“AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIÓN”

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA AMBIENTAL

PRÁCTICA Nº 10

“INFLUENCIA DE XENOBIOTICOS EN LA INTEGRIDAD DEL ADN”

FACULTAD

INGENIERÍA AMBIENTAL

CURSO

BIOQUÍMICA AMBIENTAL

INTEGRANTES

CAMACLLANQUI HUAMANLAZO, ALEX

CANCHARI MADUEÑO, FRANKLIN IGNACIO

CORAHUA MITMA GIOVANA FANNY

JACAY INGA, JHAIRO ROONY

MEDINA SOLANO, MARCO ANTONIO

TURNO

10:00 am - 12:00 pm

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INTRODUCCION

En el transcurso de los últimos 150 años el hombre ha fabricado muy diversos compuestos químicos con objeto de satisfacer las necesidades crecientes del desarrollo tecnológico y mejorar su calidad de vida. Desde el inicio de la revolución industrial, se estiman en más de 120,000 las sustancias químicas de nueva síntesis (xenobioticos) y los subproductos derivados de éstas producidos por la actividad humana, censo que se incrementa día a día y que parece no tener fin si se considera que se incorporan a la lista cerca de 2.000 nuevos compuestos cada año (Olea y Fernández 2001). Uno de ellos es el plomo que utilizaron a ciudad romana sin pensar que se estaban dañando ellos mismos, tanto así que produjeron daños en el material genético.

La degradación de los ecosistemas muchas veces se dan por estos xenobióticos producidos por el hombre ante las necesidades de combatir contra organismos que afectan su entorno, por ejemplo las aplicaciones de grandes cantidades de pesticidas en zonas agrícolas contribuyen a la presencia de sustancias tóxicas en el medio ambiente. Estos productos químicos pueden encontrar su camino en los depósitos de agua, arroyos y ríos, lo que produce un impacto adverso en la vida acuática.

Lo que veremos en la práctica es como el acetato de plomo inhibe el normal desarrollo de las células en las plantas a través de la parte radicular y lo podremos visualizar a través de la electroforesis.

MARCO TEÓRICO

ELECTROFORESIS

Según Somma y Querci (2008): la electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico, teniendo como finalidad la separación, identificación y purificación de fragmentos de ADN que se presentan de rápida ya que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos.

XENOBIOTICOS Y SU ACCIÓN EN EL DNA

El plomo Pb es un xenobiótico inorgánico que se encuentra en el grupo de los metales pesados: Mn, Co, Pb, Zn, Fe, Cd, Cr, As, Ni, Se, Hg, Be; ya que xenobiótico es toda sustancia ajena o extraña a los seres vivos.

Los efectos que generan los xenobióticos se pueden dar a nivel genético como y como consecuencia entre su interacción produciendo así rupturas en los genes o los procesos de formación no llegan a concluirse por su intervención para ver lo que realmente como sucede se hace uso de la electroforesis, donde los pequeños fragmentos de DNA migraran al polo opuesto por atracción.

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Los compuestos sintéticos (Acetato de plomo) tienen estructuras moleculares o secuencias de enlaces químicos no reconocibles por los microorganismos, éstos son los llamados xenobióticos. (Schwarzenbach y col., 1993) , estos compuestos orgánicos pueden ser parcialmente metabolizados o pueden ser recalcitrantes ya que es análogo a los aromáticos clorados los cuales tienes sustituciones especiales o estructuras complejas que son resistentes a la biodegradación por lo tanto representan una fuente de contaminación ambiental. Los compuestos xenobióticos que usualmente son resistentes a la degradación por especies biológicas individuales, pueden mineralizarse por secuencias catabólicas complementarias, que se llevan a cabo entre múltiples especies microbianas, en donde la transformación inicial es por metabolismo (proceso en que una sustancia puede ser biodegradada en presencia de una fuente secundaria de carbono). (Fritsche, 1985).

El acetato de plomo como comercialmente se conoce, es un compuesto dañino ya que afecta tanto a la salud dependiendo su concentración debido a que el plomo es metal pesado y en plantas según investigaciones de Lerda (1992) que encontró que el Pb reduce el crecimiento radicular y la frecuencia de células mitóticas, y el incremento de la frecuencia de células aberrantes en A. cepa. La intensidad del efecto está en función de la concentración del Pb. La vegetación ejerce un papel importante en la contaminación de la cadena alimenticia ya que, pueden acumular trazas de elementos tóxicos o peligrosos que pueden ser transferidos al hombre o a los animales (Muñoz, 2007).

PROBLEMÁTICA

La contaminación de suelos por metales pesados como el plomo es un problema de alcance mundial, el cual involucra a la agricultura; es decir aquellos vegetales como la cebolla (usado en el experimento) sufrirán alteraciones en su DNA por efecto del plomo y La hiperacumulación de metales pesados en plantas no solo está inducido a que la planta esté contaminada, sino que también el hombre puede contraerlo por medio de la dieta de estos productos. Los principales daños provocados por xenobióticos pueden ser: bloqueo de la capacidad transportadora de oxigeno de la hemoglobina, irritación de tejidos y la interferencia en el ADN.

