Fosfolipasas y Lipasas

José Luis Cárdenas LópezEnzimas de productos marinos

Fosfolípidos

�Esqueleto de Glicerol�2 grupos sustituyentes de ác. grasos �Tercer grupo derivado de fosfato

O

C

II.A.i.-2

C

C

OO

O

O

O P

O

O

X -

E.g. X = - (CH2)2 - N - CH3

CH3

CH3

+

fosfatidilcolina

Propiedades de Fosfolipidos

� fosfatido “Cabeza” es polar, cargado�hidrofílico

�Ác graso “cola” es no polar�hidrofóbico

P

aire

agua

II.A.i.-3

�hidrofóbico

�Molécula tiene un carácter dual �anfifílico

•Moléculas son surfo activas

–Se colocan entre fases hidrofilicas e hidrofobicas

PX

aceite

agua

PX

agua

Lípidos

�Fuente de energía metabólica�Componente esencial de membranas celulares

Enzimas lipolíticasEnzima Fuente Tejido

Lipasa Raya Pancreas

Trucha Pancreas

Bacalao Tracto digestivo

Langosta Jugo gástrico

Trucha Músculo

Bacalao Músculo

Fosfolipasa Bacalao Músculo

Trucha Músculo

Lenguado Músculo

Abadejo Músculo

Fosfolipasas

�La hidrólisis de fosfolípidos es importante en pescado congelado, en la fase lipídica con baja Aw

�En pescado congelado, la hidrólisis por �En pescado congelado, la hidrólisis por fosfolipasas, puede ocurrir mas rápido arriba del punto de congelación

Hidrólisis de fosfolípidos en carpa

0.20.30.40.50.60.7

glic

erilf

osfa

tilco

lina

mm

ol/1

0g/d

ia

00.10.2

-15 -10 -5 0

Temp de almacenamiento ( oC)

glic

erilf

osfa

tilco

lina

mm

ol/1

0g/d

ia

Tipos de fosfolipasas

O

O

R

R

(I)

(II)

A1

A2

B

O

O P

O

O-

O XO

R(II)

C

D

X=colina, serina, inositol, etc.

R(I) y R(II)=cadena alquilo

�Productos de la hidrólisis de las FL A2: ácidos grasos libres (AGL) lisofosfatidilcolina (LPC)

�Lisofosfolipasas, actúan sobre LPC�Lisofosfolipasas, actúan sobre LPC�más activas que las fosfolipasas

lisofosfolipasas

O

O

R(I)

(II)

lisofosfolipasa

O P

O

O-

O X

OH

(II)

X=colina, serina, inositol, etc.

Fosfolipasa A2 causa deterioro en surimi de bacalao en congelación, AGL� desnaturalización de proteína

80

100

120

140A

G li

bres

mg/

100

g

0

20

40

60

80

0 50 100 150

Solubilidad de proteina mg/g

AG

libr

es m

g/10

0 g

Endurecimiento

�AGL interacción hidrofóbica con actina y causa entrecruzamiento a través del puente con Ca++

� Actina----RCOO------Ca2+-----OOCR-----Actina

Interacción entre la acción de fosfolipasas y la oxidación de lípidos� Durante el congelamiento se solubilizan de los

lisosomas� La oxidación de lípidos en los microsomas

activa la fosfolipasa A2 de la trucha� La hidrólisis de fosfolípidos se ha relacionado � La hidrólisis de fosfolípidos se ha relacionado

con la fragilidad del retículo sarcoplásmico en músculo de carpa

� Las lipasas son mas activas en músculo rojo que en blanco

Propiedades de algunas fosfolipasas

PollockP. Virens

Red Sea bream (dorada)

Bacalao Trucha Carpa

Musculo Saco pilorico

HP D1

HP D2

lisosomal higado HP HP

PM (KDa)

13 14 13.5

13.5

>50 73(KDa) 5 5

pH opt 8.5-9 8-9 10 8-9

4 8-8.5 5 4-7

Temp opt 37-42 40 35-45 30-40

Ca2+ req si si si si no max max

EDTAinhibicion

si si no no no no no

FOSFOLIPASA A2 PANCREATICA DE BOVINO

Lipasas

�LPL lipasas de lipoproteínas�HL lipasas hepáticas�PL lipasas pancreáticas�GL lipasas gástricas�GL lipasas gástricas�BAL lipasas activadas por sales biliares

�Derivan del mismo gen ancestral en vertebrados

Mecanismo de reacción

CH3O

O

CH3O

O

CH3O

O

*

OHLipasa

TAG

Tripalmitina

(AG 16:0)(AG 16:0)

C

CH3O

O

CH3O

O

CH3O

O

*

O

C

CH3

O

*

OOH

CH3O

O

CH3O

O

OH2

C

CH3

OHO

*

OH

C

CH3

OH

*

O

O-

Propiedades bioquímicas de lipasas de pescado

Red sea bream

Bacalao Tiburon Leopardo

Tiburon Perro

Trucha Sardina

origen HP Saco Pilorico

Pancreas Tejido pancreas

HP

PM 60 54-57PM 60 54-57

pH optimo 8-9 6.5-7.5 8.5 8

Temp opt 25 36 35 37

Dependencia de sales biliares

Taurocolato de Na

abs abs si si

Enzimas relacionadas con oxidación de lípidos

José Luis Cárdenas LópezEnzimas de productos marinos

Oxidación de lípidos

� Iniciación LH� L* + H*�Propagación L* + O2 � LOO*

LOO*+LH� LOOH+L* LOOH LO*+ *OH

RADICALES LIBRES

PERÓXIDOS

HIDROPERÓXIDOSLOOH� LO*+ *OH

�Terminación L*+LOO*�LOOLL*+L* � LL

HIDROPERÓXIDOS

ALCOXI

NO MAS O2

Oxidación enzimática de lípidos

�Se ha enfatizado la ox de lípidos por rx no enzimáticas, pero

�rx catalizadas por enzimas del ciclo redox del Fe y la lipoxigenasa pueden ser del Fe y la lipoxigenasa pueden ser importantes en pescado

