instrumentación de hplc

7/28/2019 Instrumentacin de HPLC

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Instrumentacin de HPLC


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En esta seccin aprender lo siguiente:

Acerca de los sistemas de reparto de disolvente de HPLC.

Cmo funcionan los muestreadores.

Acerca de los detectores de HPLC habituales.


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3

El principio Un ejemplo

Descripcin general de la instrumentacinde HPLC

Muestreador

Mezclador

Columna

Detector

Disolventes

Bombas

Detector

Compartimento

de las columnas

Muestreador

Bomba cuaternaria

Desgasificador de vaco

Cabina de disolventes

Mdulo de control


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Funciones del sistema de reparto de disolvente

El sistema de reparto de disolvente tiene tres funciones bsicas:

1. Ofrecer un flujo constante y preciso.

2. Ofrecer composiciones de fase mvil precisas.3. Ofrecer la fuerza necesaria para empujar la fase mvil a travs

de la columna bien rellena.


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Vlvula de gradiente multicanal

Determina la composicin de la fase mvil. El tapn de disolvente de mayor tamao se llena

primero. La bomba cuaternaria 1100, 1090 PV5 y 1050.


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Bomba de dos pistones en serie

El primer pistndesplaza el disolventeal doble de velocidad

que el segundopistn.

Proporciona un flujoconstante y la presinnecesaria paradesplazarse por la

columna.


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Formacin de gradientes

Gradiente de baja presinGradiente de alta presin


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Resumen

La bomba es la pieza ms importante del equipo para conseguir unbuen funcionamiento de la HPLC.

Parmetros de rendimiento para bombas de HPLC: Precisin de flujo Rango de flujo Volumen de retardo Pulso de presin Precisin de la composicin


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Muestreadores

Requisitos:

Introduccin reproducible del volumen de la muestra en el flujo dela fase mvil.

Dos diseos principales:Muestreadores automticos o muestreadores manuales


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Muestreadores manuales

Entradade la

muestra

Entrada del

disolventeSalida del

disolvente

Carga de la muestra

Inyeccin de la muestra

Desde la bomba

A la columna

Entrada de

la muestra

Entrada del

disolvente

Salida del

disolvente

Desde la bomba

A la columna

Muestreador

Mezclador

Columna

Detector

Disolventes

Bombas


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Muestreadores automticos

Paso 1 Paso 2

Paso 3


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Sistema de inyeccin automtica

Tratamiento previo con sistema de inyeccin automtica:

Muestra Reactivo

ReactivoDispositivo

de medida

Unidad de

muestreo

Vlvula de 6 puertosDesde la bomba

A la columna

A residuos


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Horno de columnas

Es necesario que la columna y el disolvente tengan una temperaturaconstante para conseguir resultados reproducibles.

Tiempo de retencin

Da Da

Noche

Tiempo de retencin con horno - temperatura constante

Tiempo de retencin sintemperatura estable

Nmero de anlisis


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Detectores habituales de HPLC

UV-VIS 65%RI LS 10%

Electro 10%

FLD 8%

MS

Radioactividad

ConductividadLC/IR


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Necesidad de ms de un detector - Sensibilidad

El PAH se extrae de la tierra;Sup. LC-PAH 159 x 4,6 mm;Disolv.: H2O/CH3OH = 10:90

Fluorescencia

Seal UV

WL

241/394

WL

270/388

WL

248/411

WL302/420

WL

247/504

Tiempo (min.)


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18

Necesidad de ms de un detector - Selectividad

Flecainida en suero

Concentracin teraputica: 1,8 mg/l, 20 ul inyectado

Seal de fluorescencia y UV

Seal FL

Seal UV

Tiempo (min.)


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Necesidad de ms de un detector Informacincualitativa

Informacin cualitativa

Tomar un espectrode pico (UV)

Clorotoruln?

4468

58

96 132 138158

172

215

200

Tomar un espectro depico (MS)

104

Masa/Carga

Atrazina?

Longitud de onda (nm)

60 80 100 120 140 160 180 200 220


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Ruido del detector - Deriva

El ruido es la amplitud de todas las variaciones aleatorias de laseal del detector.

La deriva es la pendiente media de la envolvente del ruidoexpresada en AU/h.

Tiempo

Absorbancia

60 minutos

Deriva

Ruido


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Lmite de deteccin - Lmite de cuantificacin

El lmite de deteccin (LOD) es un resultado de todo el sistema decromatografa, no slo del rendimiento del detector.

