La extraccin de los taninos hidrolizables dePhyllanthus niruriLinn .: Efectos de disolventes y mtodos de extraccin Masturah Markomun,b,,, Masitah Hasanuna, Wan Wan Ramli Daudb, Harcharan Singhc, Jamaliah Md JahimbMostrar msDOI: 10.1016 / j.seppur.2006.06.003Obtener los derechos y contenidos

ResumenEfectos de los tipos de disolventes y mtodos de extraccin (extraccin por solvente (SE), la extraccin de fluido supercrtico (SFE) y la extraccin de agua a presin (PWE)) se investigaron para la recuperacin eficaz de taninos hidrolizables bioactivos a partir dePhyllanthus niruriLinn.Diversos disolventes orgnicos y acuosos seleccionados por el mtodo de Soxhlet mostraron que el cido glico y cido elgico contenido aumentaron con el contenido de agua, mientras que el rendimiento corilagin alcanz un valor mximo en 30% (v / v) de etanol en agua.A una temperatura fija, extraccin con disolventes por Soxhlet es el mejor mtodo para la extraccin de cido glico y elgico, mientras que los mtodos presurizados son mejores para la extraccin corilagin.A pesar de que la extraccin exhaustiva se logra ms rpido por PWE, SFE con la adicin de co-disolvente etanol-agua es superior en trminos de consumo de disolvente lquido de baja y fraccionamiento componente producido.Polaridad del disolvente, sin disolvente a slido-relacin y tiempo de contacto juega un papel importante en determinar el mtodo ms eficiente para la extraccin de tanino.Palabras clave Niruri de Phyllanthus; La extraccin por solvente; Extraccin con fluido supercrtico; Agua Sub-crtico; Elagitaninos

1. IntroduccinPhyllanthus niruri(Euphorbiacea) es una planta herbcea originaria de Malasia y es conocida localmente como 'Anak dukung'.Se encuentra comnmente en las regiones tropicales y en otros pases, es conocido como "chanca piedra" (espaol), 'paraparai mi' (Paraguay), 'pedra quebra' (Brasil) o 'punarnava' (India).P.niruries una medicina popular popular para el tratamiento de clculos renales y de vescula biliar, enfermedades relacionadas con el hgado como la ictericia y cncer de hgado, infecciones virales como la hepatitis y la tuberculosis, la malaria, la diabetes y la fiebre[1].En estudios cientficos,P.nirurise encontr a exhibir antiespasmdico, hipotensor, analgsico, antihepatotxica, antihepatitis, anti-mutagnica, antivirales y antibacterianas.Se encontr que los extractos acuosos y / o alcohol para inhibir la actividad del virus de la hepatitis Bin vitroyin vivo[2],[3]y[4], VIH-1 del virus de la transcriptasa inversa[5],[6]y[7], enzimas procesos propios de la replicacin de las clulas cancerosas y de crecimiento[8]y la formacin de clculos renales[9], reducir los niveles de glucosa en la sangre[10], tienen los (antihepatotoxic) propiedades protectoras del hgadoin vivoein vitro[11]y producir efectos analgsicos en ratones[12].Otras propiedades documentadas son antimalrica[13]y de los lpidos actividad reductora[14].Los efectos medicinales se atribuyen a los componentes activos presentes enP.niruritales como los lignanos, flavonoides, glicsidos, alcaloides, elagitaninos, terpenos y fenilpropanoides[1].Lpidos comunes, esteroles, y flavonoles tambin se producen en la planta.Dos grupos de tanino identificado enP.nirurison taninos hidrolizables (cido glico) y taninos condensados (flavonoides).La hidrlisis final de los elagitaninos se transforma en cido elgico y cido glico[15].Las estructuras qumicas de los taninos hidrolizables activos, a saber, Geraniin y corilagin, cido glico y cido elgico y taninos condensados tales como flavon-3-ol y flavonol enP.nirurison como se muestra en lafig.1yfig.2, respectivamente[5],[16]y[17].

Higo.1.Las estructuras qumicas y los pesos moleculares de los taninos hidrolizables.Opciones Figura

Higo.2.Estructuras qumicas bsicas de: (a) flavon-3-ol y (b) de flavonoles.Opciones FiguraLa mayora de la investigacin sobreP.niruriestaba en la deteccin qumica, la identificacin y el aislamiento, y el ensayo biolgico y estudios farmacolgicos[10],[18]y[19].Sin embargo, no mucho estudio sobre los efectos de los solventes tienen en la extraccin de los componentes activos deP.niruriha sido reportado.Notka et al.informado de los efectos de tres disolventes (agua, metanol, etanol al 50%) para el estudio farmacolgico sobre anti-VIH[5].Los investigadores encontraron que el extracto de etanol al 50% fue el ms activo en la inhibicin de la replicacin del virus de la transcriptasa inversa.El extracto de etanol al 50% se ensay para consistir en 1,10% Geraniin y 2,28% (w / w) corilagin.De Souza et al.haba informado sobre la cantidad de cido glico activo en el extracto de agua usando la cromatografa lquida de alto rendimiento tcnica (HPLC), pero ningn estudio en otro disolvente o el anlisis de otros componentes adems de cido glico se llevaron a cabo[20].Por lo tanto, el estudio de los efectos del disolvente es muy importante para el cribado y la seleccin de disolvente de las etapas de extraccin, de fraccionamiento y de purificacin en el procesamiento de hierbas.Mediante la comprensin de las propiedades de solvente, componente (soluto) propiedades y disolvente-soluto interaccin, fraccionamiento rpida y el aislamiento de los componentes deseados se puede lograr.Este trabajo presenta los resultados sobre los efectos de diversos disolventes orgnicos y acuosos con diferentes polaridades en el rendimiento de la extraccin y el contenido de taninos hidrolizables tres, a saber, el cido glico, cido elgico y corilagin.Se investigaron los efectos cualitativos y cuantitativos de disolventes utilizando diferentes mtodos de extraccin.Los mtodos de extraccin utilizados son la extraccin con disolvente y la extraccin de alta presin (extraccin con fluido supercrtico y la extraccin de agua a presin).2. mtodo experimental2.1.Productos qumicos y normasLos estndares de referencia (cido glico y cido elgico) fueron ambos comprados de Sigma Chemicals (Estados Unidos) en pureza de 98%.Geraniin aislada (pureza desconocida) fue suministrada por el Prof. H. Wagner (Universidad de Munich, Alemania).Anlisis de corilagin se llev a cabo por Nova Laboratorios Sdn.Bhd. (Malasia) con su nivel aislado y patentado (pureza del 98%).El comercial deP.niruriproducto, HEPAR-P (estandarizado al 4% corilagin y 18% de contenido total de flavonoides) se obtuvo de la misma empresa.Todos los reactivos qumicos para el anlisis de extraccin y el componente (n-hexano, ter de petrleo, diclorometano (DCM), cloroformo, acetona, metanol, etanol, acetonitrilo y cido fosfrico) eran de la calidad analtica.Agua ultra-pura obtenida usando el sistema de ultra-filtracin (USF ELGA, Reino Unido) se utiliz como disolvente de extraccin, mezclas de disolventes y la fase mvil de HPLC.Pura y grado industrial lquido CO2(99,8%) se adquiri de Gas Pantai Timur (Malasia).2.2.El material vegetalSeca y se mueleP.nirurimuestras se obtuvieron de Nova Laboratorios Sdn.Bhd. (Malasia).La muestra contiene tallos y partes areas de la planta y se ha utilizado para la produccin comercial deP.niruriproducto de HEPAR-P .La distribucin del tamao de partcula (% w / w) determinado por tamizado estaba en el intervalo de 45 a 212 micras (8%), 212 a 600 micras (35%), 600 m-1,18 mm (43%) y 1,18 a 3,35 mm (14%).2.3.La extraccin con disolventes2.3.1.Extraccin Soxhlet (SE)Cinco gramos ( 0,05) de muestra de la planta se coloc en un Whatman 25 mm 100 mm dedal de celulosa.La extraccin utilizando el mtodo estndar Sohxlet (BCHI Laboratechnik, modelo B-811, Suiza) se llev a cabo utilizando 150 ml de disolvente.La potencia de calentamiento se establece en dos (2) ciclos por hora de manera que seis (6) ciclos de extraccin se lograron dentro de 3 h de tiempo de extraccin.Diversos disolventes orgnicos (7) y-orgnico acuoso (6) con diferentes polaridades se investigaron como se indica enla Tabla 1. Para una mezcla de disolvente orgnico acuoso, el porcentaje indica el porcentaje en volumen del disolvente orgnico en la mezcla (% de volumen / volumen o v / v).Tabla 1.Efectos solventes en el rendimiento dePhyllanthus niruriextraccin por el mtodo de SoxhletDisolvente de extraccinDisolvente ndice de polaridad de SnyderunPunto de ebullicin ( C)Rendimiento de extracto (% de la muestra g / g)

Referencia

Este trabajo ( DE)bLiteratura

Orgnica

n-hexano0,1691,8 ( 0,1)0.9c[21]

5.5d[22]

ter de petrleo0,1602.2

El diclorometano3.4404.0

Cloroformo4.1619.7

Acetona5.4563.9

Etanol5.27811.6

Metanol6.66514,6 ( 1,1)17.1c[18]

Acuoso

70% de acetona (70:30 v / v de acetona-agua)6.58418.5

70% de etanol (70:30 v / v de etanol-agua)8.29020.8[19]

