Herramientas y técnicas de Ingeniería Genética

LIGACIÓN DE ADN

VECTOR: Moléculas transportadoras que transfieren y replican

fragmentos de ADN que llevan insertados.

LIGACIÓN DE ADN

T4 Ligasa liga extremos cohesivos y romos Necesita ATP y Mg++

Relación molar vector:inserto Temperatura óptima Cantidad de enzima Inhibición por alta sal y EDTA Se inactiva a 65 ºC 10 min Buffer ligasa ¡siempre frio!!!

ADN LIGASAS

Ligasa del bacteriófago T4. Requiere ATP y Mg2+. Extremos cohesivos y romos. dsDNA o dsRNA.

Ligasa de E. coli. Requiere NAD+.

La eficiencia de ligación depende de:

La cc absoluta de ADN: La cc debe ser lo suficientemente alta para asegurar que la ligación intermolecular esté favorecida sobre la auto ligación pero no demasiado alta que cause la formación de oligómeros.Por ej. para vectores pET…1 nM, 50-100 ng vector en 20 μl de reacción

Relación inserto/vector. La máxima eficiencia de ligación se obtiene en general usando una relación molar de inserto/vector=2

Estrategia de clonado

Clonado dirigido

Plásmido recombinante

Clonado no dirigido

¿Qué hacemos para que el vector no recircularice?

Desfosforilación del vector

Vector digerido con 2 enzimas distintas y purificado por gel

Vector digerido con 2 enzimas distintas sin purificar por gel

Vector digerido con 1 enzima y desfosforilado

Vector digerido con 1 enzima

sin desfosforilar

Masa de inserto en ng = Tamaño del inserto en pb x Masa del vector en ng Tamaño del vector en pb

Cálculo de la cantidad de inserto

¡¡¡¡Probar varias relaciones molares!!!!!

LIGACIÓN

extremos cohesivos extremos romos

ATP 5 mM 0,5 mM

Ligasa 0,1 uWeiss 50 uWeiss

ADN > cc….PEG

Unidad Weiss: cantidad de enzima que cataliza el intercambio de 32P de pirofosfato a [γ,β-32P]ATP en 20 minutos a 37ºC.

ADN PolimerasasTemplado: ADN

E. coli ADN Polimerasa I (y fragmento Klenow)

T7 ADN Polimerasa

ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc.)

Templado: ARN

Transcriptasas Reversas

cebador o primer

E. coli ADN polimerasa I

E. coli ADN polimerasa I

(109 KDa)

5’→ 3’ ADN polimerasa

5’→ 3’ exonucleasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

Proofreading activity = lectura de prueba

*Verifica nucleótidos después de ser añadidos.

*Permite eliminar nucleótidos desapareados en extremos 3’ y generar extremos romos .

ADN polimerasa I*No deseable en muchos casos por su actividad 5´ 3´ exonucleasa porque degrada el extremo 5´de primers y remueve 5´P de extremos a ser ligados

Fragmento de Klenow de la E. coli ADN polimerasa I

5’→ 3’ DNA polimerasa5’→ 3’ DNA polimerasa3’→ 5’ exonucleasa3’→ 5’ exonucleasa

Fragmento Klenow de laE. coli ADN polimerasa I

(68 KDa)

5’→ 3’ ADN polimerasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

* Síntesis de la 2a hebra en ADNc

* Fill in o marcación de extremos 3´recesivos de ADNdc

* Marcación de ADN por el método random primer

* Secuenciación de ADN por el método de Sanger

* Mutagénesis sitio específica con oligonucleótidos sintéticos

ADN polimerasas: Klenow y T4

T7 ADN Polimerasa

-Carece de actividad exo 5’-3’. Modificable química o genéticamente para eliminar actividad exo 3’-5’ SequenaseTM)

- Muy procesiva: muy útil en secuenciación de ADN (Sequenase™) por el método de Sanger.

T7 ADN polimerasa I

5’→ 3’ DNA polimerasa

3’→ 5’ exonucleasa (“Proofreading activity”)

ADN transferasa terminal

•Adición de nt’s al extremos 3’ del ADN:

- ANDcs (incluyendo extremos 3’ protuberantes de ADNcd). - Añade también homopolímeros de nucleótidos al extremo 3’ de ADN- Con menor eficiencia en extremos romos y recesivos

Utilidades:

• Marcación de los extremos 3' del ADN

•Añade colas de homopolímero al ADN

ADN transferasa terminal

Nombre 3'->5‘ Exo Origen Propiedades

Taq No Thermus aquaticus Vida media a 95º C 100 min. Alta tasa de error (10-4 a 2.10-5 por pb)

Pfu Sí Pyrococcus furiosus Baja tasa de error. 1-2.10-6 por pb)

Vent (Tli) Sí Thermococcus litoralis Vida media a 95º C aprox. 7 horas

Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC. (Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC)

Muy utilizadas en reacciones de PCR y secuenciación de ADN

ADN Polimerasas Termoestables (Taq, Pfu, Vent, etc)

1976: Thermus aquaticus 1988: polymerase chain reaction (PCR)

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase.Science. 1988, 239(4839):487-91

