introduccion a la genomica funcional
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Isela Elizabeth Rangel Ventura. Biología. 0730055
GENETICA MENDELIANA
En la década de 1890, la invención de mejores microscopios permiten a los biólogos para
descubrir los hechos básicos de la división celular y la reproducción sexual. El enfoque de la
genética con Grefor Mendel en la investigación dio el salto a la comprensión de lo que
realmente sucede en la transmisión de los caracteres hereditarios de padres a hijos mediante
una serie de hipótesis que publicó en 1866, pero conocida hasta 1900, pasando su vida en el
monasterio ya que finalmente se retiró de la investigación.
A través del cruzamiento selectivo de razas de plantas de guisante común (Pisum sativum) a lo
largo de muchas generaciones, Mendel descubrió que ciertos rasgos aparecen en la
descendencia sin ninguna mezcla de características de los padres; observó siete rasgos que son
fácilmente reconocibles y, aparentemente, sólo se producen en una de dos formas:
1. Flor color púrpura o blanco
2. Posición de la flor es axial o terminal
3. Longitud del tallo largo o corto
4. Forma de la semilla redonda o arrugada
5. Semilla de color amarillo o verde
6. Forma de la vaina inflada o constreñida
7. Vaina color amarillo o verde
Esta observación de que estos rasgos no aparecen en las plantas descendientes con formas
intermedias fue muy importante porque la teoría de liderazgo en la biología en el momento de
que los rasgos heredados mezcla de generación en generación. De esta manera, los científicos
más importantes en el siglo 19 aceptaron esta fusión como " teoría”.
Desde un principio, Mendel tomó en cuenta las razones más convincentes, en aquel tiempo,
para elegir el ejemplar modelo. El cual surgió de plantas guisantes comunes de jardín para el
foco de su investigación, ya que se puede cultivar fácilmente en grandes cantidades y su
reproducción puede ser manipulada, tienen órganos reproductores femeninos y masculinos
(figura-1); como resultado, se puede autopolinizar o cruzarse con otra planta. Siendo capaz de
cruzar de forma selectiva la polinización de raza pura de plantas con características
particulares y observar el resultado de muchas generaciones tomándolo como base de sus
conclusiones sobre la naturaleza de la herencia genética (Dennis O'Neil, 2010).
Figura-1. Estructura reproductiva de la flor.
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PRIMERA LEY DE MENDEL (LEY DE SEGREGACIÓN)
Mendel realizó dos innovaciones a la ciencia de la genética: 1) desarrollo de líneas puras y, 2)
toma notas de sus resultados y manteniendo cuentas estadísticas.
En las plantas de polinización cruzada que,
o bien producir semillas de guisante verde
o amarillo exclusivamente, Mendel
descubrió que la progenie de primera
generación (F1) siempre tiene semillas
amarillas. Sin embargo, la siguiente
generación (F2) siempre tiene una
proporción de 3:1 de color amarillo a
verde (figura-2a). Esta relación de 3:1 se
produce en las generaciones posteriors y
Mendel se dio cuenta de que esta era la
clave para entender los mecanismos
básicos de la herencia (figura-2b).
llegando a la vez a cuatro conclusiones:
1. Los determinantes hereditarios son de naturaleza particulada. Estos determinantes se
llaman genes.
2. Cada padre tiene un par de genes en cada célula para cada característica estudiada. La
F 1 de un cruce de dos líneas puras contiene un alelo para el fenotipo dominante y uno
para el fenotipo recesivo. Estos dos alelos componen el par de genes.
3. Un miembro de la pareja segrega gen en un gameto, por lo que cada gameto lleva
solamente un miembro del par de genes.
4. Los gametos se unen al azar y con independencia de los pares de genes implicados.
De tal forma que la Primera Ley de Mendel, la ley de la segregación; es aquella que se lleva a
cabo durante la formación de los gametos cada miembro del par de alelos se separa de la de
otros miembros para formar la constitución genética del gameto (Phillip McClean, 2000), es
decir, la separación de los dos genes de un individuo en un lugar en su descendencia.
SEGUNDA LEY DE MENDEL
También conocido como el principio de distribución independiente, Segunda ley de Mendel
sostiene que los genes se heredan de forma independiente el uno del otro. No sólo existen
genes que codifican proteínas discretos, sino también los genes se conservan durante el
desarrollo y pasa inalterado a la siguiente generación.
Mendel demostró que un organismo hereda un alelo de cada uno de sus dos padres esta es la
“ley de la segregación”. Los fenotipos de las madres y padres a menudo parece que se funden
en su descendencia, y la mayoría de los estudiantes tanto de la herencia antes de Mendel
pensaban que la herencia que participan una especie de mezcla de genes. De hecho, los genes
subyacentes se mantienen.
