la sds page-2d más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica

La SDS PAGE-2D más que una técnica, “un método” a l a vanguardia en proteómica. Mayo 28 de 2011

La SDS PAGE-2D más que una

técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica.

Mauricio Rivera*

Licenciado En Química Universidad Distrital Francisco José De Caldas, Bioquímico Clínico Pontificia Universidad Javeriana. Estudiante De Maestría en Bioquímica Facultad de Medicina Universidad Nacional De Colombia.

Introducción

Cuando se intenta hacer una retrospectiva amplia del desarrollo de la ciencia y de la tecnología focalizando un método de separación como lo es la electroforesis, se llega a corroborar de manera temprana aquel paradigma que expone acerca de la complejidad de la ciencia y del por qué tan sólo aquellos que poseen la capacidad de integrar y entretejer lo existente, son capaces de “comprender de otra forma la realidad” y generar nuevo conocimiento, trasformando las condiciones y escenarios con la invención de nuevas tecnologías.

Ahora bien, ¿donde surgen los nuevos métodos?, precisamente parten de una pregunta, un cuestionamiento que no puede ser resuelto o resuelto completamente bajo los métodos actuales y que responde a una necesidad. Posiblemente, es en búsqueda de una respuesta a dicha necesidad, que estudiando nuevos modelos y teorías surge la genialidad de quien integra el conocimiento y sugiere algo novedoso, muchas veces las herramientas ya están disponibles pero sólo algunos son capaces de ver a través de lo simple, mostrando una aplicación del conocimiento, haciendo materializable lo intangible, en otras palabras: “haciendo ciencia”

Pareciera sencillo hablar hoy de electroforesis como técnica tradicional de cualquier laboratorio alrededor del mundo, con protocolos tan ampliamente utilizados,

reutilizados, modificados, reestructurados ó tan sólo acomodados. Sin embargo, el estado actual de la electroforesis permite hacer la rotunda aclaración de que más que una técnica es todo un método y ha sido el resultado de complejos y profundos análisis en diferentes contextos de tiempo y espacio durante más de 200 años. Tratar de contar detalladamente lo sucedido durante tan largo periodo se escapa del objetivo de este escrito, no por eso será desconocido, sino que por el contrario, citaré momentos tangenciales que han permitido llegar a hablar hoy en día de la electroforesis en dos dimensiones acoplada a espectrometría de masas (SDS-PAGE 2D/MS), método que al perdurar y recrearse en el tiempo, es hoy un sistema de referencia para nuevos modelos y desarrollos en el campo de la proteómica.

Comúnmente, las investigaciones relacionadas con proteínas hacen uso de electroforesis unidimensionales, pero, entonces ¿cuándo usar electroforesis 2D? ¿Qué ventajas presenta sobre las unidimensionales? ¿Por qué y cómo nació la electroforesis 2D? ¿Cuál era la imperiosa necesidad o pregunta científica de la época que direccionó la invención de la electroforesis bidimensional? Al mantenerse casi impoluta en el tiempo y ganar prestigio en el ámbito científico ¿qué otras respuestas ha permitido contestar? ¿Es la electroforesis 2D un método ideal en la separación de proteínas?

Son preguntas como estas las que direccionaron mi búsqueda, todas ellas abocadas a responder ¿Por qué la SDS PAGE-2D es más que una técnica, es un método?

Materiales y métodos

Como diseño metodológico, se establecerán inicialmente algunas nociones históricas desde el contexto científico, reconocimientos que desde mi búsqueda bibliográfica se


hacen imperativos relacionar, puesto que son las bases teóricas y metodológicas de la SDS PAGE 2D y para efectos de mi objetivo, proporcionarán argumentos para contestar con respecto al por qué y cómo surgió el método. En un segundo plano se relacionarán aspectos fisicoquímicos elementales y claves del fundamento del método que facilitarán razonar sobre las ventajas y desventajas del mismo. Para finalizar, en un tercer aparte y una vez resumidas las ventajas y desventajas de la SDS PAGE-2D, se establecerán algunos de sus respectivos alcances y se concretará acerca de sus límites, cuestiones que le han permitido mantenerse a la vanguardia del desarrollo proteómico. Se dará especial importancia al final con respecto al uso de detergentes y las técnicas de marcaje y su relación con el acople a la espectrometría de masas.

Parte I: “Reconstruyendo el método”

Al intentar reconstruir históricamente desde sus más basales fundamentos un método como la electroforesis bidimensional, se llega a la pregunta ¿Cuál momento de la historia será el punto de corte o referencia?

En este marco histórico de búsqueda el análisis termina siendo limitado y relativo por la subjetividad de quien escribe, pues debido a la complejidad inherente de describir el desarrollo a través del tiempo, tienden a escaparse versiones, experimentos y detalles. Por eso, aunque exclusivamente se podrán resaltar aquellos acontecimientos que se hicieron públicos, no todos se relacionarán en este documento.

En aras de ampliar lo escrito, estudios de reconstrucción histórica de referencia serían:

1. Deborah Penque en 2009, quien además de profundizar acerca de la electroforesis 2D (principal objetivo de este escrito), toma como punto de partida en su reconstrucción

histórica el método incorporado de Tiselius [20]

2. También, Pier Giorgio Righetti en 2009, el cual describe de manera flexible y amable acerca del bicentenario de la electroforesis y su punto partida en el siglo XIX donde el protagonista es el profesor Reuss. [24]

Justamente, mi búsqueda comenzó con la particular atención al artículo de Pier Giorgio Righetti titulado “Bicentenario de la electroforesis”, allí a diferencia de otros documentos, además de relacionar aspectos tangenciales del nacimiento de la electroforesis, se toma como punto de partida las primeras experiencias registradas en el campo de la electrocinética, en fenómenos particulares entendidos hoy como la electroforesis y electroósmosis.

Estas experiencias, fueron invención de Ferdinand Friedrich von Reuss (Reuß) (1778—1852) profesor de la Universidad de Moscú, procedente de Alemania, quien dirigió el departamento de Química desde 1803 en dicha Universidad. En relación a los fenómenos electrocinéticos publicó un documento titulado “Nota Sobre Un Nuevo Efecto De La Electricidad Galvánica”

De acuerdo con Righetti en su documento, Reuss relata como el cuarzo en polvo y la arcilla al entrar en contacto con el agua bajo la acción de un campo de corriente eléctrica directa (corriente continua DC), podían ser trasportados al polo negativo, proceso al que llamó “flujo electroosmótico” o flujo “electro-endo-osmótico” (EOF) [24]

Se encuentran en la literatura dos experiencias significativas de Reuss en el campo de la electrocinética, en resumen, para el primer experimento se contaba con un tubo en “U” con dos cables fusionados en la parte inferior. En el fondo del tubo, se colocaba el cuarzo pulverizado entre alambres de platino, los alambres posteriormente se conectaban a una pila voltaica y una vez conectado el sistema de


acuerdo con Reuss [11] varias fenómenos se presentaban, entre ellos, se desprendían gases y mientras el agua ascendía por el tubo en el polo negativo (con respecto a su nivel inicial), el agua en el otro brazo del tubo descendía proporcionalmente y cuando se cortaba el fluido de corriente, el agua retornaba a su posición inicial, pero tan pronto se reconectaba el fenómeno anteriormente expuesto se repetía. En la figura 1 se presenta un esquema del aparato utilizado por Reuss en 1809.

Figura 1.

En su segundo experimento uso arcilla húmeda pulverizada en un sistema similar al anterior, esta vez, colocando adicional una capa de arena sobre la arcilla en el fondo de cada tubo y nuevamente cubierta con agua, ya conectado el sistema a la corriente, la arcilla comenzó a abultarse y aumento en el tubo después de cierto tiempo Reuss notó que las partículas de arcilla se habían movido hacia el polo positivo, penetrando a través de la capa de arena y formando una pequeña elevación. Esencialmente, fue en este empírico y sencillo experimento que se descubrió la electroforesis, definida para el caso particular, como el movimiento de partículas de arcilla cargadas debido al paso de una corriente eléctrica.

Más de un siglo después, la historia da el crédito al reconocido Tiselius (1902-1971), quien introdujo el término electroforesis y estableció un modelo de método llamado

electroforesis de frentes ó límites móviles, que para efectos prácticos, se considera el punto de partida de la era moderna electroforética. La electroforesis de límites móviles, se llevaba a cabo en medios homogéneos de buffer y densidad, conocido como Electroforesis en solución libre. La figura 2 muestra en esquema de dicho sistema que a diferencia del de Reuss presentaba la inclusión de amortiguadores.

