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1

LIPASAS

Drs. Alcántara y SinisterraBiotransformations Group

Faculty of Pharmacy

Universidad Complutense

www.biotransformaciones.com

Liasas, transferasase isomerasas

Enzimas aisladasCélulas aisladas

K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004

Lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.1.3): actúan como catalizadores en reacciones lipolíticas (catabolismo de grasas y aceites) a través de la hidrólisis de los enlaces éster de acilgliceroles.

LIPASAS

Son activas únicamente adsorbidas sobre una interfase oleo-acuosa, “activación interfacial.”

1. Centro activo: tríada catalítica (Ser-His-Asp ó Glu)

Características comunes de las lipasas con otras serin-hidrolasas:

2. Hueco oxianiónico: estabiliza el intermedio tetraédrico formado durante la catálisis enzimática a través de la formación de puentes de hidrógeno.

2

LIPASAS E.C. 3.1.1.1

Lipasas no específicas.- hidrolizan todas las posiciones del triglicérido: Staphilococcus aureus,

Candida rugosa

Lipasa 1,3-específicas .- conducen a 2- acil – monoglicéridos : Rhizopus arrhizus

Lipasa 2-específicas.- conducen a 1,3-diacilgliceridos : Geotrichum candidum

Catalizan la hidrólisis de esteres insolubles en agua, mediante una activación interfacial

Modelo de Verger de activación

Interfacial de las lipasas

TIPO DE LIPASA


Reconocimiento de alcoholes quirales

HO OH

OH

sn-glicerol

12

3

R1

O

O O

O

R3

O

R2

O

sn-Triglicérido

12

3

Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)

Alcoholes secundarios

m

L

HO H

3

ENANTIÓMERO RECONOCIDO


Residuos de aminoácidos en 11 lipasas mostrando la tríada catalítica, en el Hueco Oxianiónico (en cursiva) y el sitio de unión propuesto (cursiva).

Lipasa

Secuencia de consenso cercana de la Ser

nucleofila Gly-X-Ser-X-Gly

His catalítica Asp/Glu

Catalítico Hueco

Oxianiónico

CVL, PCL -Gly85-His86-Ser87-Gln88-

Gly89- -His285-Leu286- -Asp263- -Gly16-Leu17-

RML -Gly142-His143-Ser144-

Leu145-Gly146- -His257-Leu258- -Asp203- -Gly81-Ser82-

HLL-Gly144-His145-Ser146-

L 147 Gl 148-His258-Leu259- -Asp201- -Gly82-Ser83-HLL Leu147-Gly148- His258 Leu259 Asp201 Gly82 Ser83

PcamL -Gly143-His144-Ser145-

Leu146-Gly147- -His259-Ile260- -Asp199- -Gly83-Ser84-

ROL -Gly143-His144-Ser145-

Leu146-Gly147- -His257-Leu258- -Asp204- -Gly82-Thr83-

PPL -Gly150-His151-Ser152-

Leu153-Gly154- -His263-Leu264- -Asp176- -Gly76-Phe77-

CAL-B Thr103-Trp104-Ser105-

Gln106-Gly107- -His224-Ala225- -Asp187- -Gly39-Thr40-

CRL (lip1) -Gly207-Glu208-Ser209-

Ala210-Gly211- -His449-Ser450-c -Glu341- -Gly123-Gly124-

GCL (lip II) -Gly215-Glu216-Ser217-

Ala218-Gly219- -His463-Gly464- -Glu354- -Gly131-Ala132-

Asp

His

SerO

N NHH

O

O(Glu)

NH

HN

HN O

HN

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HN

HN O

HN

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

R2O O-

C O

R1

R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1

C OHO H2O

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS LIPASAS

OO

Asp

His

SerO

C OR1

N NH

O

O(Glu)

NH

HN

HN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HN

HN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

HO O-

ENZIMA ACILADA

C O

R1

R2OC

R1 R2OH

OH

HINTERMEDIOTETRAÉDRICO #2

4

3. Tapadera:Elemento estructural diferenciador de las lipasas.Formada por una porción helicoidal anfipática.Se coloca sobre el centro activo de la enzima cuando está inactiva. Existen dos conformaciones:

Conformación cerrada o inactiva (medio acuoso)

Conformación abierta (en interfase o medio orgánico)Estructura 3D de la RML

Excepciones:Lipasas de Pseudomonas glumae, Pseudomonasaeruginosa y Candida antarctica B, fosfolipasaspancreáticas A2, y la cutinasa de Fusarium solanicarecen de tapadera.Lipasas pancreáticas de nutria y de cobaya:tapadera sin activación interfacial.Lipasa de Staphylococcus hycius: activacióninterfacial sólo con algunos sustratos.