El lmite de cuantificacin (LOQ) es un lmite definido de un mtodoutilizado para un fin especfico.

Rango lineal

Pendiente = sensibilidad

MQL

MDL

Respuesta

Cantidad

Interseccin

por ejemplo, RSD 20

Por ejemplo, S/N >3


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Detectores de UV-VIS

b

c

Celda de flujo del detector

I0 I

Log I0 = A = abcI

Principios: La fraccin de luz transmitida a travs de la celda del

detector est relacionada con la concentracin del soluto, segn la leyde Beer.

Caractersticas: Especfico, sensible a la concentracin, buenaestabilidad, capacidad de gradiente.

Especial: Capacidad espectral UV-VIS (tecnologa de matriz de diodos).


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Detector de UV-VIS con capacidad de espectros

Gracias al detector UV-VIS de matriz de diodos, es posible realizar medidas deespectros en lnea. Rango de longitud de onda de 190 - 900 nm. Resolucin de longitud de onda: hasta 1 nm. Calibracin de longitud de onda con filtro de xido de holmio.

Matriz de diodos

Red de difraccinRejilla ptica

Celda de flujodel detector

Filtro de holmio

Lentes acromticas

Lmpara de UV

Lmpara de VIS


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28

Espectros en lnea - Detector UV-VIS

Longitud de onda

Tiempo

AbsorbanciaEspectros


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Representacin grfica de la isoabsorbancia

La longitud de onda de

adquisicin se puedeoptimizar en funcin delos espectros almacenados.

Lo

ngitud

deond

a


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HPLC prctica


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31


Cmo instalar un sistema de HPLC para realizar una inyeccin demuestra, incluidos los siguientes aspectos:

Manipulacin del disolvente

Preparacin de la fase mvil

Cebado del HPLC

Manipulacin de la columna - Equilibrio

Comprobacin del rendimiento del sistema


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Manipulacin del disolvente

Caractersticas del disolvente (especificaciones): Pureza Viscosidad ndice de refraccin

Punto de ebullicin Toxicidad Transparencia de UV/lmite de UV Solubilidad


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Miscibilidad del disolvente

Nombre

cido acticoAcetonaAcetonitriloBenceno

Alcohol butlicoTetracloruro de carbonoCloroformoCiclohexanoCiclopentanoDicloroetanoDiclorometanoDimetilformamidaDimetil sulfxidoDioxinaEtilacetato

Alcohol etlicoDietileterHeptanoHexano

Alcohol de metiloMetiletilcetonaI-OctanoPentano

I-Alcohol proplico

TetracloroetanoTetrahidrofuranoToluenoTricloroeteno

AguaXileno

Dipropileter

Inmiscible

Miscible

2-Propanol es unexcelente disolventeintermedio


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Lmite de UV del disolvente/Transparencia

Disolvente Lmite de UV (nm)

Acetonitrilo 190

Agua 190

Ciclohexano 195

Hexano 200

Metanol 210Etanol 210

ter dietlico 220

Diclorometano 220

Cloroformo 240

Tetracloruro de carbono 265

Tetrahidrofurano 280 (220)

Tolueno 285

El lmite de UV es la longitud deonda en la que la absorbancia esigual a 1, medida en una celda de1 cm con aire como referencia.


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Preparacin de la fase mvil

Pasos principales:

Medir el volumen apropiado de cada disolvente Mezclar los disolventes Aadir los tampones y los aditivos* Filtrar la fase mvil Desgasificar la fase mvil


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Cebado del sistema de HPLC

Detector

Muestreador

Disolventes

Mezclador

Bombas


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Almacenamiento dela columna

Evitar causar cualquier dao fsico a lacolumna

Cerrar ambos extremos para evitar quese seque

Guardar la columna bienenjuagada con el disolventeadecuado

Registrar el historial de la columna


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Instalacin de la columna

Cada columna tiene una direccin de flujo definida. La direccin del flujo es la que indica la flecha, o la direccin del texto

escrito en la columna. No cambiar la direccin del flujo, ya que disminuir el rendimiento de la

columna.

Detector

Muestreador

Mezclador

Disolventes

Bombas


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39

Equilibrado de la columna

Equilibrar con fase mvil

No presionar en exceso la columna.

De 5 a 10 volmenes de columna para equilibradode fase inversa.

Garantiza resultados reproducibles.


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Comprobacin de la columna

Las columnas nuevas deben incluir un certificado derendimiento.

