hemoderivados (v): productos de origen recombinante

Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante

XVII Curso de Introducción a la XVII Curso de Introducción a la farmacoterapia con hemoderivados

H. Vall d´Hebron, 22 - 25 Abril 2013

Soledad RuizMarketing Manager BioPharma & Vacunas

Baxter

Es la técnica mediante la cual se aislan y

transfieren secuencias de ADN altamente

específicas (genes) de un organismo y se

¿En qué consiste la tecnología recombinante?

específicas (genes) de un organismo y se

recombinan con el ADN de otro

Productos biológicos versus productos sintéticos convencionales

FVIII: Glicoproteína con 6 dominios

Gen Factor VIII localizado en cromosoma X (Xq28)2,351 aminoácidosMW 270,000 Dalton

Aspirina

Ibuprofeno

Coagulopatías congénitas

80%80%

15% 5%5%

Producto Origen Indicación

FVIIIPlasmático

RecombinanteHemofilia A

FVIII+FVW PlasmáticoEnfermedad de von Willebrand

Hemofilia A

FIXPlasmático

RecombinanteHemofilia B

Complejo protrombina

Productos e indicaciones

Complejo protrombina activado

Feiba®Plasmático Hemofilia con inhibidor

FVII activadoNovoseven®

Recombinante

Hemofilia con inhibidorHemofilia adquiridaDéficit FVIITrombastenia de Glanzmann con anticuerpos anti-plaqueta

FXIIIPlasmáticoRecombinante

Déficit congénito de FXIII

Fuente biológica de obtención

Derivados plasmáticos Productos recombinantes

Key N S, Negrier C.The Lancet 2007

TECNOLOGÍA RECOMBINANTE

April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr.

1962

April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr. Francis Crick's discovery of the double helix. In March of 1953, after many years of attempting to understand and elucidate the DNA structure they proposed the complementary double-helical configuration. Subsequently, Dr. Watson, Dr. Crick and Dr. Maurice Wilkins received the Nobel Prize in 1962 for "their discoveries of the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material.”

1984

Técnica de hibridomas para la elaboración de anticuerpos elaboración de anticuerpos monoclonales (Köler y Milstein 1975)


- Se inicia al aislar el gen de interés

- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente

- El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante)


- Se inicia al aislar el gen de interés- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un

fragmento de DNA con capacidad para crecer de una forma independiente

- El gen se inserta en el vector, y queda integrado en él: plásmido recombinante (DNA integrado en él: plásmido recombinante (DNA recombinante)

- Se clona para obtener cantidades suficientes de DNA

- Se inserta en una célula huésped que sintetizará la proteína extraña (a ella) a partir de este DNA recombinante

Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero

Molécula ADN

Gen FvW

Cadena especial de ADN(Plásmido)

Gen Factor VIII

Célula huésped

Núcleo

Plásmido se úne al ADN de la célula huésped

Plásmido

Obtención del DNA

•Desnaturalización y centrifugación

•Extracción del RNA

Precipitación y extracción •Precipitación y extracción del DNA

Purificación del DNA

Enzimas DNA

Endonucleasas de restricción

DNA ligasa

Estructura del FVIII humano

COOH(Carboxl-Terminal)BPéptido de alto peso molecular

(Amino-Terminal) NH2A1 A2

Punto de escisión proteolítica

Cadena pesada

COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2

80 kd

90 kd

Metal++

Cadena ligera

Factor VIII se activa in vivo mediante la escisión del dominio B

Péptido de alto peso molecular(Amino-Terminal) NH2

A1 A2

Punto de escisión proteolítica

COOH(Carboxl-Terminal)B

COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2

80 kd

90 kd

Metal++

Las funciones del dominio B

• No función hemostática

• Papel en el transporte intracelular

• Favorece la secreción de factor VIII

COOH(Carboxl-Terminal)B

Dorner et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:7429-32 ; Pipe et al. JBC 1998; 273: 8537-8544 ; Kaufman et al. Blood Coagul

Fibrinolysis;1997 Dec;8 Suppl2:S3-14 ; Moussalli et al. JBC 1999; 274: 32539-32542 ; Pipe SW. Haemophilia 2009; 1–10

• Control en el plegamiento de la proteína de factor VIII

– Interacción con las proteínas chaperonas

• Revisiones recientes sobre las funciones del dominio B, destacan diferentes vías por las que la deleción del dominio B podría afectar a la actividad de FVIII en sangre

Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero

Molécula ADN

Gen FvW

Cadena especial de ADN(Plásmido)

Gen Factor VIII

Célula huésped

Núcleo

Plásmido se úne al ADN de la célula huésped

Plásmido

CHO: Chinese Hámster Ovary cells (Células de Ovario de Hámster Chino)BHK: Baby Hámster Kidney cells (Células de riñón fetal de hámster)

1er Paso: Desarrollo de una línea celular mamífera

Para sintetizar moléculas biológicas complejas, como el FVIII humano, son necesarios sistemas celulares biológicos

Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO)

• Línea celular ampliamente estudiada y bien caracterizada (no procedente de

línea celular tumoral)

• Se utiliza para producir múltiples proteínas recombinantes:

– EPO (anemia), Interferon-β1a (esclerosis múltiple), folitropina-ß (infertilidad),

Dnasa (fibrosis quística)

Koplove. Ann Hematol 1994; 68: S15-S20 Goochee et al. Biotechnology 1991; 9:1347-1355 Hotchkiss et al. Thromb Haemost 1988; 60: 255-61

• Capaz de realizar todas las modificaciones postranslacionales y

postransduccionales del Factor VIII

• Resistente a infección por la mayoría de virus humanos

(Coronavirus, Sarampión, Influenza, Herpes, Rhino viruses...etc.)

• Posibilidad de producción de grandes volúmenes a gran escala

La selección del clon celular productor de FVIII se basa en ciertos criterios clave

GD 7/8 GE 5/6 GD 8/6

... 600 clones

Programa de selección de clones (Tests)

• Homogeneidad de la población

• Producción robusta de FVIII y FvW

• Perfil de Western Blot

Células productoras de rFVIII

Inmunofluorescencia FVIII

W. Mundt, Baxter BioScience.

Clon rAHF-PFM

Nutrientes necesarios para mantener las células vivas:

Azúcares

Sales

Aminoácidos

Vitaminas

Selección del Medio de Cultivo Celular

Aditivos que ayudan al crecimiento celular:

Suero ternera fetal 1950s

Insulina, albúmina, aprotinina, transferrina (bovina) 1990s

Albúmina humana e Insulina recombinante finales 1990s

Medio vegetal, sin proteínas humanas (ADVATE) 2004

Evolución

Características de los concentrados actuales de FVI IIr

Utilización de proteínas derivadas de plasma humano

Biosíntesis en cultivo

celularPurificación Formulación

PrimeraPresente Presente Presente

GeneraciónPresente Presente Presente

Segunda Generación

Presente Presente Ausente

TerceraGeneracion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente

Desarrollo de:

-Bancos Celulares Maestros (“Master Cell Bank“) y

-Bancos Celulares de Trabajo (“Working Cell Bank“)

Minus 135°C

Células CHO idénticascon gen de FVIII insertado en sus genomas

Cada fermentación comienza con la reanimación de las células procedentes del Working Cell Bank

1 ml (congelado)

70 ml Incubación (37°C)

Viales del Working Cell Bank para comenzar el cultivo celular

*Las fotografías presentadas se tomaron en la planta de Baxter para la fabricación de ADVATE (Neuchatel, Suiza)

Preparación de la solución celular

Incubación a 37°C

Expansión de la solución celularIncubación en botellas rotatorias a 37ºC

Proceso de fermentación FVIII

• Los cultivos celulares crecen en las botellas rotatorias

• Al llegar a una densidad determinada, se aúnan y se utilizan para comenzar la fermentación en biorreactores

• 3 pasos de fermentación en biorreactores:

1. Biorreactor 40 l

2. Biorreactor 320 l

3. Biorreactores 2500 l (2 X)

Biorreactores

Biorreactor

40 L.Tanque con

Medio no celular

3000 L.

Biorreactor

320 L.

2 x Biorreactores

2500 L.

Proceso de Fermentación CHEMOSTAT

Medio Fresco Sobrenadante

- Densidad celular- Viabilidad celular- pH- Gasto de oxígeno- Mezclado / agitación

Medio Fresco estéril

Sobrenadante celular

cosechado continuamente

BIORREACTOR en modo

Chemostat

Monitorización constante de:

Den

sida

d de

cél

ulas

[OD

] Extracción del sobrenadante celular con factor VIII recombinante

c

Alimentación por perfusión continua

Tiempo [días]

Den

sida

d de

cél

ulas

[OD

]

