informe de practicas (recuperado)
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1. TITULO
MICROPROPAGACION IN VITRO DE PLANTULAS DE PAPAS
NATIVAS (Solanum andigenum L.) EN EL LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGIA DE LA CARRERA PROFESIONAL DE
AGRONOMIA – UTEA- ABANCAY.
2. INTRODUCCION.
El presente informe de Prácticas Pre-profesionales describe las actividades
realizadas en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Tecnológica
de los Andes, realizado desde el 7de octubre del 2013 al 31 de febrero del
2014 para cumplir un requisito académico y optar el grado de bachiller en
Agronomía.
Habiendo participado en tareas y actividades propias de la especialidad, tales
como. La micro propagación in vitro de plántulas, específicamente en la
micro propagación de plántulas de diferentes variedades de papas nativas,
aspecto que ha permitido aplicar las capacidades asimiladas durante nuestra
formación en la universidad, bajo condiciones reales de trabajo. Capacidades
que se han afianzado y en algunos casos se han mejorado.
Las prácticas se realizaron mediante la programación de actividades por
parte del personal encargado del laboratorio de biotecnología, para que las
ejecute el practicante, con supervisión y guía del mismo.
Se espera que el presente informe de práctica de a conocer en forma clara y
dinámica las experiencias vividas y logros alcanzados.
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3. UBICACIÓN
3.1. Ubicación Política:
Región : Apurímac
Provincia : Abancay
Distrito : Abancay
Centro poblado : Las Américas.
Dirección : Av. Perú N° 700
3.2. Ubicación Hidrográfica.
Cuenca : Apurímac
Sub – Cuenca : Mariño
3.3. Ubicación Geográfica.
Latitud : 13°37´56”s
Longitud : 72°53´14”w
Altitud : 2414 m.s.n.m.
3.4. Institución.
La institución en la que se realizó las prácticas es, en la Universidad
Tecnológica de los Andes, Carrera Profesional de Agronomía. Entidad a
la que pertenece el laboratorio de Biotecnología.
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4. OBJETIVOS.
4.1. OBJETIVO GENERAL.
Micropropagar plántulas in vitro de papas nativas (Solanum
andigenum L.) en el laboratorio de biotecnología de la UTEA.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Micropropagar plántulas de papa nativas de las variedades Qeqorani,
Yanasuytu, Qachunwaqachi, Amarillo Tumbay, Moro huayro,
Camotillo, Duraznillo.
Reforzar habilidades y destrezas en el manejo de equipos e
instrumental de laboratorio en la micropropagacion invitro de
plántulas de papa.
Adquirir conocimientos adecuados de Biotecnología Agricola para
utilizarlas en el campo de acción del Ingeniero Agrónomo.
5. METAS.
Las metas planteadas por el periodo de permanencia en el laboratorio de
biotecnología fueron las que se mencionan a continuación.
Propagar 1200 plántulas in vitro de variedades nativas las cuales se
conservan como material biológico dentro del laboratorio.
Mantener los equipos e instrumentos de trabajos limpios y
esterilizados para su uso constante en el laboratorio.
6. REVISION BIBLIOGRAFICA.
6.1. Historia de la Biotecnología:
Según, García (2002). La biotecnología no es nueva, sus orígenes se
remontan a los albores de la historia de la humanidad. Nuestros ancestros
primitivos iniciaron, hace miles de años durante la Edad de Piedra, la
práctica de utilizar organismos vivos y sus productos.
La biotecnología es un término que se ha dado a la evolución y recientes
avances de la ciencia de la genética. Esta ciencia se originó hacia finales
del siglo XX con el trabajo de Gregor Johan Mendel.
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"La historia realmente se inicia con las investigaciones de Charles
Darwin, considerado como el padre de la biología moderna, que
concluyó que las especies no son fijas e inalterables, sino que son
capaces de evolucionar a lo largo del tiempo, para producir nuevas
especies. La explicación de esta evolución, según sus observaciones, se
basaba en que los miembros de una determinada especie presentaban
grandes variaciones entre ellos, unos estaban más acondicionados al
ambiente en que se encontraban que otros, lo que significaba que los más
aptos producirían más descendencia que los menos aptos. Este proceso es
conocido como selección natural, y suponía la modificación de las
características de la población, de manera que los rasgos más fuertes se
mantendrían y propagarían, mientras que los menos favorables se harían
menos comunes y acabarían desapareciendo."