Representación 3D de la lipasa de Candida rugosa (CRL)

Triada Catalítica:

Ser209, His449, Glu341

MH

O

L

.............His His.............O

M

H

L

His .............

LM

H

O His .............

LH

O

M

b. Permutación H/O c. Permutación M/L d. Permutación M/Ha. Esquema general

Modelo de reconocimiento de alcoholes primarios

Alcoholes primarios m

L

HHO

m

L

H OH

5

Reconocimiento de ácidos quirales

1. en forma de cueva (lipasas de Rhizomucor y Rhizopus).

Clasificación de las lipasas según la geometría del centro activo (Pleiss, Chem. Phys. Lipids, 1998, 93, 67):

A B C

RML: 18 Å de longitud, 4,5 Å deanchura en la base, y 6 Å en la superficiede la proteína. La parte donde se localizala tapadera tiene una altura de 12 Å, y al

otro lado tiene una altura de 8 Å

2. en forma de embudo (lipasas de Candida antarctica,Pseudomonas y páncreas de mamífero y cutinasa).

3. en forma de túnel (la lipasa de Candida rugosa).

Representación del centro activo de las lipasas de Rhizomucor miehei y Candidarugosa. (A) Orientación lateral donde los residuos se encuentran perpendiculares a lafigura y se indican por una línea continua; (B) Forma del centro activo desde una visiónfrontal; (C) Forma del centro activo visto desde arriba.

CRL: 22 Å de largo con un diámetro

de aproximadamente 4 Å.

Ser 144 (catalítica)Zona de reconocimiento del ácido de la RML

Zona de reconocimiento del ácido de la CRL Ser 209 (catalítica)

6

Phe296

Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337,

Phe296

Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337, 302. Manetti, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, 146.

Superposición de los centros de reconocimiento de los ácidos arilpropiónicos de las lipasas de RML y CRL

Phe296

Modelo cinético de resolución de una mezcla racémica

Relación de velocidades. Medida de la enantioseletividad

= E

7

Reacciones catalizadas por lipasas

TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)

ESTERIFICACIÓN

O O

R1

O

OHHOR2+

lipasa

R1

O

OR2

R1

O

OR2

lipasa, H2O

R1

O

OHHOR2+

HIDRÓLISIS DE ESTERES

SÍNTESIS DE AMIDAS

SÍNTESIS DE TIOESTERES

R1

O

OR2HSR3+

lipasa

R1

O

SR3HOR2+

R1

O

OR2H2NR3+

lipasa

R1

O

NHR3HOR2+

INTERESTERIFICACIÓN

ACIDOLISIS

( )

R1

O

OR2+ R3 OR4

Olipasa

+

O

OR4R1 R3

O

OR2

R1

O

OR2+ R3 OH

Olipasa

+

O

OR2R3 R1

O

OH

R1

O

OR2HOR3+

lipasa

R1

O

OR3HOR2+ SÍNTESIS DE PEROXIESTERES

R1

O

OR2HOOR3+

lipasa

R1

O

OOR3HOR2+

R1 OR2 1 3

Resolución cinética de compuestos quirales a través de una estrategía hidrolítica:

Resolución Cinética de racematos con lipasas

Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en la zona del alcohol (sustratos tipo I).

R1

C

H

R2 O R3

Olipasa, H2O R1

C

H

R2 OH

R2

C

H

R3 O R3

O

+

Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en el grupo ácido (sustratos tipo II).

R1

O

R3 lipasa, H2O R1 OHR2

CR CO

R3

Resolución cinética de compuestos quirales a través de transferencia de acilo.

C

H

R2 CO

OC

H

R2 COH

OC

H

R1 CO

+

R2

C

H

R1 OH

lipasaG R3

O

R2

C

H

R1 O R3

O R2

C

H

R1 OHdisolv.orgánico

R2

C

H

R1 COH

O

lipasa R3

disolv.orgánico

HO R2

C

H

R1 COH

O

R1

C

H

R1 CO

R3

O+

+

APLICACIONES

R1 R2

OH

lipasa deRh. miehei

Lipozyme IM20

disolvente orgánico+

R3

O

O

R4 R1 R2

OH

R1 R2

O+

R3

O

+HO

R4

O

4

(R,S)

R1= Ph-, Bn-, 1-naftil, 2-naftil.