Etanol al 50% (50:50 v / v de etanol-agua)7.99422.5[12]

30% de etanol (30:70 v / v de etanol-agua)7.19726,4 ( 1,9)7-9c

20% de etanol (20:80 v / v de etanol-agua)6.39827.121.6

Agua9,010026,2 ( 1,6)

Agua (previo de la muestra extrada porn-hexano)10023.5

unndice de polaridad de Snyder disolvente citado de[23].Los ndices acuosas de mezclas de disolventes se calcularon a partir de la ecuacin (IA/ 100 PA) + (IB/ 100 PB) dondeIAyIBson ndice de polaridad de los disolventes A y B, respectivamente, yPAyPBson porcentaje de disolventes A y B, respectivamente, en la mezcla de disolventes.bLa desviacin estndar de dos o tres repeticiones.cLa extraccin se a temperatura ambiente.dMaceracin dinmico.Opciones de la tablaLas soluciones de extracto bruto obtenido se concentraron y se secaron usando un evaporador rotatorio de vaco (BCHI Laboratechnik, Modelo R-144, Suiza) a temperatura 80 C o menos para eliminar los disolventes.Las temperaturas ms altas se evitaron para minimizar la degradacin de los componentes.Todos los extractos se colocaron en una condicin de temperatura ambiente antes de pesar gravimtricamente para determinar los rendimientos.2.4.Extraccin de alta presin2.4.1.Extraccin con fluidos supercrticos (SFE)Una unidad de SFE a escala de laboratorio fue diseado y montado para la extraccin deP.niruri.La configuracin de aparato se muestra esquemticamente en lafig.3. El sistema de suministro incluye dos bombas de pistones accionados por motor: bomba 1 es para el CO2(Jasco, Modelo PU 1580, Japn) y la bomba 2 es para co-disolvente (Labtech, Jones Chromatography, Reino Unido).El CO2se enfri a 2 C, usando un enfriador para mantener su estado lquido antes de que se bombe al extractor.El extractor consiste en una longitud de 14 cm 1,5 cm de dimetro interno de alta presin recipiente de acero inoxidable lleno de la muestra de la planta.Los dos extremos se conectan con lana de vidrio para sostener la muestra y para eliminar el volumen muerto del buque.El recipiente de extraccin est cerrado y controlado por la temperatura en un horno de circulacin de aire de usos mltiples (Shel Lab, EE.UU.).El CO bombeado2y codisolvente fueron pre-mezclados antes de entrar en el recipiente de extraccin.El precalentador se coloca antes de la extractora para asegurar que la mezcla de disolventes ha alcanzado la temperatura deseada antes de entrar en contacto con la muestra.Un filtro de 7 micras en lnea fue instalado antes de la recipiente de extraccin de la muestra para evitar el flujo de retorno.Un regulador de contrapresin (Jasco, Modelo BP-1580-1581, Japn) se emplea para mantener la presin del sistema.Es consisti de un releva-vlvula automatizada, que se calent a 70 C para evitar la precipitacin extracto.Vlvula V5 reduce la presin a la presin atmosfrica y se libera el extracto a un coleccionista, que se sumerge en una trampa fra (2 C).Vlvulas V1 a V5 controlaba el flujo del proceso de extraccin con fluido supercrtico.

Higo.3.Esquema del sistema de SFE.Opciones FiguraEn este estudio, 5 g ( 0,05)P.nirurise utilizaron muestras.Las temperaturas de funcionamiento de 60 y 100 C, y la presin de 200 bar se investigaron con (10%, v / v) y sin co-disolvente.Una extraccin esttica horas se dej a la temperatura y la presin estudiado, seguido de una extraccin dinmica con un caudal de disolvente de 1,5 ml / min durante 4 h.Las fracciones del extracto se recogieron cada 30 min y luego se colocan en un horno de aire (Shel Lab, EE.UU.) a 70 C durante aproximadamente 15-30 h para eliminar el codisolvente restante.Cuando no hay codisolvente estaba presente, los extractos no se calentaron para evitar la evaporacin de los componentes voltiles.Todos los extractos se colocaron entonces en una condicin de temperatura ambiente antes de gravimtricamente de pesaje para determinar los rendimientos de extraccin.2.4.2.Extraccin de agua a presin (PWE)Configuracin experimental similar al sistema de SFE como se muestra enla fig.3fue empleado para el PWE.En este mtodo, slo la bomba 2 (codisolvente) fue utilizado como un dispositivo de bombeo.Cinco gramos ( 0,05) de muestra de la planta se extrajo usando agua como disolvente.Se estudiaron las temperaturas de funcionamiento de 60 y 100 C y presiones de 100 y 150 bar.Antes de iniciar el experimento, 30 min de extraccin esttica se dej a la temperatura y la presin estudiado, seguido de una extraccin dinmica hasta el agotamiento a una tasa de flujo de agua de 1,5 y 3,0 ml / min.Las fracciones del extracto se recogieron cada 10 min, se filtr usando un papel de filtro Whatman (. No 1) y despus se sec en un horno de aire (Shel Lab, EE.UU.) a 70 C durante aproximadamente 15-30 h.Los extractos se enfriaron entonces hasta una temperatura ambiente antes de la determinacin de los rendimientos.2.5.El anlisis por HPLC2.5.1.Preparacin de la muestraSoluciones estndar de referencia para el cido glico y cido elgico se prepararon en primer lugar.El cido glico en agua se prepara con una concentracin que oscila entre 0,75 g / ml y 1,2 mg / mL.El cido elgico se disolvi en etanol al 50% con concentraciones de 2,5 mg / ml a 1 mg / ml.HEPAR-P yP.niruritodos los extractos se disolvieron en 50% de etanol en concentraciones de 1-5 mg / ml.Solucin corilagin fue preparado por el Nova Laboratorios Sdn.Bhd. (Malasia) en solvente de dilucin apropiado a 0,5 mg / ml de concentracin.Todas estas soluciones eran ultra-sonicado a 60 C durante 30 min para eliminar burbujas de aire y para asegurar que todos los slidos se disolvieron por completo antes del anlisis por HPLC.Antes de la inyeccin, todas las soluciones de muestra se filtraron a travs de un filtro de jeringa de 0,45 micras PVDF.2.5.2.Deteccin e identificacinAnlisis de los componentes se llev a cabo utilizando cromatografa lquida de alto rendimiento tcnica (HPLC) equipado con un muestreador automtico y un / vis detector de UV (Agilent Technologies, Alemania).La columna utilizada para el anlisis fue una fase inversa C18 con Genesis 250 mm 4,6 mm id y 4 m de dimetro de partcula (Jones Chromatography, Reino Unido).La separacin cromatogrfica se desarroll utilizando una fase mvil de cido fosfrico 0,1% en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) con un gradiente de disolvente B: 8-22% (35 min), 22-8% (10 min) a un caudal de 1 ml / min.El volumen de inyeccin se fij en 20 l y la deteccin era de la absorbancia UV a 270 nm.Picos cromatogrficos se identificaron mediante la comparacin con los tiempos de retencin de cido elgico, cido glico y normas corilagin.Debido a la falta de disponibilidad de la norma corilagin, algunas muestras fueron analizadas inicialmente por Nova Laboratorios Sdn.Bhd. (Malasia) usando su nivel corilagin purificada (98%) y el rea del pico se identific y se calibra a la obtenida por nuestro mtodo HPLC.Para las otras soluciones estndar de referencia, se les inyect (por triplicado) a diferentes concentraciones y anlisis de regresin lineal de los datos de rea de pico frente a la concentracin se llev a cabo.Calibraciones lineales con una precisin de ms del 99,5% se obtuvieron para todos los estndares.Se hizo una sola inyeccin del disolvente (en blanco) para determinar el tiempo de retencin de disolvente.El contenido de cido glico, cido elgico y corilagin en los extractos se calculan en base a las reas de los picos correspondientes y se inyectaron concentraciones.3. Resultados y discusin3.1.Efectos disolventes sobre rendimiento de extractoLos efectos de disolventes orgnicos y acuosos sobre el rendimiento de extraccin y el contenido de cido glico bioactivo, cido elgico y corilagin enP.nirurifueron estudiados usando el mtodo de extraccin Soxhlet estndar.La cantidad de extracto despus de la retirada del disolvente se enumera enla Tabla 1.Los resultados indican que laP.niruries ms soluble en disolventes polares a saber, agua (26,2%) y etanol acuoso (20,8-27,1%).Esto demuestra que la mayora de los componentes enP.nirurison hidrfilo o soluble en agua.El color de los extractos eran de color marrn oscuro en agua y de color marrn-verde en etanol acuoso o acetona acuosa.Bajos rendimientos de extracto se obtuvieron en el disolvente no polar tal comon-hexano (1,8%) y ter de petrleo (2,2%), y el color se observ a ser amarillento con un tinte de color verde.Los rendimientos de extraccin de otros solventes fueron en el medio (4,0 a 14,6%) y se observaron los extractos a ser verde (intensidad diferente para diferentes extractos de disolventes).El color verde podra haber sido causado por la presencia de clorofilas.Se muestra que la polaridad del disolvente juega un papel importante.Las polaridades moleculares netas de disolventes se miden por sus momentos dipolares.Las polaridades y puntos de ebullicin de los disolventes utilizados se enumeran enla Tabla 1y los momentos dipolares para algunos de los disolventes se enumeran enla Tabla 2. Otras propiedades de disolventes (excepto por ter de petrleo) utilizados en este estudio, como la constante dielctrica, cohesiva Tambin se les da la energa, la viscosidad y la tensin superficial.Con la excepcin de acetona, el rendimiento aumenta con el extracto de la polaridad del disolvente.La adicin de agua en acetona y etanol aumenta enormemente el rendimiento de extracto.Tambin se encontr que el rendimiento ms alto se puede lograr en etanol al 20%.Es significativamente ms altos que mediante el uso de etanol puro y es ligeramente ms alto que mediante el uso de agua, ya que tanto los compuestos polares y polares menos se extrajeron de co juntos.Extraccin deP.nirurimediante el uso de dos disolventes inmiscibles, no polarn-hexano (rendimiento 1,8%) seguido de agua muy polar (rendimiento 23,6%), indica que cada disolvente extrae diferentes grupos de compuestos.El rendimiento total del proceso de dos pasos es muy cerca del rendimiento utilizando slo agua (26,2%) en un proceso de un solo paso.Por lo tanto, se puede concluir que el agua extrae los componentes tanto no polares y polares en su punto de ebullicin.Tabla 1tambin muestra que los rendimientos obtenidos para otros disolventes no son muy diferentes de los rendimientos obtenidos por otros investigadores, siempre que las condiciones de extraccin son relativamente similar.Tabla 2.Propiedades de los disolventes[24]Nombre Solvente