Figura-2. Mecanismos básicos de la herencia: a.Progenies F1 y F2. b.F3
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La Síntesis Moderna. La teoría de la herencia
de Mendel conectada a una fuga peligrosa
en la teoría original de Darwin, las dos
teorías, junto con el tiempo llegaron a
formar la teoría sintética de la evolución, o
neo-darwinismo. El problema había sido la
falta de Darwin de una teoría racional de la
herencia.
Bajo la herencia mendeliana, el heterocigoto
Aa azul claro pasa intacto a sus
descendientes A y los genes que heredó de
su padre y madre. En la mezcla de la
herencia, si una persona hereda un gen A,
los dos físicamente se mezclan de alguna
manera para formar un nuevo tipo de gen
que causa el color azul claro. Y en vez de
producir 1 / 2 A de gametos y 1 / 2, entonces se producen todos los gametos A’. Esto hace una
diferencia en la segunda generación.
En un mecanismo de fusión, los "genes" no se conservan. Los genes que un individuo hereda
de sus padres son físicamente perdidos, ya que los dos conjuntos de los padres se mezclan. En
mendelismo, es perfectamente posible que los fenotipos de los padres parecen ser mezclados
en la descendencia, pero los genes no se mezclan.
TERCERA LEY DE MENDEL (LEY DE LA INDEPENDENCIA DE CARACTERES)
Hace referencia al caso de que se contemplen dos caracteres distintos. Cada uno de ellos se
transmite siguiendo las leyes anteriores con independencia de
la presencia del otro carácter. Mendel cruzó plantas de
guisantes de semilla amarilla y lisa con plantas de semilla verde
y rugosa (Homocigóticas ambas para los dos caracteres).
(Figura-4)
Las semillas obtenidas en este cruzamiento eran todas
amarillas y lisas, cumpliéndose así la primera ley para cada uno
de los caracteres considerados, y revelándonos también que
los alelos dominantes para esos caracteres son los que
determinan el color amarillo y la forma lisa. Las plantas
obtenidas y que constituyen la F1 son dihíbridas (AaBb).Estas
plantas de la F1 se cruzan entre sí, teniendo en cuenta los
gametos que formarán cada una de las plantas y que pueden
verse en la figura 8.
En el cuadro de la figura 9 se ven las semillas que aparecen y en
las proporciones que se indica.
Se puede apreciar que los alelos de los distintos genes se
transmiten con independencia unos de otros, ya que en la
segunda generación filial F2 aparecen guisantes amarillos y rugosos y otros que son verdes y
lisos, combinaciones que no se habían dado ni en la generación parental (P), ni en la filial
Figura3. (a) la herencia de fusión, los genes de los padres
para el azul (A) y rojo (a) color de fusión en su descendencia. (B) la herencia mendeliana, los genes se transmiten
inalterados por la descendencia.
Figura-4. Experimento de Mendel
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primera (F1). Asímismo, los resultados obtenidos para cada uno de los caracteres considerados
por separado, responden a la segunda ley.
Interpretación del experimento.
Los resultados de los experimentos de la tercera ley refuerzan el concepto de que los genes
son independientes entre sí, que no se mezclan ni desaparecen generación tras generación.
Para esta interpretación fue providencial la elección de los caracteres, pues estos resultados
no se cumplen siempre, sino solamente en el caso de que los dos caracteres a estudiar estén
regulados por genes que se encuentran en distintos cromosomas. No se cumple cuando los
dos genes considerados se encuentran en un mismo cromosoma, es el caso de los genes
ligados.
ADN NO CODIFICANTE
Gran parte del ADN de muchas especies probablemente no produce la producción de
proteínas. Por tanto, es llamado ADN no codificante. Por ejemplo, el genoma humano es de
aproximadamente 3 x 109 pares de nucleótidos de largo, y algunos genetistas estiman que
sólo el 10 - 25% de ella es en realidad la codificación de ADN. Se ha observado que el ADN
bacteriano tiende a ser mucho más económica y organizada. En experimentos de reasociación
de ADN se estima la proporción de ADN no codificante. En estos experimentos, hebras de ADN
se les permite unirse (volver a asociar) a la velocidad que lo hacen depende de su similitud de
secuencias. El ADN que se unieron poco a poco fue ADN "copia única", la parte del ADN que
codifica para la mayoría de los genes. Una gran parte del genoma es no codificante, el ADN
repetitivo.
Los genetistas distinguir varios tipos de ADN repetitivo. Una distinción importante es entre el
ADN tándem y repeticiones dispersas:
ADN tandem
• microsatélites. Repeticiones cortas - secuencias de nucleótidos (2 5 pares de bases). El
número de repeticiones varía, pero el promedio es de alrededor de 100 repeticiones. Muchos
loci microsatélites se encuentran dispersos a través del genoma, un ser humano promedio, por
ejemplo, contiene alrededor de 30 000 loci de microsatélites.
• minisatélites. Repeticiones de secuencias más largas de nucleótidos (aproximadamente 15
pares de bases). El número de repeticiones varía entre los loci minisatélites, y hay muchos loci
dispersos por todo el genoma. La duración media de un locus cualquiera suele ser de unos
cinco-dos mil nucleótidos.