6.2. La papa y su conservación en el Perú:
www.peruecologico.com.pe (2012). Refiere que el Perú es el país con
mayor diversidad de papas en el mundo, al contar con 8 especies nativas
domesticadas y 2,301 de las más de 4,000 variedades que existen en
Latinoamérica. Además, nuestro país posee 91 de las 200 especies que
crecen en forma silvestre en casi todo nuestro continente (y que
generalmente no son comestibles).
Según, Álvarez y Repo (1999), el Centro Internacional de la Papa (CIP)
es la institución encargada de la conservación científica de la papa, y al
mismo tiempo lo hace con otros tubérculos y algunas raíces. Su labor se
inició en 1,971 y tiene como objetivos reducir la pobreza, aumentar la
sostenibilidad ambiental y ayudar a garantizar la seguridad alimentaria
en las zonas más pobres y marginadas.
Por ello, con el fin de lograr sus objetivos, el CIP viene desarrollando
tres formas de conservación in situ de dicho tubérculo:
1) A través de plantaciones en el campo
2) Con técnicas de cultivo in vitro
3) Por medio de la conservación de semillas
El Centro Internacional de la Papa posee el banco genético de papa más
grande del mundo, con más de 5,000 tipos diferentes, entre cultivadas y
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silvestres, y a partir de ellas desarrolla formas mejoradas para un manejo
más óptimo del recurso, sobre todo, en las regiones de montaña y,
principalmente, en los Andes. En resumen, el CIP cuenta con muestras
de todas las papas cultivadas del mundo y al menos con el 75% de las
especies silvestres.
6.2.1. Clasificación taxonómica de la papa
Según, Hawkes, (1990). La papa tiene la clasificación
taxonómica que se describe a continuación
Reino : Plantae
Tipo : Spermatophyta
Clase : Angiosperma
Subclase : Dicotiledoneas
Orden : Tubiflorineas
Familia : Solanaceae
Género : Solanum
Especie : tuberosum
Nombre Científico : Solanum tuberosum
Nombre Vulgar : Papa, patata, etc.
6.2.2. Descripción botánica:
Harris, (1978) sostiene que la papa, pertenece a la familia
Solanaceae, cuyo nombre científico es Solanum tuberosum. Es
una planta herbácea, vivaz, dicotiledónea, provista de un sistema
aéreo y otro subterráneo de naturaleza rizomatosa del cual se
originan los tubérculos.
-Raíces: son fibrosas, muy ramificadas, finas y largas. Las raíces
tienen un débil poder de penetración y sólo adquieren un buen
desarrollo en un suelo mullido.
-Tallos: son aéreos, gruesos, fuertes y angulosos, siendo a los
principios erguidos y con el tiempo se van extendiendo hacia el
suelo. Los tallos se originan en la yerma del tubérculo, siendo su
altura variable entre 0.5 y 1 metro. Son de color verde pardo
debido a los pigmentos antociámicos asociados a la clorofila,
estando presentes en todo el tallo.
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-Rizomas: son tallos subterráneos de los que surgen las raíces
adventicias. Los rizomas producen unos hinchamientos
denominados tubérculos, siendo éstos ovales o redondeados.
-Tubérculos: son los órganos comestibles de la patata. Están
formados por tejido parenquimático, donde se acumulan las
reservas de almidón. En las axilas del tubérculo se sitúan las
yemas de crecimiento llamadas “ojos”, dispuestas en espiral
sobre la superficie del tubérculo.
-Hojas: son compuestas, imparipinnadas y con foliolos primarios,
secundarios e intercalares. La nerviación de las hojas es
reticulada, con una densidad mayor en los nervios y en los bordes
del limbo.
-Inflorescencias: son cimosas, están situadas en la extremidad
del tallo y sostenidas por un escapo floral. Es una planta
autógama, siendo su androesterilidad muy frecuente, a causa del
aborto de los estambres o del polen según las condiciones
climáticas. Las flores tienen la corola rotácea gamopétala de color
blanco, rosado, violeta, etc.
-Frutos: en forma de baya redondeada de color verde de 1 a 3 cm
de diámetro, que se tornan amarillos al madurar.
6.3. Introducción al cultivo in vitro
6.3.1. Generalidades
Según, Jimenez-Gonzalez (1998a). El cultivo de tejidos vegetales o
cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en
condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño
segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles
o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre,
cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de
variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.
A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa
herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en
menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos.
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Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas
libres de patógenos; plantas homocigotos, en la producción de plantas
en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El
enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los
últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de
cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas
ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores
la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de
producción.