Tabla 2.Propiedades de los disolventes[24]Nombre SolventeMomento dipolar (Debye)Constante dielctricaCohesivo densidad de energaun(J mol / ml)Viscosidad (mPa)Tensin superficial (cal / mol A2)

Acetona2.8820.49362.070.3133.77

Cloroformo1.044,71332.000.5438.39

DCM1.608.93400.220.4139.15

Etanol1.6924.85618.871.0731.62

n-hexano0.001.88200.760.3025.75

Metanol1.7032.61808.260.5431.77

Agua1.8778.362095.930.89104.70

unEs igual a la plaza del parmetro de solubilidad Hildebrandt-Scott.Opciones de la tablaLa separacin de los componentes mediante un disolvente depende de la polaridad de ambos disolvente y el componente[21].Segn Barwick, un nico disolvente podra o no ser selectivo para la separacin de dos componentes como se muestra enla fig.4. Por ejemplo, si el compuesto deseadoxes no polar, se puede extraer selectivamente usando disolvente con la polaridadP'1.Por otro lado, si el compuesto ms polaryse desea,P'xdisolvente se puede utilizar para eliminar compuestox Seprimero, seguido por el disolventeP'2para extraer compuestoy.Sin embargo, para materiales vegetales que constan de mltiples componentes con interacciones complejas, 100% de recuperacin de componente individual est probablemente no logra desde un nico disolvente puede no ser selectivo para un nico compuesto.

Higo.4.La separacin de compuestoxyycomo una funcin de la polaridad del disolvente.P'x= polaridad del compuestox,P'y= polaridad del compuestoy[21].Opciones FiguraCabe sealar que la extraccin Soxhlet slo funciona en los puntos de ebullicin de los disolventes.En el punto de ebullicin del disolvente, su tensin superficial y la viscosidad se reducen considerablemente en comparacin con a una temperatura inferior, por lo tanto, el disolvente puede llegar a los sitios activos dentro de la matriz mucho ms fcilmente.Los efectos de la temperatura de disolvente haban sido estudiados por Xu y Godber para la extraccin de -orizanol del salvado de arroz usando hexano, acetato de etilo, isopropanol y diferentes combinaciones de disolventes[22].Ellos descubrieron que la temperatura fue significativa para el disolvente que modifica la matriz pero no para el disolvente que regula la extraccin de soluto.Por lo tanto, siempre que la base de (tiempo de residencia)-disolvente-slida relacin y tiempo de contacto son la misma comparacin, el disolvente y efectos en la extraccin de taninos hidrolizables utilizando Soxhlet se puede atribuir ms significativamente a la polaridad del disolvente que a la temperatura.3.2.Efectos disolventes sobre el contenido de componenteLa presencia de cuatro picos principales componentes se detect consistentemente en los cromatogramas de HPLC de HEPAR-P y algunos de losP.niruriextractos.El cromatograma de extracto estandarizado HEPAR-P se muestra en lafig.5. El cido glico (1), corilagin (3) y cido elgico (4) se identificaron en la muestra por comparacin con los estndares externos.El cido glico, cido elgico corilagin y tienen un tiempo de retencin de 5,4, 18,9 y 31,2 min, respectivamente.Por comparacin con la huella digital qumica estndar de HEPAR-P [25], el cromatograma obtenido en este estudio muestra perfil qumico similar, con el pico ms alto identificado como corilagin.Componente A, sin embargo, no se identific en este estudio.

Higo.5.HPLC cromatograma de HEPAR-P .La columna utilizada fue una fase inversa C18 Gnesis Identificacin 250 mm 4,6 mm, 4 m de dimetro de partcula.Una fase mvil de cido fosfrico 0,1% en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) con un gradiente de disolvente B: 8-22% (35 min), 22-8% (10 min) a un caudal de 1 ml / min.El volumen de inyeccin se fij en 20 l y la deteccin era de la absorbancia UV a 270 nm.Componentes detectados son el cido glico (1), el componente A (2), corilagin (3) y cido elgico (4).Opciones FiguraA pesar de que Geraniin ha sido identificado como el tanino hidrolizable ms activo enP.niruri, la presencia de Geraniin no pudo ser verificada en este estudio basado en el mtodo de HPLC desarrollado.Es posible que el mtodo de HPLC utilizado no es adecuado para la deteccin Geraniin o que el Geraniin obtenido podra haber sido hidrolizado y por lo tanto, podra resultar en una menor pureza y producir varios artefactos.La hidrlisis y alcohlisis a los componentes ms simples tales como corilagin brevifolin, cido carboxlico, cido glico y cido elgico podran haber ocurrido en la presencia de agua y alcoholes a altas temperaturas[15].La presencia de Geraniin fue confirmado previamente por el mtodo de RMN[18]y[19]despus de los procesos de mltiples etapas de fraccionamiento y aislamiento.Las concentraciones o contenidos (% w / w de extracto) de cido elgico, cido glico y corilagin en los extractos utilizando el mtodo de extraccin de Soxhlet se muestran en lafig.6. No hay taninos se detectaron ennse detectaron cantidades extractos hexano y ter de petrleo, y trazan en cloroformo y los extractos de DCM.En la extraccin de hierbas,n-hexano y ter de petrleo se utiliza principalmente para la eliminacin de lpidos no polares y glicsidos no deseadas[26]y[27]mientras cloroformo y DCM se utilizan sobre todo para la extraccin o aislamiento de lignanos de baja polaridad y glicsidos[28].

Higo.6.Contenido de componentes enPhyllanthus niruriextrados por diferentes disolventes en comparacin con el extracto estandarizado HEPAR-P .Opciones FiguraAl igual que el rendimiento de la extraccin, los ms altos contenidos de taninos totales se encontraron en extractos de agua y etanol acuoso.El aumento del contenido de agua en etanol dio lugar a un mayor contenido de cido elgico y glico como se ve enla fig.6. Los rendimientos ms altos para ambos componentes se obtuvieron utilizando agua pura en la extraccin Soxhlet.Por otro lado, se encontr contenido corilagin ms alto de 30% (v / v) de etanol en agua.Se observ un mayor contenido de agua no aumentar an ms el rendimiento total de extracto pero un incremento adicional en el contenido de cido glico y elgico y la reduccin en el contenido corilagin.Los resultados tambin mostraron que Soxhlet la composicin de los componentes de HEPAR-P era cercana a la de extracto de etanol al 70%.Dela Tabla 2, tambin es interesante observar que los componentes de tanino slo pudieron extraerse mediante un disolvente con un valor de constante dielctrica de ms de 20 (acetona, etanol, metanol y agua).Disolvente con una constante dielctrica inferior no podra extraer los taninos.Por ejemplo, a pesar de diclorometano y cloroformo tienen casi las mismas energas cohesivas y resultaron en rendimientos similares o ms altas de extracto a la de acetona, el contenido de taninos obtenidos son mucho menos o indetectable (Fig. 6).Por otro lado, el agua tiene mucho mayor viscosidad y la tensin superficial, que normalmente no se desean en la extraccin ya que dificultan la absorcin de disolvente en los sitios activos dentro de la matriz.Sin embargo, la constante dielctrica y la energa cohesiva son significativamente ms altas y por lo tanto, las molculas de agua estn fuertemente unidos a los componentes polares de tanino.El aumento de la temperatura del disolvente al punto de ebullicin tambin podra reducir la viscosidad y la tensin superficial y aumenta an ms el rendimiento de la extraccin.Para que un componente se disuelva en el disolvente, el parmetros de solubilidad de ambas sustancias deben ser similares.Parmetro de solubilidad de un soluto puede determinarse a partir de la ecuacin de solubilidad original desarrollado por Hildebrandt y Scott[29].La solubilidad del soluto en un disolvente no slo depende de la polaridad (momento dipolar), sino tambin en el enlace de hidrgeno, unin electrosttica y conformacin (ngulo diedro).La preferencial de disolventes para donar / aceptar electrones (nuclefilo) y para donar / aceptar H+(electrfilo) con los componentes tambin es crucial.Todos estos factores son importantes para explicar el disolvente-soluto y las interacciones disolvente-disolvente.Por ejemplo, Saidman y colaboradores propusieron que flavona interacta con el disolvente de etanol a travs de la interaccin de grupo carbonilo de la droga con dos molculas de disolvente[30].Se determin que el tomo de oxgeno del carbonilo (grupo cetona) en el flavona contiene mayor densidad electrnica en comparacin con el tomo de oxgeno intracclica (grupo ter).La interaccin entre el soluto y disolvente tambin result en el aumento global del momento dipolar para la solucin.Propiedades de los taninos sin embargo, no son estudiados extensamente y estn disponibles para geraniin o corilagin hasta el momento, no publicados datos termodinmicos y fsicos.Siempre que el punto de ebullicin, el peso molecular y el peso especfico estn disponibles, las propiedades crticas (es decir la temperatura crtica, presin y volumen) y el factor acntrico pueden ser estimados por las correlaciones propuestas por Watanasiri et al.[31].Estas propiedades son necesarias para calcular los momentos dipolares de los componentes.La solubilidad del soluto en el disolvente puede estimarse aproximadamente por los grupos funcionales presentes en la estructura qumica del tanino componente.Tabla 3da el tipo y nmero de grupos funcionales en orden de polaridad decreciente.El cido glico contiene grupo cido carboxlico y es ms soluble en disolvente polar tal como agua.Otros componentes de tanino no tienen este grupo funcional y, por lo tanto, la polaridad se basa en el siguiente grupo polar (hidroxilo).Si no se toman en cuenta otros grupos funcionales menos polares, Geraniin es el siguiente compuesto polar seguido por corilagin y cido elgico.Sin embargo, el nmero y la proporcin de estos grupos en comparacin con los grupos funcionales ms polares podran desempear un papel importante en el aumento o la disminucin de la solubilidad en un disolvente.Por lo tanto, el cido glico es probablemente el ms polar seguido por el cido elgico, corilagin y finalmente Geraniin.Tabla 3.Nmero de grupos funcionales en taninos hidrolizables en polaridad decrecienteGrupo funcionalEstructura qumicade unaNmero de grupo funcional

