Las LipasasLas Lipasas : :

Aplicaciones en BiotecnologíaAplicaciones en Biotecnología

DefiniciónDefinición : :

Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se define como una carboxilesterasa capaz define como una carboxilesterasa capaz de catalizar de catalizar la hidrólisis y la la hidrólisis y la síntesissíntesis de acilgliceroles de cadena de acilgliceroles de cadena larga, teniendo como sustrato standard larga, teniendo como sustrato standard a la trioleina. a la trioleina.

Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasasAcilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas

Origen de las lipasasOrigen de las lipasas::

•Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en:encontradas en:Microorganismos Microorganismos PlantasPlantasAnimales Animales

•Comercialmente en su mayoría son de origen Comercialmente en su mayoría son de origen microbianomicrobianoHongosHongosBacteriasBacteriasLevadurasLevaduras

•Generalidades Generalidades Peso molecular 20-60 kDPeso molecular 20-60 kDContienen 2-15% de carbohidratosContienen 2-15% de carbohidratospH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianaspH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianasTopt = 30-60Topt = 30-60 o oCC

Lipasas disponibles Lipasas disponibles comercialmentecomercialmente

Origen de la lipasaOrigen de la lipasa % de % de proteínaproteína

Actividad Actividad vs vs

Trioleína Trioleína U/mgU/mg

Bandas Bandas SDS-PAGE SDS-PAGE

kDkD

bandas bandas SDS-PAGE SDS-PAGE

Número Número de de

bandas bandas esterasaesterasa

% de % de actividad actividad proteolíticproteolític

aa

Rhizomucor mieheiRhizomucor miehei 3.53.5 1616 2525 55 22 11

Rhizopus spec.Rhizopus spec. 4.84.8 3232 43, 6743, 67 1010 44 33

Humicola lanuginosaHumicola lanuginosa 2.92.9 1010 20,3020,30 44 22 2020

Candida rugosa ICandida rugosa I 4.24.2 1111 20,30,43,20,30,43,67,9067,90

1313 22 <1<1

Candida rugosa IICandida rugosa II 6.46.4 1414 43,6743,67 1111 22 <1<1

Geotrichum candidumGeotrichum candidum 4.34.3 88 6767 33 00 <1<1

Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens 1.21.2 3030 14,25,40,14,25,40,4343

66 33 <1<1

C.viscosum IC.viscosum I 1.11.1 4545 17,30,4017,30,40 33 11 00

C. viscosum IIC. viscosum II 9.59.5 154154 17,30,4017,30,40 33 11 1212

Pureza de lipasas disponibles comercialmentePureza de lipasas disponibles comercialmente

Origen de la lipasaOrigen de la lipasa ObservacionesObservaciones

Candida rugosa (CRL)Candida rugosa (CRL) Inicialmente clasificado como Inicialmente clasificado como Candida Candida cylindracea,cylindracea, clonación y purificación de la clonación y purificación de la proteína revela al menos cinco isoformas. proteína revela al menos cinco isoformas.

Geotrichum candidum (GCL)Geotrichum candidum (GCL) Contiene dos isoformas que se diferencían en la Contiene dos isoformas que se diferencían en la especificidad especificidad cis o transcis o trans en acidos grasos en acidos grasos insaturadosinsaturados

Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL)Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL) En la literatura se reportan diferentes En la literatura se reportan diferentes especificidades aunque la clonación reveló especificidades aunque la clonación reveló identidad casi total. identidad casi total.

Penicillium camembertii Penicillium camembertii (PeCL)(PeCL)

Clasificada como lipasa de Clasificada como lipasa de P. cyclopiumP. cyclopium hasta hasta 1990, recientemente se encontraron cuatro 1990, recientemente se encontraron cuatro isoformas que difieren principalmente en el isoformas que difieren principalmente en el patrón de glicosilaciónpatrón de glicosilación

Pseudomonas glumae (PGL)Pseudomonas glumae (PGL) Clonación y secuenciación reveló alta identidad Clonación y secuenciación reveló alta identidad con la lipasa de con la lipasa de Chromobacterium viscosumChromobacterium viscosum (CVL).(CVL).

Pseudomonas cepacia (PCL)Pseudomonas cepacia (PCL) Reclasificada en 1995 como Reclasificada en 1995 como Burkholderia Burkholderia cepaciacepacia. Clonación y secuenciación reveló . Clonación y secuenciación reveló identidad con la lipasa de identidad con la lipasa de Pseudomonas. sp.Pseudomonas. sp. ATCC21808 (PSL).ATCC21808 (PSL).