A esta problemática se puede determinar cuánto está fragmentado el DNA y ese quiebre de DNA se puede hace mediante electroforesis, el cual los resultados tendrían significancia para ver el efecto del acetato del plomo en el DNA.

OBJETIVO

Determinar que plomo inhibe el normal desarrollo de las células en las plantas en la parte radicular y lo podremos visualizar a través de la electroforesis, determinando la integridad de la molécula de ADN.

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MATERIALES

Raicillas de cebolla Agua destilada Acetato de plomo Tubos de micro-centrifuga Cuchara-espátula Pinzas de reloj Cámara electroforética

horizontal

Buffer Tris pH 7.4 Tips amarillos y azules Pipetas descartable Micro-pipeta 100μL Micro-pipeta 1000 μL Tritón X-100 Lauril Sulfato Bisturíes

PROCEDIMIENTO

EXPERIENCIA Nº1:

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

1. Colocamos una cebolla sobre un beaker de 250mL con agua de grifo, 4 días previos al desarrollo de la práctica. Seguimos las mismas indicaciones para la preparación de una muestra control. Muestra de cebolla (Allium cepa) en un medio de raíz flotante.

2. Agregamos 100mL de solución de Acetato de plomo 10mM en la Muestra Problema dos horas previas al desarrollo de la práctica.

3. Cortamos los ápices de 5 raicillas (meristemos apicales) y colocamos en tubos de micro-centrífuga (Control y Muestra Problema).

4. Trituramos las raicillas hasta obtener una muestra homogénea.

5. Agregamos una gota de Lauril Sulfato y una gota de Triton X-100

EXPERIENCIA Nº2:

ELECTROFORÉSIS EN GEL DE AGAROSA

1. Preparamos dos placas Porta-objetos con gel de agarosa 0.5%, con mucho cuidado mantuvimos en cada una de ellas un espacio en uno de los extremos donde colocamos la muestra.

2. Colocamos cada homogenizado en las placas con agarosa y sellamos.3. Introducimos las placas en la cámara electroforética cuidando que se

encuentren en el extremo negativo.

RESULTADOS

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Nº 6 es el tratamiento de nuestro grupo y Nº 7 es control utilizado en el experimento.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

De acuerdo a los resultados de electroforesis en nuestro experimento, el tubo control (Tubo Nº 7) presenta una mayor concentración de DNA que no ha migrado hacia el polo positivo, debido a que el DNA no está fragmentado en partículas pequeñas haciendo que sea difícil su migración. Según Posso (2009) dice que: “La velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas por: concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis”. Entonces el resultado que se obtuvo esta regulado por la alta concentración de agarosa que disminuirá la velocidad de migración del DNA fragmentado; como también el bajo voltaje disminuirá la velocidad de migración.

Los metales pesados (Acetato de plomo) poseen una gran capacidad para unirse con muy diversos tipos de moléculas orgánicas. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) también resultan afectados por los metales pesados. Efecto genotóxico que puede ser catalogado en las siguientes en: mutaciones genéticas y aberraciones cromosómicas. Para el experimento el ácido nucleico fue el ADN el cual se ha visto afectado por metales pesados, siendo en el gen en donde se producen los cambios.

El tubo tratamiento ( Tubo Nº6) representa una mayor velocidad de separación del DNA fragmentado, 4 fragmentos notorios y otros no muy asimilables a simple vista. La trituración es el que ha favorecido a que migren los fragmentos de DNA, ya que mientras mas frgmentemos el DNA, mayor será la migración de esta, la imagen muestra lo dicho.

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La electroforesis es un método importante utilizado para determinación de DNA fragmentado, proteínas y otros, que su estudio y aplicación determinan ciertos efectos relacionados al gen; y ya han realizado estudios Noris et al (2012), en el cual analizan: los niveles séricos de plomo, el daño del ADN y la severidad del autismo, en el cual el daño del ADN fue estimado por el ensayo cometa (Electroforesis alcalina de células individuales).

Las raíces de Allium cepa en tratamiento con el acetato de plomo, es una simulación de la cebolla en el suelo con contenido de plomo y que esta afectará principalmente en las raíces por encontrarse en constante crecimiento radicular y mayor frecuencia de células mitóticas. “La contaminación de los suelos por plomo es un problema importante a nivel mundial por su impacto negativo en la agricultura” (Bocanegra et al, 2012).Los vegetales lo absorben del suelo, pero es el pesticida que se les agrega el que contiene plomo. (Mönckeberg, 2002), que una vez absorbido por las raíces de las plantas, causa efectos fitotóxicos (Bautista, 1999).