Figura 2. 1

A finales de los años 30´, El profesor Abramson de la Universidad de Columbia, refirió en su publicación elementos técnicos de la electroforesis de células sanguíneas, bacterias, virus, espermatozoides entre otros usando tubos o portaobjetos como soportes (para la época el estudio de células y tejidos era marcadamente preferencial sobre las proteínas y metabolitos). Las técnicas señaladas por el profesor Abramson se fundamentaban en Tiselius (electroforesis libre) a quien visito y le ofreció una copia de la publicación.

Pasaron casi 20 años y hacia 1959 M Bier editó un clásico de la electroforesis (Electroforesis: Teoría, Métodos Y Aplicaciones) seguido por un segundo volumen en 1967. Desde su primer volumen, se analizaban los sistemas electrocinéticos. Sin embargo, en el segundo volumen se profundizaba con respecto a los avances en

1 Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpg


las electroforesis en capilar y más importante aún los diferentes medios de soporte. [3]

En la imperiosa necesidad de mejorar la resolución de la electroforesis transformando el medio de soporte, surgió el trascendental trabajo de Raymond y Weintraub que hacia el año 1959 incorporaron como soporte para la electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), este, era el producto de una co-polimerizaron entre el monómero acrilamida y el monómero entrecruzador N, N'-metilen-bis-acrilamida. Este gel química casi inerte, transparente, resistente al calor, insoluble en agua y como matriz altamente restrictiva ha sido usado desde la fecha como soporte ideal para separaciones de proteínas puesto que entre sus otras cualidades arriba mencionadas, evita la convección y minimiza la difusión, aumentando la resolución.

En esta reconstrucción histórica, no se puede obviar la contribución de Svensson que en 1962 logró la adaptación del sistema gel poliacrilamida al Isoelectroenfoque (IEF) [29], hoy, cimiento de la electroforesis en dos dimensiones.

Imprescindible fue también la intervención de la Academia de Ciencias de Nueva York que inesperadamente publicó dos clásicos en el campo electroforético:

Electroforesis En Gel fue el primer clásico de 1964 donde Ornstein [19] y Davis [7] mostraban en sus publicaciones el perfeccionamiento, ventajas y alcances de la co-polimerización para el gel de poliacrilamida y un nuevo sistema de buffer discontinuo. Así, Ornstein ampliamente describió la fundamentación del método y Davis las técnicas y aplicaciones clínicas de lo que llamaron “Electroforesis en Disco” logrando un reconocimiento como los dueños y señores del sistema de electroforesis de la época. Con la electroforesis en disco se difundió la idea de los geles discontinuos como sistema restrictivo, al manipular las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida generando diferentes tamaños

de poros a través de toda la matriz. En la figura 3 se muestran imágenes de los artículos de Ornstein y Davis.

El segundo clásico publicado en 1793 se tituló Isoelectroenfoque (IEF), claro es que el gel en poliacrilamida es una de los más importantes herramientas para mejorar la resolución, pero es definitivamente el IEF el pilar del método de la Electroforesis en dos dimensiones (2D). Para establecer y consolidar la idea de separar moléculas por punto isoeléctrico (pI) usando gradientes de pH, fue necesario consolidar un sin número de investigaciones, hallazgos y aplicaciones en cuanto al estudio de la naturaleza y composición de la materia, es decir, la química. Magistralmente, basándose en la identificación y comportamiento particular que refleja la composición de cada molécula y que le confiere características únicas ó alterando la carga y la naturaleza de las mismas, confiriendo características que orientan su aislamiento. Esta publicación de 1973 no sólo transformó la perspectiva de lo que al momento se conocía como electroforesis, ampliando el espectro de posibilidades en la separación de moléculas por su pI, sino que también, sirvió de plataforma para las siguientes investigaciones en el campo, que más adelante se tradujeron en la electroforesis en 2D. Durante la década de los 70´, la electroforesis se convirtió en la técnica de furor, ampliamente difundida, distribuida y aplicada por muchos laboratorios alrededor del mundo.

Pero el IEF no fue el único método incorporado para la época, con él, nació la isacotoforesis (ITP) pionera de la electroforesis capilar. En la ITP, conocida como electroforesis de velocidad uniforme, el fundamento presentaba como variables el tiempo de corrido y la velocidad, lo permitió caracterizar el método como se separación por desplazamiento, ya que bajo las condiciones presentadas el tiempo de corrido

La SDS PAGE-2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica.

era independiente de la velocidad de migración.

En la ITP no se utiliza electrolito de soporte, en cambio, se usan dos soluciones electrolíticas con iones de diferente movilidad, uno líder, mayor o inicial (L) y otro lento, menor o terminal (T). Para el caso particular de estudiar un catión, entonces, la solución L debe contener un catión de alta movilidad como hidrogeniones, mientras que la solución terminal debe contener un ion que presente una movilidad menor que la que se desea investigar. De esta manera, se restringe la movilidad del catión objeto de estudió al provocar un efecto sándwich o de paredes rígidas entre los iones de las soluciones L y T mesignificativamente la definición de las bandas.

B. Figura 3.

2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica.

era independiente de la velocidad de

En la ITP no se utiliza electrolito de soporte, en cambio, se usan dos soluciones

s de diferente movilidad, uno líder, mayor o inicial (L) y otro lento, menor o terminal (T). Para el caso particular de estudiar un catión, entonces, la solución L debe contener un catión de alta movilidad como hidrogeniones, mientras que

inal debe contener un ion que presente una movilidad menor que la que se desea investigar. De esta manera, se restringe la movilidad del catión objeto de estudió al provocar un efecto sándwich o de paredes rígidas entre los iones de las soluciones L y T mejorando significativamente la definición de las bandas.

Ya en 1970 por primera vez Kenrick y Margolis lograron integrar el IEF al (PAGE), es decir nació la electroforesis en dos dimensiones, con todo, esta primera versión se realizó en condiciones no denaturantes, lo cual fue modificado con la incorporación inicialmente del Dodecil Sulfato Sódico (SDS) en 1972 y agentes reductores como la UREA en la determinación del peso molecular de proteínas en lo que se denominó electroforesis en geles SDS (SDS-PAGE).

Siendo hoy consientes que PAGEes el único método usado en proteómica, no podemos desconocer que el método en sí, se ha considerado fundamental en el nacimiento, desarrollo y evolución en este campo. Asimismo, sería ingenuo creer que la SDS-PAGE es la panacea universal de las separaciones de proteínas, de hecho, cuando se abordó el análisis de complejos extractos celulares se hizo obvio que la resolución del método estaba lejos de permitir la separación de muchas de las proteínas que componían dichos extractos, por tal razón se hizo comprensible el acoplamiento de dos separaciones independientes.

A la fecha, si se replanteara la posibilidad de ampliar, mejorar, complementar o modificar el método acoplado a SDSnuevamente como exponen muchos se llegaría a la conclusión que es el IEF el mejor método asociado.

Según reportes, la primera publicaque se asocia IEF a PAGE desnaturalizante es decir SDS-PAGE se dio en 1974. Sin embargo, al parecer, fue inadvertido por la comunidad científica aparentemente según comenta Thierry Rabilloud debido a:

1. La inclusión de la muestra dentro de un tubo “en gel” en IEF, proceso eficiente pero engorroso

2. El método de tinción elegido: la clásica tinción con Azul de Coomassie en mezclas de acido-etanol

2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica. Mayo 28 de 2011

Ya en 1970 por primera vez Kenrick y Margolis lograron integrar el IEF al (PAGE), es decir nació la electroforesis en dos dimensiones, con todo, esta primera versión

ndiciones no denaturantes, lo cual fue modificado con la incorporación inicialmente del Dodecil Sulfato Sódico (SDS) en 1972 y agentes reductores como la UREA en la determinación del peso molecular de proteínas en lo que se denominó

de poliacrilamida con

Siendo hoy consientes que PAGE-2D ya no es el único método usado en proteómica, no podemos desconocer que el método en sí, se ha considerado fundamental en el nacimiento, desarrollo y evolución en este

o, sería ingenuo creer que la PAGE es la panacea universal de las

separaciones de proteínas, de hecho, cuando se abordó el análisis de complejos extractos celulares se hizo obvio que la resolución del método estaba lejos de permitir la separación

chas de las proteínas que componían dichos extractos, por tal razón se hizo comprensible el acoplamiento de dos separaciones independientes.