El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye
muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre
otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y
asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la
obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas o
transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética. Es decir que
existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la
biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos,
seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente
expresión de los genes introducidos o transgenes.
6.3.2. Cultivo in vitro de material vegetal
Muñoz (2003). Menciona que el cultivo de tejidos vegetales, es una
descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de
material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células
desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas
completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo es posible obtener
plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en
condiciones ambientales controladas.
Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se
remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento
exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la
germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de
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cultivo en condiciones asépticas y así se mantuvieron protegidas del
ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
Esta técnica tiene numerosas aplicaciones:
- Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para
especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de
extinción.Clonación de individuos de características agronómicas
muy deseables durante todo el año
- Obtención de plantas libres de virus.
- Producción de semillas sintéticas.
- Conservación de germoplasma: material de un conjunto de
individuos que representa la variabilidad genética de una población
vegetal.
- Obtención de metabolitos secundarios.
- Producción de nuevos híbridos.
- Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas
transgénicas.
- Germinación de semillas.
- Producción de haploides.
- Estudios fisiológicos diversos.
6.3.3. Bases biológicas del cultivo de tejidos, totipotencialidad
celular
Thorpe (1995) afirma respecto del proceso de transformación vegetal,
existen distintas técnicas para la transferencia de genes a las células
vegetales, siendo las principales la interacción con bacterias del
género Agrobacterium y el método de Biobalística. Una vez realizada
la transformación genética por alguno de estos dos métodos, el paso
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siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plántulas a partir
del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el
principio de “totipotencialidad celular”. De aquí la importancia del
cultivo in vitro como paso fundamental para la obtención y
regeneración de plantas genéticamente modificadas.
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible
gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen
la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de
un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células
sexuales o gametos.
Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es
característica de un grupo de células vegetales conocidas como células
meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta.
Básicamente, la reproducción asexual se puede realizar debido a que
las células vegetales poseen un mecanismo de división mitótico, al
igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas
etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica
implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo
que las mismas poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La
potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción,
epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un
organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación
alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o
completamente según las condiciones de cultivo a las que se la
someta.
Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre
medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden
dividirse dando dos tipos de respuesta:
- Una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento
tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas
denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas
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es capaz de generar órganos o embriones somáticos
(llamados así porque son estructuras similares a un
embrión pero que no se originaron por unión de gametos).
- Una respuesta morfogenética por la cual se forman
directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones
somáticos).
La primera respuesta se conoce como órgano génesis o
embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo), mientras
que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis
directa.
Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar
una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por
ejemplo el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo,
meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un
medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se
regenerará una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido
desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces u obtener embriones
somáticos para producir semillas artificiales.
Según, Villalobos y Thorpe (1991). El éxito en la propagación de una
planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular
total, es decir, que algunas células recuperen su condición
meristemática. Para lograrlo debe inducirse primero la
desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de
este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en
el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o
cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana o
peperonias mediante porciones de hojas.
Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la
respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de
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cultivo.
En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el
carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la
especie y está regulado por el balance hormonal propio y por el
estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin
embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el
agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas
vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del
crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para
conseguir la micropropagación de una planta.
6.3.4. Pasos para generar plantas a partir de explantos
aislados.
Haddad (1994) sostiene que para su aplicación es necesario ubicar e
identificar las yemas presentes en la planta madre, lo cual permitirá que
el sistema sea altamente eficiente. A continuación se describe de forma
general los pasos a seguir para su aplicación.
Este proceso incluye varias fases:
FASE 0: Preparación de la planta madre
FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia
FASE II: Multiplicación de brotes
FASE III: Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación
FASE 0: Preparación de la planta madre
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben
obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo
adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas
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madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o
varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta
en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del
fotoperíodo y de la irradiancia recibida.
FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia
Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de
los cuales se obtendrán los explantos.
Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los
fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos.
Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en
condiciones de asepsia.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar)
se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en
un medio de iniciación dentro de un bote de cultivo, para poder controlar
la sanidad y la viabilidad de los explantes.
FASE II: Multiplicación de los brotes
Durante esta fase se espera que los explantes que sobre vivieron de la
FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios
entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en
un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u
otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara
de flujo laminar.
FASE III: Elección de un medio de enraizamiento de los explantos
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente dos métodos:
Enraizamiento in vitro
Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un
medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas.
Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método
permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos
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obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es
necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la
fotosíntesis.
Enraizamiento ex vitro
Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no
necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o
vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre
de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien
desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga
una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.