Formación de superóxido y radical hidroxi libre

�Rx FentonFe+2 + O2 � Fe+3 + O2

-

2 O2- + 2 H+ � H2O2 + O2

Fe+2 + H O � Fe+3 + OH- + *OHFe+2 + H2O2 � Fe+3 + OH- + *OH�Rx Haber Weiss

Fe+3 + O2- � Fe+2 + O2

Fe+2 + H2O2�Fe+2 + OH- + *OH

Radicales

e- e- e- e-�O2 � O2

- � H2O2 � *OH � H2O2H H H2H+ H+ H+

�el *OH, o un radical oxígeno (O2- )

relacionado es el responsable de la oxidación de lípidos en tejidos biológicos

�El sistema microsomal de oxidación de lípidos es altamente activo en congelación

�Los microsomas pueden reducir el Fe3+ a Fe2+ usando electrones del NADHFe2+ usando electrones del NADH

�Diferencias en tipo de músculo:�Los microsomas de músculo rojo contienen 3-4

mas actividad que en el blanco

Lipoxigenasa

� Puede causar decoloración de carotenoides � Ha sido identificada en la piel de numerosos

peces marinos y recientemente en la sangre y los tejidos intersticiales de pescado y moluscos los tejidos intersticiales de pescado y moluscos bivalvos

� Causa la formación de hidroperóxidos específicos que pueden ser precursores de sust farmacológicamente activas, aromas de frescura y contribuir a la ox. de lípidos en pescado

Volátiles asociados a lipoxigenasa

Organismo Compuestos

Trucha 2,5-octadien-1-ol, 1-octen-3-ol,5-octen-1-ol, (2Z)-octen-1-ol, (2E)-pentenal, (2E,6Z)-nonadienal, 1-octen-3-ona, (1,5Z)-octadienal, octen-3-ona, (1,5Z)-octadienal, (1,3E,5Z)-undecatrieno

Camarón cocinado

5,8,11-tetradecatrien-2-ona

Ayu 1-octen-3-ol, (E)-2-nonenal, (E,Z)-2,6-nonadienal, 3, 6-nonadien-1-ol

� La piel del pescado contiene lipoxigenasa, pero no se encuentra en el tejido muscular, salvo algunos pocos casos como en Herring (arenque)

Enzimas protectoras�Superóxido dismutasa (SOD), catalasa,

glutation peroxidasas se han estudiado en mamíferos por su efecto inhibidor de la etapa de iniciación de la ox. lípidos

�En animales acuáticos no se han �En animales acuáticos no se han estudiado lo suficiente,

�Algunos ejemplos:�SOD en la sangre de trucha�SOD en eritrocitos de salmón�SOD en camarón Litopenaeus vannamei

Superóxido dismutasa (SOD)

�Mecanismo complejo que involucra coordinados con metales (Cu, Mn, Fe, Zn o Ni) que actúan como cofactores

�Cataliza la “dismutación” de O - a O�Cataliza la “dismutación” de O2- a O2

�Por lo que “protege” de este superóxido actuando como antioxidante

Dismutación

� El O es el aceptor de electrones en la respiración, pero algunas de sus especies son peligrosas�El superóxidoproduce mutaciones en el DNA y otras cosas peores

� Rx especial � La SOD toma dos moléculas de superóxido, a una le � La SOD toma dos moléculas de superóxido, a una le

quita el electrón extra y se lo pasa al otro� Así uno será oxígeno normal y el otro tiene un electrón

extra que rápidamente busca 2 H y forma H2O2

� El H2O2 también es peligroso, por lo que las células deben usar la catalasa para detoxificarlo

Mieloperoxidasa

�Los leucocitos de la sangre de peces son fuente de mieloperoxidasa que puede producir radical Cl*

�Se puede añadir a un doble enlace o �Se puede añadir a un doble enlace o abstraer un protón formando radicales de ácidos grasos

Cl* + --C=C--C—C*

Cl

H HH H

Cl* + --C--C=C--

H H H

--C--C=C-- + H+ +Cl-

H H H

*

H

Ferroxidasa

�Pueden jugar un papel protector importante al oxidar el ión ferroso

4Fe+2 + 4 H+ + O2 � 4Fe+3 + H2O4Fe+2 + 4 H+ + O2 � 4Fe+3 + H2Oferroxidasa

Glutation peroxidasa (EC 1.11.1.9)

Nakano, 2006 y Nagai, 2001

� Músculo y piel de diversas especies de pescado � pH óptimo 8.0 salmon, 8.5 carpa y 7.0 sea bass � glutation reducido (GSH) incrementó la estabilidad de la

enzima en salmon� Pero decreció con hidroperóxido ter-butil � Pero decreció con hidroperóxido ter-butil � En filetes de salmón almacenados a -50°C, se

incrementó la actividad gradualmente� La GSH-Px de pescado tiene potencial para prevenir

deterioro oxidativo en músculo almacenado y en el proceso

Áreas que requieren investigación en fosfolipasas de organismos marinos

�Métodos de aislamiento y purificación�Secuencias y estructura terciaria de FL �Enzimología de la lipolisis digestiva�FL de músculo�Composición y suceptibilidad a la

oxidación�Cambios FQ que ocurren durante el

congelamiento y su relación con la act de FL, hidrólisis de Flípidos y oxidación

Profundizar…

�Seafood Enzymes (2000), Haard y Simpson. Marcel Dekker