• El ADN satélite. El tamaño de la unidad repetida varía en los distintos casos, algunos son tan
pequeños (5 a 15 pares de bases) como micro y minisatélites, otros son más grandes
(alrededor de 100 pares de bases). Se encuentran a menudo en grandes bloques, de alrededor
de 1000 o más repeticiones de la secuencia de la unidad en las regiones del cromosoma cerca
del centrómero y telómeros.
Repeticiones dispersas.
Secuencias más largas (a menudo alrededor de 100 pares de bases) que se distribuyen por
todo el genoma, por lo general en forma individual limitada por otras secuencias y no en
repeticiones en tándem.
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Actualmente existen dos hipótesis principales para explicar la evolución repetitivo, no
codificante del ADN:
1. Es funcional, aunque en realidad no codifican proteínas. Puede ser necesario por alguna
razón, reglamentarias o estructurales, tal vez para mantener los genes separados o
correctamente configurado en forma tridimensional de la molécula del ADN.
2. El ADN repetitivo puede ser egoísta ADN: ADN o neutrales "basura", o parasitarias. Este
interesante concepto evolutivo nuevo es ampliamente aceptado como la explicación de gran
parte del ADN repetitivo no codificante.
ADN egoísta no es transcrito, no codificante, y no contribuye en nada al bienestar del
organismo, en la mayoría de los casos es selectivamente neutra. Una vez que se plantea, el
ADN egoísta es una pasiva replica y se transmite de padres a hijos. Los cambios en su
frecuencia en la población debido a la deriva. Sólo si una secuencia no codificante interferido
con la construcción del organismo o si se acumulan de tal manera que el ciclo celular fue
frenado por la necesidad de repetir todo, que la selección actuar para reducirla. Siempre que
la cantidad de una determinada secuencia no es excesivo, no se transcribe y se acumula en las
partes del genoma donde se no interfiere con la regulación genética y la transcripción, no hay
ninguna razón por la cual el ADN egoísta no debe evolucionar. Hay dos tipos de ADN egoísta: •
Pasivo AND. La misma secuencia no puede influir en la posibilidad de que se propaga en el
ADN y se conserva, es entonces un tipo pasivo de ADN egoísta. • parasitarias ADN. Una
secuencia particular, podría tener una oportunidad mejor que la media de propagación a
través del ADN, estas secuencias sería una más activa, una especie parásita del ADN egoísta y
proliferarían hasta comprobar por selección natural. Esto puede explicar por qué el grado de
exceso de ADN difiere mucho entre las especies: la cantidad de ADN repetitivo que fluctúan en
el tiempo, ya que evolutivamente crece por la mutación y la deriva (o selección) y se contrae
cuando la selección actúa contra la acumulación excesiva de repeticiones, las diferentes
especies sería aún fotogramas de una imagen en movimiento.
Los diferentes genes se conservan de generación en generación en virtud de la herencia
mendeliana, lo que permite la selección natural para operar. Antes de Darwin se creía
erróneamente que los genes mezclados en lugar de ser conservado, y si los genes se mezclan,
la selección natural sería mucho menos poderosa que en virtud de la herencia mendeliana.
FILOGENIA
La GENÓMICA COMPARATIVA es una rama de la genómica que ayuda a interpretar la
evolución de los organismos mediante la comparación de los genomas de diferentes especies.
Los bancos de genes (Genbank) son bases de datos de secuencias de DNA y proteínas;
proporcionan secuencias al público, investigan en bioinformática, desarrollan software para
análisis genómicos, y diseminan literatura científica sobre genómica y biología molecular.
La gran cantidad de información contenida en los genomas modernos precisa herramientas
bioinformáticas para su análisis.
La glucólisis y el ciclo de Krebs son rutas metabólicas que se encuentran en la práctica total de
los seres vivos. Para la realización generalizada de análisis filogenéticos de organismos
animales y vegetales es muy conveniente la utilización de criterios fisiológicos moleculares
comunes a todas las especies que se pretende comparar. Cada una de las reacciones químicas
de las rutas antes mencionadas está catalizada por una enzima, una proteína codificada por un
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gen. La información secuencial correspondiente podría ser muy útil ya que la universalidad de
las reacciones de estas rutas las hace especialmente apropiadas para llevar a cabo esta clase
de estudios (Alexandra Ruiz, et. al.,2009).
La evolución requiere la variación genética que resulta de cambios dentro de una reserva
genética de una población específica. Un acervo genético es la combinación de todos los
alelos-formas alternativas de un locus genético para todos los rasgos que la población puede
presentar. Los cambios en una reserva genética puede resultar de la mutación variación dentro
de un determinado gen o de los cambios en la frecuencia de los genes-la proporción de un
alelo en una población dada.