Los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un
plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar
en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en
un área sombreada con "fog-system" o "mist- system".
FASE IV: Aclimatación de los explantos enraizados
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios
ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso
dependen de la aclimatación.
Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el
momento en que se extraen los explantes de los recipientes de
enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que
estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad
relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para
responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para
evitar la desecación del explante.
Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e
incrementando progresivamente la intensidad de luz.
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6.3.5. Elementos necesarios para hacer cultivo de tejidos
vegetales
Albarracín (2008), mesiona que para llevar adelante este trabajo se
necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de
esterilidad como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo
que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra
con la que se desea trabajar.
Figura
1. Flujos
laminares para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los
modelos de flujo laminar que puede usarse para preservar la
esterilidad de las muestras.
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser
sólido o líquido y que está conformado por algún agente
gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes
esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de
carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas
vegetales (ver Tabla 1), que ayudarán a obtener una planta completa o
un órgano vegetal en particular, a partir del explanto elegido (en
condiciones de esterilidad).
Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por
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mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de
coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan
más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele
variar entre pH de 5 y 6.5.
Luego, se regulan las condiciones de temperatura y de fotoperíodo
(relación de horas luz y horas oscuridad).
Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo se puede
propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales.
Por ejemplo, si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es
mayor a 1, se favorece la generación de brotes, si es menor a 1, la
generación de raíces, si es igual a 1, la formación de callos.
Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales.
COMPONENTES CARACTERÍSTICAS Y EJEMPLOS
Agua destilada Representa el 95% del medio nutriente
Fuente de carbonoGeneralmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente autótrofos y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro.
Sustancias inorgánicas
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción adecuada para la planta elegida.
VitaminasVitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras.
Hormonas y reguladores del crecimiento
Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis.Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetalesOtras: giberalinas, ácido absícico, etileno.
Mezclas de sustancias pocodefinidas
Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales.
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Materiales inertesUsados como soporte. Incluyen agar, azarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.
Adaptada del Libro Biotecnología, UNQ 2006.
6.3.6. RELACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA
BIOTECNOLOGÍA
6.3.6.1. La Micropropagación
Según, Villalobos y Thorpe (1991). La propagación de plantas in
vitro es una técnica de la biotecnología muy utilizada en
cultivos de importancia económica. Como fue mencionado
anteriormente permite cultivar células, tejidos, órganos,
semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma
rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado,
con agentes específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente
de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y en condiciones
ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (figura 6).
Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de
interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a
escala industrial.
La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro)
constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores
logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la
producción masiva de especies hortícolas, aromáticas,
medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.
6.3.6.2. Ventajas de la micropropagación
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Mejía (1994). Mensiona las siguientes ventajas:
- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
- Permite controlar las condiciones ambientales.
- Permite
estudiar
diversos
procesos
fisiológicos.
- Evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se
realiza en medios esterilizados).
- Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios
reducidos.
- Permite la obtención de individuos uniformes.
- Facilita el transporte del material.
Figura 2. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen
numerosos explantos que sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán
lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su
multiplicación. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006.
6.3.6.3. Desventajas del cultivo invitro.
Mejía (1994) indica que se requiere de personal especializado, se
requiere infraestructura y equipos especiales, La adquisición de
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productos químicos es costosa y difícil especialmente en países con
pocos recursos, Difícil de instalar laboratorios “in vitro” donde no
exista fluido eléctrico, la escasa literatura relacionada al cultivo “in
vitro” de especies forestales, difícil respuesta inicial de algunas
especies o genotipos.
Gonzales, (1998). Afirma que generalmente se requiere de 1 a 1.5
años para adecuar las condiciones a cada especie o genotipo. Los
problemas que presenta el cultivo in vitro es: la contaminación es
grave y vitrificación es una reacción de las plantas que las hace
adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un
subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos
que estén bien.
6.3.6.4. Cultivo de meristemos
Segun, Jimenez-Gonzales (1998b). En la yema apical se
encuentra un grupo de células que conforman el meristemo
apical (con un tamaño entre 0.01 y 0.3 mm). Es un tejido
embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la
planta y regenerar plantas completas.
Figura 3. Cultivo de meristemos. A partir de un meristemo aislado se
puede obtener una planta completa. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ
2006.
El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las
más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que
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esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos
patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de
enorme potencial. A partir de una yema apical se pueden obtener 4
millones de claveles en un año.
