lipasas y fosfolipasas en la preparación de nucleósidos modificados y sus precursores

7/23/2019 Lipasas y Fosfolipasas en la Preparacin de nuclesidos modificados y sus precursores

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Universidad Nacional de Quilmes

Tesis Doctoral

Lic. Esteban Daro Gudio

Lipasas y fosfolipasas en la preparacin de nuclesidosmodificados y sus precursores

2011


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El presente trabajo de Tesis Doctoral, para optar por el

grado de Doctor en Ciencias Bsicas y Aplicadas de la

Universidad Nacional de Quilmes, ha sido realizado

en el Laboratorio de Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnologa

de la Universidad Nacional de Quilmes, bajo la direccin del

Dr. Luis Iglesias y la codireccin del Dr. Adolfo

Iribarren


3/222

I

NDICE

Captulo 1Introduccin y objetivos ................................................................................................ 1

1.1. Nuclesidos naturales y modificados ...................................................................................... 31.1.1. Generalidades .................................................................................................................. 3

1.1.2. Aplicaciones .................................................................................................................... 4

1.1.2.1. Antivirales ............................................................................................................... 4

1.1.2.2 Antitumorales .......................................................................................................... 9

1.2. Sntesis de nuclesidos .......................................................................................................... 10

1.2.1. Sntesis de nuclesidos a travs de la formacin del enlace glicosdico ....................... 11

1.2.1.1. Biocatlisis, biotransformaciones y biocatalizadores ............................................ 12

1.2.1.1.1. Ventajas de las biotransformaciones ..................................................................... 121.2.1.1.2. Desventajas de las biotransformaciones ................................................................ 14

1.2.1.1.3. Enzimas aisladas vs clulas enteras ....................................................................... 15

1.2.1.1.4. Clasificacin de las enzimas.................................................................................. 16

1.2.1.1.5. Lipasas ................................................................................................................... 17

1.2.1.1.6. Lipasa B de Candida antarctica (CAL B) ............................................................ 18

1.2.1.1.7. Lipasa de Candida rugosa (CRL) ......................................................................... 20

1.2.2. Sntesis biocataltica de nuclesidos ............................................................................. 21

1.2.2.1. Generalidades ........................................................................................................ 21

1.2.3. Sntesis de precursores en la sntesis de nuclesidos furanosas desacetiladasregioselectivamente ....................................................................................................................... 23

1.2.4. Antecedentes de la desproteccin regioselectiva de furanosas catalizadas porenzimas. ............................................................................................................................... ..25

1.3. Modificacin de nuclesidos naturales - prodrogas .............................................................. 26

1.3.1. Derivados lipdicos de nuclesidos ............................................................................... 28

1.3.1.1. Fosfoslipasa Dreaccin de transfosfatidilacin ................................................. 29

1.3.2. Derivados fosforilados de nuclesidos .......................................................................... 341.3.2.1. Aplicaciones .......................................................................................................... 34

1.3.2.2. Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato ................................................................ 36

1.3.2.2.1. Hidrlisis de cidos nucleicos ............................................................................... 36

1.3.2.2.2. Fermentacin directa ............................................................................................. 37

1.3.2.2.3. Fosforilacin catalizada por nuclesido fosfotransferasa ...................................... 38


4/222

II

1.3.2.2.4. Fosforilacin catalizada por quinasas .................................................................... 38

1.3.2.2.5. Fosfatasas cidas no especficas bacterianas ......................................................... 38

1.3.2.2.6. Fosforilacin indirecta utilizando fosfolipasas ...................................................... 39

1.4. Inmovilizacin de enzimas .................................................................................................... 40

1.4.1. Generalidades ................................................................................................................ 40

1.4.2. Mtodos de inmovilizacin ........................................................................................... 42

1.4.2.1. Mtodos por retencin qumica ............................................................................. 42

1.4.2.1.1. Adsorcin .............................................................................................................. 43

1.4.2.1.2. Unin covalente ..................................................................................................... 44

1.4.2.2. Mtodos por unin fsica ....................................................................................... 45

1.4.2.2.1. Atrapamiento ......................................................................................................... 45

1.4.2.2.2. Inclusin en membranas ........................................................................................ 46

1.4.3. Efectos de la inmovilizacin ......................................................................................... 46

1.4.3.1. Efectos en la estabilidad ........................................................................................ 47

1.4.3.2. Efectos en la actividad enzimtica ........................................................................ 48

1.5. Objetivos del presente trabajo ............................................................................................... 50

1.6. Bibliografa ........................................................................................................................... 52

Captulo 2Parte experimental ....................................................................................................... 59

2.1. Materiales .............................................................................................................................. 61

2.1.1. Consideraciones generales ............................................................................................ 61

2.2. Metodologa .......................................................................................................................... 62

2.2.1. Sntesis de pentofuransidos peracetilados ................................................................... 62

2.2.1.1. Sntesis de metil D-pentofuransidos peracetilados .............................................. 62

2.2.1.2. Sntesis de alquil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos .................................. 66

2.2.2. Sntesis de pentofuranosas peracetiladas ....................................................................... 69

2.2.3. Alcohlisis catalizadas por lipasas ................................................................................ 72

2.2.3.1. Procedimiento analtico ......................................................................................... 72

2.2.3.2. Procedimiento preparativo .................................................................................... 72

2.2.4. Hidrlisis catalizada por lipasas .................................................................................... 75


2.2.4.2. Procedimiento preparativo .................................................................................... 75

2.2.5. Alcohlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente ...................... 76


5/222

III


2.2.6. Hidrlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente......................... 76

2.2.6.1. Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] ................. 77

2.1.6.2. Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][PF6] ................................................ 77

2.2.7. Reacciones de transfosfatidilacin en medio bifsico catalizadas por la fosfolipasa D 78

2.2.7.1. Cribado de microorganismos con capacidad de catalizar la reaccin detransfosfatidilacin .................................................................................................................... 78

2.2.7.2. Obtencin del crudo enzimtico de fosfolipasa D proveniente de Streptomycesnetropsis 79

2.2.7.3. Reacciones de transfosfatidilacin ........................................................................ 79

2.2.8. Inmovilizacin de la fosfolipasa D ................................................................................ 86

2.2.8.1. Inmovilizacin por adsorcin en Duolite ........................................................... 86

2.2.8.2. Inmovilizacin en alginato .................................................................................... 872.2.8.3. Inmovilizacin en glioxil-agarosa ......................................................................... 87

2.2.8.4. Inmovilizacin en poliuretano ............................................................................... 88

2.2.8.5. Inmovilizacin por tecnologa sol-gel ................................................................... 88

2.2.8.5.1. Sntesis del precursor tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato (THEOS) .................. 88

2.2.8.5.2. Protocolo de inmovilizacin de PLD y PLD/colina oxidasa en sol-geles dopadoscon quitosano ............................................................................................................................ 88

2.2.8.6. Inmovilizacin en agarosa ..................................................................................... 89

2.2.9. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos ................................................................................ 892.2.9.1. Reacciones en fase heterognea ............................................................................ 89

2.2.9.1.1. Hidrlisis con pulsos enzimticos ......................................................................... 90

2.2.9.2. Reacciones en fase homognea ............................................................................. 90

2.2.9.3. Cribado de nuevos biocatalizadores ...................................................................... 91

2.2.9.3.1. Procedimiento experimental del screening ............................................................ 91

2.2.9.3.2. Medicin de la actividad de las soluciones de PLC .............................................. 91

2.3. Bibliografa ........................................................................................................................... 92

Captulo 3Desproteccin regioselectiva de pentofuranosas y pentofuransidos peracetilados ... 95

3.1. Objetivos y resumen .............................................................................................................. 97

3.2. Resultados y discusin .......................................................................................................... 97

3.2.1. Sntesis de los distintos sustratos................................................................................... 97

3.2.1.1. Sntesis de los furansidos utilizados .................................................................... 97


6/222

IV

3.2.1.2. Sntesis de furanosas peracetiladas ........................................................................ 99

3.2.2. Efecto del sustituyente en el carbono anomrico sobre la regioselectividad de laalcohlisis de ribofuransidos acetilados catalizada por CAL B ................................................ 100

3.2.3. Efecto de la configuracin de la furanosa sobre la regioselectividad de la reaccin .. 107

3.2.4 Alcohlisis en lquidos inicos.................................................................................... 1133.2.5 Hidrlisis enzimtica de pentofuranosas acetiladas .................................................... 117

3.2.5.1 Hidrlisis en ILs .................................................................................................. 119

3.2.5.1.1 Hidrlisis con [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] ................................................ 119

3.2.5.1.2 Hidrlisis con [BMIM][PF6] ............................................................................... 120

3.2.5.1.3 Cuantificacin de las reacciones de hidrlisis por HPLC ................................... 122

3.3 Conclusiones ....................................................................................................................... 126