La información almacenada en un gen es leído por proteínas, que se insertan en el genoma e
iniciar una serie de reacciones llamado la expresión génica. Las mutaciones en las regiones
codificantes de los genes son muy más importantes. Aquí debemos tener en cuenta la
importancia de la misma mutación en una célula somática en comparación con una célula
germinal; ya que las mutaciones en las células germinales pueden transmitirse a la generación
siguiente y luego estará presente en todas las células de un individuo que hereda esa
mutación. Esas mutaciones que tienen un efecto evolutivo puede ser dividido en dos
categorías, de la función de las mutaciones y la pérdida de la función de las mutaciones de
ganancia. Una mutación de pérdida de función de los resultados en función de la proteína
abolida o reducida. De la función de las mutaciones de ganancia, que son mucho menos
comunes, le confieren una actividad anormal de una proteína. Esto significa que muchos genes
son polimorfos y cada uno de estos alelos tiene su propia o la frecuencia de alelos del gen, una
medida de qué tan común es un alelo en una población. Las cuales varían con el tiempo debido
a dos condiciones, la selección natural y la deriva al azar.
Macromoléculas, especialmente proteínas y secuencias de genes, han superado a otros
caracteres morfológicos y de organismos como las formas más populares de los datos para los
análisis filogenéticos. A pesar de numerosos algoritmos, procedimientos y programas de
ordenador se han desarrollado, su fiabilidad y funcionalidad son, en todos los casos,
dependiendo del tamaño y la estructura del conjunto de datos bajo análisis. Por lo tanto, al
interpretar un análisis dado, una persona siempre debe considerar el modelo utilizado y
entretener a posibles explicaciones para los resultados obtenidos. Por ejemplo, los modelos
utilizados en métodos moleculares de análisis filogenético que "por defecto" supuestos,
incluyendo: La secuencia es correcta y procede de la fuente especificada. Las secuencias son
homólogas, todos descendientes de alguna manera a partir de una secuencia ancestral común.
Cada posición en la alineación de la secuencia es homóloga con todos los demás en esa
alineación. Cada una de las múltiples secuencias incluidas en un análisis filogenético común
tiene una historia común con las otras secuencias. El muestreo de taxones es adecuada para
resolver el problema en estudio. Secuencia de la variación entre las muestras es el
representante del grupo más amplio. La variabilidad de la secuencia en la muestra contiene
señal filogenética adecuada para resolver el problema en estudio. El principio general detrás
de métodos filogenéticos es encontrar un árbol que reduce al mínimo el cambio de secuencia.
Por el contrario, el cambio se haría con un adicional necesaria si las dos especies no se unieron
en el árbol, por lo que el otro árbol tiene menos probabilidades de ser el verdadero árbol. Los
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dos métodos de construcción de árbol que se utiliza con mayor frecuencia con los datos de
secuencia molecular son la evolución mínima, como vecino de unión, y de máxima
verosimilitud. Estos métodos, y el método bayesiano, son lo suficientemente flexibles para
incluir información diversa sobre la naturaleza biológica del cambio de secuencia molecular,
tales como tasa de variación entre los sitios. Un cuarto método de máxima parsimonia,
también se usa ampliamente.
La teoría neutral, propuesta por Motoo Kimura en la década de 1960. La teoría postula que la
mayoría de las mutaciones acumuladas en cualquier genoma son neutrales: "ni beneficioso ni
perjudicial en las palabras de Darwin. Así, las mutaciones podrían acumularse de forma
continua, proporcionando el mecanismo causal del reloj.
La única molécula más útiles ha sido ARN ribosomal (ARNr), que es homóloga a todos los
organismos vivos y, debido a que parece seguir evolucionando en la estructura secundaria, su
secuencia primaria es más fácil de usar para reconstruir los árboles. El uso común del rRNA
subunidad 18S es más, cerca de 1800 pares de bases y evoluciona lentamente.
SECUENCIACION
El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de
nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la
secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son
el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger
también conocido por el método didesoxi.
MÉTODO DIDESOXI DE SANGER
Compuestos:
El ADN molde en gran cantidad en estado de hélice sencilla.
Un enzima que replique el ADN (ADN Polimerasa I).
Un cebador de alrededor de 20 bases de longitud para que la ADN polimerasa I
comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH.
Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar
radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos
trifosfato en cada reacción.
Nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).
En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada
mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP),
ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi a una
concentración baja. El nucleótido
didesoxi utilizado competirá con su
homólogo por incorporarse a la
cadena de ADN que se está
sintetizando, produciendo la
terminación de la síntesis en el
momento y lugar donde se
incorpora. Por este sistema, en
cada mezcla de reacción se
Figura-5. Síntesis del ADN molde.
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producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan
todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas
contienen en el extremo 5' el cebador utilizado) (figura-5).
Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por
tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de
espesor) y de gran longitud (cerca de
50 cm) que permiten distinguir
fragmentos de ADN que se
diferencian en un solo nucleótido.