El cido glicoEl cido elgicoCorilaginGeraniin

El cido carboxlico1000

Hidroxilo341113

Cetona0001

Ester0235

ter0012

unAdoptado de Ref.[33].Opciones de la tablaEn este estudio, se puede deducir que los componentes que contienen grupos de cido carboxlico e hidroxilo se extraen preferentemente por agua a travs de los enlaces de hidrgeno.Los grupos cidos, cetonas y steres carboxlicos tienen la capacidad nuclefila (donador de electrones) en el grupo carbonilo y pueden reaccionar con el agua y el alcohol.ter es el menos polar y requiere menos disolvente polar.Sin embargo, dado que los compuestos de tanino tienen ms de un grupo funcional, cada compuesto es selectivamente soluble en diferente relacin de agua a etanol.Por ejemplo, el agua es preferible para la extraccin de cidos fenlicos pero la adicin de etanol (30%, v / v) se prefiere para la extraccin de corilagin.Los resultados de este estudio confirman tambin el trabajo por otros que en la extraccin de hierbas, agua y disolventes acuosos se utilizan preferentemente para la extraccin de taninos y polifenoles[27]y[32].El rendimiento de la extraccin, sin embargo, no slo es influenciada por el tipo de disolvente (caractersticas qumicas), sino tambin por la fuerza de solvatacin,-disolvente a slido ratio y tiempo de contacto (caractersticas fsicas) a diferentes condiciones de extraccin.3.3.Comparacin de los mtodos de extraccinUn estudio de los diferentes mtodos de extraccin es especialmente importante para la determinacin de la extraccin eficiente de soluto a partir de las matrices complejas tales como plantas.La comparacin se hizo entre el disolvente de extraccin por Soxhlet (SE), y los mtodos de extraccin de alta presin por la extraccin de agua a presin (PWE) y extraccin con fluidos supercrticos (SFE).Se emple agua como cosolvente en SFE pero actu como disolvente principal en otros mtodos de extraccin.Del mismo modo, 30% - 50% - 70% etanol y se utilizaron tambin como codisolventes en SFE y como principales disolventes en SE.Las extracciones se llevaron a cabo durante 3 h en disolvente de extraccin y hasta el agotamiento de las extracciones de alta presin.Muchas variables que intervienen en cada mtodo, por lo tanto, la comparacin directa entre los mtodos no se pueden hacer.En este estudio, la comparacin se realiza con base en los-solvente a slido ratio, tiempo de contacto (tiempo de permanencia) y la hora de extraccin de las condiciones de extraccin comparables, los rendimientos y contenido de componentes como se muestra enla Tabla 4Para SFE y PWE, los tiempos de residencia. se tuvieron en cuenta para extracciones tanto estticos como dinmicos en el recipiente 25 ml.Extracciones semi-lotes se suponen para todos los mtodos.El tiempo de residencia se determin que era de 0,5 horas por ciclo o un total de 3 h para Sohxlet, 3,8 h para SFE y 0,6-0,8 h para PWE.En SFE, los no-taninos se fraccionaron inicialmente en los primeros 0,5-3 h seguido por una extraccin de taninos en otro 1-3.5 h, dependiendo de las condiciones de extraccin empleadas.-Solvente a slido ratio (m3/ kg) se calcula en base a la cantidad de disolvente / co-disolvente que est en contacto con la muestra de la planta.Tabla 4.Comparacin de diferentes disolventes y mtodos de extraccinMtodoT( C)P(bar)Solvente tipo / cosolventeTiempo de extraccin (h)Volumen total de disolvente / co-disolvente ( 106m3)Solvente a slido lquido ratio ( 103m3/ kg)El tiempo total de residencia (h)El rendimiento total (% de la muestra g / g)Contenido de componentes (% g / g de extracto)

