la fluorescencia se realiza mediante filtros deemisión optimizados para el uso de un amplio rango de fluoróforos. El equipo de PCR atiempo real empleado en este trabajo ha sido el ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), (Fi-gura 2.2).


70

Figura 2.1. Esquema general del sistema fluorescente en un equipo de PCR a tiempo real. (El siste-ma consta de una lampara halógena de tugsteno emisora de luz que incide sobre cada muestra a tra-vés de una serie de espejos. Una vez que la luz incide sobre los fluoróforos presentes en cada mues-tra se produce luz fluorescente la cual a través de un sistema de espejos y filtros específicos llega auna cámara CCD que capta la señal fluorescente producida en cada muestra)

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2.4.2. Detección del producto de PCR

El marcaje del producto en PCR a tiempo real puede conseguirse mediante el empleode sondas de DNA (TaqMan, molecular beacons, scorpions, etc) o mediante reactivos deunión a la doble cadena de DNA (SYBR Green). A continuación se describen los métodosde marcaje empleados en este trabajo.

2.4.2.1. Sondas TaqMan

Las sondas TaqMan son oligonucleótidos de entre 20-40 pb diseñadas para que hibridencon una región interna del producto de PCR. Una sonda TaqMan esta constituida por un mar-cador fluorescente en el extremo 5’ llamado reporter (R) y un quencher (QR) en el extremo 3’(Figura 2.3). Existen diversas moléculas que pueden hacer de R y de QR (Tabla 2.8) pero sóloson válidas aquellas combinaciones en la que el espectro de emisión del R esté dentro del es-pectro de absorción del QR. De esta forma, cuando la sonda es excitada con la longitud de ondaadecuada, la energía emitida por el R es absorbida por el QR (a este fenómeno se le conocecomo FRET, Transferencia de Energía Fluorescente mediante Resonancia). La proximidad delR y del QR evita cualquier tipo de emisión fluorescente mientras la sonda esté intacta.

Al comienzo de la reacción los cebadores hibridan en la región complementaria al DNAy la Taq polimerasa se encarga de añadir nucleóticos desde los extremos 3’ de los cebadores,al mismo tiempo que la sonda TaqMan ha hibridado en su región específica situada entre loscebadores. Una vez que la Taq polimerasa alcanza el extremo 5’ de la sonda y gracias su ac-tividad 5’-exonucleasa, la sonda es fragmentada separando el R del QR con la consiguienteproducción de luz fluorescente cuando la muestra sea excitada. En el caso de que la sonda nohibride perfectamente, la Taq polimerasa libera la sonda sin fragmentarla y por lo tanto no seproducirá emisión de luz.


71

Figura 2.2. Equipo de PCR a tiempo real ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). [Este equipo per-mite una alta capacidad de procesamiento de muestras, gran reproducibilidad, precisión y un ampliorango dinámico, características necesarias para el análisis cinético de la PCR. Se pueden usar placasópticas o tubos individuales ópticos. Posee un sistema de detección fluorescente consistente en un blo-que integrado de 96 pocillos con una unidad interna de calentamiento/enfriamiento controlada por elsistema peltier en un rango de 4.0°C a 99.9°C. El sistema de detección de la fluorescencia se realizamediante distintos filtros de emisión lo cual permite el empleo de varios fluoróforos en reaccionesmultiplex (FAM, VIC, JOE, NED, TAMRA, ROX y SYBR Green)]

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El empleo de sondas permite aumentar la especificidad obtenida previamente por loscebadores evitando de este modo falsos positivos por amplificaciones inespecíficas. Ademásfacilita la identificación de mutaciones y permite el uso de reacciones multiplex (realizar múl-tiples experimentos simultáneamente) al poder utilizar varias sondas con fluoróforos distin-tos a la vez (FAM, VIC, TET, HEX o JOE).

Alternativamente se pueden emplear sondas TaqMan MGB. Éstas, permiten el empleode secuencias más cortas que las sondas TaqMan, lo que resulta muy útil en ensayos de dis-


72

Figura 2.3. Producción de señal fluorescente mediante sondas TaqMan. [(a) la Taq polimerasa (rojo)añade nucleótidos a partir de los extremos 3’ de los cebadores. La sonda marcada con el reporter (ver-de) y el quencher (azul) hibrida en una posición interna entre los cebadores. (b) la Taq polimerasaavanza y cuando llega a la sonda la desplaza. (c) la actividad 5’ exonucleasa de la Taq polierasa rom-pe la sonda. El R queda separado del QR dando lugar a la emisión de luz. (d) la Taq polimerasa ter-mina de amplificar la secuencia existente entre los cebadores]

Tabla 2.8. Principales moléculas fluorescentes empleadas como marcadores en PCR a tiempo real

Fluorocromo Máx absorción (nm) Máx emisión (nm)

SYBR Green I 497 520FAM 495 535TET 522 550JOE 525 555VIC 528 546HEX 530 560NED 553 575TAMRA 560 580ROX 580 605

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criminación alélica donde una muestra se somete a amplificación en presencia de dos sondascuya secuencia se diferencia en una sola base. Esto es posible gracias al empleo de un QR es-pecial denominado MGB, capaz de aumentar la Tm de la sonda.

2.4.2.2. SYBR Green

Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario, aumen-tando su fluorescencia unas 1.000 veces. De este modo la fluorescencia producida en el trans-curso de la PCR aumenta de forma proporcional a la cantidad de producto amplificado. ElSYBR Green es una alternativa más económica y más versátil frente al empleo de sondas yaque su unión inespecífica hace factible su empleo en la detección de cualquier DNA amplifi-cado y además evita el diseño y la puesta a punto de las sondas. Sin embargo, esta unión ines-pecífica a DNA de doble hebra no distingue entre DNA amplificado, dímeros de cebadoresy/o productos inespecíficos, por lo que puede dar lugar a falsos positivos. Para evitar ésto, seha de tener especial cuidado en el diseño de los cebadores y comprobar la Tm del productofinal (ver apartado 2.4.4).

2.4.3. Componentes y optimización de la reacción de amplificación

En general, el fundamento y los principios básicos de los componentes de la PCR con-vencional, así como la optimización de la reacción descrita en el apartado 2.3.2 son perfecta-mente aplicables a la PCR a tiempo real. Por lo tanto, únicamente se van a describir algunasparticularidades de esta técnica.

2.4.3.1. Componentes de la reacción

La alternativa más rápida y cómoda para poner a punto un protocolo de PCR a tiemporeal es el empleo de reactivos comerciales que incluyen todos los componentes necesariospara la reacción tales como el tampón, las sales, la Taq polimerasa y los nucleótidos. Estos re-activos preparados suelen contener un fluoróforo pasivo de referencia, generalmente ROX,que permite ajustar las posibles variaciones entre las muestras debidas a errores en el pipeteo.De este modo podemos encontrar en el mercado el TaqMan Buffer para el empleo de sondasy el SYBR Green Buffer para el empleo de SYBR Green.

2.4.3.2. Diseño de cebadores, sondas y amplicón

– Cebadores: Para optimizar los recursos y poder usar las mismas condiciones de ci-clado en diferentes ensayos es conveniente diseñar cebadores con una Tm entre los58-60°C. Al contrario que en la PCR convencional se deben evitar las G/Cs en el ex-


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tremo 3’. Es también importante evitar la complementariedad en la secuencia de loscebadores para que no se formen dímeros y si no es posible usar concentraciones en-tre 50 y 300 nM.

– Sondas: La Tm ha de ser 10°C mayor que la Tm de los cebadores. Nunca debe haberuna G en el extremo 5’ ya que puede hacer de quencher natural y captar la fluores-cencia emitida por el reporter. Debe haber menos de 4 G/Cs contiguas para evitar unaunión inespecífica fuerte.

– Amplicón: Ha de ser pequeño, entre 50 y 150 pb para aumentar la eficiencia de laPCR y para reducir el tiempo del ensayo. Los fragmentos pequeños se amplifican conmayor eficiencia que los grandes ya que tienen gran facilidad de desnaturalizarse a95°C y porque tan solo 15 segundos son suficientes para su polimerización dado quela Taq polimerasa coloca entre 30 y 70 bases en un segundo. Además, a diferenciacon lo que ocurre en la PCR convencional el pequeño tamaño no dificulta la detec-ción. En caso de usar SYBR Green, se recomienda que la longitud del amplicón pro-porcione una Tm mayor de 75°C para que no coincida con la Tm típica de un díme-ro de cebadores.

2.4.4. Parámetros en PCR a tiempo real

A la hora de trabajar con PCR a tiempo real es necesario conocer una serie de parámetros:

– Curva de amplificación. Corresponde a la señal fluorescente resultante de la ampli-ficación de la secuencia de DNA diana (Figura 2.4a).

– Baseline o línea base. Ciclos iniciales donde no hay un cambio sustancial de la fluo-rescencia. Se establece entre los ciclos iniciales y 2 ciclos antes de que se de un au-mento de la fluorescencia debido a la amplificación (Figura 2.4a).

– Threshold o umbral. Nivel de fluorescencia determinado por el usuario situado en lazona de amplificación exponencial de la reacción (Figura 2.4a).

– Threshold cycle (Ct). Corresponde con el ciclo de PCR en el que la curva de ampli-ficación corta al threshold. Es inversamente proporcional a la cantidad inicial de mo-léculas molde. Este parámetro es el que nos permitirá realizar análisis cuantitativos(Figura 2.4a).

– Temperatura de disociación (Tm). Está directamente relacionada con la secuencianucleotídica del fragmento amplificado (Figura 2.4b) y se puede calcular medianteun software específico (Primer Express software, Applied Biosystems, CA, USA).La Tm se utiliza como parámetro de determinación de la especificidad de la reaccióncuando se utiliza SYBR Green como sistema de detección. Al finalizar la reacción,el equipo de PCR aplica un gradiente de temperaturas creciente y monitoriza la ci-nética de disociación del fragmento amplificado. De este modo y conociendo la Tm


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teórica del amplicón se puede comprobar no solo la Tm de la secuencia amplificadasino que también permite descartar la presencia de dímeros de cebadores y amplifi-caciones inespecíficas que en general tienen una Tm diferente a la del amplicón (Fi-gura 2.4c).

– Eficiencia de la amplificación (E). Nos indica la efectividad con la que se amplifi-ca el DNA diana. Se calcula mediante la Ecuación 2 [233], donde “pdte” se co-rresponde con la pendiente de la recta patrón. Un valor de 2 indica una eficienciadel 100%.

Ecuación 2E = [10 (-1 / PDTE)]


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Figura 2.4. Representación gráfica de parámetros en PCR a tiempo real. [(a) Curva de amplificaciónde un ensayo de PCR a tiempo real. La primera parte de la curva de amplificación comienza con unosciclos iniciales (baseline) donde el aumento de la fluorescencia no es detectable, continúa con el au-mento detectable de la fluorescencia producida (fase exponencial) seguido de una fase de meseta don-de no hay aumento de a fluorescencia porque la reacción se ha saturado. La baseline, el threshold y elCt quedan representados gráficamente. (b) Ejemplo de representación gráfica de los picos de disocia-ción de tres productos de PCR con distintas Tm. (c) Ejemplo de representación gráfica de la detecciónde PD en un control negativo de PCR. La Tm de los PD suelen estar entorno a los 75°C a diferenciade la Tm de un producto de PCR que suele ser mayor de 80°C]

2.4.5. Análisis cualitativo

Los resultados en PCR a tiempo real pueden ser analizados de forma cualitativa o deforma cuantitativa. El análisis cualitativo se realiza a tiempo final y de forma similar a la PCR

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convencional clásica basada en la presencia o ausencia de una secuencia de DNA o RNA. Ladiferencia radica en que para la detección del producto amplificado ya no es necesario el usode geles de agarosa sino que la detección de fluorescencia indica presencia del fragmento bus-cado.

2.4.5.1. Detección de patógenos

Una de las aplicaciones de la PCR a tiempo real es la detección e identificación depatógenos por medio de la amplificación de secuencias específicas de DNA. Esta aplica-ción ha mejorado enormemente con la PCR a tiempo real gracias a que permite la detec-ción de múltiples fluoróforos en un mismo tubo. De este modo, podemos detectar más deun patógeno en una misma muestra e incluso incluir controles positivos internos utilizan-do sondas marcadas con fluoróforos de distinto máximo de emisión. Cabe destacar que elhecho de realizar todo el proceso en tubo cerrado reduce la posibilidad de contaminacionesposteriores.

2.4.5.2. Detección de SNPs con sondas TaqMan

Una de las aplicaciones de la PCR a tiempo real es la detección SNPs. Para el caso deun polimorfismo puntual con dos variantes, la muestra es sometida a la amplificación de unfragmento de PCR en presencia de dos sondas marcadas con fluoróforos diferentes y cuya se-cuencia se diferencia únicamente en la base del polimorfismo en estudio. Al término de la re-acción de PCR se lee la fluorescencia existente en la muestra con los filtros de emisión espe-cíficos de los dos fluorocromos usados de tal forma que la detección de una única señalfluorescente indica homozigosis de uno u otro alelo mientras que dos señales fluorescentesindican heterozigosis (Figura 2.6). El software del equipo ABI Prism 7000 permite obtenergráficamente y de forma intuitiva el genotipo final de las muestras (Figura 2.6). También po-demos analizar los SNPs en base a la curva de amplificación observando la fluorescencia decada una de las sondas.


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Figura 2.5. Representación de un ensayo de discriminación alélica. [La fluorescencia final de cadareacción es leída (a) y representada gráficamente en un diagrama de nubes según el software del equi-po ABI Prism 7000 (b)]

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2.4.6. Análisis cuantitativo

La principal característica definitoria de la PCR a tiempo real es la posibilidad de obte-ner resultados cuantitativos. El análisis cuantitativo de ácidos nucleicos puede realizarse dedos formas, mediante cuantificación absoluta (CA) o mediante cuantificación (CR) relativa(Figura 2.6).


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Figura 2.6. Estrategias de cuantificación en PCR a tiempo real. (HK, gen constitutivo de expresiónconstante en todas las muestras en estudio)

2.4.6.1. Cuantificación absoluta (CA)

La CA permite conocer la cantidad exacta del número de moléculas de DNA o RNAque presenta una muestra. Mientras que el análisis cualitativo se realiza a tiempo final, lacuantificación en PCR a tiempo real se realiza en la fase exponencial de la reacción de am-plificación. En esta fase se obtiene el Ct de la muestra a partir del cual se puede cuantificarcon gran precisión el número de copias del fragmento diana al inicio de la reacción. Para elloes necesario incluir en la misma tanda de amplificación unos controles externos de concen-traciones conocidas y crecientes de DNA diana (recta patrón) (Figura 2.7). La cantidad deDNA de una muestra desconocida se obtiene por tanto interpolando en la recta patrón el va-lor de su Ct.

La precisión de la cuantificación dependerá de la correcta elección de la recta patrón.Se ha de calcular de forma exacta la cantidad de moléculas de cada una de las diluciones quela componen. Además, tiene que permitir una alta especificidad, reproducibilidad y estabili-dad en los distintos ensayos. Una recta se puede obtener a partir de un DNA standard, plás-midos recombinantes, DNA genómico o de un producto de RT-PCR. Adicionalmente, paralograr una cuantificación correcta, la E de los patrones y las muestras problema deben ser si-

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milares, lo que implica una intensiva puesta a punto previa de la PCR. El rango de detecciónde una recta patrón puede abarcar hasta 9 ordenes de magnitud dependiendo del material em-pleado, permitiendo detectar desde 1 hasta 1010 copias.


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Figura 2.7. Gráfica de una recta patrón obtenida a partir de diluciones seriadas de concentracionesconocidas de un producto de PCR. (El software permite obtener de forma automática los parámetrosrelacionados con la recta patrón tales como el valor de R2 (coeficiente de determinación) y la pen-diente de la recta)

2.4.6.2. Cuantificación relativa (CR)

La CR se emplea para estudiar los cambios relativos en los niveles de mRNA de un gen.Este procedimiento consiste en dos etapas que pueden realizarse en un mismo tubo o en tu-bos diferentes. La primera etapa es la fase de retrotranscripción en la que todo el RNA setranscribe a cDNA por la transcriptasa inversa, seguido de la etapa de amplificación especi-fica del gen diana. Al conjunto de estas dos etapas se le denomina RT-PCR. Posteriormente,se realiza la cuantificación relativa mediante la normalización del mRNA del gen problemafrente a una o varias referencia/s interna/s o alternativamente utilizando una curva patrón ex-terna basada en diluciones seriadas de cDNA.

Para la normalización de la expresión del gen diana se emplea un gen de referencia,también llamado gen interno, gen constitutivo o gen housekeeping (HK). En 1965, Watsony cols. [286] definieron el término “housekeeping genes” como aquellos genes que se ex-presan en todos los tejidos para mantener las funciones celulares básicas. Existen multitudde genes HK que podemos agrupar en las siguientes funciones biológicas: metabolismo, di-visión celular, defensa y apoptosis, señalización y comunicación, expresión génica y trans-cripción, expresión proteica, proteínas ribosómicas, estructura y mobilidad. Un estudio re-alizado en 19 tejidos de 49 individuos reveló la existencia de 451 genes entre los 7.000genes analizados y como el perfil de expresión de los genes HK variaba en función del tipode tejido [138]. Por lo tanto, para una correcta cuantificación los genes HK han de tener unaexpresión constante e invariable en todas las muestras objeto del estudio, independiente-mente de las condiciones del ensayo (tratamiento con fármacos, estado de salud, edad, tipode tejido, etc).

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A diferencia de la CA, la normalización mediante genes HK permite obtener resultadosmuy ajustados que no se ven afectados por las variaciones que pueden existir entre las dis-tintas muestras y que afectan a los resultados del ensayo, como son la cantidad de muestraempleada, la integridad del RNA y variaciones en la E de la síntesis de cDNA, entre otras.

Aunque históricamente se ha venido empleado un único gen HK (ACTB, 18S oGAPDH) para la normalización del gen problema [117, 124, 168], estudios recientes han de-mostrado que la expresión de estos genes HK puede mostrar variaciones inter-individualesasí como variaciones en determinadas condiciones de ensayo [50, 271, 273, 285]. Por lo tan-to, algunos autores recomiendan el empleo de más de un gen HK para obtener una correctanormalización [216, 283].

La precisión de esta normalización dependerá por tanto de una buena elección de losgenes HK ya que no existe un gen o genes universales que puedan ser usados en todos los en-sayos por lo que, es necesario evaluar la estabilidad de los genes HK en cada escenario. Exis-ten diversos métodos para seleccionar los mejores genes HK [5, 217, 268, 283]. En el pre-sente trabajo se ha empleado la aplicación de Microsoft Excel GeNorm 3.4. desarrollada porVandesompele y cols. en 2002 [283]. Este método se basa en la comparación de la expresiónde una serie de genes HK entre si, de tal forma que partiendo de un número mínimo reco-mendado de 5 genes HK podemos determinar la estabilidad de estos genes (M) y el númeromínimo de genes HK necesario para una correcta normalización (V

n/n+1). De este modo, los

genes con menor M presentan la mayor estabilidad dentro del grupo de muestras que estamosanalizando y el valor umbral de 0.15 para el parámetro V

n/n+1 determina el número mínimo de

genes a usar. Esta alternativa propone el uso de al menos 3 genes HK para una correcta nor-malización. Como hemos mencionado anteriormente, es necesario que se evalúe la estabili-dad de los genes HK en cada escenario.

Una vez seleccionados los mejores genes HK se ha de normalizar la expresión del genproblema en relación a los genes HK, para lo cual se han desarrollado varios modelos mate-máticos [216, 283]. En el presente trabajo se ha utilizado el método descrito por Vandesompe-le y cols. [283]. Para ello, se ha de calcular la cantidad de mRNA (Q) de un gen mediante suCt. Se puede utilizar una recta patrón relativa obtenida a partir de diluciones seriadas de cDNAe interpolando el valor del Ct a dicha recta, o alternativamente, se puede aplicar la Ecuación 3,donde “Min Ct” es el mínimo valor de Ct para un grupo de muestras y “Ct muestra” es el Ctde la muestra en estudio (manual de usuario GeNorm, http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/ge-norm/geNorm_manual.pdf). Esta ecuación incluye la corrección de la E de reacción de PCRobtenida a partir de diluciones seriadas de cDNA según la Ecuación 2.

Ecuación 3

Finalmente, la expresión normalizada del gen problema se obtiene mediante la Ecua-ción 4, donde se calcula el ratio entre el nivel de mRNA del gen problema (QGP) y el factornormalizador (FN). Este FN específico para cada muestra y es la media geométrica de la can-tidad de mRNA de los genes HK (QHK) de referencia empleados (Ecuación 5).