R2= Me-, Et-, Pr-.

R3= Me-, Et-, Pr-, Ph-,

R4 H M

(S) (R)

R4R4= H-, Me-

I. E. De FuentesTesis Doctoral, UCM, 2002

Ph Me

OH

lipasa deRh. miehei

Lipozyme IM20

iPr2O+Me

O

O

H Ph Me

OH

Ph Me

O+

Me

O

(R,S) (S) (R)REACCIÓN TEST

A. R. Alcántara y colsChem. Phys. Lipids, 1998, 93, 169

8

FACTORES QUE DEBEN CONTROLARSE

R1

R2

OH

O

AW

1. VARIABLES CONTÍNUAS

DISOLVENTE(logP)

TEMPERATURA

RELACIÓNMOLAR

R3 NuAGITACIÓN

2. VARIABLES DISCRETAS

ESTRUCTURA DEL ALCOHOL, DEL DONADOR DEACILO, PUREZA DE LA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA,NATURALEZA DEL SOPORTE

LIPASA DE LIPASA DE Candida rugosaCandida rugosa

MEZCLA DE ISOFORMAS. 7 GENESLotti y cols. Protein Eng., 7, 531-537, 1994.

Brocca y cols. Current. Genet., 28, 454-457, 1995.

CARACTERIZADAS: Lip1- Lip5 Lotti y Alberghina. Eng. of/with lipases. Ed. K. Academic. 1996.

Lipasa P.M. (Da) pI Puntos de glicosilación Secuencia N-terminal

Lip1 57223 4,5 291, 314, 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE

Lip2 57744 4,9 351 APTA T LANGDTITGLNAI V NE

Lip3 57291 5,1 291, 314, 351 APTA K LANGDTITGLNAI I NE

Lip4 57051 5,7 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE

Lip5 56957 5,5 314, 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE

ESTRUCTURA DE LA Lip1ESTRUCTURA DE LA Lip1

CERRADA ABIERTA

TAPADERA

9

INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LIPASAS POR EFECTO DEL GLICEROLLIPASAS POR EFECTO DEL GLICEROL

Candida rugosa:

del Río y cols. Biotechnology Letters, 12, 835-838. 1990

Candida rugosa: fermentación con aceite

de oliva

LIPASAS COMERCIALES LIPASAS COMERCIALES vsvs LIPASAS LIPASAS UNIV. AUTÓNOMA BARCELONAUNIV. AUTÓNOMA BARCELONA

IsoformasLipasa Procedencia

Inductor/ Fuentede Carbono Lip1 Lip2 Lip3

Sigma Comercial ¿? 73 ± 5 8 ± 1 19 ± 2

Roche Comercial ¿? 66 ± 5 13 ± 2 21 ± 2

UAB-II Fed-Batch Q baja Ácido Oleico --- 56 ± 5 44 ± 5

UAB-III Fed-batch Q baja Ácido Oleico --- 56 ± 5 44 ± 5

UAB-IV Fed-batch Q alta Ácido Oleico 33 ± 3 40 ± 4 27 ± 3

Dominguez de Maria et aCurrent Organic Chemistry : 10(10), :1053- :1066 ( 2006)

10

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS SDSSDS--PAGEPAGE

kDa

88--

60--

1.- Comercial Sigma

2.- Comercial Roche

3.- Ácido Oleico (0,5 %)

4.- Aceite de oliva (0,2 %)

43--

1 2 3 4 5 6 7

4. Aceite de oliva (0,2 %)

5.- Aceite de girasol (0,2 %)

6.- 1-Dodecanol (0,2 %)

7.- Glicerol (0,2 %)

Intervalo: 57-62 kDa


ANÁLISIS DENSITOMÉTRICOANÁLISIS DENSITOMÉTRICO

0.80

1.00

0.80

1.00

Lipasa de Sigma Lipasa de Roche

Lip1 Lip1

Lip3

Peso Molecular (kDa)

0.00

0.20

0.40

0.60

Pro

porc

ión

(%)

60.1 58.4 53.3 48.6 45.9

Peso Molecular (kDa)

0.00

0.20

0.40

0.60

Pro

porc

ión

(%

)

60.1 58.4 53.3 48.6 45.9

Lip3 Lip3

Lip2Lip2


11

ArO

HN

OH

APLICACIÓN PRÁCTICALos beta-bloqueantes constituyen el grupo más importante dentro de los fármacos adrenérgicos.

utilizados en el tratamiento de: hipertensiónarritmiasangina de pechociertos tipos de ansiedad.