Los productos de cada una de las
cuatro mezclas de reacción se
insertan en cuatro calles o carriles
diferentes del gel. La aparición de
una banda en una posición concreta
de la autorradiografía en una de las
cuatro calles nos indica que en ese
punto de la secuencia del ADN de
nueva síntesis (complementario al
ADN molde) está la base
correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente
(figura-6). Antes de resolver la secuencia del segmento de ADN problema es conveniente
repasar el método de Sanger.
Se pasa a considerar la secuencia de bases nitrogenadas de ambas hélices de ADN, la
complementaria de nueva síntesis (ADN-C) y la hélice molde (ADN-M) y la transcripción para la
obtención de los ARNm de ambas cadenas. Con ayuda del código genético se consigue la
secuencia de aminoácidos de los posibles polipéptidos sintetizados por dichos mensajeros,
dependiendo del ribonucleótido por el que se inicie la traducción.
El primer genoma bacteriano secuenciado fue el de Haemophilus influenzae, el mismo
organismo con el que se descubrieron las enzimas de restricción en los años 1960. Figurado
por los cloroplastos, las mitocondrias de mamíferos, diferentes organismos de laboratorio
como levaduras, un gusano nematodo, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), la
planta Arabidopsis thaliana, el ratón Mus musculus. También se han secuenciado una gran
variedad de patógenos conocidos como las bacterias causantes del cólera, la tuberculosis, la
sífilis, la gonorrea, la enfermedad de Lyme, el virus de la viruela y el del mal de Epstein-Barr.
Con la conclusión de estos y muchos otros proyectos genomas se espera lograr una mejor
comprensión sobre el mecanismo de acción de los organismos patógenos, para disminuir su
virulencia, o lograr erradicarlos.
MARCADORES MOLECULARES
Los marcadores moleculares han sido definidos como cualquier diferencia notípica controlada
genéticamente. Se puede considerar que cualquier molécula, orgánica o inorgánica, que sea
característica de un organismo o proceso sea un marcador. Los marcadores idóneos son los de
ADN, siendo válido cualquier fragmento que se encuentre muy cerca del gen o de la secuencia
de interés y que lógicamente no afecte al carácter en estudio. Para otros, un marcador se
Figura-6. Lectura de electroforesis. Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' - 3', si comenzamos a leer el gel
por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la
secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' - 3'.
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refiere a cualquier molécula de proteína, ARN o ADN de tamaño o peso molecular conocido
que sirve para monitorear o calibrar la separación de las mismas utilizando electroforesis o
cromatografía, y un marcador genético como cualquier gen cuya expresión permite un efecto
fenotípico que puede ser detectado fácilmente. Los marcadores del ADN se basan
fundamentalmente en el análisis de las diferencias en pequeñas secuencias del ADN entre
individuos. Las técnicas empleadas para ello son muy diversas y dan el nombre a los distintos
tipos de marcadores, los cuales pueden ser de carácter dominante o codominante.
Algunos ejemplos de ellos son: Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP), Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), Polimorfismo en la longitud de los
fragmentos amplificados (AFLP), Microsatélites o Secuencias simples repetidas (SSR),
Amplificación aleatoria del polimorfismo de microsatélites (RAMPO) etc.
La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones
de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de interés para el hombre. Hay dos
tipos principales de marcadores: los marcadores morfológicos y los marcadores moleculares
(Azofeita, 2006).
Marcadores morfológicos
Se consideran marcadores morfológicos a los caracteres de un individuo que se expresan en un
ambiente específico y que el hombre identifica con un objetivo determinado como estimar la
variación existente en una población.
Marcadores moleculares
Corresponden a cualquier gen cuya expresión permite un efecto cuantificable u observable.
Pueden evaluarse desde que los individuos están en sus primeros estadios de desarrollo. Se
habla de marcadores genéticos cuando se transmiten según las leyes básicas de la herencia
mendeliana, por lo que es importante destacar que no todos los marcadores moleculares
pueden considerarse como genéticos. Existen dos tipos de marcadores moleculares: los
marcadores bioquímicos y los marcadores de ADN.
Marcadores Bioquímicos
Incluyen a las proteínas y las isoenzimas o aloenzimas. Las proteínas se ven menos influidas
por el ambiente al ser producto de la traducción. Las isoenzimas fueron descubiertas por
Hunter y Markert en 1957 y son diferentes variantes moleculares de una misma enzima
presentes en una especie, las cuales desempeñan la misma actividad pero pueden tener
diferentes propiedades.
Las isoenzimas se identifican mediante el proceso denominado “electroforesis”, que consiste
en colocar un extracto proteico del material a analizar en los pocillos de un soporte (papel de
celulosa o un gel hecho de agarosa o poliacrilamida) que se somete a un campo eléctrico
durante varias horas para que se separen las proteínas de acuerdo con su tamaño o carga
eléctrica. Una vez concluida la emigración de las proteínas por medio del frente de corrida
denominado Kohlrasusch, siendo que las diferencias en la movilidad electroforética de las
isoenzimas son resultantes de las diferencias en las secuencias del ADN que codifican tales
enzimas.