Q = E (Min Ct – Ct muestra)


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Ecuación 4

Ecuación 5

2.5. PCR-RFLP

El término PCR-RFLP proviene del inglés Restriction Fragment Lenght Polymorphismque traducido significa, polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción. Es unatécnica muy usada en biología molecular y consiste en el análisis de los patrones de bandasque aparecen en un gel de agarosa producidos por la digestión enzimática de una secuenciade DNA que puede haber sido previamente amplificada por PCR. Estas enzimas se conocencon el nombre de endonucleasas y son capaces de cortar la molécula de DNA en determina-das secuencias nucleotídicas específicas para cada endonucleasa. Esta secuencia de corte sellama diana de restricción y suele estar compuesta generalmente por 4 a 6 pb. Generalmentecuanto mas corta sea la secuencia diana más fragmentos de restricción se pueden generar. Laexistencia de diferencias en la secuencia nucleotídica de las moléculas de DNA a estudiar,puede dar lugar a la presencia o ausencia de sitios de restricción, lo que a su vez se traduceen diferencias de tamaño entre los fragmentos resultantes. Estos fragmentos son separados enun gel por electroforesis y los patrones resultantes pueden ser analizados y comparados. Sehan aislado gran variedad de enzimas de restricción a partir de procariotas donde se piensaque forman parte de los mecanismos de defensa contra virus bacterianos. La nomenclatura deestos enzimas comienza con la primera letra del genero de la bacteria y continúa con las dosletras siguientes corresponden a la especie y un número que se relaciona con el orden del des-cubrimiento.

2.6. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA EN Escherichia coli

Consiste en la obtención de un gran número de copias de fragmentos de DNA idénticosa partir de uno original. De forma resumida, la clonación de fragmentos de PCR comienzacon la obtención de un producto de PCR y sigue con su posterior inserción en un plásmidosintético, transformación de las células competentes de E. coli, y amplificación del fragmen-to por crecimiento de un cultivo de células transformadas. Finalmente, esas copias se aíslanmediante la purificación de los plásmidos (apartado 2.1.1.4.) con el fragmento insertado, quesi es necesario puede ser separado del vector por digestión enzimática. En nuestro estudio, elempleo de plásmidos ha permitido la secuenciación de fragmentos pequeños de hasta 75 pbasí como la obtención de diluciones seriadas para poder calcular la E de amplificación de en-sayos de PCR (apartado 2.4.6.1). Los productos de PCR se han clonado en el vectorpCR®4-TOPO empleando el TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, CA, USA). El plásmido

FN = QHK QHK QHK1 2 nn × ×

Expresión relativa = QCP / FN


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pCR®4-TOPO tiene dos genes que confieren resistencia a kanamicina y a ampicilina permi-tiendo seleccionar específicamente aquellas colonias de E. coli que poseen el plásmido conel inserto (Figura 2.8).


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Figura 2.8. Representación circular del plásmido comercial pCR®4-TOPO (Invitrogen). (El produc-to de PCR queda ligado al plásmido en la zona de inserción por medio de extremos cohesivos con T.Existen diferentes dianas de restricción que flanquean a la zona del inserto así como genes asociadosa resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. También presenta las secuencias comple-mentarias a cebadores universales M13, T3 y T7 cercanas a la zona de inserción)

2.7. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DEL DNA

La secuenciación del DNA es la determinación de la sucesión precisa de nucleótidos deun fragmento de DNA. Este proceso se puede realizar de forma automatizada y el método máspopular para hacerlo se llama el método de terminación por dideoxinucleótidos. El DNA sesintetiza con cuatro deoxinucleótidos trifosfato adenina (A), timina (T), citosina (C) y guani-na (G). El método de dideoxi recibe su nombre del papel crítico de los nucleótidos sintéticosque carecen del grupo hidroxilo (OH) en el carbono del extremo 3’. El dideoxinucleótido tri-fosfato (ddNTP) puede agregarse a la cadena creciente de DNA pero cuando esto ocurre laelongación de la cadena se detiene debido a la falta del grupo OH en el extremo 3’ necesariopara que continúe la elongación. Por esta razón, el método del dideoxi también se denominael método de terminación de la cadena.

El DNA molde que se necesita para secuenciar tiene que ser de cadena sencilla por loque se desnaturaliza el DNA durante 5 minutos a 94°C, si el DNA que se quiere secuenciares de doble cadena. Además del DNA se agrega una mezcla de los cuatro deoxinucleótidosnormales (dNTP) en suficiente cantidad (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), una mezcla de los cua-tro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), cada uno en cantidades limitantes ymarcados con fluorescencia de diferente color (fluoresceina, NBD, tetrametilrodamina y rojotexas) y Taq polimerasa tipo I de DNA. La elongación de la cadena se produce de forma nor-

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mal gracias a los deoxinucleótidos hasta que, por casualidad, la polimerasa de DNA insertaun dideoxi en lugar del deoxinucleótido normal y entonces se detiene la elongación. Si la pro-porción dNTPs / ddNTPs es lo bastante alta, algunas de las cadenas de DNA tendrán éxitoagregando varios cientos de nucleótidos antes de la inserción de un ddNTP que detiene el pro-ceso. Los fragmentos se separan por electroforesis capilar, de las cadenas más largas a las máscortas. La resolución es tan buena que una diferencia de un nucleótido es suficiente para dis-tinguir entre una cadena y la siguiente cadena con un nucleótido de más. Cada uno de los cua-tro dideoxinucleótidos fluorescentes, es iluminado por una rayo láser y el ordenador archivala secuencia dando lugar a un cromatograma como el que se muestra en la Figura 2.9.

La secuenciación de productos de PCR puede servir para confirmar si el fragmento desecuencia conocida que estamos amplificando es lo que realmente buscamos. Para ello, bas-tará con comparar la secuencia obtenida con la secuencia del producto esperado mediante ali-neamientos con un software específico como Vector NTI Suite (Informax Inc., North Bet-hesda, MD) o frente a todas las secuencias depositas en las bases de datos (GenBank)mediante búsquedas tipo Blast en el servidor del National Center for Biotechnology Infor-mation (NCBI). También nos permite conocer la secuencia de fragmentos de DNA descono-cidos, detectar mutaciones, realizar un diagnóstico prenatal, etc.


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Figura 2.9. Cromatograma representativo de la secuenciación automática de DNA. (El color decada pico corresponde con el color del nucleótido dideoxi incorporado en la posición indicada duran-te la amplificación de la secuencia de DNA en estudio)

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Capítulo 3

DESARROLLO DE DOS MÉTODOSBASADOS EN PCR-RFLP Y PCR

A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS DELOS POLIMORFISMOS DEL GEN PrP.

ANÁLISIS REPRESENTATIVO DELA POBLACIÓN OVINA DE LA CAPV

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3.1. INTRODUCCIÓN

El scrapie es una EET que afecta a ovejas y cabras [140, 223]. Como en otras EETs,existe una proteína celular inocua cuya modificación estructural la convierte en una proteí-na patógena para el individuo, PrPSc, acumulándose ésta en el SNC y en tejidos linfoides [9,280]. La edad de aparición de los síntomas clínicos está influenciada genéticamente pero lasrazones de esta relación no están todavía bien esclarecidas. Existen numerosos polimorfis-mos en el gen PrP que dan lugar a un total de 30 variantes aminoacídicas en ovino y 20 encabras [17, 21, 108, 165, 277]. Sin embargo, solo unos pocos polimorfismos presentan rela-ción con la resistencia o susceptibilidad genética frente a scrapie. Los polimorfismos conuna relación clara se encuentran en los codones 136, 154 y 171 de los que se han descritodistintas combinaciones alélicas con diferentes grados de susceptibilidad a scrapie [72].Aunque también se ha descrito la presencia de K en el codón 171 en algunas razas ovinasdel mediterráneo, no se ha constatado todavía relación alguna con la enfermedad [277]. Enrelación a los codones 136, 154 y 171, la mayor resistencia parece estar asociada al genoti-po ARR/ARR mientras que el genotipo VRQ/VRQ confiere la mayor susceptibilidad frentea scrapie. De este modo, el conocimiento de la distribución de genotipos dentro de un reba-ño puede dar una idea del riesgo de los animales a padecer la enfermedad. En el año 2002,la Unión Europea recomendó a todos los países miembros la determinación de la distribu-ción de genotipos en sus razas ovinas selectas [51], con objeto de evaluar la viabilidad de laaplicación de programas de selección encaminados a favorecer los genotipos resistentes endetrimento de los susceptibles.

La principal raza ovina de la CAPV es la Latxa, una raza lechera empleada para la pro-ducción de queso [93]. También existe una raza genéticamente emparentada a la Latxa lla-mada Carranzana cuya población representa el 6% de la cabaña ovina de la CAPV. En losaños 80 comenzó el análisis de los datos relativos a la producción lechera, momento en el quese implantó un sistema de mejora genética por medio del empleo de machos de alto valor ge-nético e inseminación artificial. Respecto a la incidencia de scrapie en las razas autóctonasvascas solo se han descrito 30 casos en la raza Latxa de los cuales 26 correspondieron a unmismo brote y el resto a 4 brotes con un único animal afectado. La incidencia es muy baja sila comparamos con la alta proporción de casos que presenta la raza Manech de los PirineosAtlánticos (Francia) que es genéticamente similar a la Latxa [86]. Aunque se desconoce la ra-zón de la distinta prevalencia de scrapie en dos razas tan similares, el conocimiento de la sus-ceptibilidad genética en la raza Latxa podría ser muy útil para conocer el riesgo potencial deesta raza. En este sentido, en 1998 se comenzó el genotipado de las razas de la CAPV en unamuestra relativamente pequeña de animales. En este primer estudio, la técnica utilizada nopermitió discernir entre Q e H en el codón 171 [147].

Se han empleado diversas metodologías para conocer los polimorfismos del gen PrP enlos codones 136, 154 y 171, entre las cuales podemos encontrar protocolos basados en la téc-nica de Southern blot, PCR-RFLP y secuenciación de DNA [143, 307, 311]. Sin embargo, es-tos protocolos son muy laboriosos por lo que como parte de este trabajo se han desarrolladodos nuevos protocolos que proporcionan resultados más fiables reduciendo el tiempo y los

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costes. El primer protocolo está basado en un análisis por PCR-RFLP descrito por Yuzbasi-yan-Gurkan y cols. en 1999 [307] y el segundo emplea la PCR a tiempo real [123, 129]. Am-bos protocolos se han aplicado al estudio de la distribución de los polimorfismos en los co-dones 136, 154 y 171 del gen PrP en una muestra representativa de la población ovina de laCAPV realizado entre los años 2001-2002.

3.2. SELECCIÓN DE LOS ANIMALES

Para el presente estudio se seleccionaron animales procedentes de razas autóctonas dela CAPV. La raza Latxa es la raza ovina más representativa de la cabaña de la CAPV. Com-prende unos 300.000 animales y presenta dos variedades, la de cabeza oscura conocida comoLatxa Cara Negra (LCN) con un porcentaje aproximado del 55% y la de cabeza rubia llama-da Latxa Cara Rubia (LCR) representada en un 39%. Asimismo, existe una segunda raza muysimilar a la LCR denominada Carranzana cuya población supone un 6% y su distribuciónqueda restringida al territorio de Carranza en Bizkaia.

Para obtener una muestra representativa de la población ovina de la CAPV, se selec-cionaron un número de animales de cada raza y variedad proporcional a su censo (1999) ya su distribución geográfica procedentes de rebaños comerciales. En el caso de animalesLCR debido a que es una variedad que esta básicamente localizada en Gipuzkoa, se eligie-ron rebaños exclusivamente de dicha provincia. Por la misma razón los rebaños de Carran-zana seleccionados procedían de Bizkaia, mientras que los rebaños de LCN pertenecían alas tres provincias. Dentro de cada territorio histórico la selección de los rebaños se hizoproporcionalmente a los censos de cada comarca, y dentro de cada comarca los rebaños seseleccionaron mediante la técnica de números aleatorios. Se decidió recoger sangre deaproximadamente 10 ovejas mayores de un año de cada uno de los 53 rebaños selecciona-


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Figura 3.1. Distribución geográfica de 53 rebaños comerciales seleccionados para el estudio de lasusceptibilidad genética a scrapie. (Mapa del territorio histórico de la CAPV donde aparece represen-tada mediante puntos verdes la localización de cada rebaño)

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dos (8 de Álava, 14 de Bizkaia y 31 de Gipuzkoa, (Figura 3.1) con lo que se obtuvieron untotal de 525 sangres distribuidas de la siguiente manera: 332 LCN, 143 LCR, 50 Carranza-na. Además, se seleccionaron también animales de interés comercial dentro del proceso deselección de ARDIEKIN: 573 machos pertenecientes a ganaderías y al Centro de Selecciónde ARDIEKIN, y 199 madres de corderos que se incorporan al Centro de Selección. Enresumen, se han analizado un total de 1297 sangres de 906 animales LCN, 341 LCR y50 CAR.

3.3. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE GENOTIPADO POR PCR-RFLP

El primer procedimiento desarrollado es el resultado de la combinación y mejora de dosprotocolos previamente descritos [144, 307]. El método descrito por Hunter y cols. en 1994[144], se basa en una amplificación por PCR de un fragmento de 707 pb del gen PrP que in-cluye los tres codones. Posteriormente, este fragmento se digiere con la enzima de restricciónBspHI para determinar los polimorfismos en los codones 136 y 154. Y finalmente, para ana-lizar el codón 171, el mismo producto de PCR se somete a hibridación con sondas específi-cas de alelo marcadas con digoxigenina. El protocolo descrito por Yuzbasiyan-Gurkan y cols.en 1999 [307], comprende dos amplificaciones por PCR y tres digestiones con las enzimas derestricción BspHI, AccI y BslI.

El protocolo desarrollado en este estudio consiste en dos PCRs similares a las descritaspor Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] (denominadas PCR-A y PCR-B) con el mismo progra-ma de ciclos y posterior digestión enzimática. Una de las mejoras introducida consiste en laeliminación del sitio de restricción AccI introducido en la PCR-B con el cebador forward porYuzbasiyan-Gurkan y cols. Este sitio de restricción era generado artificialmente para tener uncontrol positivo de la digestión por AccI. Sin embargo, la localización de esta diana próximaa un extremo del amplicón puede causar digestiones parciales (Figura 3.2). La razón de esasposibles digestiones parciales es que para una correcta digestión por la endonucleasa AccI es

3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS...

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Figura 3.2. Ejemplo de digestión parcial del producto de la PCR-B con la enzima AccI. [Calle 1, pro-ducto de la PCR-B (161 bp) no digerido. Calles 2, 5, 6 y 8, digestiones parciales de muestras QH en171. Calles 3, 4 y 7, digestiones completas de muestras QH en 171. M, marcador de peso molecular25 pb Ladder (Invitrogen, CA, USA)]

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necesaria la presencia de un mínimo de 13 pb a ambos lados del punto de corte y en este casosolo hay 12 pb (5’ - GGCCTTGGTGGT↓CTACATGCT - 3’). Por lo tanto, para evitar pro-blemas en la interpretación de los resultados debidos a digestiones parciales, se diseñó un ce-bador forward perfectamente complementario a la secuencia del gen PrP, desapareciendo asíese sitio de restricción para AccI (Tabla 3.1).


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Tabla 3.1. Secuencias de los cebadores empleados en el protocolo de PCR-RFLP

PCR-A (159 pb) PCR-B (161 pb)

F1 5’-GTGTACTACAGACCCGTGGA-3’ F2 5’-GCCTTGGTGGCTACATGCT-3’R1 5’-CATTTGCTCCACCACTCGCT-3’ R2 5’ -TGCACAAAGTTGTTCTGGTTAGTA-3’

Cada reacción de PCR (15 ml y 25 ml de volumen de reacción para la PCR-A y PCR-B,respectivamente) incluye 100 ng de DNA molde, 0.1 mM de cada cebador, 150 mM dedNTPs, 1.5 mM de Mg++ y 1 U de Taq polimerasa. Ambas reacciones se someten al mismoprograma de PCR: después de una desnaturalización a 94°C durante 4 min, se repiten 35 ci-clos de una etapa a 94°C durante 30 seg, otra de 30 seg a 57°C y otra de 30 seg a 72°C.

A continuación, los productos de PCR se someten a digestión enzimática con endonu-cleasas que reconocen los polimorfismos del gen PrP en estudio (Figura 3.3). Para determi-nar los polimorfismos de los codones 136 y 154, el producto de la PCR-B es digerido conBspHI (T↓CATAG) a 37°C durante 2 horas al igual que en el protocolo de Hunter y cols.[144]. En el caso del codón 136 esta enzima corta la secuencia nucleotídica que codifica parael aminoácido V y no corta en caso de existir A. Para el codón 154, BspHI corta el productode PCR en caso de existir H y no corta si hay R. Los polimorfismos para el codón 171 se de-terminan de la misma forma que Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] mediante la combinación

Figura 3.3. Diagrama comparativo de tres protocolos de PCR-RFLP para el genotipado del gen PrP.[(*) Amplicón de la PCR-B difiere en 1 pb en tamaño debido a una modificación del cebador forward]

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de los resultados obtenidos por la digestión del producto de la PCR-A con BslI(CCNNNNN↓NNGG) a 55°C durante 2 horas y del producto de la PCR-B con AccI(GT↓MKAC) a 37°C durante 2 h. La enzima BslI corta la secuencia que codifica para R perono así en el caso de Q o H, mientras que AccI corta R y Q pero no H. Los fragmentos de res-tricción generados son separados por electroforesis en un gel de agarosa al 3%. La detecciónde los fragmentos se realiza por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/mg) y fotografiado bajoluz UV. Los patrones de bandas generados tras la digestión enzimática se muestran en la Fi-gura 3.4 y su interpretación se describe en la Tabla 3.2.


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Figura 3.4. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos generados por la digestión enzimáti-ca de los productos de las PCRs A y B con tres endonucleasas para la determinación de los polimor-fismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP. [Calles 1 y 12, producto de la PCR-B (161 bp) nodigerido. Calle 8, producto de la PCR-A no digerido (159 bp). Calles 2-7, patrones de digestión pro-ducidos por BspHI para determinar los polimorfismos en los codones 136 y 154: calle 2, AR/AR; ca-lle 3, AH/AH; calle 4, VR/VR; calle 5, AR/AH; calle 6, VR/AR y calle 7, VR/AH. Calles 9-11 y 13-15, patrones de restricción generados con las enzimas BslI y AccI respectivamente, empleados paradeterminar los polimorfismos en el codón 171: calle 9, RR; calle 10, RQ o RH; calle 11, QQ, HH oQH; calle 13, RR, QQ o RQ; calle 14, HH y calle 15, RH o QH. M, marcador de peso molecular 25pb ladder (Invitrogen, CA, USA)]

Tabla 3.2. Interpretación de los patrones generados en el protocolo de PCR-RFLP para la determi-nación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 de gen PrP

PCR-B PCR-A PCR-ACodones

Tamaño (pb) Callea Codón 171 Tamaño (pb) Callea Tamaño (pb) Callea

136, 154BspHI BslI AccI

AR/AR 162 2 RR 81, 58, 20b 9 136, 28b 13AH/AH 80, 82 3 QQ 101, 58 11 136, 25b 13VR/VR 132, 30 4 HH 101, 58 11 161 14AR/AH 162, 80, 82 5 RQ 101, 81, 58, 20b 10 136, 25b 13VR/AR 162, 132, 30 6 RH 101, 81, 58, 20b 10 161, 136, 25b 15VR/AH 132, 80, 82, 30 7 QH 101, 58 11 161, 136, 25b 15

a El número de calle se corresponde con la numeración de calles en la Figura 3.4. b Bandas no siempre detectables en un gel de agarosa al 3%.

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3.4. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE GENOTIPADO POR PCR A TIEMPOREAL

Este protocolo se basa en 4 reacciones de PCR a tiempo real empleando 7 sondas fluo-rogénicas TaqMan MGB. El diseño de los cebadores y las sondas cuyas secuencias se mues-tran en la Tabla 3.3, ha sido realizado con ayuda del software Primer Express v2.0 (AppliedBiosystems, CA, USA). Para la determinación de los polimorfismos en los codones 136 y154 se requiere una sola reacción de PCR para cada uno. La discriminación de las variantesalélicas en 171 se resuelve por medio de la combinación de dos reacciones, una para identi-ficar los polimorfismos R/Q y otra para R/H. Cada ensayo de PCR se compone de dos son-das TaqMan MGB correspondientes a los dos polimorfismos en estudio a una concentraciónde 250 nM cada una, además de dos cebadores a 900 mM cada uno y el reactivo TaqManUniversal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Las reacciones se llevan acabo en placas de 96 pocillos donde se analizan 92 muestras. Además se incluyen un controlnegativo de PCR y tres controles correspondientes a cada una de las combinaciones alélicas.Tras realizar una mezcla de todos los reactivos comunes manualmente, ésta se reparte en laplaca con ayuda del robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, CA, USA) y finalmente se aña-de el DNA molde.