A la fecha, si se replanteara la posibilidad de ampliar, mejorar, complementar o modificar el método acoplado a SDS-PAGE, nuevamente como exponen muchos se llegaría a la conclusión que es el IEF el mejor

Según reportes, la primera publicación en la que se asocia IEF a PAGE desnaturalizante

PAGE se dio en 1974. Sin embargo, al parecer, fue inadvertido por la comunidad científica aparentemente según comenta Thierry Rabilloud debido a:

1. La inclusión de la muestra dentro de un tubo “en gel” en IEF, proceso eficiente pero

2. El método de tinción elegido: la clásica tinción con Azul de Coomassie en mezclas


Considero que, otros factores tales como: la poca experticia, sumada a lo que en mi particular opinión es trascendental en este y cualquier método: el manejo de la muestra, minimizaron la sensibilidad del método, lo que llevó a una lectura pobre, en pocas palabras un método poco impresionante.

Siguiendo en el curso de la historia, pionero no sólo en el perfeccionamiento sino en la validación del método, O´Farrell en 1975 realizó el IEF en condiciones denaturantes acoplado a SDS-PAGE, proceso que se lleva a cabo hasta el día de hoy. Con el trabajo de O´Farrell se recogen los esfuerzos mancomunados de muchos grupos de trabajo que de manera reflexiva y crítica pretendieron perfeccionar la técnica. O´farrell publica un método en algún grado reproducible, describe acerca de los gradientes de pH y para la segunda dimensión SDS-PAGE, presenta la estructura de los soportes de vidrio en los cuales se prepararían los geles.

A parte del trabajo de O´Farrell, se referencian generalmente otros dos independientes, pero sin duda se tiende a destacar a O´Farrell, puesto que logró resolver en un único gel 2D 1.100 componentes diferentes de E. coli, y de acuerdo a sus estimaciones tenía la capacidad de resolver un máximo de 5.000 proteínas. [18]

Cumpliendo con su objetivo O´Farrell, particularmente somete al análisis de aspectos técnicos que aun a la fecha son indispensables caracterizar para lograr resultados reproducibles. Entre los más destacables se encuentran:

1. La resolución evaluada desde el efecto de la cantidad de muestra de proteína y el tamaño del spot final. Aquí O´Farrell mediante un progresivo aumento de la muestra inicial en varios geles y posterior corrido en condiciones similares demuestra una relación exponencial creciente entre la cantidad de muestra que se aplica y el

diámetro de los puntos finales de la imagen 2D.

2. La reproducibilidad vista desde la alteración de los medios de cultivo, otro hit que se anotó O´Farrell al dejar constancia de la importancia que tienen las condiciones de cultivo sobre la reproducibilidad, un aspecto factor de éxito que desde la fecha ha sido considerado.

3. La mediación del gradiente de pH evaluado desde el efecto de la incorporación de agentes reductores como la Urea. Aquí O´Farrell demuestra que los sistemas comparativos deben partir de condiciones iniciales y protocolos iniciales es decir la normalización de los protocolos para aumentar la confianza en el método.

Desde mi punto de vista, la caracterización estructural y posterior investigación funcional de una molécula en el ámbito de las ciencias bioquímicas no podría haberse iniciado sin un método que permitiera en alto grado obtener la molécula objeto de estudio, aislada ó purificada. Por ende, este hallazgo metodológico de separación de alta sensibilidad con respecto a sus homólogos contemporáneos que presentó O´Farrell, generó, proyectó y direccionó en el ambiente científico la posibilidad de materializar lo que antes era intangible “el estudio de componentes más pequeños que la célula”, para el caso puntual: las proteínas.

Al parecer y como se revelaba ante la comunidad científica desde 1975 podría PAGE-2D cumplir con un estricto aislamiento, más aun, partiendo de la fuente ó procedencia de la molécula a estudiar que no es otra que los heterogéneos y complejos sistemas biológicos, que por lógica, generalmente, necesitan complejos y completos métodos que contemplen la multivariabilidad del contexto, estado, naturaleza, composición, dependencia, interconexión, sinergismo y demás factores inherentes a dichos sistemas biológicos.


Ya con O’Farrell, como comentó antes, la situación cambio radicalmente, al hacer modificaciones generalmente de forma, más no de fondo, entre las que se encuentran, que la carga de la muestra se hiciera en la parte superior del gel en IEF, el describir de forma detallada y precisa el protocolo y por último, instaurar la detección por autoradiografía, le permitieron mostrar cientos de puntos que representaban proteínas, todos en un mismo gel. Sólo con el ánimo de contextualizar la importante contribución de O´Farrell, su artículo de 1975 fue citado en cerca de 1500 publicaciones entre 1976-1980, se convirtió en el punto de referencia para quien incorporara SDS PAGE-2D. [22]

Con todo, la identificación de proteínas en esa época era todo un nuevo paradigma, por un lado, si con dificultad se lograban aislar, con el aislamiento venia su estudio estructural y posterior estudio funcional, hoy pilares de estudio de la proteómica. En esta época con las limitadas herramientas de proteómica como la biología molecular, el análisis de correlación de estados celulares se centraba en la cuantificación de proteínas y por ende el análisis estadístico e informático jugaron un papel fundamental en el análisis de las imágenes 2D.

Lo grandioso del método SDS PAGE-2D era la oportunidad de obtener puntos que representaban cada uno una única proteína, por lo que el espacio que ubicará en el gel era producto e indicio acerca de sus propiedades de masa y punto isoeléctrico (pI). Como dato curioso, el primer programa de análisis del sistema en gel 2D con el que se trabajo por cerca de una década (1977-1987) se llamó TYCHO en honor al famoso astronauta y alquimista Tycho Brahe [1] quien tras la observación de la estrellas y un posterior análisis correspondiente a ubicación espacial y relación, situaba la estrellas como puntos sobre un soporte (papel), una gran similitud con las imágenes 2D. [18] Ver fig. 4

Sin embargo sin un sistema de identificación de proteínas, y debido a lo que llamo yo la “mutación inherente” que presentaba el método: su baja reproducibilidad, la electroforesis 2D se caracterizó como un arte. Aquí toco una limitante que a la fecha significaba la poca demanda del método, el hecho de trabajar geles suaves (4%) en soportes de vidrio cilíndricos (tubos) trabajo tedioso, y una vez utilizados en IEF debían acoplarse a la segunda dimensión en las que se usaban geles en placas. Ese proceso engorroso terminaba con alta frecuencia en la deformación del gradiente lineal ó del gel del tubo lo que afectaba la reproducibilidad. Por otro lado, la misma manipulación de los anfolitos utilizados que debían ser cuidadosamente usados se convertía en otro factor de riesgo alternante por la inherente implicación técnica o manipulación humana, sumado a la inestabilidad del gradiente de pH formado que tendía a la derivación. Haciendo inútil establecer un perfil de migración en voltios y horas voltio. La concentración de los anfolitos de un lote a otro que a largo plazo altera la reproducibilidad era otro factor.

Con la incorporación hacia 1982 de gradientes de pH inmovilizados para IEF, conocidos como IPG por Bjellqvist y cols [4], unas tiras delgadas de gel con pH inmovilizados, que garantizaba gradientes de pH estables mejoró notablemente la reproducibilidad. Con la incorporación de IPG´s la electroforesis 2D pasó de ser un arte a un proceso más utilizado y más reproducible.


Hoy es posible comercialmente adquirir estas tiras deshidratadas o se pueden construir en el laboratorio. La resolución del proceso está determinada por la curva de gradiente de pH y la fuerza del campo eléctrico. Pero hay que tener cuidado con la temperatura puesto que no se puede olvidar el efecto termodinámico que tiene sobre los pKa´s de las proteínas y los amortiguadores. [13]

Pero el cambio de paradigma llegó fue con las técnicas en geles 2D para microanálisis de proteínas a través de secuenciación de Edman (la importancia de partir de la fuente de muestra que en muchos casos era escasa), eso sucedió pocos años antes que la espectrometría de masas entrara en escena.