3.4 Bibliografa ......................................................................................................................... 127

Captulo 4Estudio de la diastereoselectividad en las alcohlisis e hidrlisis de pentofuranosas ypentofuransidos catalizadas por lipasas ......................................................................................... 131

4.1 Objetivos y resumen ............................................................................................................ 133

4.2 Resultados y discusin ........................................................................................................ 133

4.2.1 Diastereoselectividad en reacciones con ribofuransidos con diversos sustituyentesanomricos .................................................................................................................................. 133

4.2.2 Diastereoselectividad en reacciones con 2-desoxirribosas, arabinosas y xilosas ........ 137

4.3 Conclusiones ....................................................................................................................... 1444.4 Bibliografa ......................................................................................................................... 145

Captulo 5Preparacin de fosfoliponuclesidos ......................................................................... 147

5.1. Objetivos y resumen ............................................................................................................ 149

5.2. Resultados y discusin ........................................................................................................ 149

5.2.1. Cribado de biocatalizadores ........................................................................................ 149

5.2.2. Sntesis de 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos ................................................................. 153

5.2.3. Evaluacin de diversas condiciones experimentales de la reaccin detransfosfatidilacin ...................................................................................................................... 156

5.2.3.1. Temperatura ........................................................................................................ 156

5.2.3.2. Utilizacin de detergentes en el medio de reaccin ............................................ 159

5.2.3.3. Evaluacin del exceso estequiomtrico de los sustratos ..................................... 162

5.3. Conclusiones ....................................................................................................................... 164


7/222

V

5.4. Bibliografa ......................................................................................................................... 165

Captulo 6Inmovilizacin de la fosfolipasa DTransfosfatidilacin en medio anhidro ........... 167



6.2.1. Evaluacin de distintos tipos de inmovilizacin ......................................................... 169

6.2.2. Tecnologa sol-gel ....................................................................................................... 173

6.2.2.1. Obtencin del precursor THEOS ........................................................................ 175

6.2.2.2. Optimizacin del proceso de inmovilizacin sol-gel .......................................... 176

6.2.2.3. Coinmovilizacin de colina oxidasa y fosfolipasa D .......................................... 178

6.3. Conclusiones ....................................................................................................................... 181

6.4. Bibliografa ......................................................................................................................... 181

Captulo 7Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato: Hidrlisis de los fosfatidilnuclesidos ...... 183



7.2.1. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio heterogneo .......................................... 186

7.2.2. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos con pulsos de PLC ............................................... 190

7.2.3. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio acuoso .................................................. 192

7.2.4. Cribado de nuevos biocatalizadores ............................................................................ 194

7.3. Conclusiones ....................................................................................................................... 195

7.4. Bibliografa ......................................................................................................................... 197

Captulo 8Resumen de resultados, conclusiones generales y perpectivas ................................. 199

8.1. Resumen de resultados ........................................................................................................ 201

8.2. Conclusiones generales y perpectivas ................................................................................. 202

Apndices ....................................................................................................................................... 205


8/222

VI


9/222

Captulo 1 Introduccin y objetivos

CAPTULO

1

INTRODUCCIN Y OBJETIVOS


10/222

Captulo 1: Introduccin y objetivos________________________________________________________________________________

2


11/222


3

1.1. Nuclesidos naturales y modificados

1.1.1. Generalidades

Los nuclesidos son glicosilaminas, que consisten en la unin de una base

nitrogenada y un monosacrido de cinco carbonos (D-ribosa o D-2-desoxirribosa) a travs

de un enlace -glicosdico. Las bases son compuestos derivados de los ncleos

heterocclicos pirimidina y purina, razn por la cual se habla de bases pirimidnicas o

pirimdicas y de bases purnicas o pricas; entre las bases que se encuentran en nuclesidos

naturales se pueden distinguir tres pirimidnicas y dos purnicas (Figura 1.1). Las bases

pirimidnicas son la timina (5-metil-2,4-dioxo-pirimidina) en el nuclesido timidina, la

citosina (2-oxo-4-amino-pirimidina) en la citidina y el uracilo (2,4-dioxo-pirimidina) en lauridina. Las bases pricas son la adenina (6-aminopurina) en el nuclesido adenosina y la

guanina (2-amino-6-oxo-purina) en la guanosina. Cuando alguna de estas bases estn

unidas a la D-ribosa se forman las subunidades del cido ribonucleico (ARN) y cuando lo

estn a la D-2-desoxirribosa forman parte del cido desoxirribonucleico (ADN).

Figura 1.1.Nuclesidos naturales


12/222


4

Cuando los nuclesidos naturales poseen una modificacin qumica, ya sea en su

base nitrogenada o en la estructura del monosacrido, son denominados anlogos de

nuclesidos. Generalmente la modificacin en la base se realiza a travs de una sustitucin

de algunos de sus tomos, en cambio en el azcar se pueden efectuar sustituciones o

eliminaciones de los hidroxilos en el C-2 y C-3, aperturas de los ciclos (nuclesidos

acclicos), sustituciones isostricas, transposiciones de la base al C-2 o C-3, entre otras

tantas.

Estos anlogos de nuclesidos presentan actividades muy interesantes desde el

punto de vista farmacolgico. Una vez en el organismo estos derivados pueden ser

fosforilados por mecanismos internos, transformndolos en antimetabolitos, ya que debido

a su similitud estructural con los nuclesidos naturales pueden participar en la biosntesis

de las cadenas de ADN o ARN en la replicacin viral o celular, bloquendola; por ende,una clula neoplsica o un virus no podrn duplicarse, disminuyendo los efectos adversos

que provocan estas entidades.

1.1.2. Aplicaciones

1.1.2.1. Antivirales

Los anlogos de nuclesidos como inhibidores de la actividad viral usualmente

actan por la interaccin de su derivado trifosfato con las polimerasas virales. Como

unidades estructurales de cidos nucleicos, los nuclesidos trifosfatos (NTPs) son los

sustratos para las polimerasas, que catalizan su polimerizacin. La biosntesis de estos

NTPs es controlada por quinasas. Los requerimientos estructurales de estos nuclesidos

para que interacten con las polimerasas y quinasas virales son los rasgos a tener en cuenta

en el diseo de nuclesidos con potencial actividad antiviral.

El desarrollo en el diseo de este tipo de drogas ha sido complicado debido a

diversas razones, la principal radica en la simplicidad del virus. Los virus son entidades

microscpicas infecciosas constituidas por material gentico (ADN o ARN) dentro de una

cubierta de naturaleza proteica denominada cpside; son parsitos intracelulares obligados

que necesitan de la maquinaria metablica de la clula husped para su propia replicacin.


13/222


5

De esta forma, el ciclo reproductivo de los virus est ntimamente conectado a la clula que

ataca, por lo que un agente antiviral efectivo debe afectar las enzimas relacionadas con el

virus sin alterar las funciones celulares del husped.

Las primeras drogas capaces de inhibir al ADN viral in vitrofueron descubiertas en

la dcada de 1950, pero el progreso real no fue sino hasta la dcada de 1970. En los ltimos

tiempos se ha comenzado a conocer ms de la bioqumica de la replicacin viral y esto ha

conducido a una aproximacin ms real en el desarrollo de los agentes antivirales,

logrndose establecer nuevas dianas para la accin de estas drogas (Figura 1.2).

Figura 1.2. Ciclo de replicacin viral. Dianas utilizadaspara la accin de los frmacos

Extrado de Enferm Infecc Microbiol Clin. 2005; 23(Supl. 2):25-32


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6

Cuando se analizan las posibilidades quimioteraputicas antivirales, la mejor gua es

el ciclo de replicacin viral, el cual puede dividirse en varios pasos: primero el virus se une

a la superficie de la clula husped. El material gentico del virus utiliza los mecanismos

bioqumicos de la clula husped para replicar su material gentico; estos pasos de

replicacin son diferentes en los virus de ARN o ADN, pero el cido ribonucleico

mensajero (ARNm) es producido en ambos. Entonces el material gentico viral es

encapsulado y las nuevas partculas salen de la clula husped. Si bien todos los virus

siguen un ciclo de replicacin, ste puede variar considerablemente de una familia de virus

a otra. Por lo general los inhibidores son especficos para una familia de virus y en algunos

casos para algn miembro en particular de esa familia.

Cualquier droga que interfiera selectivamente con algunos de los eventos descriptos

anteriormente es un candidato para un posterior uso clnico. En efecto, la mayora de losblancos donde actan los anlogos de nuclesidos son eventos biosintticos intracelulares y

su selectividad se debe generalmente a la inhibicin de enzimas virales asociadas al

metabolismo de nuclesidos y nucletidos. Existe una amplia cantidad de anlogos de

nuclesidos utilizados en terapias antivirales, algunos ejemplos de ellos se pueden

encontrar a continuacin:

La zidovudina (AZT) acta sobre la transcriptasa reversa del virus de

inmunodeficiencia humana (VIH) y cumple la funcin de terminador de la reaccin de esta

enzima; luego de la fosforilacin intracelular para formar su derivado 5-trifosfato, sufre la

prdida de un grupo difosfato, para de esta manera incorporarse en su forma 5-

monofosfato al extremo 3-terminal de la cadena de ADN del virus. En la prctica se utiliza

en conjunto con otros agentes antivirales.