Cada uso adicional deber documentarse, incluyendo: Retropresin

Fase mvil Temperatura Tipo de muestra Condicin de almacenamiento (disolvente)

En base a ese historial, la columna se puede comprobar

con una mezcla de compuesto definida.


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Cuidado y manipulacin de la columna

Lavar la columna despus de usarla con disolventesseleccionados; eliminar de la columna los componentesde la muestra fuertemente retenidos.

No guardar la columna en 100% de agua. Podrn desarrollarsemicrobios y obstruir la columna.

No abrir la columna y volver a empaquetar el material si sedesea mantener el rendimiento.

Utilizar la columna a su velocidad de flujo ptima - evitarvelocidades de flujo elevadas.

No utilizar slice o fases enlazadas durante largos perodos auna temperatura elevada. Mantener el pH de la fase mvil en un rango apropiado para la

columna.


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Repaso

1. Est realizando un anlisis rutinario cuando se da cuenta de quese produce una perturbacin peridica en la lnea de base. Lalectura de la presin flucta hacia arriba y hacia abajo. Qu

ocurre? Cmo lo corregira?


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Repaso

2. Ha decidido realizar un anlisis de fase inversa en un instrumento dellaboratorio. El operador anterior no indica los disolventes utilizados

por ltima vez en el instrumento. Pone agua en el canal A y enciendela bomba. No puede conseguir una lnea de base estable. Plantee cul

es la causa posible de este problema.


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45


Qu factores influyen en la resolucin entre los componentesde las muestras.

Cmo influyen en la resolucin el factor de capacidad (factorde retencin), la selectividad y la eficacia.

Cmo mejorar las separaciones.


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La principal preocupacin del cromatgrafo:la resolucin entre los picos cromatogrficos

to

tRA

mAU

tiempo

tRB

tRB - tRAR = 2

wA + wB

R = 1,176tRB - tRA

w1/2A + w1/2B

R = Resolucin

tRA = Tiempo deretencin, componente A

tRB = Tiempo de

retencin, componente B

w = Ancho en la base

w1/2=Ancho a mitad dealtura


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Para reas de picos iguales, un valor R de1,5 ofrece separacin de la lnea de base.

0,4 0,50,6 0,7

0,8 1,00 1,25

Valores de resolucin

Calcular la resolucin entre el primer


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48

Calcular la resolucin entre el primery el segundo pico cromatogrfico

min1 2 3 4 5 6

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)

0

.747

1.

022

2.

569

5.

849

Respuesta_________

E i d l i f d l l


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49

N: Nmero total de platos tericos disponibles; eficacia de la columna

k: Factor de capacidad (factor de retencin), la funcin de retencindel pico

La separacin relativa de los picos; la funcin de selectividad

CapacidadSelectividadEficacia

R = 1/4 N x xk'

1 + k'- 1

Ecuacin de resolucin fundamental para laelucin isocrtica

F t d l l i


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50

Factores de la resolucin

Americas' Technical Center (Centro tcnico de Amrica)

Capacidad

Selectividad Eficacia

C id d R t i


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51

Capacidad-Retencin

Inyectar

O

t - t ORt

=k'

tO

tR2

tR1

El factor de capacidad (factor de retencin) escaracterstico de un compuesto especfico en unacomposicin de fase mvil, a una temperatura y en untipo de columna determinados.

El factor de capacidad compensa los efectos de lasdimensiones de la columna y la velocidad de flujo.

El factor de capacidad es igual al nmero de moles enla fase estacionaria dividido por el nmero de moles enla fase mvil.

SelectividadEficacia

R = 1/4 N x - 1Capacidad

xk'

1 + k'

Ef t d l id d l l i


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Efecto de la capacidad en la resolucin

R

k

0 2 4 6 8 10

Rangoideal de k

Los cambios en k'tienen poco efecto en la

resolucin

Los cambiosen k' tienenel mayorefecto

12 14 16

Capacidad

k'1 + k'

La utilizacin de la retencin para aumentar la resolucin es ms eficazcuando k se encuentra entre 0 y 5.

C id d C i i d l f il


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Capacidad - Composicin de la fase mvil

Composicin del disolvente ms dbil

60% acetonitrilo40% agua

Tiempo (min.)

2 4 6 8 10

mAU

mA

U

Composicin del disolventems fuerte

Tiempo (min.)