En esa época cuando el proyecto genoma estaba en desarrollo temprano, la Secuenciación de Edman proporcionaba información para buscar homólogos, o diseñar oligonucleótidos para detectar bibliotecas de DNA, con lo que vino la edad de oro de las bases de datos de imágenes 2D en gel.

Dichas bases de datos de los años 90´ debían contar con información completa descriptiva por lo que la información referente a las proteínas debía estar enteramente disponible. Sin embargo la generalización del método provocó la diminución del valor agregado que tenían dichas bases de datos puesto que cada laboratorio elaboraba las propias.

Ya fue a mediados de los 90´con la magistral, necesaria llegada y acople de la espectrometría de masas que se dio el nacimiento a la proteómica [14] y podían detectarse las masas moleculares relativas, este mecanismo a diferencia de la Secuenciación de Edman podía sugerir posibles modificaciones pos-traduccionales, menor consumo de proteínas y por ende mayor rendimiento, sin desconocer, que proporcionaba menos información sobre la secuencia. El trabajo se redujo de días a tan

solo horas lo que aumento la productividad en al proteómica, es decir asegurando bajo SDS PAGE-2D un aislamiento de alta pureza el trabajo del espectrómetro era confiable.

Parte II: Aspectos Fundamentales básicos de las Separaciones Electroforéticas

Principios regentes relativos para electroforesis

a. Las proteínas difieren una de otras por su masa, carga y punto isoeléctrico (pI).

b. Estas propiedades pueden usarse para separar proteínas, mediante un sistema que contemple una o varias propiedades.

c. La aplicación simultanea de dos métodos electroforéticos (2D) en direcciones perpendiculares permite el máximo poder resolutivo de separación.

d. La tinción de los geles revela la posición individual de cada proteína como puntos, los cuales dependiendo del sistema de tinción pueden ser acoplados a espectrometría de masas (MS) para su posterior análisis.

i. El fundamento fisicoquímico

Partiendo de que la interacción entre fuerzas eléctricas de repulsión y atracción permite la movilidad electroforética, entonces, la ecuación matemática que representa la relación entre fuerzas eléctricas y movilidad electroforética estaría dada por:

Fe = (E / d) * q (1)

Donde Fe indica la fuerza eléctrica de atracción, E indica el potencial, d la distancia que separa los electrodos y q la carga. (E / d) = representa la fuerza del campo y es constante.

2. Fr = 6 Π r η v (2)


Donde Fr es la fuerza de repulsión o rozamiento, r el radio de la molécula, η viscosidad del medio v la velocidad de la partícula o molécula en el medio.

Al igualar las fuerzas 1 y 2 se tiene:

(E / d)* q = Fr = 6 Π r η v (3)

Aquí, la relación (v / E) reconocida como movilidad electroforética (µi) equivale a:

q / 6 Π r η d (4)

La expresión (1/ 6 Π η d) es constante (K) en las corridas electroforéticas por ende la movilidad electroforética se reduce a:

µi = K*x q/M (5)

Donde M refiere al peso molecular. Se sustituye por r ya que existe relación directa entre el radio y la masa de la partícula.

Es importante a la hora de establecer las diferencias de movilidad electroforética, identificar los cocientes de movilidad (q/M), puesto que si son equivalentes, como resultado, las partículas migrarán a la misma posición en el campo electroforético. Por el contrario entre mayor sea el cociente, mayor será la distribución de las partículas en el campo para su identificación.

Ahora bien, si el valor absoluto de los cocientes es el mismo pero la carga de signo contrario, la magnitud de migración será la misma pero con dirección contraria del punto de aplicación.

La velocidad de migración de un ion, V, en centímetros por segundo, en el seno de un campo eléctrico, es igual al producto de la intensidad del campo eléctrico E (Vcm-1) por la movilidad electroforética µe (cm2V-1s-1) (5), esto es:

V=µeE (6)

Es importante relacionar que la movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento y al tamaño de la partícula. De tal manera, el campo eléctrico actúa solamente sobre los iones; si dos especies difieren bien en la carga o en la fuerza de rozamiento, se moverán a través del tampón y se separarán. Las especies neutras no se separan por lo que el uso de agentes que permitan cargar las moléculas es indispensable antes de hacer la corrida electroforética.

Por otro lado, las proteínas de igual tamaño y carga pero diferente forma presentan mayor movilidad electroforética, ese es el caso de las proteínas globulares que se mueven con mayor facilidad debido a su forma esférica, lo que les permite una menor superficie de contacto y por ende menor rozamiento.

Hablando del rozamiento, la fuerza de retardo por rozamiento se determina en un analito cargado, a partir del tamaño y de la forma del ion y de la viscosidad del medio en el cual migra. Para iones del mismo tamaño la fuerza impulsora será mayor, en el de mayor carga, y tendrá una velocidad de migración más rápida. Para los iones que presenten la misma carga la fuerza de retardo por rozamiento será más pequeña, en el ion más pequeño y tendrá una velocidad de migración más rápida. La relación carga-tamaño de los iones combina estos dos efectos. [9]

En resumen, las fuerzas involucradas en la movilidad electroforética están dadas por un lado por la fuerza del campo eléctrico que promueve la movilidad de las partículas hacia el ánodo (una vez las moléculas a ser separadas se encuentren cargadas bien sea por su naturaleza ó por el efecto del pH sobre el medio), y la resistencia viscosa del medio que la contrarresta. La resultante será la normalización de las velocidades de desplazamiento de las partículas. Durante la electroforesis se produce la electrolisis del agua lo que genera protones

La SDS PAGE-2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica.

en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo, el uso de buffer espara evitar la acidificación del ánodo o la alcalinización del cátodo, pero no afectar las moléculas a separar.

Otro fenómeno que debe citarse es laElectroendósmosis definida como el movimiento de agua hacia el cátodo cuando se aplica un campo eléctrico al gel o en otras palabras el llamado el efecto migración contracorriente, se debe a que los contraiones (cationes) asociados a los aniones del gel se pueden mover libremente hacia el cátodo, arrastrando las moléculas de agua de su atmósfera de solvatación. El movimiento contrario de los aniones (con su agua de solvatación) hacia el ánodo no puede ocurrir, por estar unidos covalentemente a la estructura del gel. Todas las moléculas disueltas se ven arrastradas hacia el cátodo por el flujo de agua electroendosmótico. Así, la movilidad electroforética aparente de los cationes es mayor que la real, la de los aniones menores (tienen que ir "contracorriente"), y las moléculas neutras se muevcátodo. Ver figura 5

Figura 5

2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica.

en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo, el uso de buffer es principal para evitar la acidificación del ánodo o la alcalinización del cátodo, pero no afectar las

Otro fenómeno que debe citarse es la definida como el

movimiento de agua hacia el cátodo cuando se aplica un campo eléctrico al gel o en otras palabras el llamado el efecto migración contracorriente, se debe a que los contraiones (cationes) asociados a los aniones del gel se pueden mover libremente

átodo, arrastrando las moléculas de agua de su atmósfera de solvatación.

El movimiento contrario de los aniones (con su agua de solvatación) hacia el ánodo no puede ocurrir, por estar unidos covalentemente a la estructura del gel. Todas

ueltas se ven arrastradas hacia el cátodo por el flujo de agua

Así, la movilidad electroforética aparente de los cationes es mayor que la real, la de los aniones menores (tienen que ir "contracorriente"), y las moléculas neutras se mueven hacia el

El complejo acople del método electroforético permite generar una fuerza iónica alta, capaz de mantener el pH y la conductividad constante en el sistema, pero no tan elevada para interferir con las proteínas.

ii. Factores físicos clásicos que afectan la electroforesis:

a. la diferencia de potencial (V)

aplicado. Existe una relación directamente proporcional entre el campo eléctrico y la velocidad de migración.

b. la intensidad o flujo de carga eléctrica, dependiente eléctrico y la resistencia.

c. La resistencia d. Las condiciones de pH y

temperatura, de acuerdo con el efecto Joule, el paso de corriente eléctrica produce calor. Entre mayor sea el ∆V y la resistencia del sistema mayor será el flujo de calor.

iii. Clasificación de la electroforesis Por su procedimiento la electroforesis puede clasificarse en dimensional o bidimensional como aparece a continuación:

I. Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

a. PAGE-nativa b. SDS-PAGE c. Isoelectroenfoque

II. Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

Según las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en la práctica o experimento, se utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolución de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta técnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones diferentes.