Ladidanosina (ddI) es un 2,3-didesoxinuclesido que acta de manera similar que

la zidovudina, y se utiliza generalmente cuando el sndrome provocado por el VIH est

muy avanzado. Al igual que la droga anterior se utiliza en conjunto con otros frmacos.

Otras drogas utilizadas contra el virus de VIH son la zalcitabina (ddC), utilizado

especialmente en pacientes adultos con sndromes de inmunodeficiencia avanzados y que

son resistentes a la accin de la AZT; es utilizado en combinacin con otras drogas pero en

ningn caso se puede utilizar junto con ddI.


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7

La stavudina (d4T) posee una insaturacin en su residuo furansico y tambin es

utilizada cuando la enfermedad provocada por el VIH se encuentra en estados avanzados.

Otra droga utilizada que presenta una modificacin en el azcar, pero en este caso la

presencia de un heterotomo, es la emtricitabina, en donde un tomo de carbono es

sustituido por uno de azufre; esta droga tiene aplicaciones contra el VIH y el virus de la

hepatitis B, est aprobada para el tratamiento del primero mientras que para el segundo se

encuentra en fase III.

La5-trifluorometil-2-desoxiuridina, tambin conocida como TFT, ha sido utilizada

en usos tpicos para infecciones herpticas oculares, en particular para aquellas en las que

se ha presentado resistencia a otros frmacos. Las bases de su efecto antiviral son su

preferencial incorporacin en el ADN viral y subsecuente inhibicin de la transcripcin.

Otros mecanismos de accin incluyen la inhibicin de las enzimas desoxitimidn quinasa,desoxitimidilato sintetasa y ADN polimerasa1.

Las (E)-5-(2-bromovinil)-2-desoxiuridina (BVDU) y (E)-5-(2-iodovinil)-2-

desoxiuridina(IVDU) son los inhibidores del virus del herpes tipo 1 (VHS-1) y del virus de

la varicela zoster (VVZ) ms potentes y selectivos. El mecanismo de accin de estos

compuestos involucra su fosforilacin preferencial por las quinasas virales y una vez

formados los correspondientes trifosfatos, inhiben la ADN polimerasa o sirven como

sustratos para ser incorporados al ADN viral.

El aciclovir es utilizado en el tratamiento de infecciones por el virus del herpes y

varicela zoster. La alta potencia antiviral y selectividad del aciclovir es resultado de su

mayor especificidad por las quinasas virales que por las de las clulas husped, por lo que

presenta una mayor inhibicin de la ADN polimerasa viral que la celular; se incorpora

diferencialmente en el ADN viral donde acta como terminador de cadena2.

La ribavirinaes un agente antiviral de amplio espectro3, su mayor potencial clnico

es en el tratamiento de enfermedades respiratorias como la influenza A o B, para lo cual es

administrada como aerosol. Tambin es efectiva en la terapia de fiebre Lassa y otras

infecciones producidas por el virus de la fiebre hemorrgica. Este anlogo es rpidamente

monofosforilado por la enzima adenosn quinasa de la clula husped y posteriormente

fosforilado a ribavirina 5-trifosfato. La accin antiviral de la ribavirina est correlacionada

con la inhibicin de la enzima inosina monofosfato deshidrogenasa, lo que conlleva a una


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8

falta de guanosina 5-trifosfato (GTP) celular, lo que potencia la accin de 5-trifosfato de

ribavirina en la inhibicin de la RNA polimerasa viral.

Otro anlogo de nuclesidos que presenta una interesante actividad es la 6-

azauridinay se utiliza contra flavivirus, su prodroga (Azaribine) ha sido utilizada para el

tratamiento de casos agudos de psoriasis4. 6-Azauridina es convertida por la uridn quinasa

en el correspondiente monofosfato, el cual inhibe competitivamente la descarboxilacin del

cido orotidlico, un paso esencial en la biosntesis de pirimidinas.

Figura 1.3.Algunos anlogos de nuclesidos con actividad antiviral


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9

1.1.2.2Antitumorales

Los anlogos de nuclesidos con actividad antineoplsica actan tambin como

antimetabolitos, interactuando con la maquinaria encargada en la replicacin de las clulas

tumorales e interfiriendo con la sntesis de ADN, evitando de esta manera la divisin

celular y por ende el crecimiento de los tumores. Debido a que la velocidad de replicacin

es mayor en clulas tumorales, la inhibicin celular se produce principalmente en stas.

Los mecanismos de accin para estos anlogos de nuclesidos son:

- Activacin de la apoptosis por activacin de un grupo de protenas denominadas

caspasas y la activacin de ciertos receptores que estn involucrados en el inicio dela muerte celular. Asimismo, la incorporacin de los anlogos de nuclesidos en el

ADN celular causa la ruptura de la hebra en fase S (sinttica) desencadenando la

apoptosis.

- Inhibicin de las enzimas involucradas en la biosntesis de nuclesidos purnicos y

pirimidnicos.

Algunos ejemplos de estos nuclesidos son:

Lafludarabina es un anlogo arabinsido fosforilado de la adenosina, sustituido en

la posicin 2 de la base por un flor. Inhibe la sntesis de ADN interfiriendo con enzimas

como la ribonucletido reductasa y la ADN polimerasa, entre otras.

La cladribinaes un anlogo de la desoxiadenosina, en el cual la base se encuentra

sustituida en la posicin 2 por un cloro. Posee efectos inmunosupresores. Inhibe la

adenosindeaminasa, lo cual interfiere con la habilidad de la clula de procesar ADN.

Lafloxuridinaes un anlogo pirimidnico, en el cual la base se encuentra sustituida

en la posicin 5 por un flor. La forma activa es la base fluorada que es liberada

enzimticamente en el cuerpo. Este compuesto acta de diversas maneras, pero

principalmente acta como inhibidor de la timidilato sintetasa. Esta inhibicin bloquea la

sntesis de timidina, requerida para la replicacin del ADN.


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10

La citarabina(AraC) es un anlogo modificado en el azcar, en el cual la ribosa ha

sido reemplazada por arabinosa. Este compuesto daa el ADN en su fase sinttica. A su

vez, inhibe tanto la ADN como la ARN polimerasas y la enzima nucletido reductasa,

necesarias para la sntesis de ADN.

Figura 1.4.Algunos anlogos de nuclesidos con actividad antitumoral

1.2. Sntesis de nuclesidos

La sntesis qumica de nuclesidos naturales o modificados puede realizarse por

diversos mtodos. Estas metodologas se pueden resumir en tres aproximaciones sintticas:

- la glicosidacin directa de las bases purnicas o pirimidnicas naturales o

modificadas, a travs del desplazamiento de un grupo saliente ubicado en la

posicin 1 del monosacrido, por parte de un nitrgeno nucleoflico de la base;


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11

- a partir de N-glicsidos utilizados como precursores, en donde la base purnica o

pirimidnica es formada qumicamente a partir de estos;

-

y la ltima es la modificacin qumica de un nuclesido natural.

1.2.1.

Sntesis de nuclesidos a travs de la formacin del enlace

glicosdico

Una de las formas qumicas para crear un enlace glicosdico en la sntesis de

nuclesidos consiste en la utilizacin de sales de metales pesados de purinas o pirimidinas

como Ag o Hg5, para catalizar el desplazamiento nucleoflico de un halgeno posicionado

en el carbono 1 del azcar protegido. En general, esta metodologa permite obtener al

nuclesido con la regioselectividad deseada (es decir, glicosidacin en el N-1 en el caso delas pirimidinas y en el N-9 para las purinas) y con la estereoselectividad correcta

(formacin del enlace glicosdico con la configuracin ). Las principales dificultades

encontradas son la necesidad de proteger tanto la base como el azcar, la inestabilidad de

los derivados halogenados de los azcares y la baja solubilidad de las sales de mercurio.

Los bajos rendimientos obtenidos por la inestabilidad de los derivados halogenados

de los azcares pueden ser mejorados generando el tomo de halgeno reactivo in situpor

medio de la reaccin de 1-acetoxiazcares con cidos de Lewis tales como TiCl4

y SnCl4.

El problema de esta tcnica es que genera mezclas anomricas de productos y funciona

mejor con bases purnicas con grupos atractores de electrones unidos a ellas.