80% acetonitrilo

20% agua

2 4 6 8 10

La manera ms importante de cambiar lacapacidad de un pico cromatogrfico es cambiarla composicin de la fase mvil:

Cuando aumenta la fuerza de la fase mvil,disminuye el factor de capacidad de los

eluyentes. En lo que respecta a la fase inversa, un

aumento del 10% orgnico hizo disminuir elvalor de k' en cada pico cromatogrfico en unfactor de 2 o 3.

S l ti id d


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54

Selectividad

SelectividadEficacia

R = 1/4 N x - 1

Capacidad

x k'1 + k'

= kBkA

= 1,1 =1,4 =1,8

Composicin de lafase mvil

Fase mvil pH de la fase mvil

Temperatura de la columna Efectos qumicos - Aditivos Fase estacionaria

P t f t l l ti id d


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55

DISMINUCIN AUMENTO

Disolventesms dbilesDisolventesms fuertes

IPA/Agua MeOH/AguaACN/Agua

Fase estacionariaorgnica alta

C-2

C-18

Fase estacionariaorgnica baja

Se sobrecargafcilmente

No sesobrecargafcilmente

Cambio de composicinde la fase mvil

Cambio de la faseestacionaria

Parmetros que afectan a la selectividad

C bi d f t i i


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Cambio de fase estacionaria

1. Met Encefalina2. Leu Encefalina3. Angiotensina II4. Neurotensina5. Insulina (BOV)6. Cadena de insulina B7. Citocromo C

8. Mioglobina9. Calmodulina10. Anihidrasa carbnica

Tiempo (min)

ZORBAX 300 SB-CN, SB-C3, SB-C8, SB-C18(4,6 x 150 mm, P/N:883995.905, 883995.909, 883995.906, 883995.902)

Fase mvil: 15-53% en 20 min.A: 5:95 ACN:Agua con 0,10% de TFA (v/v%). B: 95:5 ACN:Agua con 0,085% de TFA (v/v%)

Inyeccin 10 l, 2-6 g proteina (en 6M guanidina HCI, pH 7.0), 1,0 ml/min., 35 C, detect. UV (215 nm)Proporcionado de Loretta A. Sandoval

Efecto del termostato de la columna en la


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57

Efecto del termostato de la columna en laseparacin

40 C

65 C

100 5

Tiempo enminutos

A B

AB

100 5

Ajuste de la temperatura de la columna


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58

Ajuste de la temperatura de la columna

1/T (K)

Citocromo C

Insulina (BOV)

RNase

Uso de la temperatura para mejorar la resolucin


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59

Uso de la temperatura para mejorar la resolucin

108

9

300 SB-CN

8

9

10

300 SB-C3

8

9

10

8

9

10 60 C35 C Mejora de laresolucin

Eficacia


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60

Respuestadel

detector

Inyectar

Tiempo

Alta eficacia

Baja eficacia

CapacidadSelectividadEficacia

R = 1/4 N x xk'

1 + k'- 1

Eficacia

Clculo de la eficacia


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61

Clculo de la eficacia

t R

W

Wi/2

TiempoB

Inyectar

N = 162

tRwB= 5,54 tRW1/2

2 =2 hptRA2

HETP = LN

N = Eficacia; Nmero de platosHETP = Altura equivalente a unaplaca tericaL = Longitud de columnahp = Altura de pico

A = rea de pico

Calcular la eficacia


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62

Calcular la eficacia

min1 2 3 4 5 6

mAU

0

50

100

150

200

250

300

DAD 1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)

0.

747

1.

022

2.

569

5.

849

Respuesta____________

Velocidades de flujo tpicas


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63

Velocidades de flujo tpicas

4,6 1-2

3,0 0,4-0,8

2,1 0,2-0,4

1,0 0,05-0,09

d.i. mm (partculas de 5 um) ml/min

velocidad de flujo2 =

d.i.2d.i.1

2

velocidad

de flujo1

Rendimiento mejorado con columnas


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64

mAU

0

1020

30

mAU

0

10

20

30

min0 1 2 3 4 5 6 7 8

mAU

0

10

20

01576S1.PPT

Zorbax SB-CN

F = 1,06 min

F = 1,54 min

F = 2,03 min

GC A

T

LC: HP1090

Columnas: 4,6 x 150, 5 MFlujo: 1,0 ml / min.A: 0,1% TFAB: 97,5% MeOH:

2,5% H2O (0,1% TFA)Temp.: 30 CDetec.: 254 nm

Rendimiento mejorado con columnastradicionales utilizando velocidades de flujoaumentadas

Aumento de la resolucin


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65

Aumentar k'

Aumentar laselectividadAumentar la eficacia

Aumento de la resolucin

Ejercicio


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66

t0

Inicial

Variacin?