Controversias en las propiedades de lipasas Controversias en las propiedades de lipasas disponibles comercialmentedisponibles comercialmente

Clasificación reciente basada en los motivos Clasificación reciente basada en los motivos conservados de su secuencia y en sus conservados de su secuencia y en sus

propiedades biológicaspropiedades biológicas

Propiedades estructurales : Plegamiento común de Propiedades estructurales : Plegamiento común de las lipasaslas lipasas

•Patrón de plegamiento / compuesto por un “core” de hebras rodeado por helices tipico de numerosas hidrolasas

•El sitio activo esta compuesto de una triada catalítica formada por Ser-His-Asp/Glu

•A diferencia de muchas enzimas el sitio catalítico no esta expuesto en la superficie, se encuentra cubierto por residuos hidrofóbicos

Asp/GluAsp/Glu

HisHisSerSer

C

24

3 5 6 7 8

N

A B CD

F

En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasasEn blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de las lipasasLas hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta

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Mecanismo de activación interfacial en las Mecanismo de activación interfacial en las lipasaslipasas

•El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una “tapa” formada por un “loop”

•Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta

•Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal

•Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa

C) estructura cerradaC) estructura cerrada D)estructura abiertaD)estructura abierta

Mecanismo de activación interfacial en las Mecanismo de activación interfacial en las lipasaslipasas

•La presencia de la tapa cubriendo el sitio activo de las lipasas y el fenómeno de activación interfacial no adecuado para distinguir lipasas de esterasas.

•Varias enzimas tienen la tapa hidrofóbica pero no presentan activación interfacial

•p.e. Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa, C.antarctica B, y lipasa pancreática, lipasa

•Vista de arriba de la lipas de Vista de arriba de la lipas de Mucor miehei Mucor miehei

•En En rojorojo zonas polares y en zonas polares y en azulazul zonas zonas hidrofóbicashidrofóbicas

•En En amarilloamarillo sitio activo sitio activo

C) estructura cerradaC) estructura cerrada D)estructura abiertaD)estructura abierta

Acceso al sitio catalítico de las lipasasAcceso al sitio catalítico de las lipasas

Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el sitio activo : Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol

sn3

RO

OR

OR

sn1

sn2

La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos sitios determina la especificidad de cada lipasa

Especificidad por el tamaño de la cadena aciladaRegioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3

Sitio activo y especificidad en lipasasSitio activo y especificidad en lipasas

Asp

O

O

H

N

N

His

H

Ser

O

O

R

O

R2

Asp

O

O

N

N

H

His

Ser

O

R

O

R2

O

H

Asp

O

O

N

N

H

His

Ser

O

R

O

R1

O

H

+Intermediario acil-enzima

Asp

O

O

H

N

N

His

H

Ser

O

O

R

O

R1

Asp

O

O

N

N

H

His

Ser

O

H

O

O

R

H

donador de acilo

Asp

O

O

N

N

H

His

Ser

O

H

O

O

R

R2

PRODUCTO

+

R2

O

H

R1

O

H

Mecanismo catalíticoMecanismo catalítico

Reacciones catalizadas por las Reacciones catalizadas por las lipasaslipasas

OO

RR11 OROR22

++ HH22OOOO

RR11 OHOH++ RR22OHOH

HidrólisisHidrólisis

OO

RR11 OHOH++ RR22OO ++ HOHHOH

EsterificaciónEsterificaciónOO

RR OHOH++ RR22OHOH ++ HOHHOH

EsterificaciónEsterificación

OO

RR33 OHOH++

OO

RR11 OROR22

TransesterificaciónTransesterificación

OO

RR11 OHOH++

OO

RR33 OROR22

OO

RR11 OROR22

++ ++++ ++ RR22OHOH

OO

RR11 OROR33RR33OHOH

OO

RR11 OROR22

AcidólisisAcidólisis

AlcoholisisAlcoholisis

O

R3 OR4

+O

R1 OR2

InteresterificaciónInteresterificación

O

R1 OR4

+O

R3 OR2

O

R1

+O

R OR2

+ R3NH2 + R2OH

AminólisisAminólisis

O

R1 NHR3

O

R1 OH+ + HOH

O

R OH+ R2SH + HOH

TioesterificaciónTioesterificaciónO

R1 SR2

O

R1

+O

R OH+ R3NH2 + HOH

AmidaciónAmidación

O

R1 NHR3

(cont.)(cont.)