Otros investigadores desarrollaron otra metodologa, al constatar que las bases

pirimidnicas sustituidas son lo suficientemente nucleoflicas para desplazar al halgeno del

azcar sin la necesidad de catalizadores. El producto final es una sal cuaternaria que

elimina un haluro de alquilo a altas temperaturas para dar el producto deseado, aunque los

rendimientos no suelen ser altos debido a que se forma una mezcla de anmeros 6, 7.

En general, a pesar de las numerosas optimizaciones que se llevaron a cabo para

mejorar estas metodologas, existen varias limitaciones que no han podido ser subsanadas,

entre ellas se puede mencionar:

- bajos rendimientos;


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12

- estereoselectividad parcial con respecto a la posicin anomrica, especialmente para

los 2-desoxirribonuclesidos;

-

regioselectividad parcial;

-

necesidad imperante de la proteccin de grupos lbiles;

-

generacin de gran cantidad de subproductos que dificultan la separacin.

Teniendo en cuenta estos problemas, se plantearon rutas alternativas para llevar a

cabo la sntesis de nuclesidos; stas incluyen la utilizacin de una serie de tcnicas que

aprovechan las ventajas que pueden llegar a tener las reacciones catalizadas por enzimas o

microorganismos.

A continuacin se hace una pequea introduccin al vasto campo de la biocatlisis y

biotransformaciones.

1.2.1.1. Biocatlisis, biotransformaciones y biocatalizadores

Una biotransformacin es definida como una reaccin o un conjunto de reacciones

simultneas en la cual un sustrato no natural es convertido en otra entidad qumica a travs

del uso de enzimas o microorganismos, o combinacin de ambos, en forma libre o

inmovilizada. Tanto las biotransformaciones como la catlisis enzimtica frecuentemente

son referidas como biocatlisisy las entidades que las llevan a cabo, biocatalizadores.

Los microorganismos y sus extractos han sido explotados desde hace miles de aos

en reacciones de fermentacin para producir alcoholes, vinagre u otros productos

alimenticios como el yogurt. En la actualidad, el inters por la biotecnologa fue estimulado

por el uso de microorganismos para producir productos qumicos a gran escala, como

azcares y aminocidos y para la qumica fina en la industria farmacutica.

El creciente uso de estas biotransformaciones en la industria se debe a un nmero de

ventajas no ofrecidas por la qumica clsica. A continuacin se har un resumen de las

ventajas y desventajas que poseen este tipo de metodologas.

1.2.1.1.1. Ventajas de las biotransformaciones


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13

- Los procesos mediados por enzimas pueden ser acelerados en un factor de 10 8 a

1012 veces con respecto al mismo proceso sin catalizar, valores muy difciles de

alcanzar por los catalizadores qumicos tradicionales. Por otra parte, los

catalizadores qumicos son utilizados en una concentracin de 0.1% a 1% en

fraccin molar mientras que las enzimas pueden ser muy eficientes, en el orden de

10-3% a 10-4% en fraccin molar, lo cual demuestra su gran eficiencia.

-

Los biocatalizadores son completamente biodegradables, transformndose en una

opcin ambientalmente compatible en el campo de la sntesis orgnica.

- Las enzimas actan bajo condiciones suaves de reaccin; en un pH de alrededor de

5-8 y en un rango de temperaturas de 20-60 C. Esto minimiza problemas laterales

tales como reacciones de descomposicin, isomerizacin, racemizacin, entre otras.

-

Tanto las enzimas como los microorganismos pueden aceptar una gran variedad desustratos no naturales y no requieren especficamente trabajar en agua por lo que se

las puede utilizar en solventes orgnicos.

- Como todo catalizador, las enzimas slo pueden acelerar la velocidad de la reaccin

pero no pueden cambiar el equilibrio termodinmico, por lo que pueden catalizar

reacciones inversas. Adems existen procesos catalizados por enzimas de una

enorme variedad de reacciones orgnicas, como por ejemplo, hidrlisis/sntesis de

steres, amidas y lactonas; oxidacin/reduccin de alquenos, compuestos

aromticos, alcoholes, aldehdos y cetonas; adicin/eliminacin de agua y

amonaco; halogenacin y deshalogenacin, alquilacin y desalquilacin,

isomerizacin, reacciones aldlicas y adicin de Michael, entre otras8.

- Los biocatalizadores, especialmente las enzimas, poseen caractersticas

sobresalientes sobre la selectividad que pueden desplegar:

Quimioselectividad: las enzimas pueden reconocer uno de entre varios

grupos funcionales de reactividad similar presentes en la molcula.

Regioselectividad: debido a su compleja estructura tridimensional, las

enzimas pueden distinguir entre grupos funcionales iguales situados en

diferentes regiones de la molcula.

Enantioselectividad: todas las enzimas estn construdas a partir de L-

aminocidos por lo que son catalizadores quirales, como consecuencia,


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14

cualquier tipo de quiralidad presente en el sustrato es reconocido para la

formacin del complejo enzima-sustrato. Por esto, los sustratos proquirales

pueden ser transformados en uno de los productos pticamente activos y

ambos enantimeros de una mezcla racmica pueden reaccionar a diferentes

velocidades, obtenindose una resolucin cintica. Esto se debe a que cada

enantimero forma un complejo estado de transicin que presenta diferentes

energas.

1.2.1.1.2.

Desventajas de las biotransformaciones

La utilizacin de biocatalizadores puede presentar algunas desventajas, pero muchas

han sido superadas con el transcurso del tiempo. Entre los problemas ms frecuentespodemos destacar:

- Las enzimas son provistas por la naturaleza en una nica forma enantiomrica por

lo que no hay disponibles enzimas que sean imgenes especulares formadas a partir

de D-aminocidos, por ende es imposible invertir la direccin de la quiralidad de

una reaccin enzimtica por eleccin de otro enantimero del biocatalizador, lo cual

es posible cuando estn involucrados catalizadores qumicos quirales. Una

alternativa puede ser la de realizar la bsqueda de otro proceso enzimtico,

modificar las condiciones de reaccin o disear enzimas a medida por medio del

empleo de tcnicas de biologa molecular.

- Las ventajas de trabajar bajo condiciones suaves de reaccin pueden llegar a

convertirse en desventaja; si una reaccin enzimtica procede slo bajo ciertos

parmetros de pH y temperatura, hay poco margen para las modificaciones.

Elevadas temperaturas, as como pH extremos o altas concentraciones salinas

pueden desnaturalizar una enzima, pero existe la posibilidad de trabajar con enzimas

provenientes de organismos extremfilos, las cuales son estables a temperaturas

mayores o a altas concentraciones salinas. La naturaleza puede proveer de un gran

nmero de enzimas que an no han sido investigadas en su aplicacin a la

biocatlisis.


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15

- Las enzimas presentan una alta actividad cataltica en agua, pero debido a su alto

punto de ebullicin, su alto calor de vaporizacin y su carcter nucleoflico, el agua

no es un medio de reaccin ideal para ciertas reacciones qumicas, adems muchos

de los sustratos utilizados son insolubles en medios acuosos. Por estos motivos el

cambio a la utilizacin de solventes orgnicos para la realizacin de las

biotransformaciones es una opcin muy utilizada aunque haya cierta prdida de

actividad enzimtica.

-

Muchas reacciones enzimticas son susceptibles de sufrir inhibicin por sustratos o

productos, lo cual causa que la enzima pierda su actividad cataltica a altas

concentraciones de sustrato o producto, un factor que limita la eficiencia del

proceso. Mientras que la inhibicin por sustrato puede ser sorteada favorablemente

agregando pequeas cantidades del sustrato a medida que avanza el tiempo dereaccin, la inhibicin por producto es ms complicada de solucionar, ya que la

remocin del producto por mtodos fsicos es frecuentemente dificultosa. Una

alternativa sencilla que surge para estos problemas es realizar un diseo adecuado

del biorreactor.

1.2.1.1.3. Enzimas aisladas vs clulas enteras

La decisin final de utilizar enzimas aisladas o clulas enteras depende de muchos

factores, entre los que se pueden destacar el tipo de reaccin, si se requiere la utilizacin de

cofactores y la necesidad de reciclarlos, as como tambin la escala a la cual la

biotransformacin se realizar.

Tanto el empleo de enzimas aisladas con distintos grados de purificacin y la de

clulas enteras presenta aspectos ventajosos y desventajosos entre los cuales podemos

destacar:

- La utilizacin de enzimas aisladas presenta las ventajas de una metodologa simple,

muy buena productividad debido a las altas concentraciones de sustrato utilizadas,

pero en muchas reacciones puede ser necesario el reciclado del cofactor. Si se las

utiliza disueltas en agua se obtienen altas actividades enzimticas pero existe la


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16

posibilidad de reacciones secundarias y la insolubilidad de sustratos lipoflicos; si se

trabaja en medios orgnicos este problema desaparece pero por lo general se

observa una disminucin de la actividad enzimtica. Una estrategia muy utilizada es

el empleo de enzimas inmovilizadas, que facilita la recuperacin del biocatalizador

y su reutilizacin, pero muchas veces durante el proceso de inmovilizacin se pierde

actividad.