Las isoenzimas tienen base genética codominante (es decir, que en un individuo diploide es
posible visualizar la expresión de ambos alelos); son selectivamente neutrales y están libres de
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efectos deletéreos (cuando los alelos tienen efectos negativos que imposibilitan la
reproducción del genotipo que los posee), efectos pleiotrópicos (cuando un gen controla la
expresión de más de un carácter en un individuo) y/o epistáticos (dominancia de un gen sobre
otro).
Desventajas: 1) presentan problemas técnicos; 2) no permiten cubrir todo el genoma, pues
sólo representan una estrecha fracción del contenido genético; 3 ) únicamente detectan la
variación de los genes que codifican para la expresión de una característica del individuo; 4 ) se
dificulta la precisión de los datos obtenidos debido al polimorfismo en el tejido de las
isoenzimas (por ejemplo, el polimorfismo detectado en una hoja no es el mismo que el que se
obtiene usando la semilla del mismo individuo).
Marcadores de ADN
Son capaces de generar una cantidad virtualmente infinita de marcadores. Existen varias
técnicas para identificar marcadores de ADN, las que se pueden agrupar en tres categorías: las
de hibridación tipo Southern, las de reacción de polimerización en cadena (PCR) y las que
combinan PCR o sus productos de ADN con la hibridación tipo Southern.
La hibridación consiste en la formación de una molécula de doble cadena mediante el
apareamiento o unión de bases complementarias de dos moléculas de una sola cadena. La
hibridación tipo Southern explora las variaciones en la longitud o tamaño de los fragmentos de
ADN ocasionadas por la restricción del genoma mediada por una enzima particular
(endonucleasa). Esta técnica comprende las siguientes etapas: primero se extrae el ADN del
material que deseamos estudiar; luego se le adicionan enzimas de restricción (endonucleasas),
las cuales cortan el ADN en fragmentos de diferente longitud; estos fragmentos son separados
en geles de agarosa, para después realizar por capilaridad o al vacío la transferencia de los
fragmentos a una membrana de papel de nitrocelulosa o de nylon (transferencia tipo
Southern). Finalmente, se hibridizan los fragmentos de la membrana con sondas marcadas
(radiactiva o no radiactivamente) para visualizar y detectar las bandas hibridadas.
Dentro de esta técnica se encuentran los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción) y los VNTR (secuencias adyacentes que se repiten en número
variable).
La técnica de PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, es una tecnología utilizada para
multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos específicos de ADN con la finalidad de detectar una
secuencia o gen de interés en el genoma del individuo en estudio. Se basa en la amplificación
de fragmentos de ADN a partir de secuencias de nucleótidos denominadas “cebador” (primer),
que son capaces de reconocer una secuencia blanco para la cual es complementaria.
Dentro de esta metodología se encuentran los marcadores llamados RAPD (ADN polimórfico
amplificado al azar), PCR iniciada con microsatélites (MP-PCR), AFLP (polimorfismo de longitud
de fragmentos amplificados) y DAF (amplificación de huellas del ADN), entre otros.
Finalmente, dentro de las metodologías que combinan la PCR o sus productos de ADN más la
hibridación tipo Southern, están los RAHM y RAMPO (amplificación aleatoria del polimorfismo
de microsatélites).
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Aplicaciones de los marcadores de ADN
El uso de marcadores moleculares en los análisis genéticos y en el mejoramiento de las plantas
ha tenido una difusión extremadamente rápida. Las principales aplicaciones incluyen la
obtención de “huellas genéticas” (fingerprinting) genómicas de individuos, variedades y
poblaciones; el análisis de la estructura y diversidad genética en poblaciones naturales y de
mejoramiento y bancos de germoplasma; el establecimiento de relaciones filogenéticas entre
diferentes individuos y especies; la construcción de mapas genéticos de alta cobertura
genómica y la localización de genes de interés económico.
TECNICA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA)
En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus, inventó un método para lograr la
multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores
y su replicación en bacterias. Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de
técnicas de la biología molecular. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios, no
sólo de investigación básica, sino también de diagnóstico clínico. Se trata de la reacción en
cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del inglés
Polymerase Chain Reaction.
Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha impuesto)
pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a
reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El
segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino
que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total (M.
Leonardo Satz, et. al., 1993). Por lo tanto la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la
repetición de un ciclo: Ciclo de amplificación.
Inicialización:
Se lleva la reacción hasta una temperatura de 94-96ºC ó 98ºC si se está usando una polimerasa
termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para
ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización:
Se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso
puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la
forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende,
por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma.
Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o
agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento/Unión del cebador:
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su
secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-
65ºC durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de
hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán
como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
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Extensión/Elongación de la cadena:
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y
partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los
dNTP’s complementarios en dirección 5′→ 3′, uniendo el grupo 5′- fosfato de los dNTPs con el
grupo 3′- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura
para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la
temperatura de máxima actividad está en 75-80°C (comúnmente 72°C). El tiempo de extensión
depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se
va a amplificar. Hay una regla básica: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación Final:
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos tras el
último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado.
Conservación:
Este paso se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a
corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción
de 0.2-0.5 ml, en pequeños tubos de 15-100 μl que se
colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN
previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan
los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga,
esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la
matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la
electroforesis en gel de Sagarosa, para fragmentos grandes;
en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más
rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente,
la electroforesis capilar.[3] El/los tamaño/s de los productos
de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de
tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los
productos de PCR.
TIPOS DE PCR
PCR anidada.- Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.
PCR in situ.- La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células,
donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada
sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una
primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ
convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades
Figura-7. Reacción en cadena de la
polimerasa.
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pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar
específicamente una población de secuencias de menor representación.
PCR multiplex.- PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción.
Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente
múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de
cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de
varios loci en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de
reactivos, rápida construcción de base de datos.
PCR en Transcriptasa inversa (RT-PCR).- Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una
transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado
ADNc.
PCR tiempo real (qPCR).-Reacción de PCR cuya principal característica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con
una muy alta probabilidad, muestras de DNA específicas a partir de su temperatura de fusión
(también denominado valor Tm, del inglés melting temperature).
ENZIMAS DE RESTRICCION
Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN entre 4-8
bp. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace
fosfodiester en la hebra de arriba (sens) y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria
(antisens).
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan
lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III
cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar
de reconocimiento hasta el sitio del corte.
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que
reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
Dentro de las aplicaciones de las enzimas de restricción, se pueden crear mapas de restricción
de un plásmido o bacteriófago, fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y
“Southern Blot”, generar fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y
“Northern” blotting y, generar fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creación de DNA recombinante.
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre
está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta
enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la
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especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que
se han aislado de esa cepa (Omayra, et. al.).
MICROARREGLOS
Son soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, en un área pequeña, de
cientos a miles de genes de manera ordenada. Los soportes sólidos pueden ser laminillas de
vidrio para microscopio, laminillas de silicon o membranas de nylon. En los microarreglos, el
DNA puede ser impreso, depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida. Esta
colección de ácidos nucléicos (blancos) impresos con un orden específico, representan una
parte o todos los genes de un organismo. Cada secuencia presente en cada una de las
alícuotas depositadas en la superficie sólida corresponde a un gen diferente.
Cabe mencionar que los microarreglos de DNA son una versión paralela y masiva a las técnicas
de Northern y Southern blot; las sondas son inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la
muestra no se marca con isótopos radioactivos, en su lugar se usan colorantes fluorescentes
que pueden detectarse por un escáner.
Los microarreglos pueden ser divididos en dos tipos principales, los cuales difieren en su
construcción y en el número de condiciones que se pueden monitorear en cada caso:
a) Microarreglos de spots de cDNA u oligonucleótidos, los cuales también se conocen
como microarreglos de dos colorantes y permiten comparar dos condiciones en la
misma laminilla.
b) Microarreglos de oligonucleótidos de alta densidad, los cuales sólo permiten
monitorear una condición por arreglo.
Experimento de microarreglos:
a) Diseño del microarreglo. Selección del tipo y cantidad de material biológico que se va
a inmovilizar sobre la superficie, que variará en función del tipo de experimento que se
desee llevar a cabo. Determinar la número de sondas que se desean inmovilizar sobre
la superficie del chip, que se verá limitada por el método de fabricación que se desee
emplear.
b) Fabricación del arreglo. Determina la densidad de integración que se puede lograr en
un microarreglo.
c) Extracción y marcado del RNA de cada una de las muestras. Los procesos a seguir son
la extracción y purificación del material a analizar, amplificación en el caso de material
genético y marcaje de la muestra.
d) Hibridización, en el arreglo, de los cDNAs marcados. Reacción de afinidad en la que se
hibridan las hebras de DNA de las muestras marcadas para permitir su posterior
identificación, con sus complementarias inmovilizadas en la superficie del
microarreglo. El lavado se realiza para eliminar las interacciones inespecíficas que se
dan entre la muestra y el material inmovilizado o la superficie del arreglo.
e) Lectura del arreglo.
f) Cuantificación de la imagen. Localización de los puntos en la imagen y la obtención de
sus intensidades de fluorescencia. Análisis de imágenes de 16 bits, puntos en los que
la reacción de hibridación ha sido positiva y los puntos en los que no ha habido tal
hibridación.