Control del equilibrio termodinámico del proceso

Control del grado de acilación de polioles

Monoésteres, Diésteres, Triésteres……..

O

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

n

-Emulsificantes para especialidades farmacéuticas-Vehículos para medicamentos-Bloques de construcción en síntesis orgánica

Actividad termodinámica: a = X = coeficiente de actividadX = fracción mol

El coeficiente de actividad termodinámica función del número del número y tipo de interacciones soluto-solvente

Control de la posición del equilibrio termodinámico

Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales

•Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de

sus coeficientes de actividad

•Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de

sus coeficientes de actividad

O

H

O

H

O

H

O

H

R

C

O

O

O

H

R

C

O

O

R

C

O

O

O

H

R

C

O

O

R

C

O

O

O

O

C

R

glycerol monoacylglycerol diacylglycerol triacylglycerol

RCOOH

H2O

fatty acid

RCOOH

H2O

fatty acid

RCOOH

H2O

fatty acid

•Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente,

baja concentración al equilibrio

•Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente,

alta concentración al equilibrio

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

monooleína

dioleína

dioleína

dioleína

dioleínadioleína

dioleína

trioleína

trioleína

trdioleína

trioleína

•Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M

•Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos

• Baja solubilidad del glicerol

Síntesis enzimática de monooleína : Glicerol + Ácido oléico en n-hexano

trioleina

dioleina

monooleina

•Rendimiento alto: 80%

•Baja selectividad por

monoésteres

•Trioleina 70%

•Dioleina 27%

•-Monooleina 3%

Síntesis selectiva de monoésteres de polioles

051015205075100

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

10100 50 20 15 5 0

75

% de 2M2B en n-hexano

monooleina

dioleina

trioleina

45

35

25

15

5

Modelo de predicción de la síntesis selectiva de monoésteres de polioles

•Cálculo teórico de los

coeficientes de actividad por

UNIFAC

•Calculo de las actividades

termodinámicas de los productos

al equilibrio

•Buena correlación del modelo

con resultados teóricos

0

10

20

30

40

50

60

70

Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis

•Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre 0.5-1 M•Proceso que se puede realizar en reactor contínuo

Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

OH

OHOH

OH

OHCH3 CH3

OOH

O

O

OO

CH3

CH3

CH3CH3

OCO- R

O

O

OO

CH3

CH3

CH3CH3

OCO- R

O

O

OHOH

CH3CH3

OCO- R

OHOH

OH

OH

+

ethanol 95 oC/H+

ethanol 95 oC/H+

ethanol 95 oC/H+

2

RCO-Cl/trietilamina

LipasaRCOOH/45 oC

73

27

55

45

37

63

31

69

6

94

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2M2P/DMSO 80:20(44,9)

2M2P (43,8)

2M2B (41,5)

2M2B/hex 50:50(39,7)

n-hexane (30,9)

monoéster de xylitoldi- and triésteres de xylitol

SolventeParametro de polaridad ET(30)

Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

O

-

A

c

y

l

O

H

O

H

O

H

O

H

O

-

A

c

y

l

O

-

A

c

y

l

O

H

A

c

y

l

-

O

O

H

O

-

A

c

y

l

O

-

A

c

y

l

O

H

O

H

O

H

Xylito

+ Acyl

Hydrophobic solvent mixtures

1-O-mono-acylxylitol

1,5-O-di-acylxylitol 1,3,5-O-tri-acylxylitol

Polar solvent mixtures

+

•Predicción de la abundancia de los prooductos en función de la polaridad del medio de reacción

•Evaluado para un gran número de mezclas de solventes (acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..)

Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30

R1

R2

NH2

R1

R2

OH

R1

R2

NH

R3

OR1

R2

O R3

O

R1

R2

NH

R3

OR1

R2

O R3

O

R1 = - OCH3

R2 = - OH

Vainillilamina

Vainillilalcohol

+ R3- COOH Lipase

+

+

Amida 95%

Amida 54% Ester 95%

Ester 52%

2M2B

n-hexane

Baja actividad termodinámica de ésteres en n-hexano

Baja actividad termodinámica de amidas en 2M2B

Control de la quimioselectividad del proceso

Resolución de mezclas racémicas quimioselectivamente

OH NH2

OHn

O NH2

OHn

RCO OH NH

OHn

OCR

O NH2

OHn

RCO OH NH

OHn

OCR

+ Lipasa

+

(S)R-COOH

(R)