-

La utilizacin de clulas enteras evita la necesidad de reciclar cofactores aunque la

productividad puede ser baja debido a problemas difusionales o de concentracin de

sustrato. Adems, pueden ocurrir reacciones secundarias no deseadas provenientes

del metabolismo celular e inactivacin frente a solventes orgnicos. Cuando se

utiliza a los microorganismos inmovilizados el biocatalizador puede ser recuperado

y reutilizado con lo que se aumenta la productividad, pero nuevamente puedensurgir problemas de prdida de actividad producto del proceso de inmovilizacin.

1.2.1.1.4. Clasificacin de las enzimas

En la actualidad existen ms de 3500 enzimas que han sido reconocidas por la

Unin Internacional de Bioqumica, y se especula que en la naturaleza existen alrededor de

25000 enzimas, a pesar de esto slo un pequeo porcentaje ha sido investigado y aplicado

en el campo de la biocatlisis.

El nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico

encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguido de cuatro nmeros separados

por puntos. El primer nmero indica el tipo de reaccin que cataliza (Tabla 1.1), el segundo

establece el subtipo, indicando el tipo de sustrato o molcula que es transferida, el tercero

denota la naturaleza del cosustrato y el cuarto es un nmero individual de cada enzima.

Dada la cantidad y tipos de enzimas que existen, slo se profundizar en aqullas

utilizadas en esta tesis.


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17

Tabla 1.1.Clasificacin de las enzimas9Clase de enzima Tipo de reaccin que cataliza Utilizacin

1. OxidoreductasasOxigenacin de uniones C-H, C-

C, C=C, C=O, remocin oadicin de hidrgeno

25%

2. TransferasasTransferencia de grupos:

aldehdo,cetona, acilos, azcar,fosforilo o metilo

10%

3. HidrolasasHidrlisis/sntesis de steres y

amidas; hidrlisis de epxidos ynitrilos

55%

4. LiasasAdicin/eliminacin de

molculas pequeas sobreuniones C=C, C=N, C=O

5%

5. Isomerasas Isomerizacin, racemizacin,epimerizacin 3%

6. LigasasFormacin/ruptura de uniones

C-O, C-S, C-N, C-C2%

1.2.1.1.5. Lipasas

Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, EC 3.1.1.3) son definidas inicialmente como

carboxilesterasas, que catalizan in vivo la hidrlisis y sntesis de cadenas largas de

acilgliceroles10, son clasificadas como serina hidrolasas debido a su inhibicin por dietil p-

nitrofenil fosfato. Poseen una trada cataltica compuesta de serina, histidina y aspartato o

glutamato, que tambin son encontradas en serina proteasas11. El mecanismo involucrado

en la catlisis de la lipasa consiste en una activacin de la serina por desprotonacin, para

lo cual histidina y aspartato son necesarios; la nucleofilicidad del grupo hidroxilo de la

serina se ve incrementada por este hecho y ataca al grupo carbonilo del sustrato formando

un intermediario acil-enzima. La presencia de un agujero oxianinico contribuye a

estabilizar la distribucin de carga y reducir la energa del estado basal del intermediariotetradrico. El paso de desacilacin est gobernado por la electronegatividad de las

molculas presentes en la interfase. En este proceso el agua, u otros nuclefilos en medio

no acuoso, atacan la enzima acetilada provocando la liberacin del producto y la

regeneracin del sitio cataltico12.


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18

Una caracterstica particular que poseen las lipasas es su activacin interfacial, este

hecho fue observado cuando la lipasa pancretica exhiba poca actividad frente a

triglicridos de cadena corta, solubles en agua, como triacetina, y se encontraban en estado

monomrico. Una vez que la concentracin del sustrato excede su lmite de solubilidad, la

reaccin hidroltica se incrementa drsticamente, frente al mismo sustrato pero en forma de

micelas o emulsiones. Esta actividad es independiente de la concentracin molar pero

controlada por la concentracin del sustrato en la interfase13. La explicacin molecular de

este fenmeno se debe a la presencia de un loop peptdico anfiflico cubriendo el sitio

activo, que en contacto con una interfase agua-lpido, sufre un cambio conformacional que

descubre el sitio cataltico. Esta apertura lleva a la enzima a su estado activo14. La adicin

de solventes orgnicos inmiscibles con el agua en las reacciones catalizadas por lipasas

puede ser una tcnica til para mejorar la actividad.Estas enzimas pueden ser encontradas en microorganismos, plantas y animales;

poseen diversas funciones en la degradacin de grasas siendo calificadas como drogas

valorables contra desordenes digestivos y enfermedades del pncreas. Adems son

ampliamente utilizadas como aditivos en detergentes y como catalizadores en la

elaboracin de productos qumicos y en sntesis orgnica en transformaciones quimio-,

regio- y/o estereoselectivas. Su gran potencial es debido a que son capaces de aceptar una

amplia variedad de sustratos, son estables en solventes no acuosos, y dependiendo del

medio de reaccin utilizado puede aprovecharse su actividad hidroltica o sinttica.

1.2.1.1.6. Lipasa B de Candida antarctica (CAL B)

El hongo de la especie Candida antarctica produce dos lipasas, denominadas A

(CAL A) y B (CAL B). Esta cepa fue aislada en un principio en la Antrtida con el fin de

encontrar enzimas con propiedades extremas. Ambas enzimas son estables en un amplio

rango de pH, con CAL A mucho ms estable a pH cidos y CAL B a pH bsico. Aunque

CAL B no es tan estable en solucin como lo es CAL A, cuando estn inmovilizadas ambas

pueden ser utilizadas a temperaturas elevadas (60 C) por gran cantidad de tiempo sin una

prdida significativa de actividad.


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19

A pesar de que CAL A tiene una preferencia por la posicin sn-2 de los

triglicridos, esta selectividad no es lo suficientemente pronunciada como para permitir la

sntesis selectiva de 1,3-diglicridos o 2-monoglicridos. Salvo su extrema

termoestabilidad, demostr baja selectividad y actividad especfica en comparacin con

otras lipasas, y su principal uso es realizado en la industria papelera y textil para la

hidrlisis de glicridos de alto punto de fusin. Estudios realizados con anterioridad

demostraron que CAL A puede catalizar esterificaciones con sustratos altamente impedidos

estricamente15.

La enzima CAL B no presenta activacin interfacial y es muy poco activa frente a

triglicridos de cadena larga. sta se presenta en diferentes preparados comerciales que

difieren en el soporte sobre el que se incorpora la enzima. El preparado comercial empleado

en esta tesis es el comercializado por Novo Nordisk como Novozym 435 donde la enzimaest soportada en una resina de nombre comercial Lewatit E. Una de las ventajas de este

preparado es que es ms estable trmicamente que la enzima nativa. Adems, esta enzima

posee una alta selectividad, y una amplia especificidad por sustratos estructuralmente muy

diversos. El rea de aplicacin ms importantes por parte de esta enzima, es la resolucin

de alcoholes racmicos, aminas y cidos16.

A pesar de la baja homologa en su secuencia proteica con respecto a otras lipasas o

esterasas, CAL B asume estructuralmente la distribucin caracterstica hlice / lmina

de todas las hidrolasas y presenta la triada cataltica Ser-His-Asp en su sitio activo (Figura

1.5). La alta estereoselectividad de CAL B, en particular para alcoholes secundarios, est

fundamentada por la presencia de un bolsillo restringido compuesto de Thr42, Ser47 y

Trp10417.


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20

Figura 1.5.Mecanismo de transesterificacin catalizada por CAL B

1.2.1.1.7. Lipasa de Candida r ugosa (CRL)

La Candida rugosa (anteriormente Candida cylindracea) es una levadura

pseudofilamentosa, unicelular, no patognica y no esporulante, que sintetiza y segrega una

mezcla de diferentes lipasas, compuesta de aproximadamente cinco isoenzimas18. Cada

isoenzima posee una cadena polipeptdica simple de 543 aminocidos y un peso molecularaparente de 60 kDa con una bien definida triada cataltica (Ser209-Glu341-His449). Esta

mezcla enzimtica ha sido utilizada en un amplio rango de reacciones catalticas en medios

de reaccin acuosos y restringidos en agua, stas incluyen hidrlisis no-especficas y

estereoselectivas, esterificacin, transesterificacin e interesterificacin. Existe una

carencia general de discriminacin a travs de los steres secundarios y primarios de los

glicridos19.

Actualmente, todas las muestras comerciales de la lipasa de Candida rugosa(CRL)

estn compuestas de una mezcla de varias isoenzimas en diferentes proporciones,

denominadas Lip1, Lip2 y Lip3. La variabilidad bioqumica encontrada para las distintas

isoenzimas se debe principalmente a modificaciones post-transduccionales

(heteroglicosilacin) provocadas por las diferentes condiciones de fermentacin a que se

someten a los microorganismos en su produccin industrial20.