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Tabla 3.3. Cebadores y sondas diseñadas para la detección de los polimorfismos del gen PrP porPCR a tiempo real

Codón Cebadores Sonda TaqMan MGB*

136 136F: 5’-CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3’ Sonda A: FAM 5’-TCATGGCACTTCC-3’136R:5’-ATAGTAACGGTCCTCATAGTCATTGC-3’ Sonda V: VIC 5’-CTCATGACACTTCC-3’

154 154F: 5’-CATGAGCAGGCCTCTTATACATTTT-3’ Sonda R: FAM 5’-CCGTTACTATCGTGAAAA-3’154R: 5’-GATCCACTGGTCTGTAGTACACTTGG-3’ Sonda H: VIC 5’-TACTATCATGAAAACATG-3’

171 171F: 5’-GTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGA-3’ Sonda R: FAM 5’-CCAGTGGATCGGTATA-3’171R: 5’-TGTTGACACAGTCATGCACAAAG-3’ Sonda Q: VIC 5’-ACCAGTGGATCAGTATA-3’

Sonda H: VIC 5’-TGGTTACTATAATGATCC-3’

a MGB Minor groove binding. A, Alanina; V, Valina; R, Arginina; H, Histidina; Q, Glutamina. F, cebador forward; R,cebador reverse.

Las bases correspondientes a los SNPs se muestran subrayadas

Las reacciones de PCR se llevan a cabo en el equipo ABI Prism 7000 (Applied Biosys-tems, CA, USA) bajo las condiciones universales: 95°C durante 10 min y 40 ciclos a 95°Cdurante 15 s y 60°C 1 min. La normalización de la señal fluorescente se realiza mediante elempleo del fluoróforo pasivo de referencia ROX incluido en el tampón de la reacción, y la in-terpretación de los resultados se lleva a cabo mediante la opción de discriminación alélica delsoftware ABI Prism 7000 y posterior comprobación de las curvas de amplificación. La inter-pretación de las curvas y gráficas obtenidas en cada reacción se explica en las Figura 3.5 yFigura 3.6.

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Figura 3.5. Interpretación de las curvas de amplificación y diagramas de discriminación alélica parala detección de polimorfismos en los codones 136 (A/V) y 154 (R/H) del gen PrP mediante sondasTaqMan MGB. (Figuras a-c, e-g, curvas de amplificación de los ensayos 136 y 154, respectivamente.Figuras d y h, diagramas de discriminación alélica para los ensayos 136 y 154, respectivamente. NTC,control negativo)

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Figura 3.6. Curvas de amplificación y diagramas de discriminación alélica para la detección de po-limorfismos en los codones 171 (R/Q/H) del gen PrP mediante sondas TaqMan MGB. (Figuras a-c,e-g, curvas de amplificación de los ensayos 171 (R/Q) y 171 (R/H), respectivamente. Figuras d y h,diagramas de discriminación alélica para los ensayos 171 (R/Q) y 171 (R/H), respectivamente. NTC,control negativo)

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3.5. VALIDACIÓN DE LAS TÉCNICAS

Con el fin de confirmar los resultados obtenidos y detectar otros posibles polimorfis-mos en los codones estudiados, se han secuenciado 34 muestras correspondientes a una mues-tra de cada una de las combinaciones alélicas además de 25 muestras genotipadas como QQen el codón 171 por las dos técnicas. Para ello, se amplifica un fragmento de 270 pb con loscebadores F2 y R1 usando las condiciones de ciclado descritas en el apartado 3.3. Los pro-ductos de PCR se purifican y posteriormente se envian a un servicio de secuenciación auto-mática. Además, se han analizado 160 muestras por ambas técnicas (PCR-RFLP y PCR atiempo real). Los resultados obtenidos de la secuenciación y el análisis paralelo por las dostécnicas confirmaron los resultados obtenidos por ambos métodos. Asímismo no se ha ob-servado ninguna mutación adicional en los codones estudiados ni en las regiones adyacentes.

3.6. DISTRIBUCIÓN DE GENOTIPOS EN RAZAS AUTÓCTONAS DE LA CAPV

La frecuencia genotípica de las razas Latxa y Carranzana se ha obtenido por uno de losdos métodos descritos anteriormente (848 muestras por PCR-RFLP y 289 por PCR a tiemporeal), o por ambas técnicas (160 muestras). La distribución genotípica obtenida se presenta enla Tabla 3.4. Las frecuencias alélicas y genotípicas entre las dos variedades de raza Latxa hansido comparadas estadísticamente mediante Chi cuadrado con el software EpiInfo 6 (CDC,Atlanta, USA). Del mismo modo se han contrastado las frecuencias alélicas y genotípicas en-tre hebras y machos.

Raza Latxa

El análisis genético de 1247 animales de raza Latxa ha revelado la presencia de los 5alelos descritos para los codones 136, 154 y 171. El alelo ARQ ha sido el más frecuente(70.3%), seguido del ARR (22.5%) y ARH (3.9%). El alelo asociado con una alta susceptibi-lidad VRQ se ha presentado en un 2.5% de los animales y el restante 0.8% ha presentado elalelo AHQ. El análisis estadístico ha revelado diferencias estadísticas (p<0.05) entre la va-riedad LCN y LCR para los alelos ARQ, ARH y VRQ. Se han encontrado 14 genotipos dife-rentes de los cuales el genotipo AHQ/AHQ ha estado representado por un solo animal de lavariedad LCR. El genotipo más frecuente en la raza Latxa ha sido el ARQ/ARQ (49.3%), se-guido del ARR/ARQ (32.6%) y ARH/ARQ (5.8%). Se han encontrado diferencias significa-tivas (p<0.05) entre las dos variedades de raza Latxa para los genotipos ARR/ARH,ARH/ARH, AHQ/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ. Cuando estos genotipos se agrupan por sugrado de susceptibilidad según la clasificación UK-NSP [72], la prevalencia del grupo de ma-yor riesgo denominado Tipo 5 (ARQ/VRQ, ARH/VRQ y VRQ/VRQ), ha sido significativa-mente menor en LCN (2.9%) que en LCR (5.0%). La frecuencia genotípica asociada a bajoriesgo, Tipo 1 (ARR/ARR), ha sido similar en ambas variedades, LCN (5.1%) y LCR (4.7%).Las diferencias de distribución de alelos y genotipos entre machos y hembras no han sido sig-nificativas (p>0.05).


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Raza Carranzana

El estudio genético de la raza Carranzana ha sido realizado en una muestra de 50 hem-bras pertenecientes a 5 rebaños. El análisis de los polimorfismos ha revelado la presencia detodos los polimorfismos analizados para los codones 136 (A/V) y 171 (R/Q/H), a diferenciadel codón 154 donde solo se ha observado uno de los dos polimorfismos descritos (R/H), elaminoácido R. El alelo mas frecuente ha sido el ARQ (62.0%) seguido del ARR (25.0%), ARH(10.0%) y VRQ (3.0%). Las combinaciones alélicas han dado lugar a 7 genotipos diferentessiendo el ARQ/ARQ (38.0%) el genotipo más frecuente, seguido por el ARR/ARQ (30.0%) yAHQ/ARQ (14.0%). Aunque el número de animales analizados ha sido bajo, no se han en-contrado animales susceptibles VRQ/VRQ dentro de esta muestra de raza Carranzana, mien-tras que el genotipo resistente ARR/ARR ha estado presente en un 6.0% de los animales.


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Tabla 3.4. Distribución de genotipos en las razas autóctonas de la CAPV: LCN, LCR y Carranzana

Tipo a Genotipo LCN LCR Latxa CarranzanaN (%) N (%) N (%) N (%)

1 ARR / ARR 46 (5.1) 16 (4.7) 62 (5.0) 3 (6.0)

2 ARR / AHQ 4 (0.4) 1 (0.3) 5 (0.4) –ARR / ARH 5 (0.6) 6 (1.8) 11 (0.9) 3 (6.0)ARR / ARQ 304 (33.6) 102 (29.9) 406 (32.6) 15 (30.0)

3 AHQ / AHQ – 1 (0.3) 1 (0.1) –AHQ / ARH 2 (0.2) – 2 (0.2) –AHQ / ARQ 9 (1.0) 2 (0.6) 11 (0.9) –ARH / ARH – 3 (0.9) 3 (0.2) –ARH / ARQ 34 (3.8) 39 (11.4) 73 (5.8) 7 (14.0)ARQ / ARQ 468 (51.7) 146 (42.8) 614 (49.3) 19 (38.0)

4 ARR / VRQ 7 (0.8) 8 (2.3) 15 (1.2) 1 (2.0)

5 AHQ / VRQ – – – –ARH / VRQ 4 (0.4) 1 (0.3) 5 (0.4) –ARQ / VRQ 21 (2.3) 15 (4.4) 36 (2.9) 2 (4.0)VRQ / VRQ 2 (0.2) 1 (0.3) 3 (0.2) –

Total 906 (100.0) 341 (100.0) 1247 (100.0) 50 (100.0)

a Grupos de riesgo según la clasificación UK-NSP [72] de menor riesgo Tipo 1 a mayor riesgo Tipo 5.N, número de animales

3.7. DISCUSIÓN

El análisis de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP en ovinopuede realizarse mediante diferentes protocolos según las necesidades de cada laboratorio. Elpresente trabajo describe dos nuevos protocolos, uno más laborioso pero que requiere menos

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equipamiento (PCR-RFLP) y un segundo método más rápido y simple pero que requiere unainversión inicial en equipamiento (PCR a tiempo real).

El primer protocolo surge de la combinación de dos protocolos previamente descritos yestá basado en la técnica de PCR-RFLP. Este protocolo incorpora una mejora en el diseño delos cebadores descritos por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] para eliminar problemas de in-terpretación posteriores. Además, mientras estos autores necesitan cuatro reacciones de PCRpara la determinación de los polimorfismos en los tres codones, el nuevo protocolo consta úni-camente de dos PCRs gracias a al empleo de una enzima utilizada por Hunter y cols. [144].

Todo protocolo basado en la técnica de PCR-RFLP puede presentar un pequeño incon-veniente. Mientras una digestión indica la presencia de la diana de restricción en la secuen-cia analizada, un resultado negativo, es decir, la ausencia de diana de restricción, puede es-conder una mutación en la secuencia reconocida por la endonucleasa que puede estarlocalizada en la posición en estudio o en otra base de la región adyacente. En esta circuns-tancia, se produciría una interpretación incorrecta. En nuestro caso hay que tener presente laposibilidad de la presencia de K en el codón 171 descrito en algunas razas ovinas mediterrá-neas [277]. La presencia de este polimorfismo daría lugar a la falta de digestión y por tantoeste resultado se interpretaría como Q en vez de K. Sin embargo, los resultados obtenidos porsecuenciación y el análisis en paralelo de muestras por las dos técnicas sugieren la ausenciade estas mutaciones adicionales, así como del alelo K en 171 dentro de las razas ovinas au-tóctonas de la CAPV.

El segundo protocolo desarrollado en el presente trabajo es rápido, poco laborioso ypermite analizar un gran número de muestras. Hay que tener en cuenta que todo el procesopuede ser automatizado con el empleo de un robot, lo cual permite analizar hasta 92 muestrasde sangre en una jornada de trabajo de 8 horas. La PCR a tiempo real es una técnica que per-mite determinar polimorfismos de una sola base usando sondas marcadas con fluorescencia.Para este protocolo se han empleado sondas TaqMan MGB que aumentan la especificidad dela hibridación en ensayos de discriminación de SNPs. Los resultados se obtienen directa-mente después de 4 reacciones de PCR a tiempo real sin necesidad de geles de agarosa, dis-minuyendo de este modo el tiempo de obtención de los resultados. Sin embargo este proto-colo requiere una alta inversión inicial en la adquisición de un equipo altamente sofisticadocomo es la PCR a tiempo real. Asimismo, los reactivos pueden resultar caros, sin embargo, elvolumen final de las reacciones pueden reducirse para abaratar el coste final. En este estudiose han conseguido reducir estos volúmenes a 5 µl para las reacciones de los codones 136 y154, y a 20 µl para las dos reacciones del codón 171 sin que esto suponga una disminuciónde la fluorescencia final y consecuentemente una difícil interpretación de los resultados. Estatécnica proporciona unos resultados muy precisos y reproducibles y es recomendable para la-boratorios de diagnóstico que necesiten procesar un número relativamente alto de muestras.Cabe destacar que recientemente y con posterioridad al trabajo publicado con los resultadospresentados en este capítulo [96], se ha publicado un nuevo método muy similar basado en laPCR a tiempo real. El nuevo protocolo se ha servido de la capacidad que tienen los nuevosequipos de PCR a tiempo real de leer más de 3 colores diferentes. De este modo se emplean


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7 sondas fluorogénicas ASO y dos reacciones de PCR a tiempo real para determinar los poli-morfismos en los codones 136, 154 y 171 [282].

Desde que se conoce la asociación entre los polimorfismos del gen PrP y la suscepti-bilidad frente a scrapie se han genotipado un gran número de razas ovinas en todo el mundo.A pesar de existir una gran variabilidad en la distribución de los genotipos según la raza, sesigue aceptando que los animales con ciertos genotipos tienen mayor predisposición a desa-rrollar scrapie clínico mientras que otros tienen menos probabilidades de padecer la enfer-medad. Con relación a la raza Latxa, los primeros datos sobre frecuencias genotípicas del genPrP fueron publicados con anterioridad a este trabajo en el año 2002 por Hurtado y cols.[147], sin embargo, la técnica empleada en dicho estudio no permitía la discriminación entrelos polimorfismos Q y H del codón 171 y ambos fueron considerados como Q. Con los pro-tocolos descritos en este trabajo se solventa este problema revelando la presencia de H en 171en forma de alelo ARH y presente en un 3.9% de los animales analizados. Asimismo este es-tudio ha revelado una alta variabilidad genética en la raza Latxa con 8 nuevos genotipos au-mentando la variabilidad genética de esta raza a un total de 14 genotipos. El genotipo salva-je ARQ/ARQ incluido en el grupo de animales con poco resistencia genética a scrapie [72]fue el genotipo más frecuente en los individuos analizados (49.3%). En comparación conotras razas como la Suffolk, Texel, Charollais o la German Ehite Headed Mutton [83, 202],la raza Latxa presenta un mayor porcentaje de este genotipo. El segundo genotipo más fre-cuente fue el ARR/ARQ, asociado a baja susceptibilidad frente a scrapie a nivel individualpero que a su vez presenta diferentes grados de susceptibilidad si tenemos en cuenta que pue-de segregar el alelo ARQ. Por otro lado, los genotipos asociados con muy alto riesgo comoson el ARQ/VRQ y VRQ/VRQ presentaron bajas frecuencias (2.9% y 0.2%, respectivamen-te). La frecuencia de H en 171 dentro de la raza Latxa es comparable a otras razas estudiadascomo la Texel, Belclare, Galway y Suffolk donde este polimorfismo se presenta en una bajaproporción de animales [83, 202]. El nivel de resistencia o susceptibilidad asociada al aleloARH no esta claro aunque parece ser que H en 171 presenta recesividad por lo que la sus-ceptibilidad del animal dependerá del otro alelo [86].

Las variedades LCN y LCR no solo se diferencian fenotípicamente, también presentandiferencias (p<0.05) en la proporción de determinados genotipos (ARR/ARH, ARH/ARH,AHQ/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ). En general, podemos decir que individuos LCN pre-sentan una ligera mayor resistencia genética a desarrollar scrapie que la variedad LCR. Estasdiferencias pueden compararse con las frecuencias genotípicas existentes en la raza Manechantes de que se implantasen los sistemas de mejora genética frente a scrapie. En esta raza lavariedad Manech Cara Negra (similar a LCN) es genéticamente más resistente que la varie-dad Manech Cara Rubia (similar a LCR). Cabe destacar que la proporción del alelo ARR esde un 50.8% en los animales Manech Cara Negra en comparación con el 17.1% en ManechCara Rubia [131], variedad donde se concentran la mayoría de los animales con scrapie.

Este trabajo analiza por primera vez los polimorfismos del gen PrP en la raza Carran-zana en la que solo se identificaron 7 genotipos, probablemente debido al tamaño de la mues-tra. Sin embargo, el número de animales analizados fue representativo de esta población y se


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ajusta a las condiciones que determina la Unión Europea (UE) para el estudio de los poli-morfismos del gen PrP en una raza pura [51]. Los resultados mostraron que el 42.0% de losanimales presentó uno de los genotipos asociados a bajo riesgo (ARR/ARR, ARR/ARQ yARR/ARH), el 54.0% presentó un genotipo asociado a baja resistencia frente a scrapie(ARH/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ) y el 4.0% presentó un genotipo asociado con alto ries-go (ARQ/VRQ) [72]. Un 10.0% de los individuos presentó el alelo ARH, un alto porcentajeen comparación con el 3.9% de la raza Latxa. Sin embargo, cabe destacar que todos los ani-males con este alelo pertenecían a dos rebaños. Ninguno de los animales analizados presen-tó el genotipo de alto riesgo VRQ/VRQ.

Los análisis genéticos realizados en el presente trabajo muestran como las razas Latxay Carranzana tienen un riesgo genético relativamente alto a desarrollar scrapie, sin embargo,la incidencia de la enfermedad no parece ser un problema. La baja incidencia de scrapie (30casos hasta Junio de 2005) hace pensar en la existencia de factores ambientales tales comouna escasa presencia del agente, la existencia de otras cepas, el manejo de los animales o enfactores ecológicos asociados con la transmisión del agente patógeno. Hasta el momento noexiste ningún método que permita dar un diagnóstico fiable del estatus de los animales invivo. Una de las estrategias más empleadas es la detección del agente patógeno en el sistemalinfoide como el tercer párpado, la amígdala o el ganglio retrofaringeo. De este modo se pue-de conseguir detectar scrapie en animales que no presentan síntomas clínicos de la enferme-dad. Sin embargo, este método además de ser difícilmente aplicable en un programa de vigi-lancia aplicado a la totalidad de la población, no es 100% fiable ya que la vía de diseminacióndel prión, así como las diferentes presentaciones de la enfermedad pueden dar lugar a falsosnegativos. Con todo esto, la estrategia del genotipado sigue siendo una buena forma de pre-vención en base al conocimiento del riesgo individual y el riesgo de transmisión del scrapie.El riesgo individual está determinado por la susceptibilidad o resistencia a scrapie [72], peroel riesgo de transmisión parece estar estrechamente ligado al genotipo de la progenie. Diver-sos estudios han demostrado que la transmisión vertical se puede dar en el momento del par-to por contacto con la placenta infectada o a través del útero [7, 278]. Sin embargo, parece serque los priones solo pueden acumularse en la placenta si el genotipo del feto es ARQ/VRQ,VRQ/VRQ, o posiblemente ARQ/ARQ, y no así en el caso de fetos con el alelo ARR [7, 278].

Los resultados presentados en este trabajo han sido empleados para el diseño de un hi-potético programa de selección y mejora genética que permita obtener una cabaña ovina enla que todos los animales presenten el genotipo resistente ARR/ARR. De este modo, se handesarrollado dos modelos, el primero más restrictivo en el que serían necesarios entre 6 y 10años y supondría una pérdida en los valores productivos. El segundo sería más laxo y tendríauna duración de entre 12 y 15 años reduciéndose así las perdidas de caracteres productivos.Hasta el momento se ha llevado a cabo una selección más suave consistente en eliminar losmachos portadores del alelo VRQ.

Cabe destacar que la aparición de casos de scrapie en animales con genotipos asocia-dos a bajo riesgo [18, 47, 206], ha reabierto el debate sobre la utilidad de la selección de ani-males resistentes ARR/ARR y la política de mejora genética frente a scrapie.


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En este trabajo se describe un protocolo de PCR-RFLP que puede ser usado en cual-quier laboratorio y una segunda alternativa para el genotipado de los polimorfismos del genPrP (PCR a tiempo real) que requiere una alta inversión pero que puede ser automatizada paraanalizar un gran numero de muestras en poco tiempo de manera rentable. Estos métodos sehan aplicado al análisis de los polimorfismos del gen PrP en 1297 animales de dos razas pu-ras autóctonas de la CAPV, entre los que se incluyen los machos empleados para insemina-ción artificial en el Programa de Mejora desde 1998. Sin embargo, dada la baja incidencia descrapie en estas razas la selección genética que se ha seguido ha sido muy suave.


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Capítulo 4

ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENESENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN

GÉNICA EN OVINO

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4.1. INTRODUCCIÓN

El análisis de la expresión de los genes tiene una gran importancia en numerosos cam-pos de la investigación biomédica. El conocimiento de los patrones de expresión génica den-tro de la complejidad de los procesos biológicos proporciona un mayor conocimiento de lasbases moleculares de las enfermedades y puede contribuir al desarrollo de fármacos muy es-pecíficos o a la mejora del diagnóstico de una enfermedad. Para ello, se han desarrollado di-versos métodos que permiten medir la cantidad de mRNA con mayor o menor exactitud.

