hplc
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HPLC
Jesús Anzano
Copyright-2002-J.A.
Esquema de separación en cromatografía líquida
N, número de platos teórico .
GENERALIDADES
Introducción de muestras
• Inyección directa• No es necesario que las muestras sean muy solubles en la fase móvil • Rara es la vez en la que se produce descomposición de la muestra • Algunas veces se inyectan derivados de la muestra. • Poca preparación de la muestra• Muestra inyectada: ng-2 mg
Columnas
• Columna: 25-50 cm• Diámetro interno de columna: 2-5 mm• Diámetro de partícula: 5-15 µm
Mecanismos de reparto
Tipo Fase estacionaria Fase móvil Aplicaciones ADSORCIÓN Gel de sílice Hexano, cloroformo, isopropanol Eteres, esteres, vitaminas
Alúmina Hexano, cloroformo, isopropanol AminasREPARTO:Fase Normal Amino Hexano, cloroformo, isopropanol Azucares, nitroderivados
Ciano Hexano, cloroformo, isopropanol Nitroderivados, aminoácidosFase inversa Dimetilsilano Agua, acetonitrilo, metanol Aminas,fenoles, vitaminas
Octilsilano Hexano, cloroformo, isopropanol Aceites, esenciales, esteroidesINTERCAMBIO IÓNICO:Intercambiador fuerte de cationes Ácido sulfónico Na2HPO4 Aminoácidos
Intercambiador fuerte de aniones Amonio cuaternario Na2HPO4 Nucleótidos
Intercambiador débil de aniones -NH2 H3PO4 Colorantes, carbohidratos
EXCLUSIÓN Gel acuoso Agua Proteínas, péptidos,
Gel orgánico Cloroformo, THF PolímerosGel de sílice THF, alcoholes, agua Compuestos biológicosVidrio poroso Hexano, cloroformo, isopropanol Compuestos biológicos
Instrumentación en HPLC
Columnas
Características de los detectores
Detector Límite de detección(masa)
Absorbancia 100 pg-1ngFluorescencia 1-10 pgElectroquimico 10 pg- 1ngIndice de refracción 100 ng-1µgConductividad 500 pg-1ngEspectrometría de masas 100 pg-1 ngFT-IR 1µgDispersión de luz 10µg
ACOPLAMIENTO HPLC-EA
- La conexión entre CL y un ICP es bastante fácil
- El caudal de aspiración de las muestras es compatible con el caudal de los eluyentes cromatográficos líquidos
- W. SLAVIN: formación de una gota la salida del eluyente cuando éste alcanza un determinado tamaño (100 mL) se desprende y cae sobre un micro-embudo de teflón conectado directamente al nebulizador.
INTERFASES
• Conexión sencilla• Dilución del analito.• Los ompuestos termolábiles, se descomponen• Posible obturación de la interfase. Interfase con cinta transportadora móvil Interfase con formación de un termosprayInterfase con ionización a presión atmosféricaIntroducción directa