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21

1.2.2. Sntesis biocataltica de nuclesidos

1.2.2.1. Generalidades

Entre las metodologas biocatalticas diseadas para la sntesis de nuclesidos, se

destaca el uso de una enzima, la nuclesido fosforilasa (NP, E.C. 2.4.2), que cataliza la

fosforlisis reversible de ribo- y desoxirribonuclesidos, dando como producto una mezcla

de -D-ribosa 1-fosfato o -D-desoxirribosa 1-fosfato y la base correspondiente. La

adicin de otra base en el medio de reaccin resulta en la formacin del producto de

transglicosidacin (Figura 1.6), es decir la transferencia de un residuo ribosdico o

desoxirribosdico de un nuclesido hacia otra base natural o modificada, a travs delintermediario furansico 1-fosfato21. Estas biotransformaciones son regio- y

estereoselectivas, produciendo la unin glicosdica en los tomos N-1 y N-9 de las bases

pirimidnicas y purnicas correspondientes, y dando como producto exclusivamente el

ismero .

La utilizacin de esta enzima se hace a travs de dos procedimientos:

-

Aislamiento de la furanosa 1-fosfato y su uso como el donor glicosdico en lareaccin de acoplamiento con la base aceptora22.

- A travs del intercambio de una base por otra, en presencia de cantidades catalticas

de fosfato inorgnico.

Comnmente esta ltima estrategia es la escogida por su sencillez, ya que la

reaccin se realiza en un sistema one-pot, pero posee algunas desventajas ya que puede

producirse una inhibicin competitiva de la enzima por parte de la base liberada. Adems,

la sntesis de nuclesidos modificados en el azcar ha sido llevada a cabo por el uso dedonores glicosdicos modificados. sta es la principal limitacin de la metodologa, donde

adems de encontrar las enzimas capaces de aceptar dicho donor glicosdico no natural, se

debe disponer del nuclesido donor del azcar, con la modificacin deseada.


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22

Figura 1.6.Sntesis de nuclesidos purnicos a partir de uno pirimidnicopor la accin de nuclesidos fosforilasas (NPs)

Se introdujo una mejora en esta metodologa para evitar el problema mencionado, es

utilizar furanosas 1-fosfato como material de partida; debido a su inestabilidad y la

dificultad que existe en su sntesis, se opta por generarlas a travs de las correspondientes

furanosas 5-fosfato por la accin de otra enzima, denominada fosfopentomutasa (PPM,

E.C. 5.4.2.7). sta cataliza la transferencia reversible del grupo fosfato entre los hidroxilos

de las posiciones 5 y 1 del residuo furansico (Figura 1.7). La sntesis del nuclesido es

posible acoplando la accin de la PPM y NP en presencia de la furanosa 5-fosfato23.

A pesar de las ventajas de esta biotransformacin, uno de los precursores necesarios

tanto para esta metodologa (la sntesis de la furanosa 5-fosfato), como para la sntesis

qumica de los nuclesidos mediante tcnicas tradicionales, son las furanosas protegidas.

Con este fin se emplean habitualmente furanosas acetiladas regioselectivamente (Figura

1.7). Este tipo de precursores puede ser obtenidos en forma qumica, con bajos

rendimientos debido a la formacin de subproductos y la poca selectividad, o pueden

aprovecharse las ventajas que aporta la biocatlisis para producirlos.


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23

Figura 1.7.Sntesis de nuclesidos catalizadas por fosfopentomutasa (PPM) y purn

nuclesido fosforilasa (PNP)

Un objetivode esta tesis doctoral es la bsqueda de condiciones experimentales que

involucren biotransformaciones, para la sntesis eficiente de estos sintones, furanosas

peracetiladas desprotegidas regioselectivamente en la posicin5, de manera de poder ser

fosforiladas qumicamente en un paso posterior y de esta manera mejorar los rendimientos

generales de la reaccin global de la sntesis de nuclesidos a travs del uso de las PPM yNPs.

1.2.3.

Sntesis de precursores en la sntesis de nuclesidos furanosas

desacetiladas regioselectivamente

La introduccin y remocin de grupos protectores es una de las transformaciones

ms importantes y utilizadas en la qumica orgnica sinttica; en particular, en laconstruccin selectiva de molculas complejas y polifuncionales como pueden ser los

oligonucletidos, oligosacridos, alcaloides, etc.

El principal problema que presentan estas transformaciones es cuando deben ser

realizadas bajo condiciones suaves de reaccin y en la presencia de funcionalidades de

reactividad similar, como as tambin cuando existen en la molcula grupos funcionales


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24

susceptibles a cidos, bases, agentes oxidantes y reductores. A pesar de que algunos de

estos problemas persisten en la actualidad en el campo de qumica orgnica clsica, el

arsenal de tcnicas de grupos protectores disponibles ha sido sustancialmente enriquecido

por la aplicacin de biocatalizadores.

La proteccin y desproteccin de monosacridos ha sido llevada a cabo a travs de

tcnicas clsicas, la introduccin de la biocatlisis ha mejorado los rendimientos de estas

reacciones en general.

La acilacin enzimtica de azcares ha demostrado una excelente utilidad cuando se

realiza en solventes orgnicos a travs de transesterificaciones catalizadas por lipasas y el

desplazamiento del equilibrio hacia productos puede ser favorecido con el uso de un exceso

del reactivo acilante o el uso de un derivado activado como pueden ser los donores de acilo

irreversibles, trihaloetil steres24, enol steres25o steres de oxima26. En particular, los enolsteres poseen la ventaja de que el enol liberado tautomeriza a cetona o a un aldehdo,

provocando que el equilibrio se desplace a productos con altos rendimientos finales. Cabe

destacar tambin, que dada la alta polaridad de los azcares, son necesarios solventes

polares como dimetilsulfxido, piridina o dimetilformamida, que generalmente inactivan

las enzimas, sin embargo varias de ellas mantienen su actividad como las provenientes de

Candida antarctica o Candida rugosa; inclusive la acetilacin de glucosa suspendida en

tetrahidrofurano ha sido posible utilizando una lipasa de Candida antarctica27. Estas

estrategias de acetilacin han sido utilizadas en monosacridos piransicos principalmente,

y no son tiles para la sntesis del precursor furansico necesario para la sntesis de

nuclesidos, ya que la posicin favorecida para la acetilacin es la del hidroxilo primario,

es decir una regioselectividad inversa a la buscada, ya que justamente esta posicin debe

estar desprotegida con respecto a las dems para que pueda ser fosforilada y ser sustrato

para la enzima PPM.

Una estrategia ms adecuada para el cumplimiento de nuestro objetivo es

aprovechar la capacidad que poseen tambin las lipasas de desproteger regioselectivamente

(Figura 1.8).


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25

Figura 1.8.Estrategia quimioenzimtica para obtener furanosas 5-O-desacetiladas

La aplicacin de lipasas para la remocin enzimtica de grupos acilos ha sido

llevada a cabo en su gran mayora con piranosas, siendo la desproteccin regioselectiva de

furanosas, en particular pentofuranosas, dejada en un segundo plano28.

1.2.4.

Antecedentes de la desproteccin regioselectiva de furanosascatalizadas por enzimas

Como ya se mencion, las furanosas no han recibido mucha atencin con respecto a

la construccin de sintones desacetilados en forma regioselectiva. Uno de los primeros

antecedentes que se puede encontrar en bibliografa corresponde a Hennen et al.29, en

donde un grupo de furansidos fueron selectivamente acetilados y desacetilados; en

particular se obtuvieron las acetilaciones de los grupos hidroxilos primarios de un conjuntode metil D-furansidos con buenos rendimientos (77-84%), catalizadas por la lipasa

pancretica porcina. Tambin se realiz la desacetilacin regioselectiva, a travs de una

reaccin hidroltica catalizada por la lipasa de Candidarugosa, que permiti obtener con

buenos rendimientos metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido y metil 2,3-di-O-acetil--

D-arabinofuransido a partir de sus derivados triacetilados. Ms recientemente, condiciones

experimentales similares permitieron obtener con buenos rendimientos el producto

desacetilado en forma regioselectiva 1,2,3-tri-O-acetil--D-ribofuranosa a partir del

derivado peracetilado30 con un 80% de rendimiento; se analizaron diversas relaciones

enzima:sustrato (p/p) siendo la ptima 1,5:1. Utilizando el mismo sustrato que en el caso

anterior, Guisn y colaboradores observaron que los productos obtenidos a partir de la

hidrlisis catalizada por una lipasa dePseudomonas fluorescensdependan del soporte en el

que estaban inmovilizados, pudiendo obtener el producto desprotegido en C-331cuando la


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26

misma era inmovilizada covalentemente en agarosa activada con glutaraldehdo. Soo Kim y

colaboradores trabajaron sobre el metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido, pudiendo

obtener cuantitativamente el producto desprotegido en C-2 a travs de una hidrlisis con

una esterasa de Rhizopus oryzae32. Por ltimo, Nicolosi y colaboradores observaron

estreo- y regioselectividades diferentes en las butanlisis catalizada por la lipasa B de

Candida antarctica y la lipasa de Candida rugosa frente al derivado peracetilado de la

hexosa D-fructofuranosa33; este trabajo es el nico referido a alcohlisis enzimtica de

pentofuranosas.