Una familia de estos compuestos, muy vendidos, presentan estructura de ariloxiamino-propanol,v.g.:Sumial, atenolol etc.

con un centro estereogénico, de forma que la actividad biológica en los tratamientos mencionadosreside fundamentalmente en el enantiómero S presentando el isómero R efectos secundariosindeseables en algunas ocasiones.

Dentro de este grupo de fármacos, el propranolol (1-isopropilamino-3(1-naftoxi)-2-propanol) se considera el compuesto de referencia. Se ha comprobado que la actividad beta-bloqueante de su isómero S es 100 veces superior a la del isómero R. Es más, el isómero R presentaun efecto secundario como contraceptivo masculino.

ArO

HN

OH

Ar nombre

propranolol

atenolol

Ar-OH

O

ClN

,1)

2) HCl (1h, 0-5ºC)Ar

O Cl

OH

2.- Resolución cinética de los racematos empleando

1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura dehalohidrina.

METODOLOGÍA:

OBJETIVO:

Optimizar un proceso quimioenzimático de obtenciónde sintones quirales para obtener estos compuestosenantioméricamente puros.

NH

pindolol

O

oxprenolol

una lipasa

I. Borreguero.Tesis Doctoral, UCM, 1999.

ArO Cl

OHO R1

OR2

lipasadisolvente orgánico

ArO (R) Cl

OH

+

Ar = 1-naftilo,1a2-naftilo,1bo-tolilo, 1cp-tolilo, 1d

1

R-1

R1 = Me, Et, Pr, -CH2Cl, -(CH2)10CH3

R2 = H, Me

ArO

(S)Cl

O

O

R1

S-2

1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina 1

Ar-OHO

Cl+Ar

O Cl

OH

ArO

O+

N

a

b

HCl (0 5ºC)HCl (0-5ºC)

Ar = 1-naftilo, t = 46 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = 2-naftilo, t = 26 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = o-tolilo, t = 72 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = p-tolilo, t = 120 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%

12

2.- Resolución cinética de los racematos de 1 empleando una lipasa

O Cl

OHO

O

lipasadisolv. orgánico

O(R)

Cl

OH+

1

O(S)

Cl

O

O

R1

S-2R-1

60

Conversion (%)

CONDICIONES ESTANDAR: SUSTRATO 1a,

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900Tiempo (h)

0

10

20

30

40

50

Lipozyme IM20

HLL

PPL

CAT. mg t (h) X (%)

Pto.13

ee1(%) Pto.1 ee3

(%) Eb EFc

HLL 106 547 30 S-(+) >99 R-(-) 32 >100 0.73

PPL 106 817 8 S-(+) 65 R-(-) 3 5 0.36

IM20 15 340 53 S-(+) >99 R-(-) 78 >100 0.71

AGENTE ACILANTE = ACETATO DE VINILO (R1 = Me, R2 = H), RELACIÓN MOLAR 1/3, DISOLVENTE = iso-OCTANO, T = 30ºC

O Cl

OHO

O

Lipozyme IM20isooctano

O(R)

Cl

OH+

1a

O(S)

Cl

O

O

S-2aR-1aT = 37ºC, t = 4 h

conversión = 55%, ee1 > 99%, E = 27

2.3.- Condiciones optimizadas

O(R)

Cl

OH

R-1aNH2

O(S)

HN

OH

PROPRANOLOL

Synthesis of nuleoside prodrugs

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HHHH

HO

CH3

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HHHH

O

CH3

O

H3C

Vinyl acetateCandida antarct ica lipase

99% yield

Anti-leukaemic produg- Glxaxo-SmithKline

Raso & Voss Appl.Ctatal. A: Chemical 221,145-158(2001)

13

Reacciones catalizadas por lipasas

TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)

ESTERIFICACIÓN

O O

R1

O

OHHOR2+

lipasa

R1

O

OR2

R1

O

OR2

lipasa, H2O

R1

O

OHHOR2+

HIDRÓLISIS DE ESTERES

SÍNTESIS DE AMIDAS

SÍNTESIS DE TIOESTERES

R1

O

OR2HSR3+

lipasa

R1

O

SR3HOR2+

R1

O

OR2H2NR3+

lipasa

R1

O

NHR3HOR2+

INTERESTERIFICACIÓN

ACIDOLISIS

( )