La técnica de Northern blot ha sido una de las herramientas clásicas más empleadaspara el análisis de la expresión génica. Esta técnica, basada en el análisis por densitometríade las bandas generadas tras la electroforesis e hibridación del mRNA con sondas marcadases larga y tediosa, por lo que no permite el análisis de un número elevado de muestras. Ade-más, requiere partir de grandes cantidades de RNA y en cualquier caso no permite una cuan-tificación muy exacta, por lo que su utilidad para medir pequeños cambios de expresión esmuy limitada. Otra de las metodologías desarrolladas para medir la expresión génica es lade los biochips, arrays o microarrays, que han permitido un salto cuantitativo y cualitativodebido a la posibilidad de analizar el comportamiento de miles de genes de forma simultá-nea [256]. Por otro lado, la técnica de RT-PCR a tiempo real ofrece una gran reproducibili-dad, alta sensibilidad y resultados muy precisos. En la actualidad, la PCR a tiempo real seemplea como técnica de confirmación de los resultados obtenidos por microarrays. Sin em-bargo, es una técnica muy compleja que puede presentar varios problemas derivados de susventajas. Existen dos estrategias de cuantificación por PCR a tiempo real: la cuantificaciónabsoluta y la relativa. La cuantificación absoluta permite conocer el número absoluto de mo-léculas de mRNA existentes por comparación con una recta patrón externa [49]. En expre-sión relativa se obtiene un ratio a partir de la expresión del gen problema y la expresión delllamado gen de referencia o housekeeping. El empleo de estos genes de referencia permiteobtener resultados más fiables que en la cuantificación absoluta debido a que se tienen encuenta artefactos inherentes al procesado de las muestras. Sin embargo, esta fiabilidad en losresultados va a depender de la selección de los genes de referencia. Con frecuencia los ge-nes HK se obtienen de la literatura y se emplean en diferentes condiciones experimentalessin tener en cuenta que ciertas condiciones pueden inducir una alteración en la expresión delgen HK [267]. Un cambio indetectable en la expresión de este gen deriva en resultados erró-neos que pueden llevar a conclusiones falsas. Para evitar esto, previo a cualquier experi-mento de cuantificación relativa se ha de realizar un análisis de la estabilidad de la expre-sión de los genes HK que se quieren emplear en la normalización en unas condicionesconcretas. Además, es también recomendable normalizar la expresión de un gen problemapor medio de más de un gen de referencia [216, 283]. De este modo, las alteraciones debi-das a posibles artefactos quedan solventadas más eficazmente que si se emplea un único gende referencia.

Los análisis de expresión génica realizados en ovino se han basado en la técnica deNorthern blot y en la RT-PCR a tiempo real. Sin embargo, muchos de los trabajos basados encuantificación relativa han empleado un solo gen de referencia sin previa comprobación de

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su estabilidad [117, 124, 168]. Por lo tanto, el estudio de la estabilidad de algunos genes HKen ovino aportaría información muy útil para cualquier estudio de expresión relativa. En estesentido, en este capítulo se analizará la estabilidad de la expresión de genes endógenos en seistejidos ovinos de animales sanos y de animales con scrapie clínico con el fin de encontrar losmejores genes de referencia en cada situación.

4.2. SELECCIÓN DE LAS MUESTRAS

El estudio de estabilidad de la expresión de los genes HK seleccionados se ha realiza-do en dos grupos de muestras: el grupo A, formado exclusivamente por animales sanos, y elgrupo B, formado por los animales del grupo A al que se le han añadido animales con scrapieclínico.

El grupo A se compone de 22 ovejas sanas de raza Latxa con distintos genotipos y conedades comprendidas entre 3 y 12 años. En el grupo B se incluyeron además cuatro hembrasde raza Latxa con scrapie clínico pertenecientes a un brote ocurrido en Diciembre de 2003.Los animales mostraban síntomas clínicos de un estadio tardío de scrapie consistentes en in-cordinación de las patas traseras, caídas, respuesta exagerada a estímulos externos, rechinarde dientes, temblores y pérdida de peso. Los cuatro animales presentaban el genotipoARQ/ARQ, y su edad era de 3, 4, 5 y 8 años.

Todos los animales incluidos dentro del grupo de los sanos fueron negativos al test rá-pido de detección de priones Platelia®BSE (Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra deóbex, mientras que los animales con scrapie clínico dieron positivo. De cada animal se obtu-vo asépticamente una muestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo,óbex, bazo, íleon terminal y nódulo linfático mesentérico (NLM). Todas las muestras fueronconservadas a –80°C para preservar el RNA en condiciones óptimas hasta su posterior ex-tracción.

4.3. EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE cDNA

Las muestras de tejido fueron homogeneizadas mecánicamente con Ribolyzer (Hybaid,Ashford, UK) y el RNA total obtenido fue aislado con el RNasy Protect Mini kit (Qiagen, Hil-den, Germany). Posteriormente el RNA total se trató con DNasa I (Ambion, TX, USA) paraevitar la amplificación del DNA genómico y el cDNA se sintetizó usando hexámeros al azary la transcriptasa reversa MultiScribeTM de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ap-plied Biosystems, CA, USA). Asimismo se comprobó la eficiencia del tratamiento con DNa-sas mediante el análisis de muestras RT negativas. El cDNA obtenido de la retrotranscripciónse diluyó para obtener una cantidad suficiente que nos permitiera usarlo en sucesivas ampli-ficaciones por PCR a tiempo real. Todas las alícuotas de cDNA fueron conservadas a –20°Chasta su posterior procesado.


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4.4. DISEÑO DE CEBADORES

Se seleccionaron genes pertenecientes a grupos funcionales diferentes con el fin de re-ducir las posibilidades de que existiera co-regulación entre ellos. De este modo se diseñaroncebadores para ocho genes HK usados comúnmente en la normalización de la expresión gé-nica: el gen de la b-actina, (ACTB), tirosina 3-monooxigenasa (YWHAZ), proteína riboso-mal L19 (RPL19), gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa (G6PDH), succinato deshidrogenasa (SDHA), hidroximetilbilano sintasa(HMBS) y ubiquitina C (UBC) (Tabla 4.1).

4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO

103

Tabla 4.1. Funciones principales de los genes HK seleccionados

Gen Función

ACTB Proteína estructural del citoesqueleto.

YWHAZ Transducción de señales por unión a residuos fosforilados de serinas de múltiples moléculasseñalizadoras.

RPL19 Componente estructural de la subunidad ribosómica 60S.

GAPDH Oxidoreductasa en la glucólisis y gluconeogénesis.

G6PDH Oxidoreductasa al inicio de la ruta de las pentosas fosfato.

SDHA Transportador de electrones el ciclo de Krebs y en la cadena respiratoria.

HMBS Síntesis del grupo hemo y metabolismo de porfirinas.

UBC Degradación de proteínas.

Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región dentro de un mismo exónusando el software Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA) y teniendo en cuenta losrequerimientos necesarios para trabajar con PCR a tiempo real y SYBR Green. Para el dise-ño de los cebadores de los genes ACTB, GAPDH, RPL19 y G6PDH se analizaron secuenciasovinas depositadas en la base de datos pública GenBank. En el caso de los genes SDHA,YWHAZ, HMBS y UBC no existían secuencias publicadas de ovino por lo que los cebadoresse diseñaron en regiones muy conservadas tras analizar múltiples alineamientos de estos ge-nes en diferentes especies animales (Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus y Homosapiens) con el programa AlingX (Vector NTI 8.0 suite, Informax Inc., MD, USA). En cual-quier caso, la secuencia bovina sirvió de referencia en caso de presentarse alguna variaciónentre las secuencias comparadas (Figura 4.1 y Figura 4.2). Además de los ya mencionados seseleccionaron otros dos genes para ser evaluados como potenciales genes HK (el gen de laproteína de unión de la TATAbox TBP y el gen de la beta 2 microglobulina B2M) para los cua-les se intentó diseñar cebadores. Sin embargo la comparación de las secuencias de distintosorganismos reveló una muy baja homología entre ellas y dificultad para cumplir los requeri-mientos exigidos para el diseño de cebadores para PCR a tiempo real y el uso SYBR Green.

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104

Figura 4.1. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de un fragmento del gen SDHA de distin-tas especies. [(a) Homo sapiens NM_004168, (b) Rattus norvegicus NM_130428, (c) Mus musculusNM_023281 y (d) Bos taurus NM_174178. Las flechas representan los cebadores diseñados en re-giones muy conservadas para amplificar un fragmento de 90 pb del gen ovino]

Figura 4.2. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de un fragmento del gen YWHAZ de dis-tintas especies. [(a) Homo sapiens NM_003406, (b) Rattus norvegicus NM_013011, (c) Mus muscu-lus NM_011740, y (d) Bos taurus NM_174814. Las flechas representan los cebadores diseñados enregiones muy conservadas para amplificar un fragmento de 120 pb del gen ovino]

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Se evaluaron 3 concentraciones de cebadores (100 mM, 200 mM y 300 mM) y la for-mación de dímeros de cebadores se analizó mediante curvas de disociación (Figura 4.3). Deeste modo, y para los posteriores análisis se emplearon aquellas concentraciones de cebado-res más altas que no presentaron dímeros de cebadores (Tabla 4.2).


105

Figura 4.3. Control de la formación de dímeros de cebador para la PCR del gen GAPDH. [(a), cur-va de amplificación; (b) curva de disociación. 1, PCR de una muestra de cDNA con cebadores a 200mM; 2, 3 y 4, PCRs de controles negativos con 100, 200 y 300 mM de cebadores, respectivamente.Se observó la formación de dímeros de cebadores (Tm de 77.7°C) en los controles negativos cuandola concentración de cebadores fue de 300 mM. Se seleccionó la concentración de 200 mM para la am-plificación del gen GAPDH (Tm de 82.0°C)]

Tabla 4.2. Secuencias de los cebadores y características de los productos de PCR

Gen* Cebador forward 5’→ 3’ Cebador reverse 5’→ 3’ [C] pb Tmt

Tmr

ACTB ATGCCTCCTGCACCACCA GCATTTGCGGTGGACGAT 300 125 85 84.3-84.8

YWHAZ TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCT TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT 100 102 79 78.9-79.4

RPL19 CAACTCCCGCCAGCAGAT CCGGGAATGGACAGTCACA 200 76 83 80.0-80.5

GAPDH ATGCCTCCTGCACCACCA AGTCCCTCCACGATGCCAA 100 76 84 81.9-82.5

G6PDH TGACCTATGGCAACCGATACAA CCGCAAAAGACATCCAGGAT 300 76 81 78.7-78.9

SDHA CATCCACTACATGACGGAGCA ATCTTGCCATCTTCAGTTCTGCTA 200 90 82 81.0-81.7

HMBS CTGCAGCGCATGGGCT CTGACCCACAGCATACATGCA 300 75 86 86.1-86.3

UBC TGCAGATCTTYGTGAAGACTCTGA CCTGGATCTTTGCCTTGACATT 300 75 80 ND

a símbolo del gen: ACTB, b-actina; YWHAZ, tyrosina 3-monooxigenasa isoforma zeta; RPL19, proteína ribosómica L19;GAPDH, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; SDHA, succinatodeshidrogenasa; HMBS, hidroximetilbilano sintasa; UBC, ubiquitina C. [C], concentraciones de ambos cebadores en mM;pb, longitud del amplicón en pb; Tm

t, temperatura de disociación teórica según Primer Express (Applied Biosystems, CA,

USA); Tmr, temperatura de disociación real expresada en rango de temperaturas obtenido según los picos de disociación de

78 muestras; ND, no determinado

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4.5. PCR A TIEMPO REAL

Se tuvo especial cuidado en el diseño de las reacciones de PCR para evitar problemasen la comparación de los resultados entre las distintas muestras. Para ello, todas las muestras(26 animales) correspondientes a un tejido fueron incluidas en la misma placa de 96 pocillosjunto con un control negativo y sometidas a PCR a tiempo real para la amplificación de unúnico gen por triplicado. Cada reacción de PCR se realizó en un volumen final de 10 µl y es-taba compuesta por 10 ng de cDNA, el tampón 2xSYBRGreen (Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA) más la cantidad necesaria de cebadores de acuerdo a la concentración re-querida (Tabla 4.2). Para dispensar la premezcla de la PCR y las muestras de cDNA en lasplacas se empleó el robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA). Todas lasreacciones se llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems,


106

Figura 4.4. Curvas de disociación de los 8 genes HK estudiados. [(a) ACTB; (b) YWHAZ; (c) RPL19;(d) GAPDH; (e) G6PDH; (f) SDHA; (g) HMBS; (h) UBC]

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Foster City, CA, USA) usando las condiciones universales de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ci-clos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación de la reacción de PCR, se aplicó el pro-tocolo de disociación para comprobar la Tm del producto amplificado (Figura 4.4).

El análisis de los resultados de PCR obtenidos para el gen HMBS reveló una alta des-viación de los triplicados de cada muestra así como unos valores de Ct muy altos, por enci-ma de 33, sugiriendo que se trataba de un gen de baja expresión. Por otro lado, la curva de di-sociación del gen UBC mostró un comportamiento extraño al presentar dos máximos defuorescencia, uno correspondiente al fragmento de 75 pb del gen UBC (81.7°C) y otro a79.1°C (Figura 4.4h). El análisis de los cebadores sugirió la existencia de hibridación de loscebadores a regiones en tandem del gen UBC como causa del comportamiento de la curva dedisociación. Por lo tanto, estos dos genes fueron descartados y no se incluyeron en los análi-sis posteriores. De este modo, fueron seis los genes HK amplificados para cada uno de lasmuestras problema. Así, para la obtención de los Cts correspondientes a todas las muestras seanalizaron un total de 2808 reacciones de PCR repartidas en 36 placas (26 animales x tripli-cado x 6 genes x 6 tejidos). Los productos de PCR de los seis genes HK fueron clonados enel vector pCR®4-TOPO usando el TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, CA, USA) y enviadosa un servicio de secuenciación automática. La especificidad de las reacciones de PCR quedóconfirmada mediante el análisis de la Tm de los productos generados, así como por el tama-ño de los mismos en un gel de agarosa al 3% y la comparación mediante Blast de las secuen-cias generadas con las existentes en la base de datos de GenBank. Las nuevas secuencias de-terminadas en este estudio para los genes ovinos SDHA y YWHAZ fueron depositadas enGenBank bajo los números de acceso AY970969 y AY970970, respectivamente. Las secuen-cias ovinas revelaron una similitud del 100% con las secuencias bovinas (Figura 4.1y Figura4.2). Los valores de los Cts fueron obtenidos utilizando el mismo valor de threshold para cadagen, y el valor del Ct para cada muestra se obtuvo calculando la media aritmética de los tri-plicados. A los valores de Ct obtenidos se les aplicó la ecuación Q=E(Ct min – Ct muestra), donde la po-tencia viene dada por la resta entre el menor Ct del grupo de muestras en estudio y el Ct de lamuestra problema. La E indica la eficiencia de la reacción de PCR, la cual fue calculada a par-tir de curva de amplificación por PCR de diluciones seriadas de una misma muestra de cDNAy la ecuación E= [10(-1/pendiente)] [233] (Tabla 4.3). Las eficiencias obtenidas en las distintas am-plificaciones estuvieron próximas al 100%.


107

Tabla 4.3. Parámetros de las rectas patrón de los seis genes endógenos seleccionados

Gen Baseline Threshold Puntosa R2 Pendiente Eficiencia

ACTB 6-20 0.250 6 0.999 -3.597 1.897

YWHAZ 3-18 0.300 6 0.988 -3.335 1.995

RPL19 6-16 0.300 6 0.992 -3.342 1.992

GAPDH 6-16 0.150 8 0.991 -3.485 1.936

G6PDH 6-24 0.300 5 0.965 -3.363 1.983

SDHA 6-26 0.200 7 0.992 -3.643 1.881

a número de puntos de la recta patrón, correspondiente al número de diluciones de cDNA empleadas. R2, coeficiente de determinación.

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4.6. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DE LOS GENES ENDÓGENOS Y SELEC-CIÓN DE GENES PARA LA NORMALIZACIÓN EN TEJIDOS OVINOS

La selección de los genes HK para la normalización de la expresión de un gen proble-ma puede variar con el tipo de muestra, con las condiciones del ensayo y con la edad, entreotros factores. De este modo, se analizó la estabilidad de los genes HK en los dos grupos demuestras de forma independiente: animales sanos (grupo A) y caso-control (grupo B). La es-tabilidad de los genes endógenos se determinó en base al método descrito por Vandesompe-le y cols. [283] y empleando la aplicación MS Excel geNorm 3.3. (ver apartado 2.4). En unprimer abordaje se analizó la estabilidad de los genes HK en el conjunto de muestras de cadagrupo con el fin de encontrar un grupo de genes HK suficientemente estable para compararla expresión de cualquier gen problema entre tejidos. El segundo abordaje analizó la estabi-lidad de los genes HK en el grupo de muestras pertenecientes a un mismo tejido.

Grupo A: Animales sanos

El análisis geNorm para el conjunto de todas las muestras de todos los tejidos mostróunos valores de M y Vn/n+1 superiores a los establecidos como límite [283], por lo que conlos genes analizados en este trabajo no se pudo obtener un grupo común de genes HK para lanormalización de todos los tejidos. Sin embargo el análisis de estabilidad de los genes HK encada tejido por separado permitió identificar distintos grupos de genes HK para la normali-zación en los distintos tejidos. Se obtuvieron unos valores de estabilidad M cercanos al 0.5 locual indicó una estabilidad relativamente buena para estos 6 genes, observándose a su vez,una gran variabilidad asociada al tipo de tejido (Tabla 4.4).

Por ejemplo, el gen G6PDH presentó el menor valor de M en el cerebelo (M=0.457),es decir, resultó ser el gen más estable de los analizados en ese tejido, sin embargo, en el bazoresultó ser el gen menos estable (M=0.569). De este análisis resulta interesante observar


108

Tabla 4.4. Valores de estabilidad de la expresión (M) de 6 genes HK en el grupo A

Tejido ACTB YWHAZ RPL19 SDHA GAPDH G6PDH

Cerebro 0.602 0.757 0.634 0.540 0.510 0.660

Cerebelo 0.477 0.480 0.452 0.518 0.473 0.457

Obex 0.534 0.493 0.593 0.541 0.451 0.479

Bazo 0.436 0.413 0.550 0.427 0.448 0.569

NLM 0.556 0.691 0.542 0.525 0.502 0.624

Íleon 0.757 0.652 0.696 0.610 0.517 0.511

Media 0.560 0.581 0.578 0.527 0.484 0.550

SD a 0.113 0.137 0.084 0.059 0.030 0.081

CV (%) b 20.133 23.669 14.543 11.192 6.268 14.771

NLM, nódulo linfático mesentéricoa Desviación estándar (SD)b Coeficiente de variación (CV)

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cómo el gen GAPDH, usado frecuentemente como gen normalizador, mostró la menor varia-ción del valor de M entre los tejidos analizados (SD=0.030). Por otro lado, otro gen tradicio-nalmente empleado en estudios de expresión, el gen ACTB, mostró una alta desviación es-tándar (SD=0.113) colocándose en penúltima posición detrás del gen YWHAZ con unadesviación estándar de 0.137 (Tabla 4.4).

A continuación, y de acuerdo con la aplicación geNorm, se realizó la exclusión conse-cutiva del gen menos estable para cada tejido observándose como el valor medio de estabili-dad M de los genes restantes iba disminuyendo en mayor o menor medida (Figura 4.5).


109

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

6 5 4 3 2

Número de genes HK

Valo

rm

ed

iod

eM

Cerebro CerebeloObex BazoGLM IleonnnN

Figura 4.5. Media de los valores de la estabilidad de la expresión (M) de los genes disponibles du-rante la exclusión del gen menos estable en 6 tejidos de animales sanos. (NLM, nódulo linfático me-sentérico. A menor valor de M mayor estabilidad)

Tabla 4.5. Series de estabilidad de 6 genes endógenos para 22 animales sanos

Cerebro Cerebelo Obex Bazo NLM Ileon

GAPDH-SDHA G6PDH-ACTB GAPDH-YWHAZ GAPDH-SDHA SDHA-RPL19 GAPDH-G6PDH

ACTB YWHAZ G6PDH ACTB GAPDH SDHA

G6PDH RPL19 SDHA YWHAZ ACTB YWHAZ

RPL19 GAPDH ACTB RPL19 G6PDH RPL19

YWHAZ SDHA RPL19 G6PDH YWHAZ ACTB

Cada serie de estabilidad se muestra ordenada desde el gen de mayor estabilidad en la parte superior al de menor estabilidaden la parte inferior. Los dos primeros genes no se pueden ordenar debido al empleo de ratios para las medidas de estabilidadde la expresión según geNorm. Los genes HK necesarios para una correcta normalización se muestran en negrita.NLM, nódulo linfático mesentérico.

Una vez que los genes HK quedaron ordenados de acuerdo a su estabilidad, el númerode genes HK necesarios para la normalización fue calculado mediante el parámetro Vn/n+1,que indicó la necesidad de emplear seis grupos de genes HK distintos según el tejido (Figura

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4.6 y Tabla 4.5). De éste modo, para una correcta normalización fueron suficientes los tresgenes más estables correspondientes a las muestras de cerebro, cerebelo, obex, bazo y nódu-lo linfático mesentérico, mientras que para muestras de íleon fueron necesarios cuatro.