2D más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica. Mayo 28 de 2011

El complejo acople del método electroforético permite generar una fuerza iónica alta, capaz de mantener el pH y la conductividad constante en el sistema, pero no tan elevada para interferir con las proteínas.

Factores físicos clásicos que afectan la electroforesis:

la diferencia de potencial (V) aplicado. Existe una relación directamente proporcional entre el campo eléctrico y la velocidad de

la intensidad o flujo de carga eléctrica, dependiente del campo eléctrico y la resistencia.

Las condiciones de pH y temperatura, de acuerdo con el efecto Joule, el paso de corriente eléctrica produce calor. Entre mayor

∆V y la resistencia del sistema mayor será el flujo de calor.

Clasificación de la electroforesis

Por su procedimiento la electroforesis puede clasificarse en dimensional o bidimensional como aparece a continuación:

Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

nativa PAGE

Isoelectroenfoque Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

Según las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en la práctica o experimento, se utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos

a resolución de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta técnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos


a. La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas.

b. La SDS-PAGE es muy útil para estimar el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas según su tamaño.

c. El Isoelectroenfoque IEF es un tipo de PAGE en una dimensión que se basa en la separación de proteínas de acuerdo con sus diferentes pI.

La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el IEF (primera dimensión) con la SDS-PAGE (segunda dimensión). Es una técnica muy resolutiva, y el mejor método analítico para separar proteínas completas e intactas que existe hoy en día. Al correr la primera dimensión IEF se establecen gradientes de pH con la finalidad de separar por Punto Isoeléctrico (pI) y la segunda dimensión en condiciones desnaturalizantes SDS PAGE para separar por masa molecular. Este método al separar proteínas no sólo por su relación carga/masa sino también por pI, convierte a la PAGE 2D en un método altamente analítico y resolutivo. Otro tipo de clasificación electroforética es dependiente del tratamiento de las muestra y de los geles, de tal forma que podría presentarse tres condiciones para PAGE:

a. Condiciones no desnaturalizantes (nativa): la separación se hace en función de la carga y del tamaño; La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en función de la carga intrínseca de las mismas, esta separación electroforética está enfocada generalmente al estudio de la función de la macromolécula ó en otras palabras de su actividad biológica, por ende el tratamiento de la muestra debe ser en menor grado invasiva.

Para este caso y dependiendo de la ubicación de la proteína, se deben utilizar agentes débiles no iónicos que favorezcan el mantener la naturaleza “normal” o funcional de la proteína tales como tritón x-100, Tween 20, NP-40 (es un detergente débil incapaz de solubilizar membrana nuclear, pero sí membrana citoplasmática) e inhibidores de proteasas. Aquí es clave la exclusión de agentes desnaturalizantes como detergentes fuertemente iónicos como el SDS, ni tampoco agentes reductores como β-mercaptoetanol ó DTT cuya función es claramente reducir los grupos tiol de cadenas peptídicas. Los buffer tienen papel protagónico al mantener al máximo las condiciones fisiológicas de pH. La desventaja con la PAGE nativa es precisamente la baja pureza de la proteína ya que al no poder restringir su unión con otras trazas de moléculas de esa misma u otra naturaleza posiblemente la proteína al final del corrido electroforético se encuentre unida a otras proteínas que no son del interés particular. [23] En este caso, esta metodología es posiblemente las más utilizada para determinar las interacciones entre las proteínas, pero cabe destacar que en este tipo de electroforesis la carga de la proteína influirá en su migración, por lo tanto, no se puede determinar de forma certera la masa molecular. [10]

b. Condiciones Desnaturalizantes-No

Reductoras: se produce la pérdida de actividad biológica y de la estructura tridimensional debido a la acción de agentes desnaturalizantes, que provocan el desplegamiento de las proteínas, como por ejemplo la urea o el Dodecil Sulfato Sódico (SDS). La electroforesis en condiciones desnaturalizantes es el método más utilizado para la separación de proteínas. La SDS-PAGE es muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa


las proteínas según su tamaño (al ser un policatión, y las proteínas permanecer cargadas positivamente, el SDS normaliza la relación carga/masa de las moléculas). Para este caso, el uso del detergente iónico SDS, sumando a altas concentraciones salinas, cambios de pH, si fuese el caso aumento de la temperatura y procesos mecánicos (congelamiento/descongelamiento), disrupción entre otros en el tratamiento de la muestra para lograr el homogenizado favorecerán la desnaturalización de la proteína. La clave del tratamiento de la muestra consiste en favorecer el desplegamiento de la proteína, manteniendo su estructura primaria, secundaría e incluso terciaría (en el caso de los puentes disulfuro)

c. Condiciones Desnaturalizantes-

Reductoras: no sólo se pierde la actividad biológica, sino que además se provoca prácticamente la perdida de las estructuras terciaría y secundaria, de tal forma que además del uso de reactivos desnaturalizantes como SDS, concentraciones altas de sales, procesos mecánicos, cambios de pH y °T, se hace uso de agentes altamente reductores tales como el β-mercaptoetanol y DTT (los cuales reducen los grupos tiol que favorecen la unión de péptidos por cisteínas, provocando su separación). Bajo estas condiciones se espera que lo único que se mantenga en gran proporción, sea la estructura primaria de la proteína.

Parte III: Ventajas, alcances, desventajas y límites de la SDS PAGE-2D

Ahora bien, con el objeto de centrar y limitar la búsqueda en electroforesis 2D, los documentos de Thierry Rabilloud et al. (2010) y Giovanni Candiano et al. (2010), escritores encontrados durante mi búsqueda, fueron de

gran ayuda al ampliar los fundamentos y detalles que entrañan el método.

i. Los límites de la electroforesis 2D

a. Con respecto a las proteínas hidrofóbicas:

Es debido al amplio bagaje que representan años de trabajo con SDS PAGE 2D/MS que se manifestó la otra debilidad que hace del método uno no ideal, un aspecto que desde que se origino el método era claro y era el hecho que sólo era un limitado grupo de proteínas las que podían ser analizadas y otra gran cantidad pasaba inadvertida, invisible o indetectable, me refiero a las proteínas hidrofóbicas.

Desde el trabajo de Reuss y Tiselius el fundamento físico de las relaciones electrocinéticas y específicamente de la acción electroforética en parte depende de la solubilidad y tal como lo expongo en aspectos claves del fundamento, el medio de transporte de los iones o partículas cargadas durante el recorrido dependen de la solubilidad de las proteínas en agua o ambientes hidrofílicos claves para la movilidad electroforética a través de un campo eléctrico. La inferencia directa que tienen las fuerzas iónicas está directamente relacionada con el agua y esta situación no puede ser extrapolada a proteínas de naturaleza hidrofóbica puesto que el modelo contemplado no es a la fecha compatible.

Se hace evidente que las proteínas por ejemplo de membrana al no ser solubilizadas bajo los protocolos establecidos son excluidas del método y por ende los esfuerzos de los defensores de la SDS PAGE-2D han estado enmarcados a mejorar la solubilidad de ese subgrupo de proteínas hidrofóbicas para la primera dimensión IEF.

Aunque sin lograr claramente el cometido, estos intentos, si ampliaron el espectro de posibilidades tales como el cambio de agentes caotrópicos (urea) o de detergentes


(SDS) usados durante el IEF. Se generaron entonces a raíz del problema nuevos detergentes compatibles con IEF y proteínas hidrofóbicas, pero como en “callejón sin salida” en ese intento llegaban al mismo punto ya que no se puede desconocer que en el IEF los gradientes de pH producto de los electrolitos utilizados son impulsados por la corriente eléctrica generando una fuerza iónica, que es también impulsada por los detergentes iónicos como el SDS.

Esta fuerza se vería gravemente alterada al sustituir detergentes iónicos por no iónicos, modificando la movilidad electroforética y resultando posiblemente en agregación de proteínas debido a la baja fuerza iónica. En pocas palabras el sistema iónico se vería colapsado y no habría resolución.

Para efectos prácticos para proteínas hidrofóbicas como las de membrana es imperativo sistemas de separación libres de IEF, pero sabemos que ese hecho sólo provocaría una separación en 1 dimensión arrojando mezclas de proteínas que serian erróneamente analizadas por espectrometría de masas (MS).