R1

O

OR2+ R3 OR4

Olipasa

+

O

OR4R1 R3

O

OR2

R1

O

OR2+ R3 OH

Olipasa

+

O

OR2R3 R1

O

OH

R1

O

OR2HOR3+

lipasa

R1

O

OR3HOR2+ SÍNTESIS DE PEROXIESTERES

R1

O

OR2HOOR3+

lipasa

R1

O

OOR3HOR2+

R1 OR2 1 3

Ejemplos de procesos estereoselectivos

K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004

Proceso regioselectivo

15

Reconocimiento de alcoholes quirales

HO OH

OH

sn-glicerol

12

3

R1

O

O O

O

R3

O

R2

O

sn-Triglicérido

12

3

Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)

Alcoholes secundarios

m

L

HO H

N

OH

N

O

FF

O

R'

RR

N N

O

O

R'OH

R R

F F

+

CALB-BR'COOR"

Organic solvent

CAL-B

10eq H2OOrg. solvent

(3R,4S) (3S,4R)

F

Chemoenzymatic synthesis of (-)Paroxetine (Serotonine reuptake inhibitor)

R= Cbz, Boc, AllocR’= Me R”= vinyl i-propenyl Et -N=C(CH3)2

E>100

N

O

H

O

O

(-) Paroxetine

R Me R vinyl,i propenyl, Et, N C(CH3)2

R’= Ph R”= vinyl

Gotor-Fernandez et al. J.Mol.Catal.B: Enzymatic 2006,40,111-120

N

N

N

O

OHN

Cl

N

N

N

O

ON

Cl

OO

R

ROH/CAL-B

spontaneous in situracemization

O

Cl OR

Chemoenzymatic synthesis of S (+) Zopliclone (hypnotic drug with similar pharmacological profile that benzodiazepines)

S- isomer is more active and less toxic than R- counterpart

N

N

N

O

ON

Cl

O

OR

N

N

N

O

ON

Cl

O

N

NCH3

S-(+)ZoplicloneN-methylpiperazine

30% yield, E>100

Gotor-Fernandez et al. J.Mol.Catal.B: Enzymatic 2006,40,111-120

16

N

NH2

N

NH2

+N

NH

N

NHcBZ

+

OCH3

1.- CAL-B, EtOAc

2- Cbz-Cl

(1R,2R) trans

(1S,2S) transTrans

Chemoenzymatic synthesis of the analgesic U-50,488

N-acylation catalyzed by lipases

N

NH

OCH2 Cl

Cl

U-50,488

Gonzalez-Sabin et al. Chem.Eur.J. 2004,10,5788-5794

17

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis

The process is equivalent to the esters hydrolysis/synthesis due to the nucleophilic characteristics of the nitrogen

Gotor-Fernandez Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)

Regioselective process

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis

Chemoselective process

Ammonolysis is performed in ammoniasaturated t BuOH

Regioselective processGotor-Fernandez .- Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)

18

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of chiral amines

Application to the synthesis of both enantiomers of Amphetamines

The synthesis is performed with ethyl acetate as acyl donor and as solvent

Gonzalez-Sabin et al. Tetrahedron Asymmetry 13,1315-1320 (2002)

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of chiral amines

Resolution of cis- & trans-2-phenylcyclopentaneamines(lactanamides).- hypoglycemis activity

Trans- antidepresant Gonzalez-sabin et al. Terahedron:Asymmetry 15,481-488(2004)

Kinetic resolution using 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium trifluormethane sulphonateAnd CALB B.-Irinescu & Kato Tetrahedron Let.. 45,523-525(2004)

Gotor-Fernandez & Gotor Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of diamines

Azamacrocycles

The synthesis involves two two biocatalytic steps.In both cases the enzyme shows a clear R-enantiopreferenceTherefore the R,R- stereomer is achieved with 98% e.e. and 30% total yield.

Gotor-Fernandez Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)

19


Sequential kinetic resolution mechanism of trans- cyclohexane-1,2-diamine



Synthesis of key synthon for the preparation of 1S,2S- U-50,488. Analgesic

E= 170

Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of aminoalcohols


Due to the intrinsic activity of lipasesOH is better substrate than NH2

Therefore the reaction can only take placeafter chemical N-protection of amino group

20

RESOLUCIÓN DE ÉSTERES RACÉMICOS

RESOLUCIÓN DE AMINAS RACÉMICAS

(R,S)

lipasa

R o S

O

NHO

O

H2N

H

(R,S)

O

O

NH2

lipasa

NH2

H

CH3

H

R

N

O

CH3

H

REACCIÓN DEL BUTILCARBONATO DE VINILO CON LA p-CLORO-1-

FENILETILAMINA

Lipasa (%) Conv. a % ee b

CRL 28 90

NOV 435 34 99R

NH2

O O

O

R OCH ClNOV-435 34 99

SP523 0 n. d.