110

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Cerebro Cerebelo Obex Bazo GLM Ileon

Valo

res

de

Vn

/n+

1

V2/3 V3/4 V4/5 V5/6

��

�

�

�

�

N

Figura 4.6. Determinación del número mínimo de genes HK para la normalización de la expresiónsegún el tejido. (↓, indica el número óptimo de genes HK necesarios en cada tejido. NLM, nódulo lin-fático mesentérico. El número de genes HK a utilizar se establece con el primer grupo de genes cuyovalor de Vn/n+1 es inferior a 0.15)

Grupo B: Caso-control

Para el análisis de estabilidad de los genes HK en este grupo de muestras se eliminó elgen YWHAZ por su supuesta implicación en enfermedades priónicas [14, 139, 279]. El análi-sis geNorm para el conjunto de todas las muestras y tejidos mostró unos valores de M yVn/n+1 superiores a los establecidos para una correcta normalización (datos no mostrados).Sin embargo, el análisis llevado a cabo en cada tejido permitió el empleo de estos genes HKpara la normalización. Se obtuvieron unos valores de estabilidad M cercanos al 0.5 (Tabla4.6) lo cual indicó una estabilidad relativamente buena para estos cinco genes HK aunque asu vez se observó una gran variabilidad asociada a la naturaleza de las muestras. Al igual queen el grupo A, el gen GAPDH, mostró también en este caso la menor variación del valor deM entre los tejidos analizados (SD=0.043), mientras que el gen ACTB mostró la mayor des-viación estándar (SD=0.094) en comparación con los otros genes HK analizados.

La eliminación consecutiva del gen menos estable (Figura 4.7) para cada tejido permi-tió obtener seis series de estabilidad para los genes HK (Tabla 4.7). A continuación y medianteel parámetro Vn/n+1 se determinó el número de genes HK normalizadores para cada tejido,siendo necesarios los tres genes HK más estables en el cerebelo, óbex, bazo y nódulo linfáti-co mesentérico mientras que para el cerebro e íleon hicieron falta cuatro genes (Tabla 4.7 yFigura 4.8).

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111

Tabla 4.6. Valores de estabilidad de la expresión (M) de 5 genes HK en el grupo B

Tejido ACTB RPL19 SDHA GAPDH G6PDH

Cerebro 0.618 0.680 0.517 0.561 0.589Cerebelo 0.466 0.459 0.490 0.461 0.450Obex 0.558 0.584 0.547 0.514 0.495Bazo 0.451 0.527 0.426 0.463 0.567NLM 0.514 0.471 0.444 0.446 0.579Íleon 0.696 0.657 0.600 0.502 0.493

Media 0.551 0.563 0.504 0.491 0.529SD a 0.094 0.093 0.065 0.043 0.057CV (%) b 17.108 16.558 12.867 8.751 10.795

NLM, nódulo linfático mesentéricoa Desviación estándar (SD)b Coeficiente de variación (CV)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

5 4 3 2

Número de genes HK

Va

lor

me

dio

de

M

Cerebro CerebeloObex BazoGLM Ileon0

,

7

N

Figura 4.7. Media de los valores de la estabilidad de la expresión (M) de los genes disponibles du-rante la exclusión del gen menos estable en 6 tejidos de animales sanos y con scrapie. (NLM, nódulolinfático mesentérico. A menor valor de M mayor estabilidad)

Tabla 4.7. Series de estabilidad de 5 genes HK en el grupo caso-control

Cerebro Cerebelo Obex Bazo NLM Ileon

GAPDH-SDHA G6PDH -ACTB GAPDH- SDHA GAPDH- SDHA SDHA-RPL19 GAPDH -G6PDHG6PDH RPL19 G6PDH ACTB GAPDH SDHAACTB GAPDH ACTB RPL19 ACTB RPL19RPL19 SDHA RPL19 G6PDH G6PDH ACTB

Cada serie de estabilidad se muestra ordenada desde el gen de mayor estabilidad en la parte superior al de menor estabilidaden la parte inferior. Los dos primeros genes no se pueden ordenar debido al empleo de ratios para las medidas de estabilidadde la expresión según geNorm. Los genes HK necesarios para una correcta normalización se muestran en negrita.NLM, nódulo linfático mesentérico.

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4.7. DISCUSIÓN

Entre las distintas metodologías desarrolladas para cuantificar la cantidad de mRNA, laRT-PCR a tiempo real proporciona la mayor sensibilidad y exactitud a la hora de estudiar per-files de expresión génica [50, 123]. Se pueden seguir dos protocolos básicos; la cuantifica-ción absoluta y la cuantificación relativa. Esta última, se ajusta más a las necesidades reque-ridas en estudios de expresión ya que el empleo de genes HK de referencia permite tener encuenta posibles artefactos derivados de la preparación de las muestras y por tanto realizar unacomparación entre muestras. En los últimos años se han realizado diversos trabajos en ex-presión génica relacionados con el ovino mediante cuantificación relativa y RT-PCR a tiem-po real, pero en todos ellos se ha seguido la estrategia empleada tradicionalmente de usar unúnico gen de referencia: 18S, GAPDH o ACTB [117, 124, 168]. Sin embargo, incluso muchosde los genes comúnmente considerados como invariables pueden presentar variaciones inte-rindividuales lo suficientemente altas como para provocar una medida errónea cuando la ex-presión del gen problema se normaliza frente a un solo gen HK. Por esta razón se ha de rea-lizar un análisis previo de la estabilidad de los genes HK que se quieren usar, de modo que lasensibilidad de esta técnica va a depender de una correcta elección de los genes HK de refe-rencia. En este estudio se ha seguido el método de Vandesompele y cols. [283] donde se re-quiere un mínimo de tres genes HK para una correcta normalización de la expresión del genproblema. Hay que tener en cuenta que la estabilidad de un gen HK es un concepto relativoen el sentido de que no siempre ha de cumplirse para todas las muestras en estudio. Es decir,no existen genes de referencia universales debido a que el tipo de tejido, la edad, el estado desalud, los tratamientos y muchos otros parámetros pueden alterar la expresión de los mismos.Por esta razón, el análisis de la estabilidad de los genes HK se debe realizar en cada grupo de


112

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Cerebro Cerebelo Obex Bazo GLM Ileon

Va

lore

sd

eV

n/n

+1

V2/3 V3/4 V4/5

�

��

��

�

N

Figura 4.8. Determinación del número mínimo de genes HK para la normalización de la expresiónsegún el tejido. (↓, indica el número óptimo de genes HK necesarios en cada tejido. NLM, nódulo lin-fático mesentérico. El número de genes HK a utilizar se establece con el primer grupo de genes cuyovalor de Vn/n+1 es inferior a 0.15)

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muestras. En este trabajo, el estado de salud y el número de los animales fueron suficientescomo para necesitar que este análisis se realizase por separado en el grupo A y el grupo B.

El primer análisis de la estabilidad de los genes HK realizado en el conjunto de datosno permitió la normalización de la expresión frente a un grupo común de genes HK en nin-guno de los dos grupos de estudio, por lo tanto, la comparación de la expresión de genes pro-blema entre los tejidos seleccionados no fue factible. Este resultado se debe probablemente ala heterogeneidad de las muestras empleadas ya que cada gen puede presentar una regulaciónespecífica de tejido. Esta variabilidad encontrada en muestras de diferente origen es consis-tente con trabajos previos [50, 271, 273, 285] y refleja la existencia de un metabolismo espe-cífico de tejido y/o factores específicos de tejido desconocidos hasta el momento. Cabe des-tacar, un estudio de microarrays realizado sobre la estabilidad de 8.000 genes HK en 60 líneascelulares donde se observó como ninguno de los genes analizados tenía un ratio de expresiónmenor de dos, es decir, todos variaron en mayor o menor medida [240]. Aunque esta hetero-geneidad inherente a la naturaleza de las muestras pueda ser un impedimento, no se descartala posibilidad de que otros genes HK diferentes a los estudiados en este trabajo permitan lanormalización entre tejidos. En un segundo abordaje, se analizó la estabilidad de la expresiónde los mismos genes HK en cada tejido de ambos grupos de muestras. Los resultados confir-maron la variabilidad dependiente de tejido observada en el primer análisis ya que se obser-varon seis series distintas de estabilidad y con ello seis grupos de genes normalizadores de-pendientes del tipo de tejido. Esta variabilidad demuestra una vez más, que no existen genesuniversales válidos para todos los tejidos o tipos celulares.

Cabe destacar la coincidencia del grupo de genes HK (GAPDH, SDHA y ACTB) se-leccionados para la normalización de muestras de cerebro y bazo en el grupo A, lo cual po-dría inducir a pensar en la posibilidad de comparar la expresión normalizada de un gen pro-blema entre ambos tejidos. Sin embargo, dicha comparación no es posible porque el análisisgeNorm con el conjunto de los Cts correspondientes a las muestras de ambos tejidos mostróunos parámetros por encima de los valores umbrales. Por lo tanto, al no mantenerse esta es-tabilidad, podemos sugerir la existencia de un comportamiento diferente dependiente del te-jido. Si comparamos las series de estabilidad de las muestras de animales sanos (eliminan-do el gen YWHAZ) y las series del grupo caso-control, podemos observar que existe una altasimilitud. Todas las series son idénticas, a excepción del cerebro y obex donde solo cambiala posición de dos genes entre sí, los genes G6PDH y ACTB en el cerebro y los genesG6PDH y SDHA en el obex. Asimismo tampoco se observa un cambio sustancial en los va-lores medios de la estabilidad (M) de ambos grupos. Estos resultados sugieren que en estegrupo concreto de muestras, tanto el aumento del tamaño de la muestra de 22 a 26 indivi-duos, así como el estatus de los animales sano/scrapie, no ha repercutido en la expresión deestos seis genes HK.

Los genes GAPDH y ACTB han sido tradicionalmente considerados como genes de ex-presión constante independientemente del tipo de muestras y por tanto han sido ampliamen-te usados como genes de referencia en muchos trabajos [267, 271]. Sin embargo, se ha ob-servado como la expresión de estos genes puede variar de 7 a 23 veces dependiendo del tipo


113

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celular o del tipo de tejido [285]. En el presente trabajo, el gen GAPDH mostró la menor va-riabilidad dentro de los seis tejidos analizados en ambos grupos de muestras. Por otro lado, elgen ACTB ocupó la penúltima posición en el ranking de estabilidad del grupo A y la últimaen el grupo B. Esta inestabilidad del gen ACTB ha sido descrita previamente en un estudio re-alizado con células intersticiales de válvulas del corazón ovino donde se observó como la va-riabilidad de su expresión invalidaba su uso como gen de referencia [306]. El gen SDHA, haresultado tener la mayor estabilidad en muestras de cerebro, bazo y nódulo linfático en am-bos grupos y en muestras de óbex dentro del grupo B. Cabe destacar como en un estudio si-milar a este trabajo realizado en muestras humanas [283], el gen SDHA fue incluido como gende referencia dada su estabilidad en neuroblastos. Por otro lado, se ha empleado como gen dereferencia en muestras del epitelio de la glándula mamaria [168] y en fluido linfático intesti-nal [124]. Por lo tanto, parece ser un gen muy bueno a tener en cuenta como posible gen dereferencia en futuros estudios de expresión en tejidos ovinos. Por otro lado, el gen YWHAZpresentó la mayor desviación estandar y el mayor valor de media de estabilidad M (menos es-table), y a pesar de que se ha empleado como gen de referencia en muestras de cerebelo, óbexe íleon, solo presentó la primera posición en la serie de estabilidad del óbex. Este gen ha sidousado como gen de referencia en muestras de médula ósea y fibroblastos [283].

En resumen, podemos decir que los resultados derivados de este estudio pueden pro-porcionar información de referencia muy útil para posteriores trabajos de expresión génica enanimales sanos o bien para el estudio de la patogenia molecular en scrapie natural. No obs-tante, hay que recordar la necesidad de una evaluación previa sobre la estabilidad de estos ge-nes en cada escenario de estudio.


114

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 114

Capítulo 5

EXPRESIÓN DEL GEN PrP ENTEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON

LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE

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5.1. INTRODUCCIÓN

Las lesiones características y predominantes en el scrapie se presentan en el sistemanervioso en forma de vacuolas desencadas por la presencia de PrPSc que se acumula de formapatológica [167, 223]. Aunque el origen exacto de la enfermedad es controvertido y no estábien determinado, la hipótesis más aceptada es la de la proteína PrPSc como único agente in-feccioso causante de las enfermedades por priones [223]. En este sentido, se ha demostradoque la presencia de PrPc es esencial para el desarrollo del scrapie [26, 35, 105]. Sin embargo,se conoce poco acerca del papel que juega esta proteína celular así como de sus mecanismosde regulación. Como se indica en el apartado 1.7.4, el desarrollo de síntomas clínicos de scra-pie está asociado a ciertos polimorfismos del gen PrP [21, 33, 141] y de acuerdo con el per-fil genético, los animales se agrupan en 5 grupos de riesgo desde el Tipo 1 hasta el Tipo 5 enorden creciente de susceptibilidad a padecer la enfermedad [72]. Esta asociación con el ge-notipo del gen PrP se apoya en numerosos estudios epidemiológicos pero todavía no se co-nocen bien sus bases moleculares. En este sentido, diversos estudios han realizado ensayos invitro para comparar la eficiencia de conversión de PrPc a PrPSc entre los distintos genotipos,demostrando la existencia de bajas eficiencias de conversión para los genotipos resistentes encomparación con los genotipos susceptibles [31, 32, 247]. Sin embargo, la existencia de fac-tores individuales, otros genes o proteínas moduladoras, podrían estar implicados en esta sus-ceptibilidad genética.

En condiciones naturales la vía oral es la ruta de entrada de los priones. Una vez que elagente infeccioso ha entrado en el hospedador, se produce una amplificación inicial en el sis-tema linforeticular seguida de la subsecuente diseminación del prión a múltiples tejidos a tra-vés de la ruta linfática, sangre o sistema nervioso periférico. Esta situación tiene lugar antesde la replicación del prión en el SNC [9, 160, 182, 281]. Teniendo en cuenta que la presenciade PrPc es esencial para el desarrollo del scrapie [26, 35, 105], sería interesante conocer la dis-tribución de la PrPc en tejidos linfoides y nerviosos para entender mejor la patogenia de la en-fermedad. Diversos estudios realizados para conocer la distribución de la PrPc en tejidos ovi-nos, han encontrado como esta proteína se encuentra mayoritariamente en el SNC, seguidode pulmones, músculo esquelético, corazón, útero, timo y lengua [40, 135, 195]. De la mis-ma manera, los niveles de mRNA del gen PrP y por lo tanto los subsecuentes niveles de laproteína, podrían jugar un papel muy importante en la transmisión y el desarrollo de la en-fermedad. En este sentido, un estudio previo realizado en tejidos bovinos mediante cuantifi-cación absoluta, reveló la existencia de altos niveles de transcritos del gen PrP tanto en teji-dos del SNC como en tejidos del sistema linfoide [274], sin embargo, estos resultados debentomarse con cautela debido a los inconvenientes que presenta el método de cuantificaciónempleado.

Con el fin de encontrar evidencias que apoyen la hipótesis de que la expresión del genPrP está ligada a la susceptibilidad genética, se han cuantificado por medio de RT-PCR atiempo real y cuantificación relativa, los niveles de mRNA del gen PrP en animales sanos condistinta susceptibilidad genética a scrapie.

117

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Las muestras empleadas en este trabajo fueron las correspondientes a los 22 animalessanos utilizados en el estudio de la estabilidad y selección de genes HK para la normalizaciónde genes del grupo A según se describe en el capítulo 4. La selección de los 22 animales sa-nos de raza Latxa se realizó de acuerdo con la distribución de genotipos para el gen PrP enla población de la CAPV [96] y su susceptibilidad frente a scrapie asociada a esos genoti-pos [72]. De este modo, se han incluido animales de los Tipos de riesgo 1, 2, 3 y 5 destacan-do como los genotipos más frecuentes están representados por más de un individuo. De estaforma, se han seleccionado y sacrificado bajo condiciones controladas tres animales con ge-notipo ARR/ARR, cinco ARQ/ARQ, uno VRQ/VRQ, uno ARH/ARH, cinco ARR/ARQ, cin-co ARQ/VRQ, uno AHQ/ARQ y un animal ARH/VRQ. El genotipado de los animales se re-alizó por el método de PCR a tiempo real descrito anteriormente [96] y que se detalla en elapartado 3.4. La edad de los animales estaba comprendida entre 3 y 12 años.

Todos los animales fueron negativos al test rápido de detección de priones Platelia®BSE(Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra de obex. De cada animal se obtuvo aséptica-mente una muestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo, obex, bazo,íleon y nódulo linfático mesentérico. Todas las muestras fueron conservadas a –80°C parapreservar el RNA en condiciones óptimas hasta su posterior extracción.

5.3. EXTRACCIÓN DE RNA, DISEÑO DE CEBADORES Y PUESTA A PUNTO DELA RT-PCR

Las muestras de RNA y cDNA para este estudio han sido las mismas que las emplea-das en el análisis de estabilidad de genes HK como condición indispensable para estudios deexpresión relativa, por lo que los procedimientos empleados han sido los mismos que en elcapítulo 4. Los cebadores para el gen PrP, fueron diseñados para amplificar una región de 95pb dentro del exón 3 del gen PrP ovino, utilizando el software Primer Express (AppliedBiosystems, CA, USA) y teniendo en cuenta los requerimientos necesarios para trabajar conPCR a tiempo real y SYBR Green (Tabla 5.1). La retrotranscripción se realizó con un pro-grama de tres ciclos: 10 min a 25°C, 45 min a 37°C y 5 min a 95°C. Las reacciones de PCRse llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA) usando las condiciones universales de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15


118

Tabla 5.1. Secuencias de los cebadores y características del producto amplificado del gen PrP

Cebadores 5’→ 3’ [C] pb Tmt

Tmr

F GCCAAAAACCAACATGAAGCAT300 95 83 83.3-83.9

R TGCTCATGGCACTTCCCAG

[C], concentraciones de ambos cebadores en mM; pb, longitud del amplicón en pb; Tmt, temperatura de disociación teórica según

Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA); Tmr, temperatura de disociación real; F, cebador forward; R cebador reverse

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 118

seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación de la reacción de PCR, se aplicó el protocolo dedisociación para analizar la formación de dímeros de cebador y la especificidad de la reac-ción mediante el análisis de la Tm (Figura 5.1). El tamaño del amplicón en gel de agarosa al3% y la secuenciación completaron la confirmación de la especificidad de la PCR.

5. EXPRESIÓN DEL GEN PRP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE

119

Figura 5.1. Curva de disociación del gen PrP. (La amplificación del fragmento de 95 pb con los ce-badores diseñados permitió obtener una amplificación sin dímeros de cebadores)

5.4. NORMALIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PrP

La normalización se realizó en base al estudio de estabilidad de genes HK realizado en elcapítulo 4 en el que se identificaron distintos genes HK de referencia según el tipo de tejido. Lanormalización de la expresión de cada muestra se realizó mediante el ratio obtenido a partir dela expresión del gen PrP y el factor normalizador para esa muestra. Los factores normalizado-res se calculan por medio de la media geométrica de la expresión de cada uno de los genes HKnecesarios según el tejido del que se trate: GAPDH, SDHA y ACTB para el cerebro y el bazo,G6PDH, ACTB y YWHAZ para el cerebelo, GAPDH, YWHAZ y G6PDH para el obex, SDHA,RPL19 y GAPDH para el linfonodo, GAPDH, G6PDH, SDHA y YWHAZ para el íleon.

5.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS

Con el fin de aprovechar toda la información disponible, se diseñaron dos estrategiaspara estudiar si la susceptibilidad genética tiene los mismos efectos en todos los tejidos ana-lizados de cada animal con un determinado perfil genético, o si existe alguna interacción en-tre el tipo de tejido y la susceptibilidad genética. En este tipo de análisis donde se compara laexpresión de un gen entre diversos tejidos es necesario que exista un grupo de genes HK úni-co para la normalización, desafortunadamente, en este conjunto de muestras no fue posible.Sin embargo sí se pudieron obtener distintos grupos de genes HK para la normalización delgen problema según el tipo de tejido. Por lo tanto, para poder comparar entre tejidos se com-probó si los FN correspondientes a cada tejido no afectaban a las medidas del mRNA. Paraello, se realizó un análisis de varianza con los FN aplicando el procedimiento General LinearModel del programa estadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA). Una vez que los resul-tados de este modelo no mostraron diferencias significativas entre tejidos, los ratios PrP/FN(nPrP) fueron transformados según la fórmula [arc sin √ (nPrPx100-1)] como se recomienda

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 119

para el uso de test paramétricos de datos relativos. Los valores de nPrP junto con todas las va-riables independientes (sexo, edad, tejido y susceptibilidad genética) así como sus interac-ciones, fueron analizadas mediante el procedimiento General Linear Model del programa es-tadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA). Este análisis mostró como las variablesindependientes sexo y edad no presentaban un efecto significativo por lo que en el modelo fi-nal solo se incluyeron las variables tipo de tejido y susceptibilidad genética. Esta susceptibi-lidad genética fue considerada de dos formas, como genotipos individuales y agrupados enTipos de riesgo [72]. Las comparaciones de medias se realizaron mediante una t de Studentcon el programa estadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA).