Con el surgimiento de la espectrometría de masas en tándem es posible mitigar en parte este hecho, ya que análisis de proteínas por SDS PAGE libre de IEF podría ser fragmentados en espectrometría de masas y por sistema de solapamiento se pueden analizar proteínas de naturaleza hidrofóbica.

b. Con respecto a los métodos de detección

Otro límite para el método, son las proteínas en baja abundancia relativa con respecto al pool de proteínas analizadas, la clave de análisis de la MS depende exclusivamente de la electroforesis en geles 2D y si el método de detección no es lo suficientemente sensible, posiblemente otras proteínas de interés no podrían ser analizadas debido a su baja presencia en relación con las otras.

La clave está en el método de visualización después de la electroforesis.

Aunque las técnicas modernas de detección de alta sensibilidad (tinción con plata y fluorescencia) son capaces de detectar en el orden de ng, sus mecanismos son de detección lineal, carecen de un mecanismo dinámico (ideal) que permitiera discriminar entre el enorme rango dinámico de la relación constitutiva entre las proteínas más raras o menos abundantes y las más abundantes de una misma muestra biológica, siendo peor aun los resultados en fluidos biológicos.

La distribución de la abundancia de proteínas provoca que en muchos casos al evaluar sensibilidad en la electroforesis, “se raje” porque el método de detección implícitamente resultará en excluir del análisis “x” cantidad de proteínas que no serán detectadas debido a su poca abundancia.

Para aliviar el problema se podrían cargar mas muestra en el gel, aprovechando esa ventaja pero esta vez, sacrificando los estudios en los que la fuente es escasa, premisa bandera de los sistemas analíticos. Eso sumando a que probablemente por alta concentración de las proteínas abundantes y de proteínas abundantes modificadas, estas últimas terminen ocupando el espacio de otras restando resolución al método. Lo que se traduce en oscurecimiento de todo el gel algo que O´Farrell comentó desde 1975, cuando evaluaba la resolución en términos de la cantidad de muestra.

Otra solución propuesta es el uso de geles gigantes que aumentarían la resolución con un mayor campo de movilidad, pero desafortunadamente las limitantes serian el manejo de los geles debido a su fragilidad, el campo eléctrico requeriría mayor potencial aplicado y la baja rentabilidad debido entre otros al costo adicional por uso de reactivos.


En resumen la complejidad del análisis de las proteínas hidrofóbicas, sumado a la baja abundancia reducen parcialmente la aplicabilidad universal del método electroforesis 2D.

ii. Las ventajas del SDS PAGE-2D

a. Sensibilidad: la electroforesis es capaz de detectar proteínas que se escapan del rango de detección de otros métodos de proteómica, entre esas proteínas están las de nucléolo y Citoquinas.

b. Solidez: Este método al ser tan antiguo ha permitido un análisis profundo, minucioso y detallado y por eso es confiable frentes a las otras recientes tecnologías que no se conocen con certeza sus alcances y limitaciones, ventajas y desventajas, ya que frente a su reciente intervención en el contexto de la proteómica no han sido sometidas a tan rigurosos análisis a los que la electroforesis 2D sí. Este método es sólido y genera confianza, esta fortaleza ha sido también ampliamente evaluada inter e intralaboratorios alrededor del mundo. Estoy completamente de acuerdo con que la búsqueda inmediata no está necesariamente en modificar una técnica tan sólida que lleva 200 años en construcción sino hay que apuntarle a la compleja y variable adecuación de la muestra.

c. Por otra parte la posibilidad de obtener la proteína completa es decir sin fraccionarse permite análisis profundos claves de la proteómica estructural. Un método fiable, reproducible y sensible que permite un análisis frente al rango dinámico de las proporciones puede ser analizado una sola vez reduciendo el uso de muestra compleja.

d. Para mi gusto, Deborah Penque en su publicación de 2009, [20]

muestra que la facilidad del protocolo actual ha permitido la globalización de la electroforesis 2D, permeando diferentes sectores y campos de investigación en proteómica. Me pareció interesante establecerla como ventaja ya que hoy en día se encuentran sitios web tutoriales de prestigioso reconocimiento para conocer diversos aspectos de la electroforesis 2D. Una vez visitados, particularmente me adhiero al siguiente: http://biophilessurf.info/proteomics.html, puesto que a mi juicio de los presentados es el más completo, que recoge bastantes herramientas útiles como: bases de datos, tutoriales de electroforesis tanto para la primera como la segunda dimensión, espectrometría de masas y los programas de análisis del gel 2D y de MS.

e. Reproducibilidad: los avances en los métodos de tinción han permitido mejorar la reproducibilidad del método, métodos como los fluorescentes, azul de Coomassie coloidal y tinción con plata moderna son compatibles con espectrometría de masas (MS). El método clásico de tinción con plata no es compatible con espectrometría de masas y se ha correlacionado el problema con el uso de formaldehido como agente de tinción, por lo que en la moderna tinción con plata, se han introducido agentes que reemplazan el formaldehido.

f. El uso de la electroforesis multiplex ha disminuido la variabilidad técnica puesto que al marcar diferentes muestras con diferentes fluoróforos y ser corridas en los mismos geles, permite la uniformidad de todo el protocolo y el efecto equivalente de las muestras por el mismo proceso


ampliando la reproducibilidad, precisión y confianza comparada con el sistema estándar.

iii. Las desventajas del método

a. Debido a la alta sensibilidad del IEF muchos componentes presentes en las muestras biológicas podrían interferir y alterar los resultados por lo que nuevamente llegamos a que el tratamiento de la muestra es esencial.

b. Control de las condiciones y heterogeneidad de las muestras: aquí llegamos a un punto álgido, en el que se concluye que la mayor fuente de variabilidad hoy en día frente al complejo sistema de SDS PAGE/MS y SDS PAGE/MS/MS. Para el caso de mamíferos y plantas a alta heterogeneidad genética y el escaso control experimental de los estudios fisiológicos son las principales fuentes de variabilidad. En el caso de bacterias, el otro extremo, la variabilidad se le debe a la alta flexibilidad metabólica, ya que pequeñas diferencias en las condiciones del cultivo se traducen en adaptación metabólica y por lo tanto cambio en el proteoma. Pero cuando esta variable está controlada en bacterias el 2D/MS se convierte en una exitosa herramienta en un amplio espectro de aspectos de la proteómica.

c. Con respecto al paralelismo (correr las muestras por duplicado para aumentar la confiabilidad de los resultados) y confianza estadística, la pobre automatización del método y lo relativamente engorroso por la cantidad de variables a tener en cuenta hacen del tiempo invertido para el tratamiento y adecuación de la muestra, elaboración de los geles,

corridas, detección y posteriores análisis una desventaja frente a otros métodos modernos. Aunque vale la pena mencionar que en 3-4 días se puede correr paralelamente entre 12 y 20 geles.

iv. Los avances y aplicaciones actuales de la SDS PAGE-2D

a. Frente a la premisa “Entre menor sea la complejidad mayor será el rendimiento” es clave a la hora de entender por que la electroforesis 2D es optima en estudio e modelos de bacterias y levaduras y que frente a la complejidad que enmarcan los sistemas genéticamente complejos que afectan por cierto los rangos de expresión e proteínas, el método tiende a limitarse a proteínas solubles y abundantes, por lo que para el resto (hidrofóbicas y de abundancia mínima) son restringidas (ejemplos: proteínas de membranas celulares y de algunos fluidos biológicos complejos).

b. En el campo de la biología celular en análisis particular de orgánulos ha tenido interacción directa con la electroforesis 2D exitosa en el estudio a partir de sub-fracciones celulares como la mitocondria y mas aplicado de los poros nucleares que gracias a la electroforesis 2D ha modificado lo que se pensaba con respecto al transporte nuclear.