ADN polimerasas dirigidas por ARN

Codificadas por retrovirus (Moloney murine leukemia o Avian myeloblastosis)

Dos actividades:

ADN polimerasa:in vivo copia sólo RNA, pero in vitro puede usar ssRNA o ssDNA (siempre necesita cebador de RNA o DNA)

RNase H: Ribonucleasa que degrada RNA en híbridos RNA-DNA, como los formados durante la transcripción reversa (exo y endonucleasa)

Usos:

- generación de cDNA- RT-PCR

Híbrido DNA-RNA5’ 3’

5’ 3’

Transcriptasas reversas

Enzima Exo 3’-5’ Exo 5’-3’ Capacidad de polimerización

Procesividad Error rate

(x106)

E. coli polim. I Baja Sí Media Baja 9

Frag. Klenow Baja No Media Baja 40

T7 DNA polim. (nativa) Alta No Rápida Alta <1

T7 DNA polim. (modificada) Baja/No No Rápida Alta

Taq DNA polim No SíRápida

Alta 285

Transcrip. reversa No No Lenta Intermedia

Resumen de las características de las ADN Polimerasas

MARCACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

"nick" ruptura de un enlace éster en un fosfato 5'., con la liberación de un grupo hidroxilo 3'. La DNAsa produce nicks

"gap" desaparición de una serie de nucleótidos contiguos

Marcación de ácidos nucleicos: Síntesis de ADN uniformemente marcado.

b) Random priming

+

Desnaturalización por calor(10 ºC, 10 min)

Generación de cadenas simples

3’5’ 3’5’

Unión de oligos (6-10 nt) “random”

3’5’ 3’5’

Extensión mediante Klenow

3’5’

Generación de fragmentos Marcados (150-200 nt)

a) Nick translation

Actividad exo 5’-3’ de DNA pol. I2

Corte (nick)por DNAsa I1

Incorporación dNTP marcadospor act. polimerasade DNA pol. I

3 dNTPdNTP

DNA duplex

c) Mediante PCR

dNTP EMPLEADO PARA LA MARCACIÓN:

Radioactivos:

32PαdNTP, 35SαdNTP, 125 I αdNTP

No radioactivos:

biotina-11-dUTP

digoxigenina-11-dUTP

α32P-ATP !!!

Utilidad:

1.- Marcación (p. ej. Radioactivo) de oligonucleótidos para estudios de hibridación

2.- Fosforilación de extremos 5’ no fosforilados, necesarios para ligación, de

“linkers” (adaptadores) o fragmentos de DNA.

Cataliza la transferencia de un fosfato desde el ATP hasta el extremo 5' de ADN o ARN

Comprar 32PγATP!!!!

Marcación de ácidos nucleicos: en el extremo del ADNPolinucleótido quinasa

Nick translation (DNAsa I + DNA polimerasa I).

Random priming (Klenow)

PCR (polimerasas termoestables)

Marcación del extremo 5’ (polinucleótido quinasa)

Eficiencia

Baja

Media

Alta

Alta

DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR HIBRIDACIÓN

CalorAgentes químicos

Tm: temperatura de “melting”: temperatura a la cual el 50 % de las moléculas del oligonucleótido están formando un dúplex con su hebra complementaria

Td: Temperatura de disociación: temp. a la cual el 50 % del oligo y su hebra complementaria unida a membrana están en duplex para una cc particular de sal y ADN

longitud Tm: depende de composición: AT vs GC

cc. de sales: cationes divalentes estabilizan.. Tm

agentes desnaturalizantes: urea, álcali

solventes orgánicos: formamida Tm

Métodos para determinar Tm

http://insilico.ehu.es/tm.php

Método de Wallace:para oligos de 14-20 nucleótidos, hibridación en membrana.

Td = 2°C(A+T) + 4°C(G+C) agregar 8ºC para convertir en Tm

% de GC Tm=81.5 ºC+16.6 (log10[Na+])+0.41(f% G+C)-0.63(% formamide)-(600/length)

Vecino más cercano: no para oligos > 50 nuc.

Tm= (ΔH-3,4 kcal)/((A+ ΔS)+(R ln(c/4)))-273.15 log(sal)

Δ H:sumatoria de los cambios de entalpía de los vecinosΔ S: sumatoria de los cambios de entropía de los vecinosR: cte de los gasesA: cte para sec. complementarias o no complementarias

La técnica de Southern blot

La técnica de Southern blot

Southern blot

Southern blot del gen de insulina

Southern blot del gen His4

C219 C146 GS115 C112 C27 25 C146

7.400 pb-5.800 pb-4.800 pb-

2.700 pb-

2.800 pb-

8.000 pb-

El ADN genómico de los distintos clones recombinantes (C219, C146, C112, C27 y 25) y de las levaduras sin transformar (GS115) fue digerido con la enzima BglII. La sonda empleada para determinar la presencia del gen HIS 4 corresponde a un fragmento de 1,5 Kb del mismo.

gen endógeno

(5400)

(1)

Southern blot

(1)

(5400)

ADN cortado con BglII. Sonda: AOX1

Northern Blot

Dot Blot

Dot blot

25

B28.1

B13.3

B12.1

B110.3

F36

C27

F37

Insulina GPDH

Western blot

Western blot