A su vez, nuestro grupo ha reportado que la desacetilacin enzimtica del metil

2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido utilizando CAL B, fue totalmente regioselectiva,

obtenindose el metil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido con elevados rendimientos. La

desacetilacin del correspondiente anmero no fue regioselectiva, pero condujocuantitativamente a la furanosa totalmente desacetilada metil -D-ribofuransido34.

Tambin fue llevado a cabo un estudio con hidrolasas de origen vegetal, pudindose

obtener cuantitativamente metil 2,3-tri-O-acetil--D-ribofuransido a partir de su derivado

triacetilado usando tejido celular de banana como biocatalizador35, observndose adems

que la regioselectividad depende fuertemente de la estructura del sustrato utilizado.

Teniendo en cuenta estos antecedentes, el primer objetivoparticular de esta tesis es

el uso de lipasas para la obtencin de los precursores necesarios para efectuar la sntesisbiocataltica de nuclesidos, es decir la sntesis de furanosas acetiladas con el hidroxilo 5

libre.

1.3. Modificacin de nuclesidos naturales - prodrogas

La modificacin de los nuclesidos naturales puede tener otras razones adems de

simplemente cambiar su estructura para cambiar su actividad antiviral o antitumoral, y esta

modificacin puede cumplir una funcin especfica, como es la de transformar el

nuclesido en una prodroga.

El trmino prodroga fue propuesto por Albert36, y es definida como un derivado

farmacolgicamente inactivo de un compuesto parental activo, que en el organismo sufre

una transformacin espontnea o enzimtica que tiene como consecuencia la liberacin de


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27

la droga libre. Este tipo de derivados han sido diseados por varios propsitos,

principalmente para resolver problemas farmacolgicos como pueden ser la absorcin

incompleta, biodisponibilidad sistemtica pobre, absorcin muy rpida o excrecin

temprana del organismo, baja especificidad por la clula diana como tambin problemas de

formulacin. Las caractersticas que debe cumplir una prodroga son:

-

un enlace covalente entre la droga y un grupo modulador;

-

ruptura del enlace in-vivo;

- carencia de actividad intrnseca;

- carencia de toxicidad;

- y parmetros cinticos ptimos de liberacin de la droga para asegurar niveles

efectivos de la misma en el sitio de accin y para minimizar la metabolizacin de laprodroga y la inactivacin gradual de la misma37.

En el caso particular de los nuclesidos, las prodrogas de stos y sus derivados

fosforilados han recibido una atencin creciente estos ltimos aos; esto se debe a que un

paso vital en el modo de accin de la mayora de los anlogos de nuclesidos purnicos y

pirimidnicos contra enfermedades virales y neoplsicas es su activacin metablica por

quinasas celulares o virales38, que lleva a la formacin de su anlogo trifosfato, que es la

especia activa biolgicamente. Algunos nuclesidos no sufren el primer paso de

fosforilacin necesario para la formacin del derivado activo, debido a que son sustratos

pobres de las quinasas o no existe una enzima capaz de catalizar esta reaccin; los

nucletidos en cambio, no tienen este problema. Sin embargo los derivados fosforilados de

los nuclesidos poseen otras desventajas; debido a su carga neta presentan baja actividad in

vitroya que tienen dificultades en traspasar la membrana plasmtica y generalmente tienen

baja estabilidad en medios biolgicos debido a la rpida desfosforilacin por parte de las

fosfatasas 39. Las prodrogas de nucletidos pueden solucionar algunos de estos problemas,

atenuando la carga neta negativa del fosfato, incrementando la transferencia intracelular

liberando la droga fosforilada en el citoplasma, adems de alterar su farmacocintica,

distribucin en los tejidos y metabolismo, mejorando su eficiencia y especificidad.


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Con respecto a prodrogas de nuclesidos de carcter lipoflico, existen numerosos

artculos que resumen distintos ejemplos40. En nuestro grupo hemos aplicado la alcohlisis

catalizada por la lipasa B de Candida antarcticapara la obtencin de diversos nuclesidos

2,3-di-O-acilados; en particular se destaca la preparacin enzimtica con altos

rendimientos de los derivados diacilados de 3-azauridina y 6-azauridina a travs de esta

metodologa, productos de carcter anfiflico y de potencial comportamiento como

prodrogas41.

1.3.1.

Derivados lipdicos de nuclesidos

Otro tipo de prodrogas de nuclesidos que se pueden encontrar en literatura, son las

prodrogas lipdicas, las mismas llevan unido covalentemente al frmaco un cido graso, unglicrido o un fosfolpido (Figura 1.9). En particular, existen dos clases de derivados

fosfolipdicos de nuclesidos, uno en el que la droga est unida al grupo fosfato del

fosfolpido (por lo que sera considerada una prodroga del nucletido) y otro desarrollado

recientemente en el que reemplaza a uno de los grupos acilos42,43.

La aproximacin utilizada para la sntesis de estas prodrogas de nucletidos se

apoya en la premisa de que existen liponuclotidos naturales que son precursores

biosintticos de fosfoglicridos como el fosfatidilinositol y fosfatidilglicerofosfato a partir

de citidina y 2-desoxicitidina difosfato diacilglicerol, cuyas reacciones proceden con la

liberacin de citidina 5-monofosfato y desoxicitidina 5-monofosfato respectivamente44.

Es por esto que liponucletidos que contienen nuclesidos con actividad antineoplsica y

antiviral han sido diseados con el objetivo de utilizar estos caminos metablicos para

provocar la liberacin intracelular del nuclesido 5-monofosfato, evitando la necesidad del

primer paso de fosforilacin a veces problemtico. De hecho, se comprob que derivados

difosfato-diacilglicerilados del arabinsido de citosina (1--D-arabinofuranosilcitosina,

AraC) y algunos 2,3-didesoxinuclesidos con actividad antiviral son sustratos de enzimas

que participan en el metabolismo lipdico con la consecuente liberacin del nucletido 45.

Las prodrogas de AraC diseadas de esta manera demostraron una estabilidad metablica

mayor y alta actividad contra varias lneas celulares cancerosas y de leucemias, incluyendo

aquellas clulas que son quinasa-deficientes46.


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Figura 1.9.Esquema de las prodrogas lipdicas de nuclesidos/nucletidos

La sntesis qumica de estos compuestos generalmente conlleva bajos

rendimientos47, debido a la formacin de gran cantidad de subproductos que dificultan la

purificacin. Una alternativa biocataltica para su sntesis se desarroll estos ltimos aos y

consiste en la utilizacin de la fosfolipasa D para catalizar una reaccin denominada

transfosfatidilacin.

1.3.1.1.Fosfoslipasa Dreaccin de transfosfatidilacin


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Los fosfolpidos son molculas anfiflicas que son ubicuas en la naturaleza. Forman

parte de las membranas y las paredes celulares, donde juegan un rol estructural y funcionan

como cofactores y activadores de varias enzimas asociadas a membranas. La hidrlisis de

estos compuestos in vivo produce la liberacin de molculas biolgicamente activas

(segundos mensajeros lipdicos: diacilglicerol, inositol 6-monofosfato, cido fosfatdico)

regulada por un grupo de enzimas denominada fosfolipasas48.

Las fosfolipasas comparten la propiedad de hidrolizar un mismo tipo de sustrato,

fosfolpidos; cada una de ellas es capaz de reconocer selectivamente uno de los cuatro

grupos ster de la molcula. Ms all de su rol en la homeostasis de las membranas, sus

funciones incluyen la digestin de nutrientes, la formacin de mensajeros involucrados en

la regulacin celular y en algunos casos excepcionales poseen propiedades txicas49.

La clasificacin de las fosfolipasas est basada de acuerdo al residuo del fosfolpidoque ataca, como se puede observar en la Figura 1.10. Las fosfolipasas A son acil-hidrolasas

clasificadas de acuerdo a la posicin del ster que hidrolizan; si catalizan la escisin del

acilo en la posicin 1 de la molcula de glicerol se denominan fosfolipasas A1, y si lo hacen

en la posicin 2 se llaman fosfolipasas A2. Algunas fosfolipasas catalizan la hidrlisis de

ambos acilos en forma indistinta, estas son llamadas fosfolipasas B. La lisis de los distintos

enlaces fosfoster son realizadas por la fosfolipasa C y la fosfolipasa D de manera similar a

una fosfatasa o a una fosfodiesterasa.