El cido glicoCorilaginEl cido elgico

SEpb1Agua3.0150303.026.21.152.9617.48

pb130% de etanol3.0150303.026.40.893.7112.97

pb1Etanol al 50%3.0150303.022.50.563.5210.82

pb170% de etanol3.0150303.020.80.183.195.74

SFEun60200Agua4.0367.23.817.80.482.426.48

6020030% de etanol4.0367.23.822.50.412.236.90

60200Etanol al 50%4.0367.23.820.60.383.455.52

6020070% de etanol4.0367.23.88.50.452.825.94

60100Etanol al 50%4.0367.23.817.50.343.676.75

100200Etanol al 50%4.0367.23.826.60.844.097.31

PWE60150Agua1.0180360,619.70.272.455.10

100100Agua1.0180360,623.20.332.356.22

100100Agua1.090180.827.00.654.118.91

HEPAR-P --------0.212,64 (4)4.17

-: No hay informacin disponible.Nmero de soporte es el contenido corilagin estandarizada reportado por Nova Laboratorios Sdn.Bhd. (Sin fecha).unDisolvente lquido se utiliz como co-disolvente mezclado con dixido de carbono supercrtico a 10% (v / v).Opciones de la tablaA una temperatura fija de 100 C, PWE a presin de 100 bar es mejor en comparacin con SE utilizando agua en trminos de menos tiempo de contacto y el tiempo total de extraccin para una proporcin similar o menos disolvente a slido.En PWE, la reduccin en la tasa de flujo (3,0 a 1,5 ml / min) caus el tiempo de contacto para aumentar y por lo tanto, el aumento de la eficiencia de la extraccin.Debido a una menor tasa de transferencia de flujo de agua, el equilibrio y la masa se logra mejor en un tiempo de residencia ms largo.Por lo tanto, aunque el rendimiento de extracto es aproximadamente igual, el contenido corilagin (4,11%) en PWE es 39% mayor que en el SE (2,96%).Tambin es posible que la polaridad de agua se reduce a la condicin sub-crtico, por lo tanto, el parmetro de solubilidad similar a la de corilagin podra lograrse.Tambin se ha encontrado que el agua subcrtica para aumentar la solubilidad de solutos relativamente polares en la extraccin de productos naturales tales como catequina y epicatequina[34].En PWE, diferentes fuerzas de solvatacin se puede lograr cambiando las propiedades del agua de normal a sub-crtico al agua supercrtica[35].En SE, mayor contenido de corilagin slo podra lograrse mediante la adicin de etanol en agua.El cido glico y cido elgico contenido se encontraron tambin ms alta en comparacin con SE PWE.Mayor grado de proceso de hidrlisis podra haber ocurrido, posiblemente debido al contacto directo del colector extracto (depsito de disolvente) con la placa caliente durante la extraccin.Por otra parte, el extracto se recogi a temperatura ambiente en el proceso de PWE.As, aunque la hidrlisis podra haber ocurrido en el extractor, la mayor parte de la energa se utiliz para liberar a los solutos de la matriz de la planta.Re-extraccin de la muestra de la planta utilizada en PWE por Soxhlet no extraer cualquier cido elgico o ms glico, lo que confirma que los altos contenidos de cidos fenlicos en la SE fueron el resultado de el proceso de hidrlisis.A pesar de que se prefiere a alta temperatura para romper los lazos de interaccin soluto-matriz y aumentar la volatilidad soluto, tambin puede causar la degradacin trmica de los componentes que son sensibles al calor y se deben evitar si es posible.Por lo tanto, las extracciones de alta presin a temperatura ms baja (60 C) fueron tambin investigados (Tabla 4).SFE a 200 bar y PWE a 150 bar se comparan.Presin superior a 150 bar en PWE produce ningn aumento adicional en rendimiento y componentes contenidos.Casi resultados similares se obtienen para ambos mtodos indican que codisolvente de agua al 10% (v / v) en SFE, que tiene una menor solvente lquido-slido a la proporcin de 0,0072 m3/ kg en comparacin con 0,036 m3/ kg en PWE, podra dar el mismo rendimiento que el PWE.Sin embargo, PWE es cuatro veces ms rpido que el SFE debido al mayor volumen de agua que entra y menor tiempo de residencia.Del mismo modo, se requieren tiempos de extraccin muy corta (5-20 min) para la extraccin de lquido a presin de otras hierbas medicinales[36].Como se mencion anteriormente, la adicin de etanol en agua podra aumentar el contenido corilagin en el mtodo SE.Por lo tanto, 30% - 50% - 70% y etanol como co-disolventes (10%, v / v) en SFE se investigaron, as tanto en 60 y 100 C.El rendimiento de extracto se encontr a aumentar con una concentracin reducida de etanol en el codisolvente y fue ms alta a 30% de etanol.En contraste con etanol al 30% en SE, en SFE se encontr que el contenido corilagin ms alta usando 50% de codisolvente etanol.A 60 C, con el fin de obtener la misma cantidad de extracto obtenido utilizando codisolvente de agua, la adicin de 50% (v / v) de etanol en agua podra reducir la presin de funcionamiento requerida de 200 bar a 100 bar.Adems, el rendimiento de extracto (20,6%) y el contenido corilagin (3,45%) de SFE con etanol al 50% a una presin de 200 bar y a una temperatura inferior (60 C) es comparable a SE utilizando etanol al 50% (22,5%, 3,52 %) en el punto de ebullicin del disolvente.Por lo tanto, la temperatura de funcionamiento se podra reducir en el SFE.A 200 bar y un 10% (v / v) de 50% co-disolvente etanol, aumentando a mayor temperatura (100 C) condujo a un aumento en el rendimiento de extracto (26,6%), que es similar al rendimiento de SE el uso de agua ( 26,2%).A esta temperatura, todo el contenido de componentes son superiores a la SFE a 60 C.A pesar de que se logr temperatura similar a la SE, el contenido de cido fenlico similares o ms altos que los de SE no podran alcanzarse debido a las mismas razones que se han mencionado anteriormente para PWE.Contenido corilagin Superior (4,09%) que SE, sin embargo se podra obtener, que es comparable a la de PWE.Tabla 4muestra que el tiempo de residencia en SFE (3,8 h) es ligeramente mayor en comparacin con SE (3 h), pero el disolvente a slido proporcin requerida es mucho menos en SFE.Otra ventaja de SFE con cosolventes de agua y de etanol-agua investigados es que la extraccin de los componentes menos polares (voltiles, lpidos, flavonoides y las clorofilas) se podra mejorar y se fraccion antes de los taninos hidrolizables en comparacin con SFE sin cosolvente o SFE con slo cosolventes orgnicos tal como (metanol o etanol. Fig 7).El aumento del rendimiento podra haber sido causado por la modificacin de la matriz de la planta y la mayor desorcin de los compuestos menos polares con la presencia de agua.Debido a la baja solubilidad de agua en CO2, dos fases pueden coexistir juntos y dar lugar a un fraccionamiento, con la fase de vapor rige principalmente por CO2que extrae los compuestos menos polares y la fase lquida rige principalmente por agua, que se extrajo los taninos hidrolizables.

Higo.7.Efecto de tipo co-disolvente en SFE a 200 bar y 60 C.Las lneas de puntos indican el fraccionamiento de los taninos hidrolizables.Opciones FiguraSe puede concluir que SFE con cosolvente etanol-agua tiene la utilizacin de disolvente lquido ms eficiente para la extraccin de taninos hidrolizables.Sin embargo, si el tiempo es el factor de control y no el volumen de disolvente, PWE se recomienda debido a los tiempos de extraccin y de residencia ms cortos.4. ConclusionesLa proyeccin por varios disolventes de extraccin mostr que la mayora de los componentes enP.nirurison hidrfilo o soluble en agua.Los taninos hidrolizables activos (cido glico, cido elgico y corilagin) se extrajeron preferiblemente usando agua o mezclas de etanol-agua.Debido a la naturaleza del agua en condiciones sub-crtico, se encontr que la extraccin de agua a presin (PWE) tena el extracto y corilagin rendimiento global ms alta en el tiempo ms corto en comparacin con la extraccin Soxhlet o SFE mtodo.Sin embargo, SFE con co-disolventes de agua y etanol-agua dio un resultado interesante desde el fraccionamiento entre los compuestos menos polares y los taninos hidrolizables era posible.SFE tambin fue superior en trminos de mnimo consumo de disolvente lquido.Por lo tanto, la optimizacin de los parmetros de funcionamiento, tanto en PWE y SFE con la mezcla cosolvente seleccionado debe estudiarse ms a fondo para la extraccin ms eficiente deP.niruricon pasos de procesamiento reducidos.AgradecimientosLa investigacin fue financiada por Malasia Ministerio de Ciencia, Tecnologa e Innovacin (MOSTI) en Investigacin La intensificacin en el rea Prioritaria (IRPA) concesin no.09-02-02-0091-EA234 y por la Universidad de Malaya en Voto F (0168 / 2003A).El autor principal tambin las gracias al Sr. NL Phang (Nova Laboratorios Sdn. 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ResumenSe propuso un sistema de inyeccin de flujo para evaluar el producto transitoria de una reaccin colorimtrica entre tanino hidrolizable y yodato de potasio (KIO3solucin).La optimizacin del sistema se llev a cabo mediante el uso de mtodos estadsticos basados en el diseo experimental.Velocidad de flujo de KIO3solucin, volumen de la muestra, la tasa de flujo de gas portador, y la bobina de reaccin fueron los factores seleccionados para su evaluacin.El cribado de paso, factorial completo 24se utiliz y se estudiaron dos niveles para cada factor seleccionado.Para la fase de optimizacin, un rostro compuesto diseo centrado 22fue empleado + estrellas para evaluar el volumen de muestra y la tasa de flujo de KIO3solucin, que fueron los factores identificados en la fase de seleccin como tener ms influencia en la seal de absorbancia.Despus de la optimizacin, el sistema propuesto se compar con la determinacin de lotes.Algunas caractersticas, tales como la frecuencia de anlisis, el consumo de reactivos y qumica generacin de residuos presentan mejores resultados por el uso del sistema propuesto si se compara con el mtodo de lotes.El sistema presenta una buena repetibilidad con una desviacin estndar inferior al 3%, paran= 10, linealidad (R2= 0,9974) para el estndar de cido tnico, la frecuencia de anlisis de 15 inyecciones h- 1y lmite de cuantificacin de 24 mg L- 1de tnico cido.Se obtuvieron buenos resultados cuando el sistema propuesto se aplic a la determinacin de tanino hidrolizable inbarbatimo Stryphnodendron,Eucalyptus citriodorayPhyllanthus niruri, muestras de plantas usadas comnmente en la medicina popular.Palabras clave Tanino hidrolizable; Yodato de potasio; Flow Injection Analysis; Diseo experimental

1. IntroduccinLos taninos son compuestos polifenlicos de alto peso molecular producidos por el metabolismo secundario de la planta.Se dividen en dos clases principales: condensados y taninos hidrolizables[1]y[2].Taninos hidrolizables estn formados por un ncleo de hidratos de carbono, por lo generaldglucosa, cuyos grupos hidroxilo pueden presentar enlaces ster con grupos fenlicos[3].Taninos hidrolizables naturales pueden ser nombrados como elagitaninos, cuando slo los cidos elgico son los grupos fenlicos unidos al ncleo de hidratos de carbono.Galotaninos se producen cuando slo cidos glico estn unidos al ncleo de hidratos de carbono, y el tanino mixta cuando ambos, cidos glico y elgico estn unidos al mismo ncleo de hidratos de carbono[4].Taninos hidrolizables naturales ocurren en madera, corteza, hojas, frutos y agallas[4],[5]y[6]y muestran diferentes efectos nutricionales, ecolgicos y medicinales[7]y[8].Teniendo en cuenta que los estudios ecolgicos y nutricionales pueden requerir anlisis de cientos de muestras, no es prctico para caracterizar cada compuesto individual como ellagitannin o galotanino[9].Por otro lado, la determinacin total de tanino hidrolizable puede ser muy til y proporcionar suficiente informacin para situaciones tales como nutricional, planta evaluacin potencial medicinal y estudios ecolgicos.Por lo tanto, la evolucin de los mtodos simples para la determinacin de taninos hidrolizables pueden ser muy tiles.En 1965, Haslam describe que la reaccin entre el tanino hidrolizable y KIO3result en un producto coloreado[10].De lo contrario, esta reaccin slo apareci para las determinaciones analticas en 1977, reportado por Bate-Smith[11].A partir de este informe, se han propuesto muchas otras modificaciones en un intento de aplicar esta reaccin como dispositivo analtico para tanino hidrolizable determinacin colorimtrica[12].La reaccin entre taninos hidrolizables y KIO3produce un compuesto coloreado transitoria (Fig. 1).Cuando los reactivos se mezclan entre s, un producto de color rojo se desarrolla.El color alcanza su mximo en un espacio de tiempo y luego comienza a desaparecer para generar un producto amarillo.