SP525 17 99

PS 0 n. d.

a Calculado por HPLC. b Determinado por 1H-RMN

LIPASA72h 25ºCHEXANO

R = OCH3, Cl

N

HR

O

22

KR OPTIMISATIONKR OPTIMISATIONCHANGING FROM VYNIL ACETATE TO VINYL BUTYRATE:Better work up (better separation) but the oposite enantiopreference was observed

TEMPERATURE EFFECTS:

Acyl donor T Conv. (%)

time (h)

eep(%) E

Vinyl acetate r. t. 50 30 >99 > 200

O

OHLipase

R O

O

+O

O

O

OH

+

O

R

THF

After 4 hours at50ºC there issome enzymedeactivation

64

Hoyos, P.; Hernandez, M.; Sinisterra, J. V.; Alcantara, A. R., Dynamic kinetic resolution of benzoins by lipase-metal combo catalysis. Journal of Organic Chemistry 2006, 71, (20), 7632-7637.

Vinyl butyrate r.t. 45 24 >99 > 200

Vinyl butyrate 37ºC 49 24 >99 > 200

Vinyl acetate 50ºC 49 4 >99 > 200

Vinyl butyrate 50ºC 50 4 >99 > 200

Best experimentalconditions.

LipaseLipase DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution??

Ar

OH

ArO

Ar

O

ArKINETIC RESOLUTION

Max. Theoretical yield = 50%DYNAMIC

??

65

Ar

(S)

O

Ar

O

Ar

(R)

OH

Ar

O

R

OO

100%

??

SHVO’S CATALYSTSHVO’S CATALYST

LipaseLipase DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution

Ru Ru

OCH

OCOC CO

Ph Ph

O

H

OPh

Ph

Ph

Ph

Ph Ph

It is widely described for DKR of alcohols

Pelliser Tetrahedron 2008,64,1563-1601

Persson et al. J.A.C.S. 1999, 121, 1645-1650

ActivationActivation

66

byby temperaturetemperature

Shvo et el. J.Am.Chem.Soc 1986,108,7400

23

O

OH

+

KR OO

O

OH

O

O

O

60

70

80

90

100

)

60

70

80

90

(mM

)

step 2

step 1

step 3

SequentialSequential DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution1. Vinyl butyrate evaporation2. Add: thrifluoroethyl butyrate

Shvo’s catalystLipase

New enzyme addition

C i 92%DKR

O

O

O

OCF3

O

0 6 12 18 24 30 36 42

t (h)

0

10

20

30

40

50

60(

0

10

20

30

40

50

Co

nce

ntr

atio

n (

68

Hoyos, et al. Journal of Organic Chemistry 2006, 71, (20), 7632-7637.

Conversion 92%eep > 99%t = 48h

24

De castro et al. Tetrahedron: Asymmetry 1997,8, pp 857-8

HIDRÓLISIS DE DIHIDROPIRIDINAS PROQUIRALES EMPLEANDO LA LIPASA B DE C.

antarctica

8 X = H, Z = H9 X = H, Z = NO220 X = CH2OCH3, Z = H21 X = CH2OCH3, Z = NO

C. antarctica

N

O O

O OO

HO

X

Z

N

Z

O O

O O

OO

OO

XR

Z = H, NO2

Producto T (ºC) t (h) %PP a % PF b [] ee% c Configuración d

20 4 26 15 21 -26,25 54 R

20 23 3,75 10 45 -17,1 80 R

8 23 5,5 60 30 -24,21 86 R

8 23 11,5 46 16 -12,35 60 R

21 23 3,75 34 25 -5,37 50 R

9 23 10,5 6 19 -5,53 90 R

a Producto de partida aislado. b Monoéster aislado por cromatografía. c exceso enantioméricodel monoéster aislado. d Configuración del monoéster mayoritario

lipasas [modo de compatibilidad] - webs.ucm.eswebs.ucm.es/info/btg/personales/jvsgago/lipasa.pdf ·...

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