+

(S) (R)

(rac)

70% 30%

n-hexano

2M2B

17% 83%

R1

R2

NH2

OH

OH

O

R2

R3

NH

O

R2

R3R1

R2

OH

R1 = HR2 = - OH

+

R3 = - OMe

ácido ferúlico

Lipasa2M2B

Síntesis preferencial de amidas en 2M2B

Reacción enantioselectiva

Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en células cancerosas

3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide

• Market Share Forecast

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Chiral Technology Market

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

Chiral Technology Market Share Forecast Breakdown 2002-2009

Traditional

Asymmetric

Biological

Growth of Biological

Decline of Traditional

The Chiral Market

50% : (2R,4R)

25% : (2R,4S)

25% : (2S,4S)

•Enantioselectividad

Poderosos Bloques de construcción en química orgánica

Enzimas mas utilizadas: •Lipasas•Esterasas•Amidasas

Resolución cinética con lipasasResolución cinética con lipasas

Evitar reversibilidad de la Evitar reversibilidad de la resoluciónresolución

•Generación de centros quirales por acilación

•Bloques de construcción en síntesis orgánica

•Construcción de librerias

•Resolución de centros quirales (en polioles)

•Modelos moleculares para RMN

OH OH

OHn

COOH OH OOPhe

OHn +

Lipasa+ H2O

carbono aquiral (R) ó (S)

Solvente orgánico

“Easy-On, Easy-Off Technology”

Sintesis-hidrólisis de amidas

“Imposible” la hidrólisis de amidas con lipasas

Proceso altamente enantioselectivo

N

H

2

C

H

3

R1

R2

N

H

C

H

3

R1

R2

O

C

R

3

N

H

2

C

H

3

R1

R2

N

H

C

H

3

R1

R2

O

C

R

3

N

H

2

C

H

3

R1

R2

R3COO+Lipasa

(R) ó (S)

+H2O

R3COO+2M2B

Lipasa

(R)

R1 = -0CH3 R2 = -0H R3 = cadena hidrocarbonada

+ H2O+

(S)

(R)

EASY-ON

EASY-OFF

SOLVENT SYSTEMS AND SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSESPROCESSES

1. Aqueous Reaction Media : 1. Aqueous Reaction Media : HidrolysisHidrolysis

2. Water: Water-Miscible Systems : 2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Hydrolysis or SynthesisSynthesis

3. Water: Water-Immiscible Systems 3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or : Hydrolysis or SynthesisSynthesis

4. Nonaqueous Reaction Media : 4. Nonaqueous Reaction Media : SynthesisSynthesis

5. Anhydrous Reaction Media : 5. Anhydrous Reaction Media : SynthesisSynthesis

6. Supercritical Fluids : 6. Supercritical Fluids : SynthesisSynthesis

7. Reverse Micellar Systems : 7. Reverse Micellar Systems : SynthesisSynthesis SistemasSistemascon bajocon bajo

8. Solvent-Free Systems : 8. Solvent-Free Systems : SynthesisSynthesis contenidocontenidode aguade agua

9. Gas-Phase Catalysis : 9. Gas-Phase Catalysis : SynthesisSynthesis

10. Ionic Liquids : 10. Ionic Liquids : SynthesisSynthesis

Sistemas de reacción para las lipasasSistemas de reacción para las lipasas

A.A. Immobilization Immobilization

• Adsorption onto solid supports such as silica gelAdsorption onto solid supports such as silica gel• Covalent attachment to solid supportsCovalent attachment to solid supports• Entrapment in organic polymers or microemulsions. Entrapment in organic polymers or microemulsions.

B. Chemical ModificationB. Chemical Modification

1.1. Cross-Linking : Cross-Linking :

• Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC) linked enzyme crystal (CLEC)

• P. cepaciaP. cepacia and and C. antarcticaC. antarctica lipases for CLEC- lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)Biotech)

PREPARATION OF MODIFIED LIPASESPREPARATION OF MODIFIED LIPASES

2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and 2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and SurfactantsSurfactants

• Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG.cyanuric acid chloride activated PEG.