c. Otra aplicación práctica de la electroforesis 2D es su integración a análisis inmunoproteoma donde el uso de anticuerpos bajo un contexto particular (reactivos de análisis para detectar y cuantificar el antígeno, ó como reactivos micro-preparativos para purificar el antígeno presente en una muestra compleja, aunque frente la posibilidad reducida de tener anticuerpos monoclonales, al final el


rendimiento cuantitativo es generalmente bajo). Por lo que los geles 2D pueden ser usados con anticuerpos en el primer formato, es decir, para efectos de detección en los cuales se tendría que tener en cuenta tres aspectos generales: 1. La especificidad de la inmuno-detección: ensayos de competición que serian imposibles en un esquema preparativo son posibles usarlas en este sistema para aumentar la especificidad en detección 2. La reproducibilidad de los geles 2D para garantizar la adaptación sin problemas a partir de geles a manchas y viceversa 3. El poder resolutivo: con la salvedad de las proteínas que comigrarían donde el antígeno podría ser identificado y el posterior análisis proteómico. Aquí se hace ajustable los gradientes de pH zoom donde la probabilidad de comigración decrece. Estos esquemas son usados frecuentemente en el campo clínico y en el estudio de modificaciones posteriores a la traducción partiendo del hecho que cada día se tiene anticuerpos capaces de detectar aminoácidos modificados (fosfotirosina, nitrotirosina, citrulinación debida a estrés oxidativo, carbonilación de proteínas y oxidación de grupos tiol). El uso de anticuerpos monoclonales seria útil la hora de detectar Isoformas de una proteína, pero en resumen el acoplamiento de inmunotransferencia al poder resolutivo de la electroforesis 2D y posterior análisis MS permite realizar análisis de proteínas modificadas con claros indicios de ser una herramienta en estudios patológicos.

d. La electroforesis en 2D es el único método resolutivo con capacidad única de separara proteínas completas con todas sus modificaciones. Lo que abre una puerta en el estudio de apoptosis como son estudiar las caspasas 3,6 y 7

e. En el marco de marcaje de patrones covalentes y no covalentes en electroforesis en 2D permite soñar con lo que venía discutiendo acerca del amplio uso que tiene la electroforesis en proteómica es decir la identificación proteínas modificadas (tales como fosforilación, glicosilación y oxidación). Pero todo esto no tiene aparentemente otro propósito mayor y es el establecimiento e identificación de biomarcadores ese es el futuro de la electroforesis.

f. Con el desarrollo de la alta reproducibilidad de los geles 2D vino la imperiosa necesidad de desarrollar distintas técnicas de marcaje o detección. Entre las técnicas de marcaje actuales para electroforesis que son el fluorescente, azul brillante de Coomassie (R250) ó azul brillante de Coomassie coloidal (cCBB) y la tinción con plata con o sin formaldehido, es sin duda el marcaje fluorescente el que supera a las otras técnicas. Ver tabla de rango de detección presentada por Beat M. Riederer. [2]

Las técnicas de marcaje en electroforesis 2D de base tienen un fundamento físico químico particular pero generalmente podrían ser caracterizados por marcaje covalente y marcaje no covalente. El marcaje no covalente, que es un marcaje post-electroforético, entre los que se encuentran las tinciones


con Azul de Coomassie y la tinción con nitrato de plata. Solo por mencionar algunos aportes en el campo Beat M. Riederer muestra que análisis comparativos que se han hecho entre SYPRO y tinción con nitrato de plata revelando mayor sensibilidad de SYPRO. Desafortunadamente el alto costo de SYPRO ruby desvía la mirada hacia el uso de moléculas más rentables como RuBPs o Rutenio II Tris (disulfonato de batofenantrolina BPS), en otros casos SYPRO ruby demostró la misma sensibilidad y rango dinámico lineal con cCBB. Sin embargo la tinción no covalente, no permite una comparación de varias muestras de proteína dentro del mismo gel 2D, pero son útiles en la detección de la composición de proteínas, al igual para la determinación de posibles modificaciones pos-traduccionales. Los variados métodos de detección de proteínas son la base de electroforesis en 2D y han ampliado la búsqueda y detección de proteínas y subconjuntos de proteínas con tipos de modificaciones particulares tales como glicosilación, fosforilación y acilaciones entre otras. Es evidente que los geles deben ser normalizados mediante programas informáticos que permitan establecer diferencias entre las composiciones de las proteínas y sus modificaciones pos-traduccionales. El marcaje covalente por otro lado presenta básicamente dos alternativas los radioisótopos y el marcaje delo aminoácidos con fluoróforos ahora ampliamente usados en geles 2D.

Es común a nivel de radioisótopos el uso de (3H, 14C, 35S, 125I, 32P, 33P) que se usan en experimentos in vivo y fosfomarcaje previo a la electroforesis 2D, desafortunadamente se deben considerar las implicaciones del trabajo con agentes radiactivos. ¿Pero qué ventaja tiene usar marcaje covalente en electroforesis en 2D?, precisamente intencionalmente informe que el marcaje no covalente está restringido al análisis comparativo de muestras de proteínas en un mismo gel lo que conoce como análisis de la expresión diferencial de proteínas o geles diferenciales (DIGE). En DIGE se permite la detección total de proteínas y proteínas específicas en un mismo gel o Blot gracias al uso de reactivos que puedan ser leídos simultáneamente a diferentes longitudes de onda. El objetivo de este sistema diferencial es incrementar la información obtenida por gel. De esta forma con este sistema se reduce significativamente el error técnico y la manipulación y se normalizan las condiciones al trabajar en un mismo gel, reduciendo el paralelismo clásico usado en electroforesis 2D, por lo que se reducen también los tiempos al reducir el número de experimentos en una sola matriz. En el caso de los de marcaje covalente, radica en que deben ser moléculas pequeñas, de naturaleza neutra, evitando así alterar el corrido ó migración electroforética. Haciendo la salvedad de que no todos los colorantes pueden ser incluidos en marcaje covalente como


etiquetas por lo que si difieren en su longitud de onda de emisión con respecto a la longitud de onda de medición podrían estar produciendo un efecto de solapamiento. Gracias al desarrollo de una gran variedad de fluoróforos, como Cyanina (Cy2, Cy3 y Cy5), Alexa Fluor, Infrared (DY-680 y DY-780) y DyLigthts entre otros, es posible hacer hoy en día DIGE. En el mercado se encuentran ya reactivos que detectan modificaciones de aminas primarias como NHS-Ester. O como es en algunos casos sistemas modificados y acoplados al oro en tecnología llamada nanogold que también aumentan la detección. [17]

En mecanismo de acilación de proteínas, es común que ocurra exclusivamente en el N-terminal de α-aminos y con ε-aminas de los residuos de lisina formando un enlace covalente resistente a la hidrólisis. Las cianinas o succinimidil ester de propilo (Cy3) o pentilo (Cy5).Ver figura 6A [8], fluoróforos caracterizados en tres grandes grupos que son: Streptocianinas o cianinas de cadena abierta (I), Hemicianinas (II) y cianinas de cadena cerrada (III) Ver figura 6B. [15]

El pre-marcar las proteínas previo a su corrida en el mismo gel 2D con Cy3 y Cy5 agentes fluorescentes solubles en agua permite la separación de muestras bajo idénticas condiciones electroforéticas. Ya que los longitudes de onda de excitación/emisión son diferentes, Cy3 (550/570 nm). Región verde del

espectro), mientras Cy5 (650/670 nm).

Si es importante ser prudentes a la hora del análisis comparativo entre proteínas etiquetadas y no etiquetadas, puesto que el enlace de las aminas puede alterar las propiedades de la carga de las proteínas. Ahora bien como estos fluoróforos tienden a reconocer modificaciones o proteínas especificas es común un marcaje no covalente posterior. Como sucede con el uso de DY 680 (mecanismo de reconocimiento de cisteínas) y de DY 780 (mecanismo de lisina etiquetada) que permite también hacer análisis de expresión diferencial de proteínas en estados diferentes, limitados por la presencia de residuos de cisteínas y lisinas, y después el marcaje no covalente pos-electroforético con cCBB. A este punto es necesario hacer las visualizaciones y lecturas inmediatamente terminada la corrida y previo a la marcación no covalente, puesto que esta última, interfiere cubriendo la tinción inicial cuando se incuba durante 24 h con cCBB. Otro asunto tangencial es si la incorporación de estas proteínas causen cambios conformacionales que hagan artefactual los resultados cuando se usan anticuerpos más aún cuando las etiquetas están dirigidas a los grupos tiol, por ejemplo en el


caso de que las cisteína esté presente en el sitio de reconocimiento del anticuerpo, ¿podría acaso ser reconocida con esa modificación o se daría algún (impedimento estérico) que disminuya la especificidad?

g. El uso de detergentes es otro campo

de estudio complejo ya que se entiende la importancia del SDS como agente denaturantes, o de otros tipos de detergentes que permitan la solubilización de membranas celulares, intracelulares, etc. En análisis DIGE para analizar, comparar y cuantificar diferencias entre muestras de proteínas es esencial por ejemplo que todos los residuos de cisteínas estén presentes en su forma marcada, ya que las parcialmente marcadas serian difíciles de comparar, que era un problema común, el cual se supero mediante el uso de un detergente que permita mantener las proteínas solubilizadas. Pero estos detergentes terminan siendo un problema en la caracterización por MS al ser agonistas en la formación de otros enlaces no covalentes o inespecificidad al incorporarse a la matriz del soporte, o aumentar el background reduciendo la posibilidad de detectar proteínas en bajas concentraciones. Por eso los lavados posteriores al 2D son indispensables para mantener la confianza al pasar la muestra al análisis MALDI/MS En 2005 Funk J y cols, publicaron un documento en el que precisamente incorporaban el determinante factor de uso de detergentes en la confianza y sensibilidad de la MS acoplada a electroforesis [24].