5.6. EXPRESIÓN NORMALIZADA DEL GEN PrP

En la Tabla 5.2 se muestran los resultados finales equivalentes a los valores de la expre-sión relativa del gen PrP clasificados por grupos de riesgo y por genotipos. La representacióngráfica de los valores de nPrP agrupados por grupos de riesgo se representa en la Figura 5.2.

El análisis global en el que se incluyeron todos los niveles de riesgo y genotipos, mos-tró la existencia de una fuerte asociación entre los valores de la expresión del gen PrP y eltipo de tejido (p<0.0001) siendo el obex el tejido con mayor expresión (38.05) seguido delíleon (35.73), nódulo linfático mesentérico (33.51), bazo (29.99), cerebelo (28.89) y cerebro(21.58). Cuando se analizó el efecto del grupo de riesgo y del genotipo, no se encontró signi-ficación estadística alguna entre ninguno de estos factores y los niveles de mRNA del genPrP. El modelo, tampoco mostró ninguna interacción entre el tipo de tejido y el grupo de ries-go o entre el tipo de tejido y el genotipo.

Cuando los valores de la expresión del gen PrP fueron analizados en cada tejido, muchasde las comparaciones realizadas (pairwise comparisons) fueron significativas (p<0.05) o mar-ginalmente significativas (p<0.10). En las muestras de cerebro, los animales del grupo de ries-go 1 (T1) mostraron la menor expresión seguido de los animales del T5, T3 y T2, pero única-mente la menor expresión del T1 frente al T2 fue marginalmente significativa (p=0.0700). Enel mismo análisis realizado según el genotipo, la expresión del gen PrP en animales ARR/ARRfue menor que en animales ARR/ARQ (p=0.0561). En el cerebelo, la expresión del T1 fue mar-ginalmente menor que en el T3 (p=0.0668). En el obex, el T1 mostró la menor expresión se-guida de T5, T2 y T3. Una vez más, el nivel de expresión en T1 fue marginalmente menor queen T3 (p=0.0633). La expresión en animales ARR/ARR fue marginalmente menor que en ani-males ARQ/ARQ (p=0.0948). En el bazo, el T1 mostró la mayor expresión seguido de T3, T5,y T2. La expresión en T1 fue significativamente mayor que en T2 (p=0.0281) y que en T5(p=0.0671), y en animales del grupo T2 menor que en los animales del T3 (p=0.0937). La ex-presión en animales ARQ/ARQ fue significativamente mayor que en los ARR/ARQ (p=0.0441)y ARQ/VRQ (p=0.0557). Además, el nivel de expresión en animales ARR/ARR fue mayor queen los ARR/ARQ (p=0.0208). En el íleon, las muestras del grupo de riesgo T1 mostraron la ma-yor expresión seguido del T3, T5, y T2. Las muestras del nódulo linfoide mesentérico de losanimales del grupo T1 mostraron la menor expresión seguida de T2, T5, y T3.


120

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 120


121

Tabl

a 5.

2.N

ivel

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pres

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en P

rP(u

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Teji

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es

Tip

on

nPrP

SDnP

rPSD

nPrP

SDnP

rPSD

nPrP

SDnP

rPSD

nPrP

SDnP

rPSD

13

15.8

294.

279

21.2

023.

052

29.8

9212

.223

38.8

5116

.115

42.0

488.

800

31.4

243.

496

22.3

089.

057

37.4

4210

.470

25

27.1

324.

830

26.6

323.

495

37.8

976.

930

24.5

0416

.953

33.6

5913

.712

31.9

404.

088

30.5

547.

267

30.0

3512

.551

37

21.0

255.

869

33.0

886.

515

42.4

357.

598

33.4

6818

.426

36.3

1813

.434

36.9

716.

320

32.1

8311

.001

35.5

8613

.054

57

20.6

455.

092

29.5

844.

439

37.2

838.

811

26.6

2810

.323

33.8

979.

467

32.0

515.

895

29.1

719.

247

30.8

598.

903

Tipo

Gen

otip

o

1A

RR/A

RR3

15.8

294.

279

21.2

023.

052

29.8

9212

.223

38.8

5116

.115

42.0

488.

800

31.4

243.

496

22.3

089.

057

37.4

4210

.470

2A

RR/A

RQ5

27.1

324.

830

26.6

323.

495

37.8

976.

930

24.5

0416

.953

33.6

5913

.712

31.9

404.

088

30.5

547.

267

30.0

3512

.551

3A

HQ

/ARQ

129

.470

–45

.592

–56

.099

–11

.441

–63

.868

–31

.838

–43

.721

13.4

1335

.716

26.4

28

3A

RH/A

RH1

16.2

43–

33.8

11–

35.5

39–

45.2

82–

29.6

73–

37.1

85–

28.5

3110

.676

37.3

817.

807

3A

RQ/A

RQ5

20.2

935.

239

30.4

423.

962

41.0

815.

073

35.5

1118

.651

32.1

376.

932

37.9

557.

218

30.6

069.

842

35.2

0111

.580

5A

RH/V

RQ1

18.8

56–

39.0

65–

41.0

20–

42.6

11–

29.0

04–

27.5

37–

32.9

8112

.271

33.0

518.

312

5A

RQ/V

RQ5

22.1

905.

129

28.0

721.

817

33.3

095.

306

24.0

199.

236

32.4

139.

370

32.0

896.

509

27.8

576.

213

29.5

078.

816

5V

RQ/V

RQ1

14.7

12–

27.6

67–

53.4

16–

23.6

91–

46.2

08–

36.3

72–

31.9

3219

.701

35.4

2411

.289

Tota

l22

21.5

845.

991

28.8

856.

055

38.0

548.

841

29.9

8915

.268

35.7

2511

.328

33.5

065.

621

29.5

089.

736

33.0

7311

.517

Los

gru

pos

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iesg

o y

los

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tipos

apa

rece

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Cuando la variable dependiente nPrP se agrupó en tejidos del SNC (cerebro, cerebeloy obex) frente a tejidos linfoides (bazo, íleon y nódulo linfoide mesentérico), el modelo esta-dístico reveló la existencia de una relación entre la cantidad de mRNA del gen PrP y el efec-to tipo de tejido (p=0.0160). Se encontró además, una asociación estadística marginal para lainteracción entre el tipo de tejido y el grupo de riesgo (p=0.0623), mientras que la interacciónentre el tipo de tejido y genotipo fue muy débil (p=0.2060). El nivel de mRNA del gen PrPen tejidos linfoides fue significativamente mayor que en tejidos del sistema nervioso(p=0.0160). Dentro del grupo de tejidos nerviosos, los animales del grupo T3 mostraron losmayores niveles de expresión seguidos de los del T2, T5, y T1. El nivel de expresión encon-trado en animales T1 fue menor que en T2 (p=0.0496), T3 (p=0.0174), y T5 (p=0.0863). Losanimales ARR/ARR mostraron una menor expresión que animales con genotipos ARR/ARQ(p=0.0520) o ARQ/ARQ (p=0.0571). Respecto a tejidos linfoides, los animales del grupo T1mostraron la mayor expresión seguida de T3, T5, y T2. La expresión del T1 fue mayor queen T2 (p=0.0840). Además, los animales ARR/ARR mostraron una mayor expresión que losanimales ARR/ARQ (p=0.0871) y ARQ/VRQ (p=0.0839).

5.7. DISCUSIÓN

La hipótesis de partida de este trabajo se ha basado en dos premisas fundamentales. Porun lado se conoce la existencia de una susceptibilidad genética a scrapie [21, 33, 141] y porotro lado se sabe que la presencia de PrPc es necesaria para el desarrollo de la enfermedad [26,35, 105]. Con estas dos realidades, este trabajo ha estudiado la hipotética relación entre losniveles de expresión del gen PrP y la susceptibilidad genética asociada a este gen, como una


122

0

10

20

30

40

50

60

Cerebro Cerebelo Obex Bazo Ileon NLM Tejidos

Nerviosos

Tejidos

Linfáticos

PrP

mR

NA

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rari

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)T1

T2

T3

T5

Tejidos

Linfoides

Figura 5.2. Niveles de expresión del gen PrP en los diferentes tejidos de 22 animales agrupados se-gún el UK-NSP [72]. (Los niveles de mRNA del gen PrP se obtuvieron por RT-PCR a tiempo real ycuantificación relativa empleando los genes HK más estables en cada tejido. Las barras de error re-presentan la desviación estándar)

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 122

explicación a nivel molecular de la susceptibilidad genética a scrapie. Para ello, se analizaronlos niveles de mRNA del gen PrP en seis tejidos de gran relevancia para el desarrollo y trans-misión del scrapie en 22 animales con distinta susceptibilidad genética. Entre las distintas me-todologías existentes se eligió la PCR a tiempo real debido a su alta sensibilidad y precisión.

Los resultados revelaron diferencias estadísticas en la expresión del gen PrP entre losdistintos tejidos. El mayor nivel de expresión en las muestras del SNC correspondió al obexseguido del cerebelo y cerebro. Esta expresión elevada en el obex podría estar indicando al-tos niveles de PrPc que a su vez indicaría altos niveles de agregados de PrPSc en el hipotéticocaso en que el prión hubiese entrado en el organismo y considerando la PrPc como sustratopara la conversión a la isoforma patógena. De este modo, las diferencias en la cantidad de PrPc

en los tres tejidos del SNC podrían tener cierta relación con la aparición espacio-temporal deagregados de PrPSc y a su vez, podría apoyar la idea de que el obex sea la mejor fuente de ma-terial para la detección de la PrPSc con los test rápidos de TSEs. Sin embargo, cabe destacarque a diferencia de lo que ocurre en el scrapie clásico, en la región del obex de los llamadoscasos atípicos, se observa una baja absorbancia en la prueba Platelia®BSE ELISA (Bio-Rad,Hercules, CA, USA) y una falta de depósitos de PrPSc por inmunohistoquímica en compara-ción con el cerebelo donde se localizan los principales depósitos de PrPSc [23, 48]. Tambiénse debe descartar la existencia de factores inherentes a la naturaleza de cada tejido como sonla estabilidad de los transcritos o la regulación postranscripcional del gen PrP. En este con-texto, diversos estudios sobre el mRNA del gen PrP han revelado la existencia de dos trans-critos del gen PrP de distinto tamaño (4.6 y 2.1 kb), con una distribución específica de teji-do, distintos grados de estabilidad y distinta eficiencia de traducción [110, 135, 146]. Por otraparte, el patrón de glicosilación de las isoformas de la PrPc así como la cantidad de ésta, res-ponden a un patrón específico en cada tejido, encontrando la menor cantidad de PrPc en teji-dos linfoides (tres ordenes de magnitud) que en tejidos del SNC [195]. Curiosamente, en elpresente trabajo se han encontrado mayores niveles de mRNA del gen PrP en tejidos linfoi-des que en SNC lo cual sugiere la existencia de una fuerte regulación postranscripcional entejidos linfoides. En cualquier caso, la comparación de la expresión del gen PrP entre tejidosde distinta naturaleza puede resultar muy compleja y difícil de interpretar por lo que el reali-zar un análisis independiente en cada tejido o al menos en cada grupo de tejidos (linfoides vs.nerviosos) podría ser de gran ayuda. Por esta razón, los valores de expresión de los tejidosnerviosos fueron agrupados y comparados con los valores agrupados obtenidos para los teji-dos linfoides. En general, se observó una tendencia hacia el incremento de los niveles demRNA del gen PrP en paralelo a la susceptibilidad genética a scrapie en tejidos del SNC. Enestos tejidos, los animales pertenecientes al T1 mostraron los menores niveles de expresión,observándose un incremento gradual hacia el grupo T3. Curiosamente, los animales del T3mostraron más mRNA del gen PrP que el grupo T5, sin embargo, no se encontraron diferen-cias significativas. Por otro lado, en bazo e íleon, el grupo T1 presentó los mayores nivelesde expresión mientras que se encontraron resultados contradictorios cuando se realizó el aná-lisis por genotipos. Cabe pensar como la existencia de artefactos derivados de los inhibidoresde la PCR existentes en el bazo o la distribución heterogénea del sistema inmune en el íleonde distintos animales, podrían contribuir a la alta variabilidad encontrada en estas muestras.


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02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 123

En general, la mayoría de las diferencias encontradas en este estudio fueron significa-tivamente marginales. Aunque se podría pensar que el análisis de un mayor número de ani-males podría contribuir a aumentar el poder estadístico del análisis, los resultados presenta-dos en este trabajo no apoyan la existencia de una relación entre los niveles de mRNA del genPrP y la susceptibilidad genética a scrapie. En estudios posteriores a este, se ha observadouna relación entre los niveles de PrPc y el genotipo en una pequeña muestra de células mo-nonucleares de sangre periférica ovina [121], y con la cantidad de PrPSc (pero no PrPc) en elencéfalo de ovejas infectadas experimentalmente [188]. Sin embargo, diferentes mecanismostejido-específicos que controlen los procesos de transcripción, traducción y síntesis proteica,podrían explicar estas diferencias asociadas al genotipo no detectadas a nivel de los transcri-tos de PrPc. Dada la importancia de la PrPc como sustrato para formación de la isoforma pa-tógena, el conocimiento del gen PrP a nivel de sus transcritos puede ser de gran relevancia,y en este sentido, los resultados presentados en este trabajo proporcionan información valio-sa para posteriores estudios. Sin embargo, el scrapie es una enfermedad muy compleja y mul-tifactorial. La existencia de otros factores como la regulación postranscripcional, la influen-cia de otros genes desconocidos hasta ahora y factores específicos asociados a las distintascepas circulantes pueden influir de forma decisiva en el proceso global de la patogénesis delscrapie.


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02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 124

Capítulo 6

PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 125

6.1. INTRODUCCIÓN

Todas las enfermedades por priones comparten una serie de alteraciones neurológicascomunes como son la activación de la glía, la vacuolización y la neurodegeneración progre-siva del tejido nervioso con la consiguiente pérdida de neuronas. A pesar de que se han reali-zado numerosos estudios para llegar a comprender el complejo mecanismo molecular delscrapie, todavía siguen sin esclarecerse muchos aspectos de esta patología. En este sentido,se ha descrito la existencia de una gliosis reactiva y una secreción de citoquinas como conse-cuencia de la acumulación patológica de PrPSc [102, 181, 257]. Asimismo diversos estudiosrealizados en infecciones experimentales en modelos animales, han descrito como tiene lugaruna alteración en la regulación de la expresión génica observándose una sobreexpresión dehasta 121 genes diferentes [65, 235, 301] [36]. Entre estos, podemos encontrar genes asocia-dos con la astrocitosis, la activación de la microglía e indicadores de estrés celular como laproteína ácida fibrilar glial (GFAP) o la catepsina-S. También se han encontrado alterados ge-nes de mantenimiento de la homeostasis como el gen Cu/ZnSOD. Otra de las alteraciones ob-servadas ha sido la relacionada con la familia de proteínas 14-3-3. Estas proteínas están sien-do estudiadas como posibles marcadores de enfermedad priónica desde que se conoce suexpresión diferencial en el líquido cerebroespinal de pacientes con Creutzfeldt-Jakob [14,139, 279].

La apoptosis es el principal mecanismo de muerte neuronal que sufren las neuronas tan-to en infecciones experimentales como en la forma natural de las EETs. [89, 103, 178, 255,296], pudiéndose observar a nivel molecular una alteración de la expresión de genes relacio-nados con la apoptosis. También se ha descrito como la activación de la microglía y su dis-tribución espacio-temporal refleja el patrón determinado por los depósitos de PrPSc y como asu vez precede a la detección de muerte neuronal por apoptosis [102]. En este sentido, diver-sos trabajos sobre infecciones experimentales de scrapie en ratón han descrito la existenciade una alteración en la expresión de genes relacionados con la apoptosis como los genesBcl-2, Bax o caspasa-3 [150, 211].

La mayoría de la bibliografía existente relacionada con la expresión génica en el scra-pie se ha realizado con infecciones experimentales y modelos animales, sin embargo, existenpocos trabajos publicados sobre el scrapie en su forma natural. Por lo tanto, teniendo en cuen-ta estudios realizados anteriormente, en este trabajo se analiza la expresión de nueve genesrelacionados con diversos aspectos de la patogenia del scrapie. Se han analizado genes aso-ciados a la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis, la apoptosis, así comoel gen PrP, en tres áreas relevantes del SNC de cuatro animales con scrapie natural y 22 ani-males control mediante RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa.


Tanto los animales como las muestras empleadas en este trabajo fueron las mismas queen el estudio de la estabilidad y selección de genes HK descrito para el grupo B del capítulo 4

127

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 127

formado por animales sanos y con scrapie. A modo de recordatorio, los animales con scrapiecorrespondieron a cuatro hembras de raza Latxa con scrapie clínico pertenecientes a un bro-te que tuvo lugar en Diciembre de 2003. Los animales mostraban síntomas clínicos de un es-tadio tardío de scrapie consistentes en incoordinación de las patas traseras, caídas, respuestaexagerada a estímulos externos, rechinar de dientes, temblores y pérdida de peso. Todos losanimales presentaban el genotipo ARQ/ARQ determinado según el protocolo previamentedescrito [96] y que se detalla en el apartado 3.4. La edad de estos animales era de 3, 4, 5 y 8años. Como animales control se analizaron 22 animales sanos de diferentes genotipos y per-tenecientes a rebaños libres de scrapie. La edad de estos animales osciló entre 3 y 12 años.

Todos los animales sanos fueron negativos al test rápido de detección de priones Plate-lia“BSE (Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra de obex, mientras que los cuatro ani-males con síntomas clínicos fueron positivos. De cada animal se obtuvo asépticamente unamuestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo y obex, bazo, íleon ynódulo linfático mesentérico. Todas las muestras fueron conservadas a –80°C para preservarel RNA en condiciones óptimas hasta su posterior extracción.

6.3. EXTRACCIÓN DE RNA, DISEÑO DE CEBADORES Y PUESTA A PUNTO DELA RT-PCR

Las muestras de RNA y cDNA para este estudio han sido las mismas que las emplea-das en el análisis de estabilidad de genes HK como condición indispensable para estudios deexpresión relativa, por lo que los procedimientos empleados han sido los mismos que en elcapítulo 4.

Se diseñaron cebadores específicos para los genes GFAP (proteína ácida fibrilar glial),catepsina-S, SOD (Cu/Zn superóxido dismutasa), caspasa-3, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2),Mcl-1 (Myeloid cell leukemia 1) y Bax (Proteína asociada a Bcl-2 x) (Tabla 6.1). Para el di-seño de los cebadores de los genes GFAP, catepsina-S, caspasa-3, Bcl-2, Mcl-1 y Bax se ana-lizaron secuencias ovinas depositadas en la base de datos pública GenBank. En el caso de losgenes catepsina-S y SOD no existían secuencias publicadas de ovino por lo que los cebado-res se diseñaron en regiones muy conservadas tras analizar múltiples alineamientos de estosgenes en diferentes especies animales (Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus y Homosapiens) con el programa AlingX (Vector NTI 8.0 suite, Informax Inc., MD, USA). Los ce-badores para los genes 14-3-3 zeta, también llamado YWHAZ (tirosina 3-monooxigenasa), yPrP fueron diseñados anteriormente según se describe en el 4.4 y 5.3 respectivamente.

La retrotranscripción se realizó con un programa de tres ciclos: 10 min a 25°C, 45 mina 37°C y 5 min a 95°C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador ABIPRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando las condiciones universa-les de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación dela reacción de PCR, se aplicó el protocolo de disociación para comprobar la Tm del produc-to amplificado.


128

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 128

Para todas las parejas de cebadores diseñadas se analizó la formación de dímeros de ce-bador y la especificidad de la reacción se confirmó mediante el análisis de la Tm de la curvade disociación (Figura 6.1), tamaño en gel de agarosa al 3% y secuenciación.

6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE

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.7ºC

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.7ºC

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.6ºC

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Figura 6.1. Curvas de disociación de 9 genes empleados en el análisis. [(a), GFAP; (b), catepsina-S;(c), PrP; (d), SOD (e), 14-3-3 zeta;(f), caspasa-3; (g), Bcl-2; (h), Mcl-1; (i), Bax]

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 129


130

Se analizaron todos los genes descritos exclusivamente en el cerebro, cerebelo y obexpor tratarte de genes más relacionados con el sistema nervioso. Solo en el caso del gen PrPse incluyeron los tejidos restantes pertenecientes al sistema linfoide por su implicación en latransmisión del prión.