Aumento?

Aumento?

t

Ejercicio

Describir qu componente dela ecuacin de la resolucinse ha cambiado en cada caso:N, k o ?.

En cada uno de los casos,qu parmetro cambiara (esdecir, composicin de fasemvil) para mejorar laseparacin inicial?

Ejercicio


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67

Ejercicio

El anlisis se realiz en una columna C-8 de 100 x 4,6 mm con un d.i. de 10um. La velocidad de flujo fue de 2 ml/min con 70/30 de alcohol IPA/agua.

Enumerar las maneras de mejorar la separacin.

0 tiempo

mAU

Ejercicio


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68

Ejercicio

1. Enumerar tres maneras de aumentar la retencin del componente de unamuestra.

2. Enumerar cuatro maneras de disminuir el ancho de banda de los picos

cromatogrficos.

3. Cules de estos parmetros afectan a la eficacia de una columna? Fuerza de elucin Viscosidad de la fase mvil Tamao de partculas de la fase estacionaria Longitud de la columna Temperatura de la columna Volumen externo a la columna

El i d di t


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Elucin de gradientes



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70


En qu consiste el proceso de elucin de gradientes y cules sonsus ventajas.

Cmo optimizar una separacin de gradiente.

Consideraciones prcticas para establecer separaciones degradientes.

El problema general de la elucin


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El problema general de la elucin

Resolucin defectuosa de los picosque antes eluyen.

Aumento del ancho de pico ydescenso de la altura de pico en los

picos que eluyen ms tarde.

Tiempos largos de anlisis debido aun rango amplio de valores k'. Contaminacin de columnas con

componentes de fuerte retencin.

Elucin isocrtica - La composicin de la fase mvil permanececonstante durante el tiempo que tarda la muestra en eluir.

Elucin de gradientes - Solucin A


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72

Elucin de gradientes Solucin A

Elucin de gradientes - Lacomposicin de la fase mvil cambiadurante la separacin. Ventajas

Resolucin mejorada Mayor deteccin

Capacidad para separarmuestras complejas Tiempos de anlisis ms cortos Disminucin del deterioro de la

columna debido a loscomponentes retenidos confuerza

Otros usos Limpieza de la columna Anlisis de exploracin en el

desarrollo de mtodos

Separacin de gradiente de polipptidos


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73

1 2 3

4

56

7 8

0 2 4 8 10 12 14 16 18 206Tiempo (min.)

Columna: ZORBAX 300SB-C3

5 m, 4,6 x 150 mmGradiente: 15-35% B en 19 min.Fase mvil: A: 95:5 H2O:ACN

con 0,1% de TFAB: 5:95 H2O:ACN

con 0,085% de TFA

1. Leucin a Encefal ina2. Angiotensina3. RNasa A4. Insulina5. Citocromo C6. Lisozima

7. Mioglobina8. Anihidrasa carbnica

Caractersticas de gradientes Se utilizan dos disolventes para desarrollar el

gradiente La fuerza de elucin aumenta con el tiempo Tener en cuenta la forma del gradiente Tener en cuenta la inclinacin del gradiente

Qu ocurre durante el anlisis de un gradiente?


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74

Qu ocurre durante el anlisis de un gradiente?

%O

rg

0

25

50

75

100

0 10 20 30

Tiempo (min)

k'

Aumento del % de modificadororgnico

Cambio de particin a fase mvil

Aumento de la velocidad delcompuesto

A li i tit ti


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Anlisis cuantitativo



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76


Los principios del anlisis cuantitativo.



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77


En la cuantificacin se utilizan tresprincipios diferentes:

Calibracin de patrn externo Calibracin de patrn interno Adicin de patrn %rea %Norm

1

23

4

5

Tiempo

6

Cantidad de compuesto 5?

R

e

s

pu

e

s

t

a

Calibracin de patrn externo


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Ca b ac de pat e te o

Calibracinde 3 niveles

Respuesta

Cantidad

3 concentraciones

La calibracin de tres niveles es un requisito mnimo parademostrar la linealidad de la curva de calibracin

DMRFRespuestaCantidad xxMuestra =)(

instrumentación de hplc

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