1 2 3 4 5 6 180

a

b

a fase de latencia b fase logarítmica c fase estacionaria

Fase de crecimiento

Proceso de Cultivo Celular continuo y estable

Den

sid

ad C

elu

lar

Tiempo

Den

sid

ad C

elu

lar

Proceso de Alimentación por lotes Proceso Chemostat

El proceso de fabricación de FVIIIr consiste en 3 pasos principales:

1. Biosíntesis de FVIII en cultivo celular en biorreactores

2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos

3. Formulación final, llenado y liofilización

Purificación de FVIIIr mediante cromatografía (Inmunoafinidad y cromatografía de intercambio iónico)

Cromatografía de inmunoafinidad / Ligandos sintéticos

Cromatografía de intercambio catiónico

Proceso Purificación

Línea celular de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales anti-FVIII adaptada a un medio vegetal libre de proteínas

FVIII

Inactivación viral

Cromatografía de intercambio aniónico

Tratamiento solvente/detergente S/D (TNBP+TritonX-100/Tween 80)

(NF)

El eluído es congelado y almacenado a –80ºC

Para la formulación final, llenado y liofilización

Recogida del FVIIIr purificado

El “bulk“ de FVIIIr se almacena a -80°C hasta la formulación final

Llenado aséptico de viales

Liofilizadores

Llenado formulación final

Características de los actuales concentrados de FV IIIr

Utilización de material derivado de plasma humano

Biosíntesis en cultivo celular Purificación Formulación

Primera Presente Presente Presente

Primera Generación

Presente Presente Presente

SegundaGeneración

Presente Presente Ausente

TerceraGeneracion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente

LÍNEA CELULAR CHO BHK CHO CHO

MOLÉCULA FVIII FVIII COMPLETO FVIII COMPLETO BDD-FVIII FVIII COMPLETO

UTILIZACIÓN DE ALBÚMINA

SI SI NO NO

INACTIVACIÓN Y

RECOMBINATETM

3ª GENERACIÓN2ª GENERACIÓN1ª GENERACIÓN

FACTOR VIII

INACTIVACIÓN Y ELIMINACIÓN VIRAL

CROMATOGRAFÍA SD SD + NF SD

CROMATOGRAFÍA

1. Cromatografíade intercambio iónico

2. Cromatografía inmunoafinidad




2. Cromatografía con ligandossintéticos (químicos)



EXCIPIENTES

AminoácidosAlbúmina

Cloruro sódico

SacarosaAminoácidos

Cloruro Sódico

SacarosaAminoácidos

Cloruro Sódico

TrehalosaManitol

AminoácidosCloruro Sódico

Ovario de hamster chino

Cromatografía y nanofiltración

No presencia de albúmina

nanofiltración

1.Cromatografía de intercambio iónico

2.Cromatografía de inmunoafinidad por anticuerpos monoclonales murinos

Aminoácidos, sacarosa y Tween 80

FVIIa Plasmático y FVIIa Recombinante (rVIIa)

• Estructura protéica idéntica (aminoácidos, péptidos).

• Igual estructura de hidratos de carbono. • Igual estructura de hidratos de carbono.

• Propiedades ezimáticas idénticas.

Indicaciones del rFVIIa

• Registros: EU (96), USA (99), Japón (00)

• Hemofilia congénita con inhibidor

• Hemofilia adquirida• Hemofilia adquirida

• Déficit congénito de factor VII

• Trombastenia de Glanzmann

Próximos factores recombinantes en el mercado

Factor IX recombinante (FIXr)MOLÉCULA COMPLETATERCERA GENERACIÓN

BAXTER

Factor VIII recombinante (FVIIIr)DOMINIO B TRUNCADOTERCERA GENERACIÓN

NOVO-NORDISK

Factor VIII recombinante (FVIIIr)MOLÉCULA COMPLETATERCERA GENERACIÓN

BAYER

Factor VIII recombinante (FVIIIhr)TERCERA GENERACIÓN

OCTAPHARMA

Factor XIII recombinante (FXIIIr) TERCERA GENERACIÓN NOVO-NORDISK

Factor VIII recombinante (FVIIIhr)TERCERA GENERACIÓN

CÉLULAS HUMANASOCTAPHARMA

Factor VII recombinante activado (aFVIIr)

TERCERA GENERACIÓN BAXTER

Factor von Willebrandrecombinante (FvWr)

TERCERA GENERACIÓN BAXTER

Factor VIII recombinante porcino (OBI-1)

Molécula de FVIII porcina de origen recombinante

BAXTER

CRITERIOS DE UTILIZACIÓN DE LOS FACTORES ANTIHEMOFÍLICOS

(Fundación Victoria Eugenia, 2006)