La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción
lenta o dificultosa (como las orquídeas) o acelerar la producción de
plantas bianuales.
6.3.7. CULTIVO DE CÉLULAS Y ÓRGANOS
VEGETALES EN BIORREACTORES
Radice, Silva (2004), sostiene que una vez obtenidos los callos a partir
de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una
suspensión de células. La misma puede utilizarse para generar
embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas) o puede
directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son
compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en
determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias
farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos
secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol,
algunos edulcorantes, entre otros. Los cultivos celulares se llevan a
cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de
unos pocos a miles de litros) diseñados para propiciar el
crecimiento y/o la multiplicación de distinto tipo de células y/u
órganos
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.Figura 4. Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden
establecer cultivos de células para producir compuestos de interés o para obtener
embriones somáticos y semillas artificiales, entre múltiples aplicaciones. Adaptado de
Biotecnología-UNQ, 2006.
Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores,
especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes,
que producen un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la
raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad de producto
deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por
cultivo de raíces es el paclitaxel o taxol, que es utilizado como
anticancerígeno.
6.3.8. ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN
VITRO
Según, Mejía (1994). El cultivo in vitro es muy costoso, entre otros
detalles porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos
laboratorios grandes y con mercado.
La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera
aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda
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aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas
operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.
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Figura 5. Fase de aclimatación en invernadero
6.3.8.1. Aplicaciones prácticas en el cultivo in vitro
Hurtado (1994). Mensiona que:
Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos
técnicas:
- Micropropagación de estaquillas
- Organogénesis de callos
Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
- Cultivo de meristemos
- Microinjerto in vitro
Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer
en condiciones normales.
Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos
parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se
inoculan esos parásitos o in vitro.
Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El
cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados
inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de
germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.
Prevención del aborto embrionario como resultado de
incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o
intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces
incompatibles dan abortos.
Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para
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introducir material genético, etc.
Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar
que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.
Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen
(anteras). Teniendo ventajas como la obtención rápida
de homocigotos y producción de híbridos.
6.3.9. Equipo y material necesario empleado en el cultivo in
vitro
- Autoclave
- Cámara de flujo laminar
- Medio de cultivo
- Planta
- Cámara de cultivo
Figura 6. Autoclave
Para esterilizar todo lo
que vamos a utilizar:
agua, algunos
nutrientes, material, etc.
se utiliza la olla
autoclave. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión,
pero de
mayor
tamaño,
donde
se
controla la presión y la temperatura (hasta 120º).
Figura 7. Cámara de flujo laminar.
23
La cámara de flujo laminar es donde se realizan todas las
manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un
ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.
Figura 8. Medio de cultivo.
Se verte agua y nutrientes
(hormonas) en un tubo de ensayo,
que se tapa con un tapón.
Dependiendo del material que se va a
propagar, el tubo se pone vertical o un
poco inclinado.
Figura 9. Planta.
El material vegetal de partida
puede ser del campo, pero esto
conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se
lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en
condiciones controlada para que haya menos infecciones.
Figura 10. Cámara de cultivo.
La cámara de cultivo es una
habitación de dimensiones muy
variables, en la que se controlan
las condiciones de luz, temperatura,
humedad, variación día-noche, etc.
6.3.10. Condiciones del cultivo in vitro
Gonzales y Vilca (1998). Sostienen que:
- En la cámara de flujo laminar no puede entrar material
contaminado. El problema más importante en todo el proceso del
24
cultivo in vitro son las contaminaciones.
- En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias,
como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa,
encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no
soporten altas temperaturas.
- El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre
al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente
se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que
se absorben en el filtro determinadas sustancias.
- Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles,
ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.
- El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5.5 y 6.5.
- Se necesita agar y medio sólido 0.6 – 0.9%.
- El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente
de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.
- El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en
prepararlo.
- En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz
(16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la
oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-
26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-
30ºC para plantas tropicales.
- Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también
influyen determinadas características de la planta, como el tipo,
genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más
adulta.
- En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de
gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un
25
aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la
planta. De ahí la importancia del cierre.
6.3.11. Subcultivos o replicado
Gonzales y Vilca (1998). Refieren que cuando sembramos
microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan raíces
ni hojas, sino que se produzca una proliferación (crecimiento) para
obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos.
No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal;
tan sólo se hace 8-10 veces.
Ocurre entonces lo siguiente:
- El medio nutritivo se agota y se seca.
- El material vegetal ocupa todo el tubo.
- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
- El medio se hace líquido.