Básicamente estableció unos rangos o valores umbral de tolerancia de detergentes en las muestras de proteínas y péptidos para MS. Ver tabla 1

Se han generado además una gran variedad de nuevos detergentes para la preparación de complejos de proteínas insolubles como los detergentes resistentes a membranas (DRM) aislados de la corteza renal bovina por tratamiento sucesivos con Triton x-100 usando la actividad de la fosfatasa alcalina, posterior electroforesis 1 y 2D y determinación de la composición de ácidos grasos por cromatografía de gases. Lo anterior esencial para la determinación de los niveles de saturación de los fosfolípidos de membrana reconstituidas. En resumen gracias a la detenida estudio acerca del efecto y la necesidad del uso de detergentes en electroforesis 2D y su efecto sobre la MS se han aplicado nuevas tecnologías que permitan obtener detergentes compatibles con MS/MS más aún en la identificación de proteínas hidrofóbicas.

Un clásico moderno de los alcances que tiene la electroforesis 2D es el que presentan en su revisión Giovanni Candiano y cols [5], quienes de forma admirable registran no sólo el fundamento del método sino que da una nueva mirada con respecto al análisis de orina, visto desde la proteómica, donde se


pretenden establecer biomarcadores urinarios claves en el área de la bioquímica clínica.

Discusión

La reproducibilidad, la sensibilidad y la resolución de SDS PAGE-2D están directamente asociadas a factores claves como las condiciones del cultivo, la procedencia y naturaleza de la muestra, el uso de detergentes, las técnicas de visualización, la cantidad de muestra, los reactivos, los tiempos de corrido, las condiciones de los geles y de los gradientes de pH entre otros aspectos tangenciales inherentes al éxito del método, lo qué permite validar que la SDS PAGE-2D no es una técnica, es un método clave en proteómica.

Hoy en día el paradigma de la resolución se ha cambiado a la hipótesis que la resolución por grado de importancia debe ser referida a la compleja adaptación de la muestra.

Aquellos con clara evidencia de formación técnica conciben la SDS PAGE 2D como un simple protocolo, lo que en resumen les limita la posibilidad de modificar las condiciones del mismo a sus necesidades particulares. El problema considero que radica sustancialmente en la poca profundización acerca del método, una vez se conozca el fundamento y el racional si es posible modificarlo a intención particular, de hecho la historia lo ratifica, ya que en muchas ocasiones ha sido así como se ha logrado mejorar o trasformar un método, haciéndolo más resolutivo, eficiente, reproducibles, sensible, especifico y confiable.

Referencias

1. Administrador CBE (2008, mayo). Tycho Brahe: estrellas y hombres nuevos. Disponible en: http://www.madrimasd.org/blogs/astrofisica/2008/05/05/90910

2. Beat M. Riederer. (2008). Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional

gel electrophoresis. Journal of Proteomics 71 231 – 244

3. Bier M., Electrophoresis: Theory Methods and Applications. Academic Press, New York, 1959 (vol. I) and 1967 (vol. II)

4. Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., et al., (1982) Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods, 6, 317–339

5. Candiano, G., Santuccic, L., et al., Review: 2D-electrophoresis and the urine proteome map: Where do we stand? Journal of Proteomics 73 (2010) 829–844

6. CÓRDOVA, J., La contribución de Faraday a la teoría de disociación electrolítica. Disponible en: http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:eGuMHmRrVCYJ:bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen3/ciencia3/136/htm/sec_9.htm+reacciones+de+Kohlrausch&cd=9&hl=es&ct=clnk&source=www.google.com

7. Davis, B.J. (1964). Disc Electrophoresis. 2, Method and application to human serum proteins. Ann. New York Acad. Sci. 121 404-427

8. Disponible en wikipedia: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Cy3_Cy5_dyes.gif

9. Electroforesis Disponible en: http://www.google.com/#sclient=psy&hl=es&source=hp&q=La+fuerza+de+retardo+por+rozamiento+se+determina+en+un+analito+cargado%2C+a+partir+del+tama%C3%B1o+y+de+la+forma+del+ion+y+de+la+viscosidad+del+medio+en+el+cual+migra&aq=f&aqi=&aql=&oq=&pbx=1&bav=on.2,or.r_gc.r_pw.&fp=7c5024a988c4ee32

10. Electroforesis nativa. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_nativa

11. F.Reuss. “Notice sur un nouvel effet de l'électricité galvanique” (A Note on the New Action of Galvanic Electricity (1808)) — in the book: Selected Works on Electricity. M: Gos. Izd-vo tekhniko-teor.liter., 1956, p.159–168

12. Funk J, Li X, Franz T. (2005) Threshold values for detergents in protein and peptide samples for mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 19(20)2986–8

13. Gómez, D., Tesis: Identificación de eventos moleculares asociados a la intoxicación con la toxina Cn2 mediante electroforesis bidimensional en gel. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/52210159/25/Isoelectroenfoque

14. James, P., (1997). Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. Quarterly Reviews of Biophysics, 30, 279-331

15. Johannes, H.H. (2000). Cyanine: Direkte Funktionalisierung, Oligomerisierung, linear und nichtlinear optische Eigenschaften,


(Dissertation TU Braunschweig). Disponible en: http://deposit.d-nb.de/cgi-bin/dokserv?idn=960115293&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=960115293.pdf

16. DEL POZO YAUNER, L. EVALUACIÓN FINAL CURSO

DE MÉTODOS EN BIOTECNOLOGÍA. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/electroforesis/electroforesis/introduccion/boundaryelectr.jpg

17. Nanoprobes (2005, mayo). Disponible en: http://www.nanoprobes.com/newsletters/Vol6_Iss5.html

18. O’Farrells, P.,(1975). High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 250, No. 10, Issue of May 25, pp. 4007-4021.

19. Ornstein, L. (1964), Disc Electrophoresis, 1, Background and Theory. Ann New York Acad. Sci. 121 321-349

20. Penque, D., Review: Two-Dimensional Gel Electrophoresis And Mass Spectrometry For Biomarker Discovery. Proteomics Clin. Appl. 2009, 3, 155–172

21. Pertsov, E.A. Zaitseva (Baum)., (2008). Discovery Of Electrokinetic Phenomena. Disponible en: www.icc2008.ru/en/conference/plenary_en.pdf

22. Rabilloud, T., Chevallet, M., E. et al., Review: Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. Journal of Proteomics 73 (2010) 2064-2077

23. Reisinger, V., Eichacker, L., Solubilization of membrane protein complexes for blue native PAGE. Journal of proteomics, (2008). 71 277–283

24. Righetti, P., News And Views: Happy Bicentennial, Electrophoresis. Journal of Proteomics 73 (2009) 181–187

25. Schulenberg, B., Goodman, TN., et al, (2004). Characterization of dynamic and steady-state protein phosphorylation using a fluorescent phosphoprotein gel stain and mass spectrometry. Electrophoresis; 25 (15):2526–2532.

26. SDS-PAGE. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE

27. Skoog, Duoglas; Holler, James y Nieman, Timothy – Principios De Análisis Instrumental. Quinta Edición. Editorial Mc GRAW – HILL. 2001.

28. Squires,T., Khair, Aditya.,(2009) The Francois Frenkiel award lecture: fundamental aspects of concentration polarization. Disponible en: http://apps3.aps.org/aps/meetings/dfd09/dfd09-khair-squires.pdf

29. Svensson H. (1962). Isoelectric fractionation, analysis and characterization of ampholytes in natural pH gradients. Acta Chem. Scad. 16 546-466.

la sds page-2d más que una técnica, “un método” a la vanguardia en proteómica

Documents