Figura 1.10.Accin de las fosfolipasas

En biocatlisis, las fosfolipasas han sido utilizadas para llevar a cabo un gran

nmero de biotransformaciones a nivel laboratorio como as tambin a escala industrial 50.


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- Fosfolipasas A1y A2

La fosfolipasa A1 (PLA1, EC 3.1.1.32) hidroliza glicerofosfolpidos en la posicin

sn1 dando como productos finales una molcula de cido graso y un lisofosfolpido; poseen

una amplia especificidad por diversos sustratos. Enzimas con actividad PLA1 han sido

caracterizadas en lipasas pancreticas de cerdo de Guinea51, y tambin en Rhizomucor,

Mucor javanicus y Serratia. Algunas de estos preparados enzimticos estn disponibles

comercialmente y pueden ser utilizados para la hidrlisis de fosfolpidos en sistemas

emulsionados, como enzima libre o inmovilizada. Su tendencia para catalizar la

transesterificacin puede ser til sintticamente en sistemas donde la actividad del agua es

controlada, con una produccin por encima del 60%52.

La fosfolipasa A2(PLA2, EC 3.1.1.4) hidroliza a la L--fosfatidilcolina para dar L--lisofosfatidilcolina y un cido graso como productos, tambin acepta como sustratos la

fosfatidiletanolamina, cido fosfatdico y otros fosfolpidos. La fuente ms accesible para

esta enzima son las PLA2 pancreticas, sin embargo para aplicaciones biocatalticas se

utilizan aquellas enzimas de invertebrados (Crotalus adamentus, Naja naja, Crotalus

atrox), de mamferos (pncreas bovino o porcino) y de microorganismos (Streptomyces

violaceoruber, S. cinnamomeus, S. griseus)53,54. Ya que la hidrlisis por parte de esta

enzima es ms eficiente que la transesterificacin, se suele utilizar la misma para hidrolizarel residuo a ser reemplazado por otro acilo (en la posicin sn2) y la reesterificacin se suele

hacer qumicamente. La interesterificacin de fosfatidilcolina con cido mirstico en

presencia de PLA2inmovilizada ha sido reportada, con una incorporacin del mismo de un

43% en la posicin sn2. La PLA2 es especfica para fosfolpidos con la configuracin

absoluta natural en la posicin sn2; esta propiedad puede ser til para resolucin de

fosfolpidos racmicos o para evaluar la configuracin absoluta de fosfolpidos de orgenes

diferentes55.

-

Fosfolipasa C

Dos importantes enzimas con la actividad de la fosfolipasa C (PLC, EC 3.1.4.3)

pueden ser reconocidas y utilizadas para la modificacin de fosfolpidos. La primera de


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ellas es la fosfolipasa C especfica de fosfatidilcolina, que a pesar de llamarse as acepta

como sustrato a una gran cantidad de fosfolpidos con distintas cabezas polares. Pueden ser

obtenidas de cepas de Bacillus cereuscomo tambin de Clostridium perfringens. La PLC

ms comnmente utilizada es la de B. cereusya que esta es excretada fuera de la clula56.

La otra fosfolipasa es la que cataliza la hidrlisis de fosfatidilinositol que puede ser

obtenida deB. cereusyB. thuringiensis.

La funcin natural que tiene la fosfolipasa C es la de asegurar el correcto suministro

de fosfato a la clula, esta hiptesis es soportada por la existencia de mecanismos de

regulacin de genes de la PLC por fosfato exgeno. Tambin a ciertas fosfolipasas C se les

han adjudicado funciones en la patogenia de enfermedades debido a que poseen actividad

citoltica.

- Fosfolipasa D

La fosfolipasa D (PLD, EC 3.1.4.4) posee una posicin destacada sobre las dems

debido a que en presencia de un alcohol aceptor adecuado cataliza eficientemente el

intercambio de la cabeza polar de los glicerofosfolpidos en una reaccin de

transesterificacin o comnmente llamada transfosfatidilacin. El espectro de alcoholes de

distinta estructura que puede ser introducido como cabeza polar es amplio, en general los

alcoholes primarios son mejores aceptores que los secundarios, mientras que los terciarios

no poseen reactividad57. Esta enzima est ampliamente distribuida en clulas de mamferos,

plantas, hongos y bacterias58; especialmente las provenientes de fuentes bacterianas,

especficamente del gnero Streptomyces, son superiores a todas las dems en su capacidad

de catalizar la transfosfatidilacin59 y al tratarse de una protena extracelular, facilita su

utilizacin.

La accin cataltica sugiere un mecanismo ping-pong con un intermediario

covalente fosfatidil-enzima (Figura 1.10). El primer paso requiere el ataque cataltico del

imidazol de la His170 sobre el tomo de fsforo del sustrato, se forma un intermediario

pentacoordinado de fsforo, luego un hidrgeno es donado desde la His488 a la cabeza

polar del fosfolpido y de esta manera es liberada la colina. En el siguiente paso la His488


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es capaz de tomar un protn para activar el agua o la molcula de alcohol y de esta manera

dar como producto final cido fosfatdico o el producto de transfosfatidilacin 60.

Figura 1.10.Mecanismo de hidrlisis de PLD

R: 1,2-diacilglicerol; R: colina

En el campo de los nuclesidos, la capacidad de efectuar la transfosfatidilacin por

parte de la fosfolipasa D de origen bacteriano ha sido aplicada a la sntesis de diversas

prodrogas de nuclesidos, como el derivado 5-fosfatidil-2-desoxi-2-metilencitidina que

prolong la esperanza de vida de ratones inoculados con sarcoma M5076 y sus efectosfueron claramente superiores a los del 2-desoxi-2-metilencitidina (DMDC)61. Otros

derivados de distintos nuclesidos con actividad farmacolgica fueron sintetizados por

Matsuda y colaboradores demostrando efectos superiores a los de sus drogas parentales62-64.

A su vez, el comportamiento en solucin de los fosfatidilnuclesidos formados a

travs de esta metodologa ha sido estudiado, mostrando que son capaces de autoagregarse


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para formar estructuras micelares. Texeira y colaboradores 65observaron una particularidad

cuando analizaban las concentraciones micelares crticas (c.m.c.) de

dioctanoilfosfatidiladenosina (diC8P-Ade) y dioctanoilfosfatidiluridina (diC8P-Uri), dado

que cuando preparaban una mezcla de ambos la c.m.c. medida era un 20% menor a la

obtenida por cada uno de los fosfolpidos por separado. Esto indicaba que un mecanismo

energticamente favorable operaba entre las cabezas polares; los datos obtenidos por SANS

(small-angle neutron scattering), RMN, UV y DC (dicrosmo circular) permitieron

establecer que existe un proceso de reconocimiento entre las bases complementarias de los

nuclesidos ubicados en la cabeza polar de los fosfolpidos. Actualmente este campo sigue

en constante estudio66-69.

1.3.2.

Derivados fosforilados de nuclesidos

1.3.2.1. Aplicaciones

Otra forma de evitar que los nuclesidos con actividad farmacolgica sean

catabolizados rpidamente en sangre a derivados inactivos, provocando una pobre

biodisponibilidad del mismo, es aumentando su solubilidad y su polaridad. Un modo de

hacerlo es introduciendo funciones polares o inicas, como es el caso de los fosfatos, que

son posteriormente metabolizados y transformados en el principio activo correspondiente;

es decir que cuando penetra la clula este es fosforilado nuevamente a nuclesido 5-

trifosfato, el metabolito intracelular activo70.

El caso ms representativo es el de la fludarabina (2-fluoro-9--D-

arabinofuranosiladenina). Este nuclesido presenta una baja solubilidad en agua por lo que

el suministro de su derivado fosforilado se convirti en una alternativa interesante.

Actualmente la fludarabina 5-monofosfato est indicada en el tratamiento de pacientes con

malignidades de clulas B como leucemia linfoltica crnica (LLC) o linfoma folicular71, 72.

De la misma manera, el arabinsido de guanina (9--D-arabinofuranosilguanina,

AraG) es un agente efectivo contra el crecimiento de la clulas T y clulas leucmicas

humanas pero su pobre solubilidad limita su uso clnico73. Nelarabina, una prodroga

hidrosoluble de AraG, es efectiva contra leucemia linfoblstica aguda y linfoma de clulas


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T74. Por otro lado, la administracin de arabinoadenosina 5-monofosfato en casos de

hepatitis B crnica asociada a hepatitis autoinmune, permiti la inhibicin de la replicacin

del ADN de virus de la hepatitis B (VHB) y la remis

lipasas y fosfolipasas en la preparación de nucleósidos modificados y sus precursores

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