26
6.3.12. Fases del cultivo de meristemos
Según, Gonzales y Vilca (1998). Consta de las siguientes fases:
1.Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).
2. Siembra en el medio de la magenta.
3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.
4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).
5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda
llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio,
etc.
6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.
7. Plantación en el campo.
6.3.13. Fases del cultivo de embriones
Se utiliza mucho en manzano.
1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea.
2. Se coge el embrión de la semilla.
3. Se inocula en el tubo.
4.A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.
5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.
27
6.3.14. Micropropagación
Figura 11. Se parte de una yema, bráctea o axilar y se empieza a
desarrollar en el medio de cultivo.
Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos
subcultivos (para obtener más plantas).
El número de subcultivos depende del material vegetal:
Ejemplo de micropropagación de Kiwi.
- Se parte de un trozo de tallo.
- Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.
- En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.
- Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8
semanas hasta llenar el vidrio.
- Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.
- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.
6.3.15. Cultivo de callo in vitro
Según, Liu (1981). Se parte de un trozo de hoja o de tallo, bien de una planta
madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede
ser sólido o líquido.
Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también
proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión. A partir
de entonces se desarrolla normalmente.
6.3.16. Obtención de plantas haploides
Albarracín, (2008). Refiere que normalmente se trabaja con la antera en su
totalidad, no con granos de polen en particular. No se riega nunca por
aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.
28
De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un
cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis.
- Embriogénesis: se forman células (poliembriones).
- Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien
de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).
6.3.17. Problemas en el cultivo in vitro
Figura 16. Contaminación grave.
Gonzales y Vilca (1998). Sostiene que la vitrificación, es una
reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de
vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material
sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.
29
7. MATERIALES y EQUIPOS
1. Material Vegetal
Plántulas de papa in vitro de 1 - 3 meses de edad, entre ellas tenemos
las variedades como: qeqorani, yanasuytu, qachunwaqachi, amarillo
tumbay, moro huayro, camotillo, duraznillo.
2. Material de laboratorio.
Magentas, mecheros, bandejas de plástico, pinzas, bisturí, tubos de
ensayo, servilletas desechables de papel, placas Petri, cintas plásticas,
marcador permanente, papel alumino.
3. Equipos
Agitador magnético, autoclave, balanza analítica, cámara de flujo
laminar, cámara de cultivo, cámara fotográfica, destilador, termómetro
de máxima y mínima, pH-metro.
4. Reactivos
Medio basal Murashige & Skoog mixture (MS), agar ash2 -4%, agua
destilada, alcohol al 96ºC, cloro comercial, hidróxido de sodio, etanol.
30
8. METODO.
Para la micropropagacion se usó el método de crecimiento mínimo in vitro,
que es uno de los más utilizados y constituye una alternativa de las técnicas
del cultivo de tejidos para mantener plántulas en mejores condiciones
sanitarias.
Mediante esta técnica se obtiene un estricto control sobre plagas y
enfermedades al encontrarse el material confinado en un microambiente
aséptico, también el sistema ocupa muy poco espacio y al propagarse
clonalmente permite el mantenimiento del genotipo.
9. LABORES REALIZADAS.
9.1. RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE
LABORATORIO.
MATERIALES
▪ Lapicero
▪ Hojas
▪ Cuaderno
▪ Lapiz
PROCEDIMIENTOS
Se observo a los siguientes materiales:
▪ Autoclave.
▪ Balanza Analítica.
▪ Pipetas.
▪ Buretas.
▪ Vasos de precipitación
▪ Probetas 25 y 50 ml.
▪ Cepillos de lavado de tubos.
▪ Agitador magnético para disolver medios de cultivo.
▪ Magentas de vidrio.
31
▪ Tubos de ensayo.
▪ Botellas con tapa rosca.
▪ Refrigerador.
▪ pH - metro.
▪ Autoclave de presión para la esterilización a vapor.
▪ Camara de flujo laminar.
▪ Mechero bunsen para flamear las pinzas y bisturís.
▪ Pinzas de puntas finas para la sujecciòn de los tejidos en el corte con el
bisturí.
▪ Bisturís para el corte del tejido.
▪ Agujas finas para separas meristemas.
▪ Microscopio binocular.
9.2. LAVADO DE MATERIALES DE VIDRIO Y PLASTICO
DEL LABORATORIO.
MATERIALES.
Para realizar el lavado de los materiales de vidrio en el laboratorio debemos
contar con detergente, jabón, rascabuches o cepillo de tubos de ensayo, agua,
etc.
