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Técnicas de genética molecular

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Page 1: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Técnicas de genética molecular

Page 2: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

- Detección de secuencias de ADN y ARN

- Localización de un gen

- Estructura y función de una región genómica

- Expresión génica

Se requieren métodos para trabajar con una pequeña

parte del ADN o del ARN

Técnicas de genética molecular

Page 3: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Separación de moléculas por tamaño y carga eléctrica

Permite visualizar fragmentos de ADN:

electroforesis en gel de agarosa

electroforesis en gel de poliacrilamida

electroforesis capilar

Electroforesis

Page 4: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Preparación:

Electroforesis en gel de agarosa

Page 5: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Electroforesis horizontal:

Electroforesis en gel de agarosa

Page 6: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Escaleras de fragmentos de tamaño conocido

100 pb p-GEM PhiX-HaeIII

Marcadores de tamaño molecular

Page 7: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Preparación:

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Page 8: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Electroforesis vertical:

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Page 9: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Secuenciador automático

ABI 3130

Electroforesis capilar

Page 10: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Agentes intercalantes emisores de fluorescencia en

transiluminador de luz UV

Visualización de los fragmentos de ADN

Page 11: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Bromuro de etidio (Sharp en 1973):

- molécula plana capaz de unirse al ADN

- agente carcinogénico y mutagénico.

- se une al ADN de dos formas:

- unión fuerte intercalándose entre los pares

de bases,

- unión débil, “no intercalante”, luego de que

los sitios de intercalación están saturados.

Agentes intercalantes

Page 12: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Intercalación de la molécula de

BrEt- entre dos bases contiguas en

la molécula de ADN.

Luego de la unión, la fluorescencia

del colorante a la luz UV aumenta

casi 20 veces.

Máximo de emisión del BrEt- a

595 nm.

Agentes intercalantes

Page 13: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Riesgo de exposición al BrEt: cancerígeno

Utilización de colorantes inocuos:

Sybr Green, Sybr Gold, Sybr Safe, GelRed, GelGreen.

Agentes intercalantes

Page 14: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Marcación radioactiva del ADN con 32P y

detección por autorradiografías

1 2 3 E 4 5 6 7 8 9 10

Visualización de los fragmentos de ADN

Page 15: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Nitrato de plata, con transiluminador de luz visible

Visualización de los fragmentos de ADN

Page 16: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Marcación con fluoróforos + lector láser

Visualización de los fragmentos de ADN

Page 17: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Obtención de moléculas de ADN genómico

Page 18: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Etapas generales de una extracción de ADN:

-ruptura de membranas

-digestión proteica

-purificación

-precipitación

-resuspensión del ADN

Obtención de moléculas de ADN genómico

Page 19: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Obtención de moléculas de ADN genómico

Page 20: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Sangre: • leucocitos de mamíferos (camélidos: eritrocitos

nucleados) • Eritrocitos y leucocitos de otros grupos

Page 21: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Otros fluidos corporales: • Líquido amniótico • Semen • Orina

Page 22: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Pelos: • Con folículo: ADN nuclear y mitocondrial • Sin folículo: ADN mitocondrial

Page 23: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Epitelio bucal: • hisopado de mucosa bucal • enjuague bucal • hisopado de objetos

Page 24: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Hueso: • exhumaciones • restos arqueológicos

Page 25: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Materia fecal:

Page 26: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Material vegetal: • Hojas • Semillas • Flores, etc.

Page 27: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Fuentes de ADN

• Microorganismos: • Cultivos de laboratorio • Material arqueológico (sarro dental antiguo)

Page 28: Técnicas de genética molecular · Técnicas de genética molecular - Detección de secuencias de ADN y ARN - Localización de un gen - Estructura y función de una región genómica

Obtención de ARN

Minimizar la actividad de ARNasas (¡muy estables!) - uso de material descartable libre de ARNasas - tratamiento del material de vidrio y las soluciones con DEPC 0,1% - uso de inhibidores de ARNasas (tiocianato de guanidina y agentes reductores) - trabajar rápido, en baja temperatura, con tapas cerradas - utilización permanente de guantes


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