UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRSFACULTAD DE INGENIERAINGENIERA AMBIENTALGESTIN II/2013

INGENIERA BIOQUMICAPRQ-216 L

INFORME DE PROYECTO

DETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL RUMENDE LA VACA QUE DEGRADAN CELULOSA

Docente: M. Sc. Ing. Virginia Rojas Mercado

Estudiantes: Aguilar Coria Ximena Gabriela Marin Antezana Katherine Stephanie

Fecha: 4 de Diciembre

INFORME DE PROYECTODETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL RUMEN DE LA VACA QUE DEGRADAN CELULOSA

1. ANTECEDENTES

La celulosa es el principal componente de la pared celular de los vegetales, es el elemento ms abundante de la biomasa terrestre, y es uno de los materiales ms utilizados por el hombre desde los tiempos remotos. Esta fibra natural, es utilizada como materia prima para la fabricacin de diversos objetos de uso cotidiano, por lo que se producen grandes cantidades de residuos con este material; se estima que la biosfera recibe hasta 1015 toneladas anuales de celulosa en forma de desechos biolgicos.La celulosa no es digerible ni aprovechable por el hombre, sin embargo, los rumiantes que son animales fibrosos, pueden digerir grandes cantidades, gracias a la accin de microorganismos como bacterias y hongos presentes en el rumen. Estos microorganismos son capaces de degradar los componentes fibrosos, principalmente celulosa, hemicelulosa y pectina, a travs de diferentes mecanismos, que de manera efectiva los convierte en compuestos sencillos como cidos grasos y alcoholes.El aislamiento e identificacin de microorganismos, con actividad celuloltica representan un importante recurso, para la disminucin del impacto ambiental producido por los residuos vegetales, y la generacin por medio de stos residuos, de productos fermentables como el etanol, que podra convertirse en un biocombustible.Siendo una gran contribucin para el desarrollo sostenible de los biocombustibles, a travs del aprovechamiento de residuos.

2. OBJETIVO

2.1. Objetivo General:

Aislar las principales bacterias del rumen de bovinos procedentes de mataderos del departamento de La Paz que degradan celulosa.

2.2. Objetivos Especficos:

Obtener muestras de rumen bajo condiciones estriles para posteriormente utilizarlas como punto de partida de este proyecto. Preparar y utilizar agares especficos para el aislamiento de los microorganismos objetivo. Aislar los microorganismos a partir del rumen de vaca para causar una mayor degradacin de aserrn.

3. JUSTIFICACIN

Actualmente en el mundo se procesa una gran cantidad y diversidad de residuos de celulosa, como resultado de actividades en la agricultura y la industria. Entre los residuos con alto contenido de celulosa encontramos los generados por explotacin forestal como el aserrn y de explotacin agrcola como la quinua, estos residuos a pesar de ser altamente estables y poseer un gran potencial energtico, no tienen uso alternativo a gran escala.Los mtodos actuales de disposicin de los residuos forestales, el largo periodo para degradarse y el inadecuado manejo, generan un alto impacto en el ambiente.Lo mencionado anteriormente, es un importante argumento para el desarrollo y estudio de alternativas, que permitan identificar mtodos para degradar y aprovechar la celulosa de los residuos. El uso de microorganismos con actividad celuloltica, constituye una opcin viable en la solucin de la problemtica de los residuos vegetales no aprovechados.

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Toma de muestras

Las muestras de lquido ruminal se recolectarn en envases estriles de 50 ml. y jeringas de 20 ml. Se recolectaran en forma aleatoria cuatro muestras de lquido ruminal fresco evitando tocar las paredes del estmago y trasladadas inmediatamente al laboratorio del IIDEPROQ.

4.2. Diagrama de Flujo

El aserrn debe tener un tamao menor a 2 mm.Segn especificaciones anterioresEn tubos ependorfEn tres envases esterilizados de 100ml. Directamente del estmago del vacuno.