Dado su perfil de eficacia y seguridad se recomienda el paso progresivodel tratamiento de la hemofilia a concentrados de FVIII o FIX de origenrecombinante, en modalidades terapéuticas habituales (a demanda,profilaxis primaria, profilaxis secundaria)

“Es particularmente importante, en temas de seguridad, que no creemos unasituación en la que pudiera peligrar la disponibilidad de derivados de plasma paraaquellos que lo necesiten”

(Goldfard B. National Hemophilia Foundation, Hemacare 2007; 12:15-22)

GUÍA TERAPÉUTICA

Retos en los factores de la coagulación

• Inhibidores

• Coste

• Adherencia

Nuevos concentrados de factores de la coagulación

• INHIBIDORES

• Coste

• Adherencia

Inhibidores

• Coppola A. Haemophilia 2010; 16 (supp 1):13-19

Inhibidores

rFVIII vs pd-FVIII

Inhibidores: Estudio RODIN

OBJ: Evaluar si el tipo de FVIII y el intercambio de productos puede estar asociado al incremento de inhibidores en PUPs con HAG

MET: Recogida retrospectiva de 75 DEsen 574 ptes HAG nacidos entre 2000-20102000-2010

RESULTADOS:

1. FVIIIr y FVIIIdp confieren igual riesgo de desarrollo de inhibidores

2. Contenido FvW y cambio entre productos no estuvo asociado con riesgo de desarrollo de inhibidor

3. Inesperadamente, los FVIIIr de 2ª gen se asociaron a un riesgo aumentado (60%), comparando con 3ª gen

Inhibidores: Consecuencias del Estudio RODIN


• Inhibidores

• COSTE

• Adherencia

Coste:

Eficiencia

• Reducción de hemorragias en 99,4% en la mediana de la TAH

• La profilaxis individualizada (pK) con FVIII 3ª gen de molécula completa redujo nº sangrados incluso en dosificación cada 3 días

• 42% de los pts tuvieron CERO sangrados/año


• Inhibidores

• Coste

• ADHERENCIA

• Adherencia a profilaxis es aún problema

• Lindvall K,et al. Haemophilia 2006; 12: 47-51.

• Duncan N, et al . Haemophilia 2010; 16: 247-55.

Adherencia

• Personalización de la profilaxis para cada tipo de paciente, e infusiones menos frecuentes pueden mejorarla

¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?

� Infusiones IV de factor menos frecuentes

� Tratamiento sin infusiones IV


� Infusiones IV de factor menos frecuentes:

– Desarrollo de cocentrados de Factor VIII de más larga duración:

• Unión a proteínas de fusión: IgG o albúmina

Hace a la molécula más resistente a la acción de la trombina, manteniéndose activo más tiempoactivo más tiempo

• Unión a otras moléculas: PEG/ PSA/PEGlip

Para disminuir la velocidad de inactivación por parte de la trombina, y aumentar el tiempo que la molécula permanece activa (ABC) -- PEG

Para conservar la función con un aumento de la estabilidad

• Combinación de FVIII pegilado o polisializado con FvW

• Modificación de aminoácidos: Análogos, rFVIII variante

Prolonga la vida media, por ej. aumentando unión a plaquetas


FVIII:

�Vida media corta

�No atraviesa piel ni pulmón

�Se destruye en el tracto GI

�Genera inhibidores si se administra por vía no IV

� Tratamiento sin infusiones IV:

– Moléculas sintéticas– Restauran la capacidad de generación de trombina po r la vía

extrínseca (por ejemplo, bloqueando los inhibidores de la coagulación, inhibidores del TFPI)

– Fucoide como tto adyuvante del FVIII en profilaxis

Tratamiento vía oral

La tecnología recombinante:

� Permite generar proteínas para uso terapéutico no procedente de

donaciones

� No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma

CONCLUSIONES

� No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma

� Minimiza el riesgo de transmisión de virus humanos

� Tiene un perfil de seguridad específico

� La fuente de partida es única, sistematizada y bien caracterizada

� Es un proceso industrial técnicamente exigente y regulado

La tecnología recombinante :

� Supone un incremento potencial en el nivel de seguridad de los

hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de

CONCLUSIONES

hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de

seguridad implementadas en los productos plasmáticos

� Abre el camino a nuevas generaciones de proteínas

terapéuticas

hemoderivados (v): productos de origen recombinante

Health & Medicine