PROCEDIMIENTO.
El lavado de los materiales se realizó usando la esponja con jabón o
detergente, siendo necesaria la utilización de una corriente de agua y un
balde para el enjuague. Se lavaron los materiales de vidrio, las Magentas,
Tubos de ensayo, Vasos de precipitación, Erlenmeyer, etc.
9.3. ASEPSIA DEL LABORATORIO MATERIALES
▪ Hipoclorito de sodio
▪ Alcohol
▪ Algodón.
▪ Detergente y jabón.
▪ Agua.
▪ Etc.
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En el laboratorio de cultivos In vitro, la asepsia es muy importante y se
realizó de la siguiente manera:
PROCEDIMIENTO
Se realizo una limpieza general de las salas de esterilización, sala de
micropropagacion y sala de crecimiento, con el uso del detergente en agua,
jabón en agua, y el uso final de hipoclorito de sodio.
Se realizó la limpieza de las repisas, pisos, ventanas, estantes, etc.
La importancia de este método radica en que:
▪ Una buena asepsia conlleva al éxito del crecimiento de las plántulas.
▪ La asepsia reside principalmente en mantener el ambiente libre de
microorganismos patogenos.
▪ Al ingresar al laboratorio se debe de usar guardapolvo para así evitar que
contaminemos el medio o la sala.
▪ La limpieza de mesas y repisas se realiza utilizando algodón empapado con
alcohol e hipoclorito de sodio para así dejar el medio libre de contaminantes
en la repisa.
9.4. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO, PLACAS
PETRI, MAGENTAS, PINZAS, BISTURI, AGUA.
La esterilización tanto del material de vidrio, material de plástico y medios
de cultivo es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo In vitro.
MATERIALES
Autoclave.
PROCEDIMIENTO
Los materiales se ponen dentro del autoclave en bolsas de polipropileno y
dejamos que se incremente la temperatura hasta llegar a los 300 grados
centígrados durante 15 min. Esta olla autoclave cuenta con un termostato que
33
regulara la temperatura y un reloj que indicara la presión a la que se
encuentra en el interior.
EL AUTOCLAVE
Es un instrumento habitual en los laboratorios, En esencia el autoclave es un
recipiente en el cual se consigue exponer a los materiales a una alta
temperatura, superiores a la de la ebullición del agua gracias al aumento de
la presión.
Debemos recordar que para la esterilización debemos de mantener un nivel
con agua destilada dentro del autoclave antes de llenar los materiales y
medios de esterilización y luego asegurar el equipo para no dejar salir el
vapor de agua. Siendo esta práctica necesaria solo cuando la temperatura
sobrepasa la adecuada. Entonces haremos necesaria la utilización de la
válvula del purgado.
FUNCIONAMIENTO
FASE DE PURGADO: A medida que la energía calienta el agua del fondo
del carderìn, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciendo salir por
la válvula de purgado este vapor caliente. Esta fase termina cuando alcanza
la temperatura adecuada de esterilización,
FASE DE ESTERILIZACION: Una ves cerrada la válvula de purgado y
alcanzada la temperatura adecuada se inicia el proceso de esterilización,
FASE DE DESCARGA: Llegado la temperatura de esterilización
controlamos 15 minutos para luego apagar el autoclave. Dejamos durante
dos horas para luego abrir la tapa y sacar todo el material del recipiente
autoclave y llevarlos al cuarto de micropropagacion.
9.5. ASEPSIA DE LA CAMARA DE FLUJO LAMINAR
MATERIALES
Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo In vitro debe
realizarse en condiciones de esterilidad total para así evitar la contaminación
34
de los materiales propagadas. Y para evitar esto haremos uso de la cámara de
flujo laminar.
PROCEDIMIENTO
La esterilidad de la cámara de flujo laminar se consigue por que circula en su
interior, aire puro y no deja ingresar aire de afuera de la cámara, para la total
esterilización se logro con una desinfección previa con papel toalla
empapada con alcohol.
9.6. DESTILACION DE AGUA
MATERIALES
▪ Destilador de agua.
PROCEDIMIENTO
La destilación del agua se lleva a cabo gracias a un destilador de agua que
viene equipado con todo lo necesario que calienta el agua contaminada y
deja salir solo el vapor de agua libre de todo contaminante. Que al pasar por
al destilador se enfria y deja caer gotas de agua destilada a un frasco
definitivo.
9.7. MICROPROPAGACION DE PAPA
MATERIALES
▪ Placas petri esterilizadas.
▪ Bisturís.