• Alternative to PEG is to use the Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35)polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent as a covalent modifiermodifier

• Hydrophobic polymers such as Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethylpolystyrene and polymethylmethacrylatemethacrylate or amphiphilic polymers such as or amphiphilic polymers such as poly N-poly N-

vinylpyrrolidonevinylpyrrolidone

• Nonionic synthetic Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)monostearate (Span 60)

Aplicaciones industriales de las lipasasAplicaciones industriales de las lipasas

•Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridostriglicéridos

• Disponibilidad de materia prima, Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons 60 millones de tons de aceites y grasas por año.de aceites y grasas por año.

•Cinco millones de toneladas para uso no alimentarioCinco millones de toneladas para uso no alimentario

•La principal aplicación es la obtención de jabones, La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químicoproceso químico

•El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproducto subproducto

•Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con mundo que usa esta tecnología con Candida rugosaCandida rugosa lipase. lipase.

•Proceso en lote a 40 Proceso en lote a 40 ooC, durante 48 horasC, durante 48 horas

•An alternative source of energy for public transport is the An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production.so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production.

•METHYL ESTERS OF FATTY ACIDSMETHYL ESTERS OF FATTY ACIDS

•Produced chemically using oil from various plants (e.g. Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed).rapeseed).

•Alcohoysis catalyzed by KOH Alcohoysis catalyzed by KOH

•Can be catalysed in a single transesterification reaction Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents. using lipases in organic solvents.

•At an industrial scale failed so far because of the high cost At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst. of the appropriate biocatalyst.

•Two strategies were recently presented : Two strategies were recently presented :

•Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated use stability even upon repeated use

•Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalystair drying resulted in a whole-cell biocatalyst

•Síntesis de metil- o etil- ésteres de Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : ácidos grasos por alcoholisis :

BiodieselBiodiesel

Mejoramiento de la untabilidad de los aceitesMejoramiento de la untabilidad de los aceites

Se puede modular el punto de fusión de una grasa por Se puede modular el punto de fusión de una grasa por hidrogenación de dobles enlaceshidrogenación de dobles enlaces

Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos saturados al aceite por interestificación grasos saturados al aceite por interestificación enzimáticaenzimática

sn3

RO

OR

OR

sn1

sn2

sn3

XO

OX

OX

sn1

sn2+

sn3

RO

OX

OX

sn1

sn2

sn3

XO

OR

OX

sn1

sn2+Lipase

Síntesis de sustitutos de grasa de cacaoSíntesis de sustitutos de grasa de cacao

•En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y Malasiaexportadas por Kenia y Malasia

•Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 ooC)C)

sn3

XO

OR

OY

sn1

sn2Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmíticoPara X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico

Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmenteprimordialmente

•Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS). de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS).

•Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpioUso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio

•Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.Rhizopus.

Grasas de alta digestibilidadGrasas de alta digestibilidad

•Mejoramiento en la absorción de triglicéridosMejoramiento en la absorción de triglicéridos

•Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorciónabsorción

sn3

XO

OR

OY

sn1

sn2Para X = palmíticoPara X = palmítico

Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche maternaGrasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna

•Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléicointerestirificación de tripalmitina y ácido oléico

•Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada)L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada)

•““Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis químicamediante síntesis química

Síntesis de emulsificantesSíntesis de emulsificantes

•Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentosindustria de alimentos

•150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir 150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridosde triglicéridos

•Los métodos enzimáticos incluyen : Los métodos enzimáticos incluyen : Esterificación y glicerólisisEsterificación y glicerólisis

•Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorableBajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable

•Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacionalaumentar su estabilidad operacional

Aplicaciones diversas (Hidrólisis)Aplicaciones diversas (Hidrólisis)

•DetergentesDetergentes: Remoción de productos lipídicos: Remoción de productos lipídicos

•Productos comerciales : Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.

•Industria papeleraIndustria papelera : Eliminación de triglicéridos de : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co.,lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co.,

•Industria de lacteosIndustria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteosaditivos a partir de productos lacteos

Promiscuidad Catalítica:

Nuevas reaccionesViejas enzimas

Single-enzyme multi-step conversions

O O

O O

OHHOO

HOOH

OH+

Ser-Hydrolase

"Natural reaction"

OHHOO

HOOH

O O

OO

OHHOO

HOOH

O O

OO

Ser-Hydrolase

"Unatural reaction"

NŸ

NŸ+

NŸ = Nucl?ophile

Nü

Nü

Nü =Nucléophile

47

“Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of enzyme active sites to catalyze more than one chemical

transformation”

•Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre:

•Diferentes grupos funcionales

•Diferentes tipos de enlace

•Diferente mecanismo de reacción

Angew. Chem. Int Ed. 2004, 43, 6032-6040

48

Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por lipasas

• Formación de enlaces C-CNucleófilo

enlaceC-CAtaque nucleofílico

Nucleófilos

Electrófios

49a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun. 2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F. J. of Biotech., 2006.

