dna recombinante
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DNA Recombinante: Una molécula de DNA formada por la unión de segmentos de
DNA de distintos orígenes. Los DNAs recombinantes son utilizados en el clonamiento
de genes, en la modificación genética de organismos y como herramienta general en
biología molecular.
Algunas técnicas utilizadas:
• Corte de DNA en secuencias específicas por endonucleasas de
restricción (enzimas de restricción)
• Hibridización o Hibridación de ácidos nucleicos: permite encontrar una
secuencia específica de DNA o RNA sobre la base de la
complementariedad de bases
• Clonamiento de DNA: una molécula de DNA puede ser copiada para
generar muchas copias idénticas de ella
• Amplificación de segmentos de DNA por la reacción en cadena de la
polimerasa o PCR.
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
Tipo I y Tipo III: Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). Cortan a cierta
distancia de la secuencia de reconocimiento
Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río
abajo.
Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II: Sólo tienen actividad de restricción.
Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
Sólo requieren Mg++ como cofactor.
No necesitan ATP.
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1.- Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2.- Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3.- Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”
y “Northern” blotting.
4.- Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creación de DNA recombinante.
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) es diferentes
secuencias de DNA homólogos que pueden ser detectadas por la
presencia de fragmentos de diferentes longitudes luego de la
Digestión de muestras de DNA con especificas Endonucleasas de
restricción.
Para ello se utilizan combinaciones de Enzimas de Restricción
Además del clásico plasmidio (utilizado para clonar),
existen diferentes sistemas de Expresión.
Yeast Artificial Chromosome (YAC)
Vectores de Expresión
Vectores Retrovirales
Vectores Lentivirales
Hibridacion
• La hibridación de Ac. Nucleicos es fundamental en estudios moleculares. Utiliza la capacidad natural de union entre DNA o RNA para formar dsDNA o dsRNA.
• Es una propiedad utilizada en muchas tecnicas de biologia molecular (diagnostic tests).
Southern blot
Nitrocelulosa
5’ ACTGCTCGATGCTCTCGGATCGCTCTGATTCG 3’
DNA unido a la membrana
3’ ACCAGAGCCTAGC 5’
sonda
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Componentes: Template • Pureza, origen, concentracion
• DNA genómico ~ 100-250 ng
• DNA plasmidial ~ 20 ng
Buffer • Necesario el MgCl2 • (0.5mM to 3.0mM 1.5mM default)
dNTP’s • Concentración Final 200M Polimerase • Grado de error y condiciones requeridas Primer(s) • tamaño (typically 18-30 nt) • G+C content (40-60%)
Parametros Criticos: Annealing Temperature • Cerca de 5-7°C bajo la Tm Annealing Time • Regla de 1kb por minuto Primer Design
El primer ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias específicas de DNA. El
DNA aislado de células es calentado para separar
sus hebras complementarias. Estas
hebras son hibridizadas a dos fragmentos de DNA
de hebra simple (oligonucleótidos), que han sido sintetizados
químicamente. Estos dos oligonucleótidos sirven
como partidores específicos para la
síntesis de DNA por la DNA polimerasa, la cual
copia el DNA que se encuentra entre las
regiones de unión de los partidores.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (polymerase chain reaction)
Hebras de DNA complementarias separadas por calor
Partidores definidos
Síntesis de DNA
Región amplificada
Cada ciclo tiene 3 etapas: denaturación (separación de hebras), hibridización (unión de partidores al templado) y elongación (polimerización de
desoxirribonucleótidos para sintetizar DNA sobre el templado).
PARTIDORES
DENATURACIÓN: HIBRIDACIÓN:
PARTIDORES
ELONGACIÓN:
La cantidad de DNA producido se duplica en cada ciclo, lográndose una amplificación
exponencial del fragmento deseado, a partir de poca cantidad de DNA. La enzima utilizada
para amplificar DNA en el PCR es la de la bacteria Thermus aquaticus (Taq Polimerasa).
Este organismo vive en ambientes de temperaturas muy altas (géiseres), lo cual permite
que su DNA polimerasa resista las temperaturas requeridas para la amplificación por PCR
Real-Time PCR
Existen tres métodos generales para la detección cuantitativa: 1. Reactivo que se une al DNA (SYBR Green) 2. Hidrolisis de sondas (TaqMan, Beacons, Scorpions) – utiliza la actividad
exonucleasa de la DNA Pol
• SYBR Green I binds dsDNA
• SGI fluorescence increases when bound to dsDNA
• As dsDNA accumulates, more SGI binds the DNA and the fluorescence increase
l
l
l
l
PCR
Reaction Progression
l
l
l
l l
l
l
l l
l l
l
RT-PCR EN TIEMPO REAL (SYBR Green)
• Target specific hybridization probe
• 5’ reporter and 3’ quencher
• Utilizes FRET quenching
R
Q
Reporter
Quencher R Q
* heat for BHQs
Energy
Light* Light
RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)
Taq Taq
R Q Q
l
R Q R
Q
1. During PCR, probe hybridizes
to target sequence
2. Probe is partially
displaced during extension
3. Probe cleaved by 5’- 3’
nuclease activity of polymerase
4. Illuminated free reporter
exhibits unquenched fluorescence
RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)
HeLa, -actin
iScript qRT-PCR Standard Curve Comparison:
cDNA serial dilution vs. total RNA serial dilution
Log Starting Quantity (femtograms of input RNA)
Note: 1/10th of cDNA reaction used for PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cycle Threshold Num
be
T )
5
10
15
20
25
30
35
40
cDNA Standard Curve Total RNA Standard Curve
cDNA total
RNA Slope -3.394
-3.382 Corr. Coef. 0.999
0.999 Intercept 38.91
38.09 PCR efficiency 97.1% 97.6%