Tabla 6.1. Secuencias de los cebadores y características de los productos amplificados

Gena Cebador Forward 5’→ 3’ Cebador Reverse 5’→ 3’ [C] pb Tmt

Tmr

GFAP TGCCTATCGACAGGAAGCAGAT TGGACGCCACTGCCTCATA 300 233 83 84.5-85.0Catepsina-S AAAGAAGCCGTGGCCAATAAA AGGCCCCAGCTGTTTTTCA 300 191 80 79.3-79.8PrP GCCAAAAACCAACATGAAGCAT TGCTCATGGCACTTCCCAG 300 95 83 83.3-83.8SOD GATGAAGAGAGGCATGTTGGAGA TCATTTCCACCTCTGCCCAA 300 170 79 79.6-79.814-3-3 zeta TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCT TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT 100 102 79 78.9-79.4Caspasa-3 CCAATGGACCCGTCGATCT GTCTGCCTCAACTGGTATTTTCTGA 300 188 79 80.3-80.6Bcl-2 TTCGCCGAGATGTCCAGTC TTGACGCTCTCCACACACATG 300 155 85 85.5-85.9Mcl-1 CTAGCAGAAAGCATCACAGATGTTCT GCCTTCTAGGTCCTCTACACGGA 300 111 79 77.8-78.1Bax TGTCTGAAGCGCATTGGAGAT AGGGCCTTGAGCACCAGTTT 300 191 82 83.3-83.6

a símbolo del gen; GFAP (proteína ácida fibrilar glíal), PrP (proteína prión), SOD (Cu/Zn superóxido dismutasa), 14-3-3 zeta (tirosina 3-monooxigenasa), Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Mcl-1 (Myeloid cell leukemia 1) y Bax (ProteínaX asociada a Bcl-2). [C], concentraciones de ambos cebadores en mM; pb, longitud del amplicón en pb; Tm

t, temperatura de disociación teórica

según Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA); Tmr, temperatura de disociación real expresada en rango de

temperaturas obtenido según los picos de disociación de 78 muestras.

6.4. NORMALIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

La normalización se realizó en base al estudio de estabilidad de genes HK realizado enel capítulo 4 en el que se identificaron distintos genes HK de referencia según el tipo de teji-do. La normalización de la expresión de cada gen para cada muestra se realizó mediante el

Tabla 6.2. Valores normalizados de los niveles mRNA de nueve genes en animales sanos y en ani-males con scrapie natural

Cerebro Cerebelo Obex

Gen Control Scrapie Control Scrapie Control Scrapie

mRNA SD mRNA SD mRNA SD mRNA SD mRNA SD mRNA SD

PrP 25.28 7.49 21.51 1.40 30.61 6.18 40.34 4.08 36.79 8.46 39.90 0.47GFAP 4.80 1.82 22.91 13.83 21.62 9.46 23.50 3.91 30.01 13.72 64.26 20.31Catepsina-S 25.34 23.18 33.33 13.66 35.34 19.00 41.23 9.97 29.51 19.87 57.12 20.06Bcl2 23.50 8.11 18.52 0.90 29.26 9.14 38.81 14.27 33.72 20.19 46.19 23.19Mcl-1 25.22 10.35 31.10 9.11 24.76 13.03 32.21 7.75 26.55 14.25 37.36 10.52Bax 26.08 9.73 28.15 14.18 25.99 8.02 24.04 6.31 24.15 18.37 21.85 8.08Caspasa-3 30.27 12.88 11.83 3.83 19.65 9.32 22.10 2.24 19.31 16.68 15.46 11.13SOD 29.35 14.05 22.17 6.41 32.00 9.73 41.67 3.05 20.11 13.61 13.86 5.1414-3-3 z 37.38 16.80 18.89 3.92 31.77 7.87 40.26 7.33 42.88 9.52 31.61 7.24

SD, desviación estándar

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 130

ratio obtenido a partir de la expresión del gen problema y el FN para cada muestra. Los FNse calculan por medio de la media geométrica de la expresión de cada uno de los genes HKnecesarios según el tejido del que se trate: GAPDH, SDHA, G6PDH y ACTB para el cerebro,G6PDH, ACTB y RPL19 para el cerebelo, GAPDH, SDHA y G6PDH para el obex, GAPDH,SDHA y ACTB para el bazo, SDHA, RPL19 y GAPDH para el linfonodo, GAPDH, G6PDH,SDHA y RPL19 para el íleon. Los valores obtenidos para los distintos genes agrupados en sa-nos y enfermos se presentan en la Tabla 6.2 y en la Figura 6.2.

6.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

Las diferencias estadísticas entre los grupos control y afectados por scrapie fueron cal-culadas con el test no paramétrico Mann Whitney y el programa estadístico SAS versión8 (SAS institute, Cary, NC, USA). Este estadístico está recomendado para la comparación degrupos con un número de muestras bajo (n~20). Por otro lado, los test no paramétricos no re-quieren que los valores a analizar se ajusten a una distribución normal. Los valores de p<0.10,fueron considerados como diferencias marginalmente significativas, valores de p<0.05 indi-caron diferencias significativas y p<0.01 como diferencias altamente significativas.

El análisis de los valores de expresión normalizada para los genes GFAP, catepsina-S,PrP, SOD, 14-3-3 zeta y caspasa-3 mostró la existencia de diferencias significativas entreanimales sanos y enfermos al menos en uno de los tejidos analizados (Tabla 6.3, Figura 6.2).Por el contrario, los niveles de expresión de los genes Bcl-2, Mcl-1 y Bax no mostraron dife-rencias significativas en ninguno de los tejidos. Respecto a los genes relacionados con la glía,la expresión del gen GFAP presentó niveles de expresión significativamente mayores en elcerebro y obex de los animales con scrapie respecto de los animales control (incrementos de4.8 veces, p=0.0022, y de 2.1 veces, p=0.0069, respectivamente). Para el gen de la catepsina-S, se observó un aumento de la expresión de 1.9 veces en el obex de animales enfermos res-pecto a los animales sanos (p=0.0230). Los niveles de mRNA del gen PrP en el cerebelo deanimales con scrapie fue 1.3 veces mayor (p=0.0129) en comparación con los animales con-trol. El gen que codifica para la enzima antioxidante SOD mostró un incremento de 1.3 ve-


131

Tabla 6.3. Diferencias de expresión entre animales sanos y animales con scrapie

Tejido GFAP catepsina-S PrP SOD 14-3-3 zeta caspasa-3 Bcl-2 Mcl-1 Bax

Cerebro↑4.8 ↑1.3 ↓1.2 ↓1.3 ↓2.0 ↓2.6 ↓1.3 ↑1.2 ↑1.1

p=0.0022 p=0.1179 p=0.3198 p=0.3556 p=0.0550 p=0.0069 p=0.2387 p=0.1029 p=0.9433

Cerebelo↑1.1 ↑1.2 ↑1.3 ↑1.3 ↑1.3 ↑1.1 ↑1.3 ↑1.3 ↓1.1

p=0.4344 p=0.4344 p=0.0129 p=0.0393 p=0.0646 p=0.1552 p=0.1021 p=0.1356 p=0.5224

Obex↑2.1 ↑1.9 ↑1.1 ↓1.5 ↓1.4 ↓1.2 ↑1.4 ↑1.4 ↓1.1

p=0.0069 p=0.0230 p=0.2008 p=0.6698 p=0.0393 p=0.7223 p=0.2555 p=0.1179 p=0.7762

Los números indican el incremento de una sobreexpresión (↑) o desregulación (↓) entre los animales con scrapie y el grupocontrol. Los valores de p se calcularon por medio del test Mann Withney. Los valores de p <0.10 se indican en negrita.

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 131

ces (p=0.0393) en las muestras de cerebelo de animales con scrapie. El gen para la isoformazeta de la proteína 14-3-3 mostró una sobreexpresión en el cerebelo de los animales con scra-pie (1.3 veces, p=0.0646) mientras se observó una desregulación en el cerebro y en el obex


132

Bcl-

2

0

20

40

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ere

be

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***

Figura 6.2. Representación gráfica de la comparación de los valores normalizados de los niveles demRNA entre el grupo control (columna gris) y el grupo de animales con scrapie (columna negra).[En el eje de abscisas se representan los niveles medios del mRNA normalizado obtenido por RT-PCRa tiempo real y cuantificación relativa empleando los genes HK más estables en cada tejido. Las ba-rras de error representan la desviación estándar. (*), diferencia marginalmente significativa p<0.10;(**), diferencia significativa p<0.05 y (***), diferencia altamente significativa p<0.01 (Mann Whit-ney U test)]

02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 132

de animales afectados de scrapie (2.0 veces, p=0.0550 y 1.4 veces, p=0.0393, respectiva-mente). Respecto a los genes implicados en la apoptosis, únicamente el gen de la caspasa-3mostró una expresión significativamente menor en los animales con scrapie (2.6 veces,p=0.0069). El resto de genes, Bcl-2, Mcl-1 y Bax, no mostraron diferencias significativas.

6.6. DISCUSIÓN

La patogenia de las enfermedades por priones en el SNC comprende una serie de me-canismos comunes todavía lejos de una buena caracterización molecular. Con el fin de cono-cer mejor las posibles alteraciones moleculares que tienen lugar en el SNC de animales conscrapie natural, se han analizado los niveles de expresión (mRNA) de nueve genes asociadoscon la activación de la glía, apoptosis y neuroprotección. Los resultados obtenidos en este tra-bajo, confirmaron la sobreexpresión previamente descrita por otros autores del gen GFAP yademás, han permitido describir por primera vez la alteración de nuevos genes como el de lacatepsina-S, PrP, SOD, 14-3-3 zeta y caspasa-3 en scrapie natural.

El gen GFAP es el principal componente de los filamentos intermedios de la astroglíay se emplea como marcador histológico de activación astrocítica [87]. Los astrocitos, comoparte de la glía, juegan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso y en elmantenimiento de la homeostasis del tejido neural. En relación con el scrapie, se ha observa-do la inducción de gliosis en infecciones experimentales en ratones. Los astrocitos han sidoimplicados en la formación y replicación del prión [78, 303]. Se ha descrito también como eldesarrollo temporal y la distribución espacial de la activación astrocítica recuerda al patrónseguido por los depósitos de PrPSc [102]. Diversos estudios han demostrado una sobreexpre-sión del gen GFAP en homogeneizados de encéfalos de ratones infectados con scrapie [65,81, 169, 235, 257, 301]. De hecho, se ha sugerido que la región reguladora de 2 kb del pro-motor del gen GFAP presenta los elementos necesarios para los mecanismos de acción delprión [275]. En el presente trabajo, se ha observado una sobreexpresión altamente significa-tiva del gen GFAP en el obex y cerebro de animales con scrapie natural indicando la presen-cia de actividad astrocítica. Este incremento de mRNAs del gen GFAP se correlaciona con ladistribución espacial de los depósitos de PrPSc encontrados por inmunohistoquímica, la cualmostró depósitos en el cerebro y en el obex pero no así en el cerebelo (datos no mostrados).Sin embargo, otros autores [8, 99, 173] han descrito alteración del gen GFAP también en elcerebelo de animales con scrapie natural. Estas pequeñas discrepancias podrían tener relacióncon el estadio de la enfermedad, la cepa de scrapie y/o el método de detección empleado. Paraconfirmar estas suposiciones sería necesario realizar una serie de análisis exhaustivos adicio-nales.

La catepsina-S es una proteasa lisosomal de la glía esencial para el reciclaje de las pro-teínas intracelulares y a la que se le atribuye cierta implicación en procesos relacionados conla destrucción y remodelado del tejido nervioso. Además, se ha sugerido su implicación en eldesarrollo de placas amiloides [175, 199]. También se ha descrito un aumento en los nivelesde mRNA de catepsina-S en modelos animales de scrapie y Creutzfeldt-Jakob [10, 65, 301].


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En este trabajo se ha encontrado por primera vez una sobreexpresión del gen catepsina-S enmuestras de obex de animales con scrapie natural, sugiriendo su participación en la forma-ción de las vacuolas presentes en el scrapie debido a su actividad proteolítica. Además, el hi-potético papel modulador propuesto para la catepsina-S en la formación y persistencia deb-amiloide en las placas seniles de algunos desordenes neurológicos podría también aplicar-se al scrapie, de manera que favoreciese la formación de agregados de PrPSc. En resumen, losperfiles de expresión obtenidos en este estudio para los genes GFAP y catepsina-S, sugierenla existencia de mayor actividad glial en el obex que en el cerebro de animales afectados descrapie.

Aunque la función biológica de la PrPc no está del todo clara, existen numerosos traba-jos que sugieren una función neuroprotectora [244]. Entre otras propiedades, se ha observa-do actividad protectora ante la toxicidad provocada por la proteína Doppel, un papel defensi-vo en el estrés oxidativo y un efecto antiapoptótico contra muchos tipos de daño celular comola apoptosis mediada por Bax. En este sentido, se ha descrito una sobrexpresión del gen PrPen isquémia cerebral humana y de ratón [189] o bajo diferentes lesiones del SNC humano[88]. En relación al scrapie, mientras que empleando la técnica de Northern blot no se obser-vó alteración alguna en infecciones experimentales de ratones [65, 170], Li y cols. [176], des-cribieron sobreexpresión empleando la técnica de RT-PCR. Estas diferencias podrían atri-buirse a la técnica empleada o bien a diferencias en la respuesta del hospedador. Asimismoun trabajo muy reciente ha demostrado un aumento a nivel de proteína PrPc en células mono-nucleares de sangre periférica ovina de animales sanos [121]. En el presente trabajo, se ha ob-servado una sobreexpresión del gen PrP en el cerebelo de animales con scrapie natural. Estasobreexpresión también se ha observado para el gen SOD en el cerebelo de animales conscrapie. La principal función antioxidante atribuida a la PrPc se basa en su capacidad de re-gular la actividad de la enzima SOD [37, 250, 251]. Por un lado, la actividad de SOD depen-de de la disponibilidad del Cu2+ y por otro lado se conoce la capacidad de la PrPc de unir Cu2+

e internalizarlo en el citoplasma. En 1998, Brown y cols. [37] demostraron la relación entrela PrPc y la SOD en el sentido de que la actividad de SOD aumenta bajo una sobreexpresiónde PrPc y por el contrario, una falta de PrPc provoca una disminución de la actividad de SOD.Cabe destacar como el aumento de la PrPc no refleja necesariamente un aumento de los nive-les de la proteína SOD o de su mRNA [37, 231]. En este trabajo, se ha observado un aumen-to de los niveles de SOD en las muestras de cerebelo de animales con scrapie, sugiriendo unadoble defensa antioxidante a través del aumento de la presencia del enzima SOD y medianteel aumento de su actividad enzimática por medio del incremento de la PrPc.

La familia de las proteínas 14-3-3 comprende un conjunto de proteínas altamente con-servadas, con múltiples funciones reguladoras y con implicación en diversos procesos celu-lares [82, 186]. Cabe destacar su función protectora de promover la supervivencia neuronalante la apoptosis por medio de su interacción con otras proteínas [308] [46] [309] [305]. Enmamíferos, se han descrito hasta siete isoformas diferentes con distinta distribución, locali-zación celular o distinta regulación de la expresión, pero que comparten el mismo dominio deinteracción con otras proteínas. Se desconoce el papel de esta familia en enfermedades porpriones, sin embargo, se ha detectado la presencia de estas proteínas en el líquido cerebroes-


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pinal de enfermedades priónicas humanas y animales, por lo que han sido consideradas comoposibles marcadores de enfermedad priónica [14, 139, 279]. Cabe destacar la existencia deuna regulación diferencial de estas proteínas en ratones con scrapie experimental, depen-diente de la isoforma de la que se trate y de su localización tisular [15]. En el presente estu-dio, mientras que en las muestras del cerebelo y obex de animales afectados de scrapie se haobservado una desregulación del gen 14-3-3 zeta, en el cerebelo ha tenido lugar una sobre-expresión.

La sobreexpresión de los genes PrP, SOD y 14-3-3 zeta observada en el cerebelo de losanimales con scrapie podría estar indicando una respuesta global de neuroprotección. Sin em-bargo, no se han detectado depósitos de PrPSc en esta región. Esta situación induce a pensaren la existencia de depósitos iniciales de PrPSc aún indetectables por inmunohistoquímica queserían insuficientes para activar el mecanismo glial pero capaces de activar el mecanismoneuroprotector mediado por los genes PrP, SOD y 14-3-3 zeta para contrarrestar una toxici-dad primaria desencadenada por esas partículas aún indetectables de PrPSc. En contraposición,el cerebro y el obex, donde se detectaron depósitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reac-tiva, mostraría la situación contraria. La expresión constitutiva observada para los genes PrPy SOD podría interpretarse como una situación de neuroprotección reducida, la desregulacióndel gen 14-3-3 zeta podría tener un efecto negativo en la supervivencia neuronal y la sobre-expresión de los genes GFAP y catepsina-S confirmaría la activación de la glía. Además, lapérdida del papel neuroprotector de la PrPc debida a su conversión en PrPSc debería tenerse encuenta en el obex y en el cerebro de los animales con scrapie.

Numerosos estudios basados en infecciones experimentales por priones, en cultivos ce-lulares o en scrapie natural han demostrado como la apoptosis es la principal vía de muerteneuronal en las EETs [89, 103, 255]. Existen una serie de estímulos pro-apoptóticos que a tra-vés de señales en cascada llevan a las neuronas hacia una muerte por apoptosis (TNF, Fas,Bax o caspasa-3) o hacia la supervivencia a través de citoquinas, factores de crecimiento ygenes anti-apoptóticos como el Bcl-2 y el Mcl-1. El presente trabajo ha revelado un cambioen el perfil de expresión de los genes pro-apoptóticos como la caspasa-3 en scrapie natural yuna expresión constitutiva de los genes Bcl-2, Mcl-1 y Bax. Las caspasas son un grupo de cis-tein aspartil proteasas que intervienen en el mecanismo de la apoptosis. Muchas de las seña-les apoptóticas convergen en la activación de la caspasa-3, la cual es la responsable de loscambios morfológicos y bioquímicos de la muerte por apoptosis. Aunque se conoce la in-ducción de la apoptosis por PrPSc a través de la caspasa-3 [126, 127, 150, 262], no se puedendescartar otras vías alternativas [248]. Se ha propuesto una asociación entre la activación dela caspasa-3 y la formación de b-amiloide [11, 100, 238]. Además la caspasa-3 puede romperenzimáticamente las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 eliminando sus propiedades anti-apoptóticas ya su vez liberando señales pro-apoptóticas similares a Bax [58, 60, 287]. En contra de lo quese esperaba, en el presente trabajo se ha detectado una desregulación altamente significativadel gen de la caspasa-3 en las muestras de cerebro de los animales con scrapie. Esta desregu-lación podría traducirse en bajos niveles de caspasa-3 susceptible de ser activada, retrasandode esta forma las consecuencias de la apoptosis. La proteína Bcl-2 está considerada comoanti-apoptótica contrarestando el estrés mitocondrial mediado por Bax, y de este modo pre-


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viniendo la liberación del citocromo C y la subsiguiente activación de las caspasas [200, 246,284, 310]. Aunque no se han encontrado diferencias significativas en el trabajo presentado,se ha observado una menor expresión del gen Bcl-2 y una mayor expresión del gen Bax en elcerebro de animales afectados por scrapie en comparación con el grupo control. Park y cols.[211] mediante la técnica de RT-PCR, encontraron resultados similares en ratones infectadoscon la cepa de scrapie 263K.

Analizando de forma conjunta todos los resultados obtenidos, se puede pensar que losdiferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de los animalescon scrapie podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia molecular delscrapie. Una vez que el prión alcanza el SNC, la aparición de lesiones en el obex precede asu detección en cerebro y posteriormente en el cerebelo. Puesto que no se detectaron depósi-tos de PrPSc en el cerebelo de estos cuatro animales en una fase clínica de la enfermedad, lasituación observada en el cerebelo podría extrapolarse a lo que sucedería en los estadios ini-ciales de la patogenia del scrapie, primero en el obex y después en el cerebro. De esta forma,mientras el cerebelo mostró una respuesta global neuroprotectora en un intento de mantenerla homeostasis celular contra los efectos tóxicos de los depósitos iniciales de PrPSc, el perfilde expresión observado en el obex y cerebro corresponderían a un estadio patológico másavanzado. Por lo tanto, en un estadio temprano de la enfermedad, el obex y el cerebro mos-trarían un perfil similar al encontrado por este estudio en el cerebelo. Sin embargo, para con-firmar esta deducción, serían necesarios posteriores ensayos con infecciones experimentalescontroladas. Además, no se puede descartar la participación de otros mecanismos como laexistencia de una respuesta específica de tejido.

En resumen, los resultados presentados en este trabajo proporcionan información adi-cional para comprender la complejidad de la patogenia molecular del scrapie natural. Cono-cer el papel de estos genes en las enfermedades por priones puede ser muy util para el desa-rrollo de terapias de control, tratamientos y para en el desarrollo de tests diagnósticosante-morten.


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CONCLUSIONES

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1. Se han desarrollado dos protocolos para la determinación de los polimorfismos en los co-dones 136, 154 y 171 del gen PrP. El primer protocolo basado en el método de PCR-RFLPes sencillo, no requiere una inversión elevada y se puede implantar en cualquier laborato-rio de biología molecular. El segundo protocolo, basado en la detección de SNPs median-te la técnica de PCR a tiempo real, requiere cierta inversión económica inicial que se vecompensada por la capacidad de procesar un gran número de muestras en poco tiempo, re-sultando idóneo para laboratorios de diagnóstico con una carga de trabajo media-alta.

2. Las razas autóctonas de la CAPV presentan una susceptibilidad genética frente a scrapierelativamente alta. Así, aunque la frecuencia de los genotipos asociados a mayor riesgo(T5) fue relativamente baja (3.5%), el genotipo asociado con susceptiblidad ARQ/ARQpresentó la mayor prevalencia (49.3% en Latxa y 38.0% en Carranzana).