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TRANSFORMACION GENETICA
Es la alteración genética de una célula que resulta de la introducción y expresión de material
genético externo (DNA). Dentro de los mecanismos empleados se encuentra la competencia
natural, en la que Algunas bacterias (cerca del 1% de todas las especies) son capaces de
incorporar de manera natural, ADN bajo condiciones de laboratorio; y muchas más pueden ser
capaces de hacerlo en sus ambientes naturales. Estas especies traen un conjunto de
maquinaria genética específica para llevar el ADN a través de la membrana o membranas.
Mientras que la competencia artificial no está codificada en los genes celulares. Sino que es
inducida por procedimientos en el laboratorio, en donde las células son convertidas en
permeables de forma pasiva, a través de condiciones que normalmente no ocurren en la
naturaleza.
SILENCIAMIENTO DE GENES
La interferencia por ARN, ARN de interferencia o ARNi, es un proceso de silenciamiento génico
mediado por moléculas de ARN. Es característico de células eucariotas y tiene gran
importancia en procesos de desarrollo y diferenciación celular, cáncer y defensa frente a virus.
Actualmente numerosas técnicas de biología molecular empleadas en investigación básica y
terapia se basan en este proceso. Por tanto que el silenciamiento génico es un término general
que describe la epigenética procesos de regulación génica. El silenciamiento génico término se
utiliza generalmente para describir la "desconexión" de un gen por un mecanismo distinto de
la modificación
genética.
Existen varios tipos
de silenciamiento
génico:
silenciamiento
génico
transcripcional,
post-
transcripcional del
gen silenciador,
silenciamiento
génico meiótica
(figura-8).
Tanto que los ARN de interferencia al ser son pequeñas molñeculas (de 20 a 25 nucléotidos)
que se generan por fragmentación de precursores más largos. Se clasificar en tres grandes
grupos: siRNA, ARN interferente pequeño, Son moléculas de ARN bicatenario perfectamente
complementarias de aproximadamente 20 o 21 nucleótidos con 2 nucleótidos desemparejados
en cada extremo 3'. miRNA, microARN, se generan a partir de precursores específicos
codificados en el genoma, que al transcribirse se pliegan en horquillas (hairpins)
intramoleculares que contienen segmentos de complementariedad imperfecta. piRNA, ARN
Figura-8. Comparación de las estrategias de silenciamiento de genes.
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asociados a Piwi, se generan a partir de precursores largos monocatenarios, en un proceso que
es independiente de Drosha y Dicer; estos ARN pequeños se asocian con una subfamilia de las
proteínas 'Argonauta' denominada proteínas Piwi.
El silenciamiento génico conlleva a estudios específicos como puede ser en:
El silenciamiento de la transcripción:
Genómica de impresión de datos
Paramutation
Silenciamiento de trasposon
Silenciamiento de trasgen
silenciamiento génico transcripcional
posición del efecto
Dirigida por metilación del ADN del ARN
Post-transcripcional del gen silenciador:
ARN de interferencia
Meiótica silenciamiento de genes:
Transvección
Meiótica silenciamiento de ADN no apareados
Componentes celulares de silenciamiento de genes:
Las histonas
Cromatina y heterocromatina
MicroARN
siRNA
dsRNA
Dicer
Los transposones
Dentro del campo de aplicación del silenciamiento de genes se basa en el desarrollo de
valiosas características nuevas para las plantas y los animales del ganado; así como en el
desarrollo tecnologíco para combatir las enfermedades en plantas, animales y seres humanos.
TERAPIA GENICA
Terapia génica es el tratamiento de una enfermedad mediante la introducción de un nuevo
gen en una célula. El nuevo gen se puede utilizar para sustituir una función que está perdiendo
debido a un gen defectuoso. Los investigadores pueden utilizar uno de varios métodos para la
corrección de genes defectuosos:
Un gen normal se puede insertar en un lugar no específico en el genoma para
reemplazar un gen no funcional.
Un gen anormal puede ser cambiado por un gen normal a través de la recombinación
homóloga.
El gen anormal puede ser reparado a través de mutación inversa de selectiva, que
vuelve el gen a su función normal.
La regulación (el grado en que un gen es activado o desactivado) de un gen en
particular podría ser alterado.
La terapia genética se puede clasificar en los dos siguientes tipos:
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Línea germinal la terapia génica
En el caso de la terapia génica germinal son modificados por la introducción de genes
funcionales. Por lo tanto, el cambio debido a la terapia sería hereditaria y se transmite a las
generaciones posteriores. Este nuevo enfoque, en teoría, debe ser altamente eficaz en la lucha
contra los trastornos genéticos y enfermedades hereditarias.
Terapia génica somática
En el caso de la terapia génica somática, los genes terapéuticos se transfieren a las células
somáticas de un paciente. Cualquier modificación y efectos se limitarán a cada paciente sólo, y
no serán heredadas por la descendencia del paciente o de generaciones posteriores.
Los factores efectivos de la terapia genética están mediados por la naturaleza de la terapia al
ser permanente para cualquier condición, mejor respuesta inmune ante enfermedades, etc.
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