▪ Pinzas,
▪ Cámara de flujo laminar
▪ Magentas con plantitas de papa en crecimiento
▪ Materiales de desinfección.
35
PROCEDIMIENTO DE MICROPROPAGACION
Esterilizar placas Petri (colocadas en bolsas) y preparar la cámara de
flojo laminar desinfectando con alcohol las superficies internas.
Esterilizar los instrumentos con la ayuda del mechero y colocarlos
sobre una placa Petri.
Destapar la magenta, extraer la planta y colocarla sobre la placa Petri
con la ayuda de una pinza y el bisturí.
Extraer las hojas y cortar los nudos.
Destapar una magenta con medio fresco esteril y colocar los nudos en
su interior, tratando de hundirlo ligeramente en el medio y con la
yema hacia arriba.
Tapar el frasco.
Sellar la magenta con cintas plásticas y rotularlo correctamente.
trasladar los frascos a la sala de de incubación.
Siguiendo los mismos pasos se micropropagó 1200 plantas de papa entre las
variendades Qeqorani, Yanasuytu, Qachunwaqachi, Amarillo Tumbay, Moro
Huayro, Camotillo y Duraznillo.
36
Esquema del proceso de la micropropagacion de plántulas de papa.
9.8. EVALUACION VISUAL DE CONTAMINACION DE
MEDIOS DE CULTIVO Y PLANTAS IN VITRO
MATERIALES
▪ Papel
▪ Lapicero
PROCEDIMIENTO
Con la ayuda visula se realizó la evaluación de los medios y plántulas de
papa micropropagadas, encontrándose muy pocos magentas contaminados
pero un alto porcentaje de magentas con plántulas sanas y con crecimiento
rápido de las yemas.
37
10. RESULTADOS.
Se propago 1200 plantulas de papas nativas entre las variedades
(qeqorani, yanasuytu, qachunwaqachi, amarillo tumbay, moro
huayro, camotillo, duraznillo), que servirá como material biológico
para la conservación y propagación de estas variedades, que se
muestran en el cuadro con sus cantidades correspondientes.
VARIEDADES CANTIDADES MICROPROPAGADAS
Qeqorani 200 plantulas
Yanasuytu 250 plantulas
Qachunwaqachi 200 plantulas
Amarillo tumbay 100 plantulas
Morohuayro 300 plantulas
Camotillo 100 plantulas
Duraznillo 50 plantulas
Total 1200 plantulas
se logro mantener en optimas condiciones de asepsia tanto el
ambiente del laboratorio como de los equipos y materiales, para lo
38
cual se realizaba la desinfección y/o esterilización inmediatamente
después de su uso.
11. CONCLUSIONES.
Las prácticas realizadas en el laboratorio de Biotecnología de la
UTEA, me permitieron reforzar conocimientos, habilidades y
destrezas en el manejo de equipos, instrumentos y principalmente
conocer y aplicar métodos de micropropagacion in vitro de papas
nativas que servirán como material de conservación y propagación de
las diferentes variedades micropropagadas.
El cultivo in vitro es una tecnología que nos brinda muchas
oportunidades en la micropropagación de plantas, en especial en
producir plantas madres optimas para su propagación, ya que cuenta
con un control estricto para su propagación.
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12. RECOMENDACIONES.
Se recomienda a los alumnos de Agronomía realizar prácticas en el
Laboratorio de Biotecnología de la UTEA, ya que es importante tener
una visión integral de la carrera para llegar a ser mejores
profesionales.
La UTEA debiera destinar un mayor presupuesto al Laboratorio de
Biotecnologia ya que es fundamental ampliar el laboratorio e
implementarlo con el material necesario para poder recibir mayor
cantidad de alumnos de todas las carreras.
40
13. BIBLIOGRAFIA.
1. Albarracín, H. 2008. Módulo de Trabajo Métodos Biotecnológicos.
UNIVERSIDAD PRIVADA JOSE CARLOS MARIATEGUI,
Moquegua-Perú. 73 pp.
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42
14. ANEXOS.
FOTOGRAFIAS.
LABORES REALIZADAS EN EL LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA.
Fot. 01 Extraccion de plántulas de la magenta a la placa Petri para su diseccion.
Fot. 02. diseccion de nudos e introducción en el medio de cultivo solido.
43
Fot. 03. Introducción de nudos al medio de cultivo.
Fot. 04 y 05. Evaluación de los cultivos in vitro de papa
44
Fot. 06 y 07 Esterilización de medios de cultivo
45
46