3. El análisis de estabilidad de la expresión de seis genes endógenos en seis tejidos ovinos,ha permitido obtener diferentes grupos de genes de referencia para los seis tejidos estu-diados. El procedimiento seguido y los resultados obtenidos sirven de referencia para otrosestudios de expresión génica en animales sanos o con scrapie.

4. Existe cierta tendencia al aumento en los niveles de mRNA del gen PrP a medida que au-menta la susceptibilidad genética, sin embargo, los resultados obtenidos no apoyan de ma-nera clara la existencia de una relación entre la expresión del gen PrP y la susceptibilidadgenética a scrapie.

5. Además de la sobreexpresión del gen GFAP previamente descrita por otros autores, se hadescrito por primera vez en scrapie natural la alteración de genes relacionados con la glía(catepsina-S), el estrés oxidativo (SOD), la apoptosis (caspasa-3), así como de los genes14-3-3 zeta y PrP.

6. Los diferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de losanimales enfermos podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia mo-lecular del scrapie. La respuesta global neuroprotectora observada en el cerebelo de ani-males en una fase clínica de la enfermedad pero sin depósitos de PrPSc, podría extrapolar-se a lo que sucedería en los estadios iniciales de la patogenia del scrapie, primero en elobex y después en el cerebro. El perfil de expresión observado en el obex y cerebro don-de se detectaron depósitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reactiva, corresponderían aun estadio patológico más avanzado.

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RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA

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RESUMEN

El scrapie es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a ovejas y cabras, que se in-cluye dentro del grupo de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs). Según la hi-pótesis más aceptada hasta el momento, el agente causal es una única proteína llamada prióno PrPSc. Esta proteína sería el resultado de un cambio conformacional de una proteína de idén-tica estructura primaria y codificada por el hospedador, la PrPc. Antes de la aparición del pri-mer caso de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) en el año 1986, la preocupación porel scrapie se debía a las pérdidas económicas y el interés por esta encefalopatía se centrabaen conocer su transmisibilidad con el fin de erradicarla. Sin embargo, a partir de su posibleimplicación en la aparición de la EEB y más aún, indirectamente con la aparición de casoshumanos asociados al consumo de carne contaminada con EEB, se produjo una crisis ali-mentaria de gran magnitud que incrementó la preocupación y el interés por el scrapie.

La incidencia del scrapie a nivel mundial es muy variable siendo en el Reino Unidodonde se han concentrado la mayor parte de los casos. En la CAPV el número de casos es muybajo y no parece suponer un problema de primer orden (5 brotes hasta junio de 2005). Sin em-bargo, la mayor incidencia del scrapie en otras comunidades así como el alto número de ca-sos en una raza similar de los Pirineos Atlánticos, alimentan y mantienen la preocupación porel scrapie. Una de las estrategias más extendidas para erradicar el scrapie consiste en la se-lección genética de animales resistentes a la enfermedad. Esta predisposición genética se en-cuentra ligada a una serie de polimorfismos del gen PrP que confieren susceptibilidad o re-sistencia a scrapie. Los animales con el genotipo ARR/ARR para los codones 136, 154 y 171presentan la mayor resistencia en comparación a los animales con el genotipo VRQ/VRQ demayor susceptibilidad. En este sentido en el presente trabajo se han desarrollado dos métodospara la detección de estos polimorfismos que han permitido conocer el riesgo hipotético fren-te a scrapie en las razas autóctonas de la CAPV (Latxa y Carranzana). El análisis de una mues-tra representativa de estos animales ha revelado como estas razas poseen una sensibilidad ge-nética media-alta a scrapie, sin embargo, la baja incidencia de casos positivos en las mismashace que la selección genética en estos animales deba realizarse con cautela.

Una de las razones de esta susceptibilidad genética parece encontrarse en la secuenciaaminoacídica de la proteína PrPc. Diversos estudios han demostrado la existencia de diferen-cias en la velocidad del cambio conformacional de PrPc a PrPSc dependiendo de su combina-ción aminoacídica. La variante resistente ARR/ARR presenta menor velocidad de cambioconformacional que la variante susceptible VRQ/VRQ. En este trabajo se han estudiado lasbases moleculares de la susceptibilidad genética desde otro punto de vista. Se han analizadoy comparado los niveles de expresión del gen PrP con la susceptibilidad genética a scrapiecon el fin de testar la hipótesis de que en los animales de mayor sensibilidad genética tuvie-ra lugar una mayor expresión del gen PrP y con ello una mayor presencia de precursor PrPc

susceptible de ser transformado en PrPSc. Para ello, se ha empleado un método de cuantifica-ción de mRNA muy preciso, la RT-PCR a tiempo real unido a la cuantificación relativa. Enprimer lugar se ha llevado a cabo un análisis de la estabilidad de genes endógenos suscepti-bles de ser usados como genes de referencia. Como resultado, se han identificado diferentes

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grupos de genes endógenos para la normalización de la expresión en cada uno de los seis te-jidos estudiados (cerebro, cerebelo, obex, bazo, nódulo linfático mesentérico e íleon). Unavez normalizada su expresión utilizando los genes endógenos correspondientes se ha obser-vado cierta tendencia a un aumento en los niveles del mRNA del gen PrP a medida que au-menta la susceptibilidad genética a scrapie en los tejidos del sistema nerviosos central. Sinembargo, las diferencias encontradas han sido marginales por lo que no se ha podido concluirque exista una relación entre la susceptibilidad genética a scrapie y los niveles de mRNA delgen PrP.

Como último abordaje experimental de este trabajo, se han estudiado también algunosaspectos de la patogenia molecular del scrapie. En esta encefalopatía así como en otras EETstienen lugar una serie de lesiones y alteraciones comunes a nivel microscópico tales como unaactivación de la glía, el estrés oxidativo y la neurodegeneración por apoptosis. Parte de estasalteraciones se presentan también en otras enfermedades neurodegenerativas humanas comoel Parkinson y el Alzheimer por lo que el estudio del scrapie podría ayudar a comprender me-jor este grupo de enfermedades. Se ha realizado un análisis de los niveles de expresión de nue-ve genes relacionados con la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis, laapoptosis, así como del gen PrP, en el cerebro, cerebelo y obex de animales sanos y con scra-pie clínico. El empleo de la RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa ha permitido de-tectar alteración de genes relacionados con la glía (GFAP y catepsina-S), el estrés oxidativo(SOD), la apoptosis (caspasa-3), el gen 14-3-3 zeta y el gen PrP en los animales con scrapie.Los diferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de los ani-males con scrapie podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia molecu-lar del scrapie. La respuesta global neuroprotectora observada en el cerebelo de animales enuna fase clínica de la enfermedad pero sin depósitos de PrPSc, podría extrapolarse a lo que su-cedería en los estadios iniciales de la patogenia del scrapie, primero en el obex y después enel cerebro. El perfil de expresión observado en el obex y cerebro donde se detectaron depó-sitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reactiva, corresponderían a un estadio patológicomás avanzado. Estos resultados proporcionan valiosa información para comprender mejor lacomplejidad de la patogenia molecular del scrapie natural.


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SUMMARY

Scrapie is a neurodegenerative disease included in the group of Transmissible Spongi-form Encephalopathies (TSE) that affects sheep and goats. According to the most acceptedhypothesis, the prion protein PrPSc is the only causative agent. This protein is the result of aconformational change of a protein with the same primary structure coded by the host, PrPc.Prior to the first case of Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) occurred in 1986, scrapieconcern focused on the economical losses caused by the disease and scientific interest cen-tred on the study of its transmissibility with the aim of eradicating it. However, the food safe-ty crisis occurred after the hypothetical implication of scrapie in BSE and indirectly in the ap-pearance of human cases associated to the consumption of meat from cows with BSE,increased the concern and the interest in scrapie.

The incidence of scrapie varies significantly in different countries, but most of the cas-es have been recorded in the United Kingdom. In the Basque Country, the number of cases isquite low and it does not seem to be a problem (five outbreaks up to June 2005). However,due to the higher incidence in other regions of Spain, and the high number of scrapie cases ina similar breed of the Atlantic Pyrenees, the problem of scrapie cannot be ignored. One of themost extended strategies to eradicate the disease is based on the genetic selection of scrapieresistant animals. This genetic resistance is linked to several polymorphisms of the PrP genewhich confer different levels of susceptibility or resistance to the disease. Animals withARR/ARR genotype for 136, 154 and 171 codons show the highest resistance to scrapie inopposition to those with VRQ/VRQ genotype, which has been associated to the highest risk.In this sense, in the present work two methods have been developed to detect these polymor-phisms. These methods were applied to a representative sample of the sheep population of theBasque Country breeds (Latxa and Carranzana). The results showed that these breeds have amedium-high susceptibility to suffer scrapie, although the low incidence of clinical casescalls for caution in the application of genetic selection.

This genetic susceptibility seems to be linked to the aminoacidic sequence of the PrPc

protein. Several studies have revealed the existence of differences in the rate of PrPc conver-sion into PrPSc associated to different aminoacidic combinations. This conformational changehas been demonstrated to be slower in animals with the resistant variant ARR/ARR than inthose with the susceptible VRQ/VRQ genotype. In this work the molecular bases of this ge-netic susceptibility have been studied from another point of view. The expression levels of thePrP gene were compared with the genetic susceptibility to scrapie with the aim to test the hy-pothesis that animals with the highest susceptibility show the highest expression levels of PrPmRNA and thus, a higher presence of precursor PrPc susceptible of being transformed intoPrPSc. For this purpose, an accurate quantification method to measure the mRNA was used,real time RT-PCR and relative quantification. Previous to the PrP gene expression analysisthe stability of six housekeeping (ACTB, GAPDH, SDHA, G6PDH, YWHAZ and RPL19)genes was assessed in order to select the best ones for relative quantification. This analysisshowed a large tissue-associated variation and identified a different and specific set of HKgenes for each tissue. The normalised PrP gene expression showed a tendency towards in-


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creased PrP mRNA levels and genetic susceptibility in central nervous system. However, thedifferences found were only marginal and therefore, the results did not support the hypothe-sis that PrP mRNA levels vary between genotypes. Finally, some aspects of the molecularpathogenesis of scrapie were also investigated as part of this study. Several lesions and alter-ations like glial activation, oxidative stress and neurodegeneration via apoptosis are commonto this and other TSEs. Some of these alterations do also occur in human neurodegenerativediseases like Parkinson and Alzheimer, and therefore, studies on scrapie could help to betterunderstand these important human diseases. As part of this study, the levels of nine genes re-lated to glial activation, homeostasis maintenance, apoptosis as well as the PrP gene, wereanalysed in the cerebrum, cerebellum and obex of healthy and scrapie affected animals. Theresults showed an alteration in genes related to glia (GFAP and cathepsin-S), oxidative stress(SOD), apoptosis (caspase-3) and changes in 14-3-3 and PrP genes in animals with naturalscrapie. The different expression profiles found in the three brain areas of scrapie-affected an-imals might reflect the spatial-temporal distribution of scrapie molecular pathogenesis. Theglobal neuroprotective response observed in cerebellum of animals with a clinical stage of thedisease where PrPSc aggregates were not found, could be extrapolated to what could occur inthe initial stages of scrapie pathogenesis firstly in obex and after in cerebrum. The expressionprofile observed in obex and cerebrum where PrPSc aggregates, neuronal lesions and reactiveglia were found, would correspond to a later pathological stage. These results provide addi-tional information to understand the complexity of natural scrapie molecular pathogenesis.


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LABURPENA

Scrapie-a ardi eta ahuntzei endekapen neurologikoa eragiten dien, Entzefalopatia Es-pongiforme Transmitigarri taldeko gaixotasuna da. Oraindaino hipotesi onartuena kontutanharturik, prioi edo PrPSc deituriko proteina baten eragina litzateke berau. Proteina hau ostala-riak berak kodifikaturiko PRPc proteinaren aldaketa konformazionalaren ondorioa litzateke,oinarrizko egitura bera luketelarik biek. Hasiera batean, Behi Entzefalopatia Espongiformelehen kasua 1986. urtean agertu aurretik, Scrapie-ak eragiten zuen kezka nagusia sor zitza-keen galera ekonomikoen araberakoa zen eta entzefalopatia honen interesaren funtsa, erradi-katzeko asmotan, transmititzeko moduaren ezagutzan legoke. Interes eta kezka hau berriz,ikaragarri areagotu zen Behi Entzefalopatia Espongiformearen agerpenean izan zezakeeneraginarengatik eta kutsaturiko haragiaren kontsumoarekin erlazionaturiko gizaki kasu ager-penekin bat,

Scrapie-aren mundu zeharreko hedapena oso aldakorra da, Erresuma Batua izanik kasugehien pairatzen duen herrialdea. Euskal Autonomia Erkidegoan berriz, kasu kopurua oso ba-xua da (2005ko ekaina arte 5 agerraldi) oinarrizko arazoa izatetik urrun dagoelarik. Hala ere,ezin begi bistaz galdu behar, beste komunitate batzuetan eta Pirinio Atlantikoan antzerakoarraza batek jasaten duen kasu kopuru altua kontutan hartuz. Scrapie-a erradikatzeko dara-bilten estrategia zabalduena gaixotasunarekiko erresistentzia duten animalien hautespen ge-netikoan oinarritzen da. PrP genean gertzen diren polimorfismo batzuk dira animaliek gaixo-tasunarekiko erresistentzia edo sentikortasun gehiago izatearen gakoa. 136, 154 eta 171kodoietarako ARR/ARR genotipodun animaliek dute erresistentzia gehien, VRQ/VRQ senti-kortasun gehien duten animalien aurrean. Bide hau jorratuz, lan honetan polimorfismo hauekdetektatzeko bi metodo garatu dira, bide batez, Elkarte Autonomikoan dauden bertako arra-zek (Karrantzakoa eta latxa) Scrapie-a jasateko duten arrisku hipotetikoa ikuskatuz. Anima-lia hauen lagin adierazgarria aztertuz, arraza hauek sentsibilitate genetiko ertain-altua dutelaondoriozta daiteke, hau Elkarte Autonomikoan jasaten den kasu kopuru baxuarekin kontraja-rriz eta beraz, hemen behintzat, selekzio genetikoaren estrategia bidezko erradikapena kontuhandiz bideratuz.

Sentikortasun genetiko honen arrazoietako bat PRPc aminoazido sekuentzian legoke.Lan desberdinek, aminoazido sekuentzien araberako PrPc –tik PrPSc –rako aldaketa konforma-zionalaren abiaduran desberdintasunak frogatu dituzte. ARR/ARR aldaki- erresistenteakVRQ/VRQ aldaki-sentikorrak baino aldaketa konformazional abiadura geldoagoa du. Lan ho-netan, sentikortasun genetikoaren oinarri molekularrak beste ikuspuntu batetik aztertu dira.PrP genearen espresio mailak aztertu eta Scrapie-arekiko sentikortasun genetikoarekin aldera-tu dira, honela sentsibilitate genetiko handiagoa duten animaliek, PrP genearen espresio han-diagoa eta beraz, PRPSc egoerara aldatzeko aukera handiagoa duten PrPc prekurtsorearen pre-sentzia handiagoa luketen hipotesia landuz. Horretarako RNA mezularia kuantifiatzen duenmetodo oso zehatza erabili da; denbora errealeko RT-PCRa kuantifikazio erlatiboarekin bat.

Lehenik, erreferentzi gene bezela erabiltzeko, gene endogenoen egonkortasun-analisiaburutu da. Ehunaren arabera gene endogeno talde deserdinak lortu dira, gene normalizatzai-


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le gisa erabiliz. Honek, PrP geneko RNA mezulari mailaren handitze joera dagoela sentikor-tasun genetikoaren handitzearekin batera behatzea ahalbideratu du. Hala ere, aurkikuntzarendiferentzia eskasiak ez du erlazioa dagoenaren ondorioztatzea suposatu.

Lan honen azken txanpa gisa, Scrapie-aren patogenia molekularraren zenbait atal az-tertu dira. Beste hainbat Entzefalopatia Espongiforme Transmitigarrietan bezala entzefalopa-tia honetan, maila mikroskopikoan, lesio eta asaldura amankomun batzuk ageri dira, halanola, gliaren aktibazioa, estres oxidatiboa eta apoptosi bidezko neuroendakapena. Gizakiekpairatzen dituzten Parkinson eta Alzheimer gisako endekapen neurologikozko hainbat gaixo-tasunetan ere antzerako asaldurak agertzen direnez, Scrapie gaixotasunaren ikasketak, gisahonetako hainbat gaixotasun hobeto ezagutzen lagun lezake. Gliaren aktibazioan, homeosta-siaren mantenuan eta apoptosian eragina duten bederatzi generen eta animalia osasuntsu zeinScrapie klinikoa duten PrP genearen garun, zerebelo eta obex espresio mailako azterketa bu-rutu da. Denbora errealeko RT-PCRak eta kuantifikazio erlatiboak, gliaren aktibazioarekinzerikusia duten genetan (GFAP eta catepsina-S), estres oxidatiboarekin zerikusia dutenetan(SOD), apoptosiarekin (caspasa-3), 14-3-3 zeta genean eta Scrapie gaixotasunadun PrP ge-nean gertaturiko alterazio genetikoak detektatzea ahalbideratu dute.

Scrapie-dun animalien entzefalo gune desberdinetan ikusitako espresio profil desber-dinek, Scrapie-aren patogenia molekularraren espazio-denbora kokapena adieraz lezake.PrPSc metaketa gabeko gaixotasunaren fase klinikoan, zerebeloan ikus daitekeen erantzunneurobabesle orokorra, Scrapie patogeniaren hasierako estadioetan, lehenik obexean eta on-doren garunean gerta daitekeenaren adierazle zatekeen. PrPSc metaketak antzeman diren obexeta garunean ikusitako espresio perfilak, lesio neuronalak eta berraktibatutako glia, estadiopatologiko aurreratu baten adierazle lirateke. Emaitza hauek Scrapie naturalaren patogeniamolekularraren konplexutasuna hobe ulertzen lagun dezakete.


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TESIS DOCTORALES PUBLICADAS

1. La raza Latxa: Sistemas de producción y características reproductivas. EDUARDO URIAR-TE EGURCEGUI

2. Estudio y puesta a punto de un método simplificado de control lechero cualitativo en la razaovina Latxa y su inclusión en el plan de selección. GUSTAVO ADOLFO MARÍIA LEVRINO

3. Implicaciones tecnológicas de la composición química del pescado con especial referen-cia a los lípidos. ROGELIO POZO CARRO

4. Estudio de suelos de Vizkaia. MARGARITA DOMINGO URARTE

5. El Maedi o neumonía progresiva en el conjunto de las enfermedades respiratorias cróni-cas del ganado ovino en la Comunidad Autónoma Vasca. LORENZO GONZÁLEZ ANGULO

6. Estudio experimental de las fases iniciales de la paratuberculosis ovina. RAMÓN A. JUS-TE JORDAN

7. Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación porelementos metálicos de sedimentos de ríos. ESTILITA RUIZ ROMERA

8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLVARO AU-NOS GÓMEZ

9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS)para la fertilización de las praderas permanentes. MARTA RODRÍGUEZ JULIA

10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TE-RESA SANCHO ORTIZ

11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo trasel enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA

12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria enla Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS

13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.):caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA

SALAZAR BAYONA

14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebañosde ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ

15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Co-munidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTÍNEZ

16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicusBoiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO

17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa.MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA

18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influen-cia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZA-RRALDE

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19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos am-biental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA

20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Au-tónoma del País Vasco. J.J. ADURIZ RECALDE

21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfoló-gicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ

22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ

23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicasdel queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA

24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Ma-riano GÓMEZ FERNÁNDEZ.

25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas demaíz. GOTZONE GARAY SOLACHI

26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES

27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTU-BAY FUENTES

28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características mi-crobiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISO J. PÉREZ ELORTONDO

29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO

30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis capri-na y ovina por Mycobacterium bovis. Mª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA

31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa(Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca dela trucha. ROSA Mª ECHARRI TOMÉ

32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia delos procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISA-BEL NÁJERA ORTIGOSA

33. Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitroge-nados durante la maduración del queso Idiazabal. Mª SOLEDAD VICENTE MARTÍN

34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y vi-rus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad AutónomaVasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA

35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador,de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO

36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuestainmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS

37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN

EXTRAMIANA ALONSO

38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA

MERCEDES GARCÍA GOTI

39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los reba-ños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS

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40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio His-tórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO

41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuber-culosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU

42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bo-vino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS

43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Meto-dología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS

44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micro-mamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural.HORACIO GIL GIL

45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoracióne introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU

46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en laviabilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE

47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfer-medad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces.RAQUEL ARANGUREN RUIZ

48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detec-ción, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS

49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de pro-ducción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA

50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploi-de. LEIRE BARANDALLA URTIAGA

51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolí-ticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO

52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlán-tico Norte. Josu Santiago Burrutxaga

53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónomade euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRIGUEZ

54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., “cv Derio”)en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER

55. Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genéti-ca y Patogenia Molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO

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