CONCLUSIONES

La parte fundamental del presente trabajo realizado fue poder experimentar los efectos que produce los metales pesados en el material genético, y comparar estos resultados con los teóricos. Para ello tuvimos que extrapolar los datos teóricos en un pequeño procedimiento realizado a una muestra vegetal (cebolla), del cual podemos concluir y afirmar ciertos enunciados:

Si bien es cierto que el método de la electroforesis viene hacer un técnica que detecta los fragmentos de ADN o sitios donde han ocurrido procesos incompletos de la replicación del ADN, sin embargo no podemos afirmar a ciencia cierta que esta técnica es 100 % segura en poder explicar que la causa fundamental de una mala duplicación del ADN u otras aberraciones como la mutación o la formación de micro nucléolos en la mitosis sea producto de la interacción del acetato de plomo con el mismo material genético, ya que para llegar a una afirmación mucho más acertada deberíamos tomar en cuenta la expresión genotípica de los genes, es allí donde podemos apreciar claramente los efectos de este contaminante tóxico, pero viéndolo desde un punto de vista preventivo la técnica electroforética tienen criterios favorables para poder ser usada.

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Ahora con respecto a nuestro presente trabajo concluimos que los datos obtenidos siguieron o se encuentran en los mismos parámetros teóricos, sin embargo como mencionabas líneas a tras debemos considerar que los datos obtenidos tienen un cierto grado de incertidumbre ya que no podemos descartar que en el momento de hacer el trabajo mecánico para poder liberar el material genético hayamos fragmentado a este, y teniendo en consecuencia rompimiento mecánico de cadenas simples o de bajo peso molecular, el cual pudieron alterar nuestros resultados con un insignificante grado de error.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué los xenobióticos afectan la integridad del ADN?

Traavick menciono lo siguiente “Existe xenobioticos con propiedades y actividades biológicas que hacen pensar que existen por lo menos dos tipos diferentes de impactos posibles sobre el destino del ecosistema. Algunos xenobiotico pueden actuar como mutágenos. Los mutágenos pueden hacer que el ADN desnudo se escape o se libere con su secuencia o estructura cambiada. Esto a su vez puede influir en la capacidad de células y organismos de asimilar ADN, la transferencia horizontal y el establecimiento a largo plazo en los ecosistemas de formas que son totalmente impredecibles para nosotros. Se ha sabido de casos los que han ocurrido cambios menores en una secuencia de ADN que altera el expectro de un elemento genético transferible a de un huésped

Como ya se ha comentado en otros temas, muchos Xbs (en su mayoría carcinógenos) actúan en el organismo mediante la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) o a través de la formación de aductos con las proteínas y con el ADN. La formación de aductos requiere la existencia de grupos electrofílicos (deficientes en electrones) en el Xb (ó carcinógeno) y de centros nucleofílicos (ricos en electrones) tales como grupos amino, sulfhidrilo, hidroxilo, presentes en otras moléculas (proteínas, ARN y ADN). Estos aductos distorsionan la estructura de las proteínas y/o ácidos nucleicos y, por tanto, su función o replicación en su caso. En el caso del ADN, normalmente el daño producido puede ser reparado, pero si no lo es, se introduce una base inapropiada en la nueva cadena de ADN, lo que originaría una mutación.

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REFERENCIAS:

1. Bautista, F. (1999). Introducción al estudio de la contaminación del suelo por metales pesados. Universidad Autónoma de Yucatán, México. 22-35p

2. M. Somma, M. Querci (2008): Electroforesis en gel de agarosa; Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos extraído (09-06-2015) de: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf

3. Schwarzenbach R.P., Gschwend P.M. e Imboden D.M. (1993). Reacciones transformaciones biológicas. En: Ambiental Química Orgánica. pp. 491-494. Publicación Wiley-Interscience E.E.U.A

4. Noris E., M. Robinso A.,Pérez A.. (2012). Niveles de plomo y daño en el ADN en niños con trastornos del espectro autista. Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología, 1, 2.

5. Bocanegra, M., Alfaro, C., & Garcia, F. (. (2012). Sorcion de plomo por cultivos vegetales in vitro con diferente grado de adaptación a la sequía. Universidad Autónoma de San Luis de Potosí, 1, 217-223.

6. Posso, D. (2009). ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA. Disponible en: http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Electroforesis%20de%20ADN%20en%20geles%20de%20agarosa.pdf

7. Mönckeberg, F. (2002). La Amenaza del Plomo. Creces, 1, 1.8. Lerda, A. (1992). Anyons: La mecánica cuántica de partículas con

estadísticas fraccionarios (Vol. 14). Springer Science y Business Media.9. Olea, N., Fernández, M. F., & Martín-Olmedo, P. (2001). Disruptores

endocrinos: el caso particular de los xenobióticos estrogénicos. I Estrógenos naturales.

10.Alexanian, R., Barlogie, B., & Fritsche, H. (1985). Beta2 microglobulin in multiple myeloma. American journal of hematology, 20(4), 345-351.

11.Muñoz, N (2007). Determinación de plomo y cadmio en hierbas medicinales. Disponible en: http://www.ub.edu.ar/investigaciones/tesinas/275_Tesina%20Munoz.pdf

12.Traavik, T. (2000) peligro del ADN desnudo y el ácido Nucleico Libre pp 29-31 . Informó a la Dirección de Gestión de la Naturaleza, Noruega

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