Introducir las cajas Petri a la bolsa y sellar bienSolo aquellas que presenten crecimiento, si fuese as esperar 24 horas ms

5. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales

CANTIDADMATERIALCARACTERSTICA

20Caja Petri

1Incubadora

1Termmetro de Mercurio0-100 C

1Esptula

1Varilla de Vidrio

3Matraz Erlenmeyer con tapa rosca500 ml

1Matraz aforado250 ml

2Matraz aforado100 ml

1Vidrio reloj

5Vasos de precipitado100 ml

1Recipiente hermticamente cerrado

2Cepillos

1Hornilla Elctrica

2Pipeta graduada10 ml

2Pipeta graduada1 ml

1Autoclave

1Garrafa

1Piseta

1Balanza elctrica

10Tubos ependorf15 ml

1Centrifugadora

Reactivos

REACTIVOS

alcohol

Agua destilada

Aserrn

Agar- Agar

cido ctrico

Bicarbonato de sodio

Muestras de lquido de Rumen de Vaca

Triptosa

Cloruro sdico

Infusin de corazn

Agua peptonada

Papel filtro

6. CRONOGRAMA

ACTIVIDAD

l23456789

JVSDLMMJV

Obtencin del lq. ruminal

Filtrado del lq. ruminal y esterilizacin.

Esterilizacin del aserrn

Esterilizacin de tubos

Preparacin del agar

Incubacin del medio de cultivo

Aislamiento de las cepas obtenidas

Incubacin de cepas aisladas en cajas Petri con papel filtro

Determinacin de la masa del papel filtro 1 da

Determinacin de la masa del papel filtro 1 da

Determinacin de la masa del papel filtro 1 da

COLORDA

Trabajo

Das no hbiles

Das de incubacin

7. VARIANTES DEL PROCESOPrimera etapa de aislamiento Los cambios que se realizaron en la preparacin del medio fueron:Para la preparacin de 250 ml de medio se utilizaron los siguientes reactivos en las siguientes relaciones:

ReactivoMasa utilizada (g)

Infusin de cerebro y corazn9.25

Triptona0.185

Agar-Agar1.0

NaCl0.0925

Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante 15 minConjuntamente se autoclabaron 50 g de aserrn en un embase separado.

Preparacin del inoculoPara la preparacin del inculo se tomaron muestras del lquido ruminal de vaca, provenientes del altiplano (La Paz, Oruro, de 3 animales, estas muestras fueron tomados en frascos de vidrio color mbar previamente esterilizados.Las muestras tomadas se mantuvieron a temperaturas de 20 C en frascos hermticamente cerrados durante 3 das, pasado este tiempo se procedi a centrifugar con la ayuda de tubos Eperndorf a 250 rpm durante 15 min. El lquido obtenido libre de slidos suspendidos se utiliz como inoculo.

Volumen del inoculo (ml)10 ml

Preparacin del CO2Para obtener un medio anaerobio se utilizaron las siguientes cantidades de los compuestos:Reactivocantidad

cido ctrico3.46 g

Bicarbonato de sodio4.54 g

Agua destilada20 ml

Segunda etapa de aislamiento

Los cambios que se realizaron en la preparacin del medio fueron:Para la preparacin de 150 ml de medio se utilizaron los siguientes reactivos en las siguientes relaciones:

ReactivoMasa utilizada (g)

Infusin de cerebro y corazn3.5

Triptona0.162

Agar-Agar0.7999

NaCl0.0112

Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante 15 minSe procedi tambin a la preparacin de los papeles filtro para nueve cajas petri en vez del aserrn como fuente de celulosa. Preparacin de Agua PeptonadaPara la segunda etapa de aislamiento se inocularon los m.o. hallados a profundidad, y para enjuagar los mismos se realiz la toma de muestra con agua peptonada de la cual se utiliz las siguientes cantidades:Para un volumen de 100 ml:

ReactivoMasa utilizada (g)

Agua Peptonada1.5

8. CLCULOSDATOS OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE Primera etapa de aislamientoCantidades del medio y del aserrn utilizados por caja petri:

ReactivoCantidad Utilizada

Volumen de medio25 ml

Masa de aserrn1 g

Solo 6 cajas petri tuvieron resultados Segunda etapa de aislamientoLas cantidades utilizadas de medio y agua peptonada por caja petri:

ReactivoCantidad Utilizada

Volumen del medio16 ml

Volumen de Agua peptonada10 ml

Las masas de los papeles filtro colocados en cada caja al inicio y despus de la incubacin fueron:

# de Caja PetriMasa inicial del papel filtro (g)Masa final del papel filtro (g)T (d)

10,80460,80461

20,92400,92281

30,80260,80212

40,81740,81652

50,82710,82712

60,73250,73253

70,84140,83703

80,89840,89803

90,89160,89123

PROCESAMIENTO DE DATOS En la segunda etapa se puede ver que la masa consumida de celulosa fue:

# de Caja PetriMasa inicial del papel filtro (g)Masa final del papel filtro (g)Masa consumida (g)

10,80460,80460

20,92400,92280,0012

30,80260,80210,0005

40,81740,81650,0009

50,82710,82710

60,73250,73250

70,84140,83700,0044

80,89840,89800,0004

90,89160,89120,0004

9. RESULTADOS Primera etapa: Foto 1. Medio de cultivo inoculado

Foto 2. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr

Foto 3. Caja Petri despus de la incubacin

Foto 4. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr. que presenta m.o. de color blanquecino

Segunda etapa:El promedio de lo consumido por el microorganismo en funcin del tiempo es:

t (d)Masa de celulosa promedio (g)

10,0006

20,0005

30,0013

Grfica 1. Masa de celulosa consumida versus tiempo de incubacin.

10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Primera etapa de Aislamiento:Como se podr apreciar en las fotos 4 y 2 se puede apreciar levemente la presencia de microorganismos de color blanquecino, de forma esfrica los cuales se encuentran en superficie, de las 10 cajas Petri sembradas con el lquido ruminal solo se pudo detectar en 6 la presencia de microorganismos, las restantes 4 no presentaron variacin alguna despus de la inoculacin como se podr apreciar en la foto 3, la cual es idntica a la fotografa 1. Segunda etapa de aislamiento:Como se podr apreciar en los datos obtenidos la variacin de las masas de los papeles filtro por tiempo se tiene los siguientes resultados:

Primer daEn el primer da se realiz la medicin de la masa de papel de 2 cajas petri en las cuales se pudo apreciar que en la primera caja no hubo consumo alguno de celulosa del papel filtro, mientras que la segunda caja petri si hubo consumo de de celulosa.

Segundo daEn el segundo da se realiz la medicin de la masa de papel de 3 cajas petri, pudindose apreciar en las primeras 2 un consumo de masa pequeo, menor que al del primer da, y en la ltima caja no se tubo consumo de celulosa.

Tercer daEn el tercer y ltimo da de incubacin se pudo aprecia una cala petri sin cambio de masa del papel utilizado como fuente de celulosa, y en las restantes tres cajas se pudo apreciar un cambio de masa del papel en dos de ellas menores a los resultados de los anteriores das y en una de ellas un consumo bastante alto en comparacin con los dems datos.

11. CONCLUSIONES Para la primera etapa de aislamiento de microorganismos se logr separar un tipo de microorganismos esto se evidenci por la formacin de burbujas en el agar, la turbidez del medio, y por la leve identificacin de m.o. blanquecinos. Sin embargo no se obtuvo la presencia de los m.o. en todas las cajas petri inoculadas slo en 3 de estas. Para la segunda etapa de aislamiento de microorganismos se evidenci el leve consumo de celulosa contenido en el papel, sin embargo se pudo apreciar que la masa consumida por los mismos fue baja y en algunos casos nula. Tambin se pudo notar que en la segunda etapa, algunas de las cajas petri no presentaron crecimiento alguno de m.o. esto debido probablemente a la falta de algn nutriente en el medio, o en este caso a la falta de CO2 puesto que la inoculacin se realiz a profundidad y no en superficie sin contacto con CO2.

12. RECOMENDACIONES Se pudo apreciar que la presencia de ciertos componentes o la falta de otros en el medio puede afectar el crecimiento y desarrollo de los m.o. Un factor muy importante a tomar en cuenta es la temperatura de incubacin y el pH del medio a utilizarse, en nuestro caso las temperaturas de incubacin fueron bajas por lo cual el desarrollo de los microorganismos en algunos casos fue nula. Si se desea utilizar como fuente de celulosa aserrn es aconsejable que este se encuentre lo ms finamente molido y se recomienda tamizar para obtener una mejor fuente de celulosa.

13. BIBLIOGRAFA

Bravo Mara Amparo. (n.d.). Bacterias Anaerobias (Versin Digital). Universidad del Cauca. Facultad de Ciencias de la Salud.

Mateo-Snchez Jos, Cobos-Peralta Mario A., Trinidad-Santos Antonio, Cetina-Alcal Vctor, y Vargas-Hernndez Jess. (2002.). AISLAMIENTO DE BACTERIAS RUMINALES DEGRADADORAS DEL ASERRN. Obtenido el 14 de Noviembre del 2013 de:www.produccion-animal.com.ar Guerrero A. (2011). Aislamiento de Bacterias Ruminales degradadoras de celulosa (Versin Digital). Univesidad Politecnica Salesiana. Cuenca.