R1

NHR2

CNCN

NR2

R1

NH NH NH

+CALB

Amines

Addition d'amines secondaires

N

HN

R1

R2

O

O

R3O

O

R3NN

R2

R1

+Hydrolase

50û C solvant org.

addition d'imidazoles

Addition 1,4 d'amines sur des systèmes , insaturés

(5) (6) (7)

(8) (9) (10)

50°CSolvant organique

50

Mecanismo Clásico

H

H

HN

H

N

N

H(His)OO

(Asp)

Oxyanionhole

O

H

CH3

O

O

H

(Thr40)

CH3O

H(Gln 106)

O

O-

O

(Ser)

51

Mecanismo propuesto para Ser-Hidrolasas

Desplazamiento catalítico

Acido de Lewis

Transferencia de protónAcido-Base

52

But : Preparación de intermediarios de la síntesis de -aminoácidos con estereo quuimica específica

R OH

NH2 O

53

H

O

OCH3 Me

O

OCH3 Ph

O

OCH3

H

O

OCH3

Me

H

O

OCH3

Ph

(12a) (12b) (12c)

(12d) (12e)

methyl acrylate methyl crotonate methyl cinnamate

methyl methacrylate methyl 2-phenylacrylate

Esters insaturés

Amines primaires

NH2 NH2

CH3

NH3

Amoníaco Bencilamina-feniletilamina

(R) y (S)(R) and (S)

phenylethylamineAmmonium Benzylamine

54

Figure 1. Hypothetical catalytic addition of benzylamine to methyl crotonate in the active site of CaL-B. The carbonyl oxygen of the ,-unsaturated is bound to the oxyanion hole and the nucleophile is activated by His.

MeO

O

H CH3

H

H

HN

HNH

N

N

HHisOO

Asp

Oxyanionhole

O

H

CH3

O

O

H

(Thr40)

CH3O

H(Gln 106)

H

H

HN

H

N

N

H(His)OO

(Asp)

Oxyanionhole

O

H

CH3

O

O

H

(Thr40)

CH3O

H(Gln 106)

O

O-

O

(Ser)

55

Me

O

OCH3NH2+ CaL-B

72 h, 65oCSolvent

Me OMe

ONH

Ph

Ph

Me NH

O

Ph

+

(1) (2)

(3)

(4)

Me NH

ONHPh

+

(5)Ph

Adición 1,4

Adición 1,2

Doble Adición 1,4

Posibles reacciones

Se ha reportado la formación preferencial de amidas :

•Solventes no polares•Bajas concentraciones de sustrato (Metil acrilato)•Temperaturas ≈ 45 ºC

56

Entry Solvent ET(30) NMR Ratio

% (3) % (4)

1 n-Hexane 30.9 95 52 Toluene 33.9 76

243 DisoPropyl ether 34 64

364 THF 37.4 60 405 n-Hex:2M2B, 1:1 39.2 46

546 n-Hex:2M2B, 1:3 40.1 48

527 2M2B 41.0 20

80

Table 1. Influence of organic media on the reaction of 0.5 M of Benzylamine (1) and 0.75 M of Methyl crotonate (2) using 20 mg/mmol of CaL-B/(1), at 65 °C for 72 h.

57

Changes in polarity of reaction media describing the profile of (A) Michael adduct (3) and (B) aminolysis product (4) as a function of empirical polarity parameters ET(30).

58

Entry[a] [1] (M) % 3 % 4 (%)Conv [b] Final Conc. (M)

(3) (4)

1 0.50 >95 <5 85 0.40 0.022 0.25 63 37 49 0.08 0.043 0.10 62 38 53 0.03 0.024 0.05 37 63 66 0.01 0.02

[a] Substrate initial concentration ratio 1:1.5 (1) with respect to (2). [b] Determined by HPLC and referred to initial concentration of (1).

Table 2. Influence of the initial concentration of (1) in n-hexane on the ratio of (3) and (4) determined by HPLC, after 72 h of reaction.

Aplicacion en química orgánicaAplicacion en química orgánica

Las LipasasLas Lipasas : :

Aplicaciones en BiotecnologíaAplicaciones en Biotecnología