Higo.1.La reaccin entre el tanino hidrolizable y KIO3.Opciones FiguraEl mtodo tradicional anterior para la determinacin de tanino hidrolizable basada en el KIO3reaccin recomienda para relajarse mezcla de los reactivos antes de la medicin del producto de color, a 550 nm[13].Sin embargo, la investigacin adicional en esta rea ha indicado que, frente a la refrigeracin, las temperaturas altas aumentan la velocidad de reaccin[11]y[12].Los sistemas de flujo presentan una caracterstica cintica intrnseca[14].Todas las mediciones se realizan a las mismas condiciones de tiempo y de dispersin para los estndares de anlisis y muestras, sin necesidad de completar la reaccin.Adems, el sistema de flujo puede ser considerado como un sistema cerrado "cuasi", reducir la exposicin a soluciones qumicas y problemas de contaminacin ambiental, debido a una reduccin en los residuos generados[14].Cada sistema de flujo propuesto para la sustitucin de un mtodo analtico lote debe ser optimizado.Diseo experimental para la optimizacin es una herramienta estadstica utilizada para examinar sistemticamente los problemas que surgen en la investigacin, desarrollo y produccin.Con un diseo experimental informacin interesante se puede conseguir, ya que el experimento no se realiza al azar, pero se planea[15].Tcnicas quimiomtricas se introdujeron en la qumica analtica casi al mismo tiempo que el anlisis por inyeccin en flujo, y el aumento del uso de tanto ha revelado tendencias similares[16].Diseo experimental es una estrategia quimiomtrico que trabaja con muchos factores de forma simultnea, lo que puede influir en una respuesta del sistema.Por lo tanto, es posible evaluar los factores que han presentado influencias significativas en la respuesta del sistema, y si estas influencias son negativos o positivos[17]y[18].El objetivo de este trabajo fue construir y evaluar un ensayo adecuado para la determinacin del nivel de tanino hidrolizable en las plantas de uso comn como aplicacin de medicamentos dispositivos quimiomtricos a la optimizacin del ensayo propuesto.2. Materiales y mtodosTodas las soluciones se prepararon a partir de reactivos de grado analtico y agua destilada-desionizada se utilizan en todo.El reactivo de KIO3de solucin (2,5% w / v) se prepar por disolucin de 25 g de KIO3en 1000 ml de agua.La solucin de extraccin, que se utiliza para la preparacin de la muestra, fue acetona 70% (v / v), que se prepar diluyendo 70 ml de acetona pura en 100 ml de agua.La solucin analtica de stock de 5000 mg L- 1fue preparado por solubilizacin de 0,25 g de cido tnico en 50 ml de solucin de extraccin.Las soluciones analticas estndar que contenan 0, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mg L- 1de cido tnico se prepararon por dilucin acuosa de la solucin analtica de stock.Las muestras evaluadas fueron las especies de plantas que tienen propiedades medicinales:barbatimo Stryphnodendron,Eucalyptus citriodorayPhyllanthus niruri.Las plantas se cosecharon y se lavaron inmediatamente en el flujo de agua comn para eliminar las partculas de polvo.Despus, las muestras se enjuagaron con agua destilada-desionizada, se congel en nitrgeno lquido (- 196 C) y se liofiliz en un liofilizador (modelo Savant Novalyphe NL 150).Adems, las muestras secas se molieron en un molino criognico (modelo Spex Certiprep 6750).Por otra parte, una masa de 0,25 g de muestras de suelo (materia seca) se mezcl con 15 ml de solucin de extraccin (acetona al 70% v / v) y la mezcla se agit durante 10 min en un bao ultrasnico (Unique, modelo USC 1400, 81 W de potencia y 40 KHz de la frecuencia), seguido por 10 min de centrifugacin a 2000 rpm.Los extractos finales fueron diluidas cinco veces con agua, antes de la determinacin.Un sistema de flujo bsico fue desarrollado para permitir la reaccin en lnea entre el tanino hidrolizable y KIO3solucin.La configuracin de flujo consta de un modelo ISM 761 bomba peristltica (Ismatec, Suiza) con tubos de bombeo viton, inyectores conmutar[19], un espectrofotmetro modelo 432 (Femto, S. Paulo, Brasil) con una celda de flujo tubular (volumen internoca80 l , camino ptico 12 mm), una grabadora Stripchart modelo BD111 (Kipp y Zonen, Delft Holanda), y un bao de agua (Fanem, Brasil).El colector se construy con 0,8 mm tubo de polietileno Identificacin de un tipo de muro no plegable y plexigls conectores en forma de Y.El rendimiento bsico del sistema de flujo propuesto, representado en lafig.2, se optimiz el uso de un diseo experimental.

Higo.2.Sistema propuesto flujo: S, Muestra;SL, Sample Loop (350 l);CF, Flow Carrier (agua, 0,30 ml min- 1);RF, Flujo Reactivo (KIO32,5% (m / v), 0,88 mL min- 1);RC, serpentn de reaccin (500 l);WB, Bao de agua (T= 30 C);SD, detector espectrofotomtrico (= 550 nm);W, de Residuos;PR, potenciomtrica Recorder.Opciones FiguraPara la optimizacin del sistema una solucin de cido tnico de 500 mg L- 1se utiliz.En la fase de seleccin, a 24diseo factorial se aplic a explorar el KIO3y corriente portadora fluye factores de tasa, volumen de la muestra y de la bobina de reaccin.Los dos niveles estudiados para cada factor se muestran en laTabla 1.Tabla 1.Niveles de factores estudiados en fase de seleccin (24factorial design)FactoresNivel bajo (- 1)Alto nivel (+ 1)Unidad

KIO3caudal0.886.0mL min- 1

Velocidad de flujo Carrier0.303.4mL min- 1

Volumen de la muestra50250l

Reaccin bobina5001500l

Opciones de la tablaDurante la fase de optimizacin, un rostro compuesto diseo centrado 22+ estrellas se aplic para evaluar el volumen de la muestra y KIO3soluciones factores de caudal.Los niveles estudiados se muestran en laTabla 2.Tabla 2.Niveles de factores estudiados en fase de optimizacin (2de 2diseo + estrellas)FactoresNivel bajo (- 1)Nivel central (0)Alto nivel (+ 1)Unidad

KIO3caudal0.620.881.14mL min- 1

Volumen de la muestra150250350l

Opciones de la tablaLos Statgraphics plus software para Windows 3.0 se utiliz para analizar los datos de los diseos experimentales.Los mismos estndares de anlisis y soluciones de muestras presentadas al sistema de flujo optimizado tambin se presentaron al mtodo discontinuo Willis y Allen, slo modificar la temperatura propuesta por ellos[12].El mtodo de lote consisti en el calentamiento de 5 ml de KIO3de solucin (2,5% w / v) durante 7 min a 30 C, seguido por la adicin de 1 ml de solucin de muestra.La solucin mezclada despus se someti a 2 min ms de calentamiento a 30 C, antes de la determinacin espectrofotomtrica a 550 nm.3. Resultados y discusionesEl objetivo principal de este trabajo fue desarrollar un mtodo de costo fcil, simple y de bajo para la determinacin de taninos hidrolizables, que podra ser til en estudios nutricionales, medicinales y ecolgicas.La reaccin colorimtrica entre tanino hidrolizable y KIO3solucin, ya utilizada por Willis y Allen[12]en un procedimiento discontinuo, pareca ser perfecto para este objetivo.Por otra parte, la reaccin entre el tanino hidrolizable y yodato de potasio se considera el mtodo ms adecuado para las determinaciones de elagitanina y galotanino[8].La automatizacin de la reaccin se determin como la primera etapa de estos estudios.En el paso preliminar, se evalu la temperatura de reaccin.Segn Willis y Allen[12], temperaturas superiores a 25 C podra ser ventajoso si se utiliza un sistema automatizado.Por lo tanto, 30 C se aplic como el punto de partida de este estudio, como ya fue utilizado por Hartzfeld et al.[9].Otras temperaturas ms se evaluaron 30 C, pero durante los experimentos temperaturas superiores a 30 C producen burbujas en los tubos de polietileno, especialmente en el serpentn de reaccin.En consecuencia, se observa como una perturbacin en la estabilidad de la seal analtica.Por lo tanto, la temperatura se fij a 30 C.Por otra parte, los otros factores considerados en el estudio, lo que podra interferir con la intensidad del color rojo del producto de reaccin fueron la tasa de soporte de muestra de flujo (A), KIO3caudal de la solucin (B), volumen de la muestra (C), y el volumen de la bobina de reaccin (D).Para la optimizacin de estos parmetros, se utiliz la metodologa multivariado porque este tipo de metodologa de optimizacin permite la evaluacin de los cuales factores presentes influencias significativas en la respuesta del sistema, y si la influencia es negativo o positivo.La variacin simultnea de factores que tambin permite la evaluacin de los efectos de interaccin entre los factores estudiados.Es imposible evaluar los factores que interactan utilizando la metodologa de un factor-en-un-tiempo para una optimizacin del sistema[17]y[18].De esta manera, los parmetros fueron simultneamente variados, en un total de 16 experimentos llevados a cabo por triplicado, teniendo en cuenta dos niveles para cada uno.El valor de la absorbancia fue el parmetro monitorizado como respuesta del sistema.El diagrama de Pareto (Fig. 3) muestra que al 95% de nivel de confianza del factores individuales volumen de la muestra (C), KIO3caudal (B) y la tasa de flujo de gas portador (A), fueron, en este orden, los factores ms importantes en respuesta del sistema.

Higo.3.Diagrama de Pareto para determinar los valores de absorbancia despus de la reaccin entre KIO3y 500 mg L- 1de cido tnico.Opciones FiguraTambin est claro que las interacciones entre el volumen de la muestra y KIO3caudal (AB), KIO3tasa de flujo y velocidad de flujo portador (BC), la tasa de flujo de gas portador y el volumen de la muestra (AC) y la tasa de flujo de gas portador y el volumen de reaccin de la bobina (AD ), fueron las interacciones de los factores ms influyentes en la respuesta del sistema.Para evaluar la influencia de factores individuales y las interacciones, la trama de los efectos principales y la trama interacciones fueron consideradas (Fig. 4yfig. 5, respectivamente).

Higo.4.Grfica de efectos principales para el valor de absorbancia determinado despus de la reaccin entre KIO3y 500 mg L- 1de cido tnico.Opciones Figura

Higo.5.Parcela de Interaccin para el valor de absorbancia determinado despus de la reaccin entre KIO3y 500 mg L- 1de cido tnico (A: caudal portador, B: KIO3caudal, C: volumen de la muestra, D: volumen de la bobina).Opciones FiguraEn la grfica de efectos principales (Fig. 4) se puede observar que, sin embargo caudal portador (A) y KIO3caudal (B) tuvieron un efecto considerable en el valor de la extincin, estas son las influencias negativas, es decir, en la lejos a medida que aumenta A o B, el valor de absorbancia disminuye.A medida que el nivel mnimo estudi por un era pequea (0,30 ml min- 1), se consider apropiado para estudiar la tasa de caudales ms bajos, teniendo en cuenta los daos a la frecuencia analtica.De esta manera, la condicin ptima para el factor A se fija en su nivel mnimo estudiado (0,30 ml min- 1).Sin embargo, se consider muy importante para evaluar el factor B (KIO3caudal) de nuevo.La trama de interaccin (Fig. 5) muestra las interacciones entre los dos factores cuando el primero se fija en el centro de los niveles estudiados.La barra negativo representa el nivel mnimo, mientras que el bar positivo representa el nivel mximo estudiado para el segundo factor interactuar.En la interaccin AB, el factor A se fij en 1,85 mL min- 1, en el centro de 3,4 y 0,30, niveles mximos y mnimos estudiado respectivamente.Como se puede observar, en esta situacin, el factor B (KIO3caudal) tiene una gran influencia en el valor de absorbancia, en su nivel mnimo, debido la barra negativa es mayor que el positivo.Se confirma la influencia negativa del factor B con respecto al valor de absorbancia observada en los principales efectos parcela (. Fig 4).Como se discuti anteriormente, el factor B necesita ser evaluado de nuevo, de modo que esta nueva evaluacin puede considerar niveles ms bajos, en lugar del mnimo estudiado en este diseo experimental.La interaccin BC (Fig. 5), representa para el factor B (KIO3caudal) fijado en 3,44 ml min- 1, demostrado que las influencias del factor C (volumen de muestra) en gran medida el aumento del valor de la absorbancia, en su nivel mximo estudiado (el bar positivo es mayor que el negativo).Por lo tanto, el factor C tambin necesitaba ser evaluado de nuevo.Para la interaccin de CA, se puede observar que cuando el factor A se fij en 1,85 ml min- 1, factor de C (volumen de muestra) influencia es mayor para el nivel mximo de C (250 l).Se confirma una vez ms la necesidad de evaluar el factor C en niveles superiores a la mxima estudiada aqu.La ltima interaccin destac como relevante a nivel de confianza del 95% fue AD.Cuando A (caudal portadora) se fij en 1,85 mL min- 1, el factor D (volumen bobina de reaccin) no present una gran influencia en su nivel mximo (1.500 l).Sin embargo factor A se estudi de nuevo y, como el factor D no revel influencia como factor individual, se fija en su nivel mnimo, con el objetivo de aumentar la frecuencia de anlisis del sistema.Con base en los resultados anteriores, los factores B (KIO3caudal) y C (volumen de muestra) se optimizaron.Una metodologa de superficie de respuesta, sobre la base de cara centrada diseo compuesto 22+ estrellas se utiliz para este fin.Enla fig.6, una superficie de respuesta obtenida por valores de absorbancia a partir de 10 experimentos realizados por triplicado se representa.

Higo.6.Superficie de respuesta estimado para el valor de absorbancia determinado despus de la reaccin entre KIO3y 500 mg L- 1de cido tnico.Opciones FiguraLos resultados muestran las mejores condiciones para los factores evaluados.Estos se obtienen mediante la fijacin como 0,88 ml min- 1KIO3tasa de flujo (B) y 350 l el volumen de muestra introducida en el sistema (C).Por lo tanto, con estos experimentos era posible establecer la configuracin del sistema, que se describe en la leyenda dela figura.2.A continuacin, se evalu el sistema de flujo optimizado, y pareca adecuado para ser aplicado para la determinacin de taninos hidrolizables en las plantas.Este sistema presenta una frecuencia de anlisis de 15 inyecciones por hora, un intervalo lineal de hasta 1000 mg L- 1de cido tnico (R2= 0,9974), buena reproducibilidad y repetibilidad (RSD 3%,n= 10) y sin efectos de memoria (figura . 7), y un lmite de cuantificacin de 24 mg L- 1de cido tnico.

Higo.7.(A) de salida del registrador para la curva analtica: desde la derecha a izquierda por triplicado inyeccin de solucin, 0, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mg de cido tnico por litro de solucin.(B) Curva parcela analtica y su ajuste lineal.Opciones FiguraAdems de las caractersticas comunes de los sistemas de flujo esbozados por Ruzicka y Hansen[14], tales como la economa de reactivos y menor generacin de residuos, la capacidad de obtener todas las mediciones en el mismo perodo de tiempo despus de la reaccin, fue el punto clave de este mtodo.Como KIO3y la reaccin de tanino hidrolizable presenta un producto de color transitoria[12], en el mtodo por lotes es muy difcil de controlar el tiempo de cada medicin.Por lo tanto, siempre se introducen errores[20].Estos errores pueden causar disminucin del rango lineal y repetibilidad debido a las diferencias de tiempo mnimo entre cada determinacin.La validacin del mtodo propuesto se realiz mediante el uso de la suma y procedimiento de recuperacin.Con una adicin de 200 mg L- 1de cido tnico a una muestra, se obtuvo 97% de recuperacin, despus de la determinacin en el sistema de flujo propuesto.Despus de la optimizacin y caracterizacin, el sistema de flujo propuesto se aplic para determinar la concentracin de tanino hidrolizable en tres especies de plantas, que se utiliza comnmente en la medicina popular,S.barbatimo,E.citriodorayP.niruri.Los resultados obtenidos usando el sistema de flujo propuesto se compararon con los obtenidos por el mtodo discontinuo, descrito por Willis y Allen[12], donde la temperatura empleada fue de 30 C en lugar de 25 C.Esta modificacin se realiz con el objetivo de mantener las mismas condiciones para las dos metodologas de comparacin y los resultados obtenidos se describen enla Tabla 3.Tabla 3.Contenido de tanino hidrolizable determinado enbarbatimo Stryphnodendron,Eucalyptus citriodorayPhyllanthus niruriespecies de plantas por el mtodo por lotes y sistema de flujo propuestoMuestraTaninos hidrolizables (g kg- 1)Taninos hidrolizables (g kg- 1)F-testt-test

Mtodo por lotesMtodo de flujo propuesto

Eucalyptus citriodora(madera)199 ( 21)ununa191 ( 17)1.5 NSbb0.42 NS

Citriodora Eucalipto(hojas)93 ( 22)107 ( 24)1.2 NS0.61 NS

Stryphnodendron barbatimo(madera)70 ( 8,5)46 ( 3,5)5.9 NS3.7 NS

Phyllanthus niruri(hojas)134 ( 1,6)154 ( 2,6)2.6 NS9.1 NS

unLa desviacin estndar paran= 2.bNo significativo.Opciones de la tablaComo se puede observar, el emparejadoF-test muestra que al nivel de confianza del 95%, hay acuerdo entre los resultados obtenidos por ambos, lote y mtodo de flujo propuesto.Para comparar los resultados sealados como no significativas porF-test, la comparacin mediot-test fue aplicado.Lost-valores tambin muestran que los resultados obtenidos por ambos mtodos estn de acuerdo en el nivel de confianza del 95%.4. ConclusionesEl sistema propuesto presenta buenas caractersticas para ser aplicado a la determinacin de tanino hidrolizable en las plantas.La posibilidad de la determinacin en lnea aumenta la frecuencia de anlisis y produce resultados libres de errores relacionados con el tiempo de las mediciones, caracterstica de los mtodos de proceso por lotes.El uso de enfoque quimiomtrico para la optimizacin permite un mejor sistema de colector con nmero relativamente pequeo de experimentos.ReconocimientoLos autores desean agradecer a los CAPES y CNPq de apoyo financiero y becas proporcionado a los autores.Referencias1. [1] CS McSneeney, B. Palmer, DM McNeill, HACER Krouse Anim.Alimente Ciencia.Technol., 91 (2001), p.83 [SD-008]2. [2] J.-P.Salminen, V. Ossipov, E. Haukioja, K. Pihlaja Fitoqumica, 57 (2001), p.15 [SD-008]3. [3] J.-P.Salminen, V. Ossipov, J. Loponen, E. Haukioja, K. Pihlaja J. Chromatogr., A, 864 (1999), p.283 [SD-008]4. [4] I. Muller-Haervey Anim.Alimente Ciencia.Technol., 91 (2001), p.3 [SD-008]5. [5] S. Feng, A. Tang, J. Jiang, J. Fan Anal.Chim.Acta, 455 (2002), p.187 [SD-008]6. [6] T. Yoshida, T. Maruyama, A. Nitta, T. Okuda Fitoqumica, 42 (1996), p.1171 [SD-008]7. [7] T. Okuda Fitoqumica, 66 (2005), p.2012 [SD-008]8. [8] JM Monteiro, UP Albuquerque, EL Arajo Quim.Nova, 28 (2005), p.892 [SD-008]9. [9] PW Hartzfeld, PR Forkner, MD Hunter, AE Hagerman J. Agric.Chem., 50 (2002), p.1785 [SD-008]10. [10] E. Haslam Fitoqumica, 4 (1965), p.495 [SD-008]11. [11] CE Bate-Smith Fitoqumica, 16 (1977), p.1421 [SD-008]12. [12] RB Willis, R. Allen Analyst, 123 (1998), p.435 [SD-008]13. [13] PG Waterman, S. Mole Anlisis de metabolitos fenlicos vegetales (1994), p.100 Oxford [SD-008]14. [14] J. Ruzicka, H. Hansen Anlisis por Inyeccin en Flujo (2 ed.) John Wiley & Sons, N. York (1988), p.498 [SD-008]15. [15] T. Lundstedt, E. Seifert, L. Abramo, B. Thelin, A. Nystrom, J. Pettersen, R. Bergman Chemom.Intell.Lab.Syst., 42 (1998), p.3 [SD-008]16. [16] B. Karlberg, R. Torgrip Anal.Chim.Acta, 500 (2003), p.299 [SD-008]17. [17] B. Barros Neto, ES Scarmnio, RE Bruns Planejamento e otimizao de Experimentos (2 ed.) Unicamp, Campinas (1995), p.299 [SD-008]18. [18] SN Deming, S. Morgan Anal.Chim.Acta, 150 (1983), p.183 [SD-008]19. [19] FJ Krug, H. Bergamn Filho, EAG Zagatto Anal.Chim.Acta, 179 (1983), p.291 [SD-008]20. [20] CE Ferreira, ARA Nogueira Talanta, 51 (2000),

Alimentacin Animal Ciencia y TecnologaVolume 91, Issues 1-2, el 16 de mayo de 2001, pginas 3-20Taninos: Anlisis y los efectos biolgicos en los alimentos para rumiantes

Anlisis de los taninos hidrolizables Irene Mueller-Harvey,Mostrar msDOI: 10.1016 / S0377-8401 (01) 00227-9Obtener los derechos y contenidos

ResumenEsta crtica se ocupa de las principales cuestiones relacionadas con el anlisis de los taninos hidrolizables (HTS).Cubre brevemente su distribucin en el reino vegetal y se describen sus principales caractersticas estructurales.HTs menudo han sido ignoradas porque son aparentemente ms difcil de analizar que los taninos condensados.Datos analticos significativos dependen crticamente de las tcnicas de preparacin de muestras, almacenamiento y extraccin apropiadas.Esto requiere una cierta comprensin de la reactividad de los taninos hidrolizables.Mezclas de HTs se han medido por ensayos de tanino generales, tales como precipitacin con metales o protenas, y por ensayos colorimtricos para fenoles totales.Algunos HTs tambin se pueden medir mediante ensayos colorimtricos ms especficas.Aunque los ensayos colorimtricos son ampliamente utilizados para los anlisis de tanino, por lo general, no proporcionan datos cuantitativos precisos.A lo sumo, que proporcionan datos a efectos comparativos.Cromatografa en capa fina (TLC) y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) son herramientas tiles para examinar muestras para los diferentes tipos de taninos, taninos hidrolizables o condensados.Adems, hay tcnicas fisicoqumicas, tales como la resonancia magntica nuclear (RMN) y espectrometra de masas (MS), que se utilizan para identificar compuestos de tanino puros.Ms recientemente, otras tcnicas de MS han sido desarrollados que son capaces de producir pesos moleculares de mezclas de taninos crudo.Palabras clave Extraccin; Estructuras; Colorimetra; TLC; HPLC; RMN; MS

1. Ocurrencia y estructuras de los taninos hidrolizables (HTS)Tabla 1ilustra que los taninos hidrolizables son sintetizados por una amplia variedad de plantas y rboles (Haslam, 1981;Okuda et al, 1990.;Kumar y Vaithiyanathan, 1990) y varias de stas se han usado como alimentos para animales (Le Hourou, 1980) .Pueden ocurrir en madera, corteza, hojas, frutos y agallas.Vale la pena sealar que algunas especies producen ya sea galotaninos o elagitaninos, mientras que otros producen mezclas complejas que contienen galo, ellagi- y taninos condensados.Por ejemploAcacia,AceryFagaceaeson bien conocidos por tener ambos taninos condensados y hidrolizables (Bate-Smith, 1977;. Mueller-Harvey et al, 1987;Ishimaru et al., 1987).Tabla 1.Ocurrencia de taninos hidrolizables en las plantas y rbolesFamiliaEspeciesTipos de taninos

AnacardiaceaeRhussp.Galotaninos, elagitaninos

LeguminosaeCaesalpiniasp.Galotaninos, elagitaninos

Acaciasp.Galo, galatos de catequina

FagaceaeQuercussp.Galotaninos, elagitaninos

Castaneasp.Elagitaninos

CombretaceaeTerminaliasp.Elagitaninos

MyrtaceaeEucalyptussp.Elagitaninos

Opciones de la tablaHigo.1muestra las relaciones entre la biosntesis de compuestos diferentes HTs.El compuesto central, pentagalloylglucose, es el punto de partida para muchas estructuras de taninos complejos.Este compuesto pertenece a los denominados galotaninos.Estos consisten en un poliol central, tal como la glucosa, que est rodeado por varias unidades de cido glico.Otras unidades de cido glico se pueden unir a travs de un enlace depside (. Fig 2).Galotaninos simples son relativamente raros en la naturaleza, pero tienden a ser los principales constituyentes de los cidos tnicos disponibles comercialmente, por ejemplo, los taninos chinos deRhus semialata(Hagerman et al., 1997).Galotaninos ocurren enAcer,Quercus,RhusyPelargoniumespecies (Haslam, 1986;. auto y otros, 1986).Ms taninos complejos, tales como los elagitaninos, tambin se derivan de biosintticamente pentagalloylglucose por reacciones oxidativas entre las unidades de cido glico.

Higo.1.Metabolismo de cido glico (G) en taninos hidrolizables (despus deAuto et al, 1986.): pentagalloylglucose es el precursor de galotaninos (GT) y elagitaninos (ET).Opciones Figura

Higo.2.Ejemplo de un bono depside que se forma entre el grupo fenlico de la parte superior y el grupo cido de las unidades de cido glico inferiores.Opciones FiguraUn nmero muy grande de molculas de HTs existe en la naturaleza.La variacin estructural entre estos compuestos es causada por acoplamiento oxidativo de unidades de cido glico vecinos o por oxidacin de los anillos aromticos (Nonaka, 1989;. Okuda et al, 1990).Fig.3yfig.4dar ejemplos de estos dos tipos de reacciones.Tales reacciones de acoplamiento oxidativo puede producir HTs grandes y complejos.Fig.5muestra una HTs dimricos formados por el acoplamiento oxidativo entre dos cidos glico, cada uno de los cuales est unido a un ncleo diferente de la glucosa.Cabe destacar en este punto que la mayora de los ensayos colorimtricos HTs slo detectan la galoil o hexahydroxydiphenoyl grupos (HHDP), pero no a los productos de reaccin ms complejos se representa enla figura.3yfig.4. Como resultado, muchos compuestos HTs pueden escapar cuantificacin en pruebas colorimtricas diseados para HTs!

Higo.3.Reacciones de acoplamiento oxidativo entre unidades de cido glico pueden dar lugar a residuos ms grandes fenlicos en taninos hidrolizables (despus deNonaka, 1989).Opciones Figura

Higo.4.Las reacciones de oxidacin de los anillos aromticos en elagitaninos y otros taninos hidrolizables (despus deNonaka, 1989).Opciones Figura

Higo.5.Ejemplo de una llamada tanino hidrolizable dimrica, ya que contiene dos unidades de azcar, cada uno de los cuales est rodeado por el cido glico o sus metabolitos (despus deYoshida et al., 1985).Opciones Figura2. Extraccin de HTsHa habido mucho debate sobre si fresco, liofilizado o muestras secadas al aire se deben analizar.Las recomendaciones generales son que las muestras frescas son la opcin preferida para la extraccin de taninos.Sin embargo, esto a menudo no es prctico ni viable.La siguiente mejor opcin es la de transportar las muestras en fro (por ejemplo, sobre hielo o dixido de carbono) antes de la liofilizacin.Sin embargo, si las muestras son para ser secada al aire, se recomienda que se pueden secar a la sombra.Okuda et al.(1989)demostraron que algunos compuestos fenlicos se descomponen muy rpidamente en la luz solar directa o si se seca a temperaturas elevadas